Procédures légères
Etude de deux peptides sur leur effet thérapeutique potentiel dans un modèle murin de maladie neurodégénérative impliquant la protéine Tau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris de ce projet portent une mutation du gène Tau qui leur fait développer, à partir de quatre mois, une paralysie progressive des membres postérieurs. 676 d'entre elles vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 436 et modéré pour 240. 240 subissent une biopsie de la queue pour génotypage et 304 une injection dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, geste qui peut provoquer une ulcération de la cornée ou une exophtalmie, afin de faire produire dans leurs neurones un fragment de protéine censé bloquer l'agrégation de Tau. Certaines sont tuées un mois après l'injection, d'autres à cinq mois pour éviter des symptômes moteurs plus graves, et d'autres encore, écrit le porteur, "pour fin d'accouplement et génotype sans intérêt".
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est notamment caractérisée par le dysfonctionnement de la protéine Tau dans les neurones du système nerveux central. Cette protéine, dont la dégradation normale est altérée dans la maladie, s’accumule et s’agrège de façon toxique dans les neurones et finit par entraîner la dégénérescence du cerveau. Nous avons mis en évidence qu’une protéine X interagissait avec Tau. Nous avons également constaté que l’expression de cette protéine X est faible dans le cerveau de patients atteint de la maladie d'Alzheimer et que cette baisse est associée à l’apparition des formes pathologiques de Tau dans les neurones. La partie de la protéine X impliquée dans l’inhibition de l'agrégation de la protéine Tau a été identifiée. Nous proposons dans ce projet d’étudier l’impact thérapeutique potentiel de cette partie de la protéine X sur la progression de cette maladie de Tau chez la souris. Pour cela, nous disposons au laboratoire d’un modèle de souris porteur d’une mutation du gène de Tau générant une maladie proche de la maladie d'Alzheimer et présentant une accumulation de Tau dans les neurones du cerveau et de la moelle épinière. Notre objectif à court terme est de produire dans le cerveau et la moelle épinière de souris deux formes plus ou moins longue de cette partie de la protéine X afin de déterminer à moyen terme leur efficacité à ralentir/guérir la maladie.
Bénéfices attendus
Si la production dans les neurones des parties de la protéine X, dont nous savons qu'elles sont capables d'empêcher l'agrégation de Tau, agit sur l'évolution de la maladie chez ces souris, de nouvelles perspectives thérapeutiques seraient envisageables chez l'homme atteint de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Une biopsie de la queue de courte durée sera effectué sur 240 animaux. Pour l'expérimentation, 304 animaux issus d'accouplement de souris homozygotes Tau seront soumis à une injection intraveineuse. Une injection rapide (moins de 20 secondes) est effectuée sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Certaines souris seront génotypées. La contention et la biopsie de queue sont des gestes bien maîtrisés mais qui peuvent générer de légères douleurs et un court moment de stress chez la souris. Le modèle de souris Tau présente un trouble moteur se développant spontanément et progressivement à partir de 4 mois d’âge et développe une paralysie légère et progressive des membres inférieurs pénalisant la mobilité de la souris. Les expériences d’injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbitaire peuvent présenter dans de très rares cas une opacité/ulcération de la cornée ou une exophtalmie.
Devenir
Certaines souris seront euthanasiées pour fin d'accouplement et génotype sans intérêt. D'autres seront euthanasiés à 1 mois post-injection et cela avant l'apparition des troubles moteurs (à partir de 4 mois) pour vérifier la présence de la partie de la protéine X dans les neurones. Enfin certaines souris vieilliront jusqu'à 5 mois d'âge pour vérifier l'effet de la partie de la protéine X sur l'agrégation de Tau dans les neurones, âge auquel elles seront toutes euthanasiées pour limiter l'apparition de symptôme moteur plus grave pour les souris.
Remplacement
Nos résultats obtenus sur des neurones en culture tendent à montrer un effet inhibiteur de cette partie de la protéine X sur l’agrégation et l’accumulation de la protéine Tau. Le passage sur un modèle souris est nécessaire pour évaluer les bénéfices potentiels de ces fragments de protéine au plan moléculaire et surtout au plan fonctionnel sur la motricité de l'animal. En effet, nous voulons voir dans ce modèle si ces fragments peuvent 1) être exprimé dans les neurones, 2) protéger ces cellules de la toxicité de Tau et 3) prévenir une perte fonctionnelle lié à la toxicité de ces neurones. N’ayant aucun autre modèle disponible pour cette évaluation indispensable avant des études possible chez l’homme, ce passage sur modèle animal est incontournable.
Réduction
Nous récupérerons les cerveaux et moelles épinières des animaux soumis aux tests de motricité pour l’analyse moléculaire. Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à notre étude, le cerveau et la moelle épinière de chaque souris seront coupés en deux. Chaque partie sera analysée par deux types d'analyses. Le calcul du nombre d'animaux nécessaire a été effectué par des tests statistiques et basé sur une comparaison de deux moyennes (témoins/traités) au cours du temps dans chaque expérience.
Raffinement
Le modèle de souris utilisé présente un trouble moteur léger à partir de 4 mois d’âge qui progresse jusqu’à 5 mois d’âge. Afin de limiter une possible souffrance de l’animal liée à un trouble moteur, la nourriture sera déposée directement et systématiquement dans la cage à partir de 4 mois d’âge. L’ensemble des expériences d’injection seront réalisées sur des souris anesthésiées. Une observation attentive de la douleur sera effectuée. Après réveil de l’animal, une évaluation hebdomadaire du mal être des animaux basée sur une observation attentive de 5 minutes du comportement de l'animal, sera effectuée par l’expérimentateur et/ou les animaliers sur différents critères (voir tableau scoring). Des analgésiques pourront être administrés par voie sous cutanée pour réduire au minimum une possible souffrance des animaux. Cette observation sera renforcée par un portoir dit "intelligent" dans lequel les souris seront analysées sur leurs motricité 24h/24h, 7j/7j. Cette activité nous permetta d’identifier les cages de souris présentant des niveaux de motricité anormales (agressivité, immobilité …) et d'intervenir précocément pour améliorer en conséquence le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Etant donné nos résultats positifs sur l’efficacité de la région de la protéine X à inhiber l’agrégation de la protéine Tau purifiée, nous avons choisi d’étudier ce modèle murin qui présente certaines anomalies observées dans la pathologie humaine aussi bien sur le plan moléculaire que comportemental. Ce modèle, déjà bien caractérisé, fait l’objet de nombreuses publications scientifiques et nous donne une bonne base de travail pour la mise en place de ce projet. La production de la région d'intérêt de la protéine X sera induite à 1 (stade précoce) et 3 (stade médian) mois d'âge; l’évolution de la tauopathie sera suivie au niveau moléculaire et fonctionnel sur la locomotion des souris et comparée à l’évolution des animaux témoins.
Effet de programmations thermiques précoces sur le comportement et la physiologie des juvéniles de truites communes (Salmo trutta L.)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Ni relâchées dans les rivières voisines, au motif d'un risque de pollution génétique, ni reprises par l'écloserie qui les a produites faute de place, les 96 truites communes juvéniles de ce projet seront toutes tuées, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus bas. Elles sont soumises à jusqu'à quatre séances de pêche à l'électricité de vingt minutes pour être recapturées, puis à trois tests enchaînés sans pause : exploration d'une arène inconnue, confrontation à un objet nouveau, réaction à une élévation de la température de l'eau. La mesure du métabolisme les enferme ensuite trois heures dans une chambre respirométrique individuelle. Le porteur justifie le choix de l'espèce par sa valeur de modèle en écologie évolutive et par ses "forts enjeux économiques, écologiques et culturels", la population étudiée se trouvant en limite sud de son aire de répartition.
Objectifs
Dans le contexte actuel de forte pression sur la biodiversité aquatique, il est important de caractériser les liens entre variabilité environnementale et évolution des populations de poisson, notamment à travers l’étude de la variabilité des comportements et de la dépense énergétique, en lien l’adaptation. Une des conséquences du changement climatique est de produire des conditions variables lors des phases de croissance sous gravier des salmonidés, notamment des bas débits hivernaux et printaniers. Un des effets attendus est d’abaisser la hauteur d'eau sur certaines frayères et de réduire les écoulements intra gravélaire qui participent au maintien de températures optimales pour le développement des œufs et des larves. Ces conditions peuvent induire du stress qui peut avoir des conséquences à moyen terme, notamment sur la croissance et la survie, paramètres liés aux comportements et au métabolisme. Ainsi, les individus émergents possédant des caractéristiques comportementales et métaboliques adaptées, maintenues dans le temps, pourraient avoir de meilleures croissances et mieux survivre dans les conditions futures, où la fréquence des températures élevées augmentera. Ce processus pourrait orienter et contraindre l’évolution génétique, du métabolisme et des comportements au sein des populations. L'objectif du projet est de caractériser, chez la truite commune, Salmo trutta L., l'effet de l’augmentation des températures en phase embryonnaire et larvaire, avant nutrition exogène, sur le développement, le comportement et le métabolisme des stades plus avancés (alevin). Par ailleurs, il vise à déterminer si les traits produits par ces augmentations sont maintenus dans le temps, et si certains procurent un avantage lors de la première phase de développement en eau libre (croissance, survie).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent les connaissances fondamentales et appliquées sur l'écologie et l'évolution des salmonidés juvéniles soumis aux variations thermiques durant la phase embryo-larvaire, en conditions d’élevage et en milieu naturel. Le projet déterminera si 1) les programmations thermiques en phase embryo-larvaire ont des conséquences en termes de développement, de comportement et de métabolisme, selon l’intensité de celles-ci 2) les paramètres comportementaux et métaboliques individuels sont conservés entre l’émergence du gravier et 30 jours après une phase de croissance en eau courante 3) la croissance et la survie sont impactées par la programmation thermique appliquée aux stades embryo-larvaires. Ces connaissances permettront de nourrir les modèles visant à prédire l’évolution des populations de truite impactées par les changements climatiques futurs. Elles pourront également aider les gestionnaires et la filière piscicole en révélant les impacts de périodes à forte variabilité thermique sur le développement sous gravier ou en incubateur, et améliorer la prise de décision pour la gestion des débits naturels (éclusées, débits réservés, …) ou des températures en élevage. La mise au jour de comportements et de métabolismes mieux adaptés aux variabilités thermiques futures pourrait orienter les choix de géniteurs et de croisements dans les actions de repeuplement ou en production salmonicole.
Procédures
1) Pêche à l’électricité : un maximum de 4 pêches à l’électricité, d’une durée de 20 minutes, sera réalisé sur une période de 4 jours pour tenter de recapturer les 96 poissons. 2) Tests comportementaux : jusqu'à 96 individus seront soumis aux tests et un maximum 32 poissons par jour sera testé pendant 3 jours consécutifs. Les 3 tests s’enchaîneront sur une durée totale de 20 minutes sans arrêt marqué entre chacun. A. Test exploratoire : après 2 minutes d’acclimatation dans un abri, ce test de 4 minutes vise à étudier le comportement d’exploration de l’arène inconnue (nage libre). B. Test du nouvel objet : ce test de 4 minutes vise à étudier le comportement d’exploration d’un objet auparavant inconnu de l’individu. C. Test de thermotaxie : ce test de 10 minutes a pour objectif d’étudier le comportement et les déplacements de l’individu face à une augmentation de la température de l’eau. 3) Mesure du métabolisme : La procédure consiste à mesurer la consommation d'oxygène en chambre respirométrique individuelle grâce à des sondes à oxygène. Les 96 individus pourront être soumis à cette mesure. La chambre est alimentée en eau de bonne qualité physico-chimique. L’alimentation est fermée durant 20 minutes pendant lesquelles la diminution de la concentration en oxygène est mesurée. Les phases de circuits ouvert et fermé de 20 min alterneront durant 3 h.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles sur les animaux sont majoritairement liées au stress impliqué par les manipulations (changement de bac, stabulation, transport) et lors des prises de mesures comportementales et métaboliques. Pour le comportement il s’agit d’exposer des individus à des situations inconnues (nouvel environnement ou objet) ou des variations de température dans une arène expérimentale éclairée par rétro-éclairage (sous l’arène) ou éclairage indirect (plafond). Par ailleurs, l’estimation du métabolisme de base requiert l’isolement des poissons dans des chambres métaboliques individuelles, ce qui pourrait induire un stress.
Devenir
Le remise en liberté des poissons issus de l’élevage sur le lieu de l’expérimentation (rivières proches) n’est pas possible car il y a un risque de pollution génétique. Les animaux ne peuvent pas retourner dans l’établissement fournisseur car ils ont été produits et élevés pour les besoins de cette étude et il n’a pas la capacité d’accueil suffisante pour continuer à les maintenir en hébergement.
Remplacement
Les œufs et larves de truite se développent sous le gravier pendant environ 80 jours ce qui les expose potentiellement à des variations thermiques défavorables puisque les possibilités de changements volontaires d’habitat sont impossibles à cette phase. L’impact à moyen terme de ces variations durant le développement sous gravier et jusqu’à 30 jours après émergence en eau libre ne peut être estimé que sur des animaux vivants, ayant réalisé une croissance postérieure à la variation thermique. Aucune méthode substitutive telle que le travail sur des lignées cellulaires ou des tissus entiers n’est envisageable pour obtenir de tels résultats, puisque c’est le développement, le comportement individuel (déplacement, exploration, réaction à un stimulus thermique) et le métabolisme (consommation d’oxygène) de l’individu entier au repos qui seront étudiés.
Réduction
Le projet vise à tester l’effet d’une programmation thermique (14°C et 16°C) sur la croissance, l’activité d’exploration et le métabolisme des poissons. Le protocole évaluera l’effet de la programmation sur les individus à la fin de la phase embryo-larvaire, puis 30 jours plus tard. Pour cela 32 individus par programmation seront testés. Sur la base de données publiées et à l’aide d’un calculateur de puissance, la taille d’échantillon estimée lors d’une simulation pour détecter une différence de métabolisme de routine entre deux groupes est de 31 individus. Par ailleurs, une synthèse méthodologique publiée récemment indique que les recherches comportementales utilisant des arènes connectées par un couloir nécessitent de tester plus de 20 individus pour optimiser la probabilité de détecter des différences comportementales significatives entre groupes.
Raffinement
Acclimatation : Les 96 individus seront transférés de l’écloserie à la rivière expérimentale pour être acclimatés dans des bacs équipés d’abris. Une acclimatation sera observée en circuit semi-ouvert (équilibrage des masses d’eau) puis ouvert. Le lendemain, ils seront déposés dans un bief du chenal au crépuscule, dans une zone abritée. Ils pourront alors se répartir librement et commencer leur nutrition naturelle. Ce chenal est conçu pour une croissance sans alimentation artificielle, grâce à des proies naturelles dérivantes (insectes, zooplancton). L’eau du ruisseau, de bonne qualité physico-chimique, est filtrée, ce qui empêche l’entrée de poissons extérieurs. Le débit est modulable et produit des vitesses et profondeurs caractéristiques des habitats naturels. Le bief d'accueil des poissons abritera une densité similaire à celle des conditions naturelles. Un substrat de galets et graviers est déposé dans les biefs sur une hauteur importante. Des abris constitués de tuiles et de blocs seront installés afin de réduire la compétition entre individus. Le chenal sera couvert par un filet pour éviter la prédation aviaire et il est bordé d’un brise-vue afin de limiter le stress causé par les observateurs. Un opérateur effectuera une inspection visuelle quotidienne. En cas de mortalité accidentelle, les individus seront extraits du bief pour éviter toute dégradation environnementale (pathogènes, champignons). Points limites lors des tests comportementaux : des signes de stress important entraineront l’arrêt du test et l’isolement du poisson dans un bac afin de suivre sa récupération. Points limites lors des mesures métaboliques : si un individu s’agite dans la chambre plus de quelques secondes, il sera retiré et remplacé par un autre. Si le taux d’oxygène venait à baisser de façon importante l’individu sera retiré de la chambre et replacé en stabulation.
Choix des espèces
La truite commune (Salmo trutta L.) est une espèce d'eau froide dont la population étudiée est en limite sud de l'aire de répartition. Connaître ses capacités d'adaptation au changement climatique est important pour sa conservation et pour comprendre son expansion dans les milieux plus au nord, sous l’effet du changement climatique. Cette espèce à forts enjeux économiques, écologiques et culturels est en régression dans son aire sud mais pourrait s’étendre au nord dans les zones arctiques. C'est par ailleurs une espèce modèle en écologie évolutive. L'interprétation des résultats obtenus bénéficiera de l'abondante bibliographie existante bien que cette dernière soit très restreinte sur le maintien des phénotypes sous influence de programmations thermiques au cours du temps et en milieu naturel. Le stade juvénile, à partir de la première nutrition exogène et jusqu’à 30 jours de développement post-nutrition, sera utilisé. Ce stade a été choisi pour permettre aux poissons de débuter une nutrition autonome sur des proies sauvages, tout en évitant qu’ils ne s’habituent à une alimentation artificielle (pellets ou proies vivantes d’élevage). Cela garantit une adaptation immédiate à des conditions de vie sauvage, ce qui présente plusieurs avantages. Le premier est d’éviter aux individus un changement nutritionnel susceptible d’entraîner des conséquences comportementales et physiologiques, telles que l’absence de recherche active de proies ou un métabolisme façonné par une alimentation d’élevage. Ces éléments pourraient biaiser les résultats des tests. Le second avantage est lié aux objectifs du projet, qui consistent à tester la stabilité des phénotypes en conditions naturelles, depuis l’émergence jusqu’à 30 jours de développement. Cette période, extrêmement critique pour les individus, englobe l’établissement de la nutrition exogène, des comportements sociaux et de nage, ainsi que la mise en place des territoires et les premières phases de croissance en eaux libres.
Eclairage sur MafB : Le chef d’orchestre qui oriente les cellules souches vers la voie myéloïde.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris qui perdent 20 % de leur poids maximum, ou dont le score sur la grille de douleur atteint 10 à 12, sont mises à mort. 4 233 souris vont être utilisées dans ce projet, dont 4 113 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse, des injections mimant une infection, et pour certaines une destruction de la moelle osseuse par rayons X suivie d'une greffe de cellules, avec fatigue, hypothermie et perte de poids pendant une quinzaine de jours. Le porteur cherche à établir le rôle d'un facteur de transcription dans la fabrication des globules blancs, et indique que les animaux issus de l'élevage passent d'une procédure à la suivante, les reproducteurs mis à part, avant d'être tués.
Objectifs
L'objectif de notre projet est d'explorer les mécanismes moléculaires permettant la différenciation des cellules souches sanguines, appelées cellules souches hématopoïétiques (CSH), notamment vers la différentiation en globules blancs. Les CSH, résidant dans la moelle osseuse, sont des cellules à longue durée de vie dotées d'une capacité d'auto-renouvellement, nécessaire pour renouveler les différentes cellules composant le sang. En raison de ces caractéristiques, les CSH doivent relever le défi de maintenir un équilibre délicat entre auto-renouvellement et différentiation extensive pour reconstituer les cellules sanguines épuisées. Cet équilibre délicat est crucial pour maintenir l'homéostasie et répondre aux demandes évolutives de l’organisme. Les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs ne sont pas totalement compris. De par nos résultats antérieurs, le facteur de transcription MafB pourrait jouer un rôle dans cette différenciation. Nous avons montré que les CSH possèdent la capacité de conserver une mémoire des signaux infectieux précédents. Cette mémoire, caractérisée par un ensemble de modifications épigénétiques, a été appelée "immunité entraînée". Ce phénomène a des implications significatives dans la mise en place d’une seconde réponse adaptée à la suite d’un même stimulus. Nos résultats suggèrent que le facteur MafB 1/ joue un rôle dans la différenciation des CSHs en condition homéostatique et inflammatoire (notamment en favorisant la production des cellules myéloïdes (hématies, polynucléaires, monocytes et plaquettes en urgence), 2/ serait impliqué dans la mécanistique de mise en place de la mémoire entrainée des CSH. Alors que MafB est une protéine qui intéragit avec elle-même, dans certains contextes inflammatoires, elle peut former un complexe avec un autre facteur Fos qui pourra potentiellement impacter la différenciation des CSHs et la mise en place mise en place de la mémoire entraînée. Notre projet aura donc pour objectifs: 1/ l’étude du rôle de MafB dans les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs en conditions homéostatiques ; 2/ l’étude du rôle de MafB dans les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs en conditions inflammatoires de type myélopoïèse d'urgence et dans l’immunité entrainée au niveau des modifications épigénétiques induites par la primostimulation, 3/ la capacité des CSHs à reconstituer totalement une moelle osseuse en absence de MafB ou en présence du complexe MafB/Fos
Bénéfices attendus
L’étude de la différenciation des CSHs présente de nombreux bénéfices potentiels, tant pour la recherche fondamentale que pour les applications cliniques. Sur le plan scientifique, elle permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent la transformation des CSH en différents types de cellules sanguines, notamment les hématies, les polynucléaires, les monocytes et les plaquettes. Cette connaissance approfondie pourrait aider à identifier des dysfonctionnements immunitaires responsables comme par exemple des formes graves du SARS-Cov2 ouvrant ainsi la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques modulant l’activité de ces cellules. En clinique, une meilleure maîtrise de la différenciation des CSH pourrait améliorer les thérapies cellulaires, notamment les greffes de moelle osseuse, et favoriser le développement de traitements régénératifs pour réparer les tissus endommagés. En outre, ces avancées pourraient contribuer à la création de thérapies personnalisées, en optimisant l'utilisation des cellules souches pour répondre aux besoins spécifiques des patients. Finalement l’immunité entrainée représente un concept novateur et sa modulation une alternative thérapeutique en tant que solution de remplacement aux antibiotiques en favorisant la création de vaccins à large spectre.
Procédures
Cette procédure a pour but de produire les animaux d’intérêt utiles au projet à savoir des souris issues des lignées MafB flox CSF1R Cre, MafB flox Vav1 Cre, MafB Flox Vav1 Cre PU1 KI GFP et MafB Flox/MafB E269R Vav1 Cre. D'après nos études précédentes, nous considérons qu'environ 3% des animaux necessiteront un second génotypage fait par prélèvment caudal (--28 jours et sera effectué sous anesthésie gazeuse isofluorane 4%. Le génotypage du modèle PU1 KI GFP se fait de par l’analyse de la protéine PU1 KI GFP présente dans les souris issues de la lignée MafB Flox Vav1 CRE PU1 KI GFP par analyse sanguine en cytométrie en flux. Pour cela, un prélèvement sanguin d'un volume de 100µL effectué en retro-orbital sera effectué sur des souris âgées de 5-7 semaines. . Certaines souris pourront subir en vigile injection intra-veineuse qui entraine une légère douleur de courte durée pour l’injection d’un traceur avant mise à mort, Certaines souris recevront une stimulation inflammatoire soit en injection intra-veineuse dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie gazeuse soit en injection intrepéritonéale sur animaux vigiles. Les souris subiront un prélèvement sanguin (entre 1 et 4 prélèvements séparés d’une semaine) au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse puis une injection intrepéritonéale unique pour l’injection d’un traceur avant mise à mort. Pour les stimulations inflammatoires, cela varie de 1 à 3 jour en fonction du type de stimulation. Certaines souris subiront une myéloablation par irradiation aux rayons X sur animaux vigiles (quelques 5 min) puis une transplantation en injection intra-veineuse dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie gazeuse d’une suspension de cellules de moelles osseuses. Les souris subiront un prélèvement sanguin (entre 1 et 4 prélèvements séparés d’un mois) au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse puis une injection intrepéritonéale unique pour l’injection d’un traceur avant mise à mort. Les injections ou prélèvements entrainent une légère douleur de courte durée (quelques minutes) localisée au niveau de la zone d’injection ou de prélèvements.
Impact sur les animaux
La myéloablation peut rendre les animaux plus susceptibles aux risques infectieux. La répétition des gestes techniques et l’inconfort que peut ressentir l’animal après une injection mimant une infection ou après une myéloablation pourront engendrer une souffrance modérée. Les souris pourront présenter une fatigue, une légère hypothermie et une perte de poids pendant 2 jours (injection mimant une infection) ou 15 jours (transplantation suivant une myéloablation). Les animaux peuvent présenter des signes de stress liés à leur contention
Devenir
Animaux conservés pour la suite des procédures après la procédure 1 (excepté pour les réproducteurs) et mise à mort pour les autres procédures.
Remplacement
Afin d'étudier le potentielle rôle du gène MafB dans la régulation de la différenciation des cellules souches hématopoiétques, nous ne pouvons pas remplacer le modele murin. En effet, les cellules souches hematopoiétiques étant particulièrment régulées par leur environement, d'un point de vue physique via des interactions directes cellules-cellules mais aussi de part l'ensemble des médiateurs chimiques régulant leur communication, l'utilisation de lignée cellulaire est impossible. Ne pouvant donc pas remplacer le modèle murin, nous réduirons autant que possible leur utilisation.
Réduction
Sur la base de nos données préliminaires, nous calculerons le nombre minimum de souris nécessaires pour chaque expérimentation permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif (calcul du n avec un test unilatéral pour une différence de 10%, un risque alpha de 5%, une puissance bêta de 80%). Nous avons également choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec leurs contrôles de même portée respectifs et non avec des souris de type sauvage.
Raffinement
Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les souris afin d'améliorer le bien être de l'animal pour obtenir des données fiables. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (prélèvement sanguin et transplantation). Nous vérifierons l’état de santé des souris quotidiennement : tout changement dans leur comportement ou l’apparition de signes cliniques (posture, prostration, difficultés à se déplacer et à s’alimenter, déshydratation) sera relevé et évalué grâce à une grille d'évaluation de la douleur. Lorsque les souris présenteront une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids maximum ou si le score de la grille de douleur atteint 10-12, soit le cas sévère, les animaux seront alors mis à mort. Durant l’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur (environnement contrôlé : température et ventilation régulées, lumière avec un cycle de 12h, hygrométrie), avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. Les souris seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. L’environnement est enrichi par des dômes en carton ou du coton.
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Animal de petite taille et à reproduction rapide. Bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Disponibilité de modèles génétiquement modifiés nécessaires aux études réalisées dans ce projet. Les animaux seront utilisés entre 8 semaines et 2 ans sachant qu’il n’est pas exclu que l’impact de la délétion de MafB évolue au cours du vieillissement.
Étude des mécanismes contrôlant la formation et le remodelage de l’os chez la souris (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
936 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 552 d'entre elles et modéré pour 384. Entre le septième et le douzième jour de vie, chaque souriceau subit une biopsie de la queue pour établir son profil génétique, puis viennent un recueil d'urine par contention, deux injections de marqueurs et une imagerie osseuse haute résolution sous anesthésie profonde. Le sang et les organes sont prélevés après mise à mort. L'objet déclaré est de décrire un défaut osseux lié à une mutation rare, à six âges différents et sur seize animaux par sexe et par profil génétique, ce qui commande l'effectif, et le porteur conclut que les modèles cellulaires ne reproduisant ni la chronologie du développement osseux ni les interactions entre tissus, le recours à l'animal est "nécessaire".
Objectifs
La maladie rare étudiée est associée chez l'homme à un défaut de croissance. Une mutation génétique particulière associée à la maladie entraine un défaut de l’os chez la souris et des taux anormaux dans le sang de composés associés à la biologie de l’os. Il apparaît donc nécessaire d’étudier les conséquences de cette mutation dans le modèle murin, qui récapitule des défauts observés chez les patients. Dans ce cadre, les objectifs du projet seront de réaliser des dosages à partir de prélèvements sanguins et d’urine ; et d’utiliser une technique d’imagerie sur des animaux placés sous anesthésie générale pour obtenir des images haute résolution de l’os, facilitant les mesures et la visualisation d’anomalies de l’os. La réalisation de ce projet, sur deux établissements utilisateurs (EU) différents, permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans le développement et la croissance de l’os, et de mieux comprendre la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet renforcera les connaissances de base sur le mécanisme de formation osseuse et les fonctions développementales de ce gène. Ces découvertes pourraient également être utiles en clinique pour anticiper les problèmes de santé liés au vieillissement chez les patients atteints de cette maladie rare et chez d'autres patients présentant des maladies osseuses.
Procédures
Le profil génétique des animaux sera établi à l’aide d’une biopsie de queue (durée de 30 secondes) entre 7 et 12 jours post-natal (EU1). Un recueil des urines sera effectué par simple contention des animaux, une seule fois (1 minute - EU1). Les deux injections de marqueurs (30 secondes par injection - EU1), nécessaires à l’analyse par imagerie (5 minutes par radiographie - EU2) , seront réalisées sur animaux avant leur anesthésie profonde (EU2) pour l’analyse par imagerie (EU2) et le recueil de sang (EU2).
Impact sur les animaux
La biopsie de queue entre 7 et 12 jours post-natal peut entrainer un stress dû à la contention et une légère douleur. Le prélèvement d’urine se fait par contention de l’animal et peut également engendrer un stress pour les animaux du fait d’être manipulé. Les injections par voie intra-péritonéale peuvent entrainer une douleur minime ou un inconfort passager. Le transport des animaux vers un autre centre parisien peut lui aussi engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et de sang pour analyse.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas de récapituler les processus impliqués dans la formation et le vieillissement osseux, la chronologie des processus développementaux et les interactions des cellules osseuses avec leur environnement et les autres tissus, ainsi que l’analyse de la structure de l’os. Le recours à l’animal est donc nécessaire.
Réduction
Nous estimons la taille de l’échantillon à 16 animaux par sexe et par profil génétique souhaité à chaque temps pour réaliser des analyses statistiques fiables et obtenir des résultats scientifiques robustes aux différents âges de 6, 12, 15, 18, 20 et 52 semaines. Toutes les procédures expérimentales sont réalisées sur les mêmes lots d’animaux à un âge donné grâce notamment à l’utilisation successive de plusieurs techniques permettant le recueil d’urine et de sang pour l’analyse de plusieurs paramètres en une seule observation et l’analyse de plusieurs paramètres de l’os grâce à l’imagerie sur des animaux placés sous anesthésie générale.
Raffinement
Tous les animaux seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Plusieurs points limites sont mis en place dans le but d'identifier une éventuelle souffrance ou détresse des animaux et si nécessaire de les mettre à mort. L’imagerie sera effectuée sur des animaux placés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
La souris est un animal dont les processus de formation de l’os sont semblables à celui de l’Homme, permettant un parallèle avec la maladie humaine. De plus, de nombreux appareils et techniques sont adaptés et disponibles pour le modèle souris. Cette espèce présente donc tous les avantages pour répondre à l’objectif de ce projet, soit étudier la dynamique et les fonctions de l’os liés à un défaut génétique au cours du vieillissement. Ce projet a donc pour objectif de mieux décrire le phénotype osseux au cours du vieillissement en utilisant des animaux âgés de 6, 12, 15, 18, 20 et 52 semaines au moment des analyses.
Evaluation d’un candidat médicament sur la physiopathologie de la drépanocytose dans le modèle murin Townes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Génétiquement modifiées pour porter l'hémoglobine drépanocytaire, 1 608 souris Townes vivent avec une anémie, des globules rouges de très courte durée de vie et une nécrose du foie. Elles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 492 d'entre elles et sévère pour 1 116. Le protocole prévoit un gavage quotidien pendant plusieurs dizaines de jours ou plusieurs mois, des injections intrapéritonéales quotidiennes alternées, une injection dans le sinus de l'œil et des prélèvements sanguins répétés, le porteur indiquant que le stress de ces manipulations peut déclencher des crises vaso-occlusives et la mort de certains animaux. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever le sérum, les érythrocytes et les organes, dans une étude demandée par un partenaire industriel.
Objectifs
La drépanocytose ou anémie falciforme est une maladie autosomique récessive. L'espérance de vie des patients atteints de cette maladie génétique est fortement réduite. Cette maladie génétique la plus fréquente en france est due à une substitution d'une glutamine par une valine à la sixième position du gène codant pour la béta-globine. L'expression de ce gène chez les individus homozygotes donne une hémoglobine anormale (HbS) qui dans certaines conditions (température, stress, hypoxie, deshydratation) favorise la formation de globules rouges de forme allongées en faucille induisant des phénomènes vaso-occlusifs, une anémie et des prédispositions aux infections bactériennes. A la demande d'un partenaire industriel, l'objectif de ce projet est de compléter une étude partielle réalisée dans d'autres laboratoires sur la pharmacocinétique et la pharmacodynamique d'un candidat médicament de la drépanocytose très prometteur en utilisant un modèle murin in vivo spécifique de la drépanocytose (souris Townes homozygote pour HbS). Ces animaux présentent une anémie, une demi-vie des érythrocytes très courte et expriment un phénotype commun à la maladie humaine (augmentation des leucocytes, nécrose hépatique avec des infiltrats de neutrophiles et de macrophages, augmentation de l'érythropoïèse, splénomégalie, légère glomérulopathie). Ce projet est composé de 10 procédures qui complètent des travaux réalisés dans différents laboratoires relatifs à l'activité d'un candidat médicament sur la physiopathologie de la drépanocytose dans le modèle murin Townes. Ce projet comparera également l'effet de notre composé avec des molécules déjà commercialisées.
Bénéfices attendus
Nous attendons une amélioration de l'espérance de vie des animaux et une caractérisation de la cinétique et de la dynamique de la molécule utilisée. Celle- ci devrait pouvoir être proposée à des patients qui expriment des formes sévères de la maladie.
Procédures
Des animaux pourront être soumis à des prélèvements de sang qui respecteront la volémie grâce au volume et à la fréquence. Des animaux pourront êtres soumis à un gavage quotidien pendant plusieurs dizaines de jours ou plusieurs mois selon la procédure. Des animaux pourront subir une injection intra-péritonéale quotidienne alternativement gauche et droite pendant plusieurs dizaines de jours. Des animaux subiront une injection intra-veineuse d'un marqueur spécifique des glogules rouges (sinus retro-orbital, volume 50µl). Chacune de ces interventions dure au maximum 2 minutes ( contention de l'animal et exécution du geste technique). Un stress pourra être induit pendant la réalisation de ces gestes techniques et au cours de la pesée des animaux toutes les 2 semaines (durée 1 minute).
Impact sur les animaux
Concernant la molécule utilisée dans ce projet, les études toxicologiques n'ont pas démontré une activité toxique à la dose utilisée. Toutefois nous attendons l'expression de symptômes de la drépanocytose (anémie, inflammation, phénomènes vaso-occlusifs) sous l'effet d'un stress au cours de la manipulation des animaux qui expriment un génotype drépanocytaire. Des crises peuvent conduire au décès d'animaux. Toutefois nous attendons une amélioration chez les individus traités.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélever et étudier le sérum, les érythrocytes et les organes.
Remplacement
Cette maladie a des conséquences sur tous les organes vitaux (foie, coeur, rein, poumons, rate, cerveau) et comme il n'existe pas de modèle capable de mimer les relations complexes entre ces organes, un organisme entier vivant est incontournable.
Réduction
Les effectifs ont été calculés au plus juste en utilisant des animaux des deux sexes puisque cette maladie est autosomique. En tenant compte d'une possible mortalité d'animaux et de la puissance de 0,8 de nos tests statistiques, nous avons déterminé des groupes de 4 à 8 individus de chaque sexe.
Raffinement
Les conditions d'hébergement et de manipulation des animaux ne doivent pas exacerber les symptômes de la drépanocytose. Les animaux seront manipulés le plus souvent par cup handling ou par tubing. L'enrichissement par des buchettes à grignoter et du matériel de nidification sera présent. Les animaux seront observés pour la détermination du score sans les manipuler. Des points limites ont été établis et l'administration d'analgésique sera envisagée si le score est atteint. L'anesthésie gazeuse (vetflurane) sera utilisée au cours des prélèvements de sang.
Choix des espèces
L'espèce murine a été choisie puisque plus de 90% des gènes humains ont un orthologue direct chez la souris. Cette espèce animale est facilement et rapidement reproductible. Le modèle murin est modifiable génétiquement pour lui donner des caractéristiques humaines. De nombreux réactifs ainsi que des techniques variées sont disponibles pour réaliser les études biologiques. Les animaux choisis sont des animaux génétiquement modifiés (gènes de la globine alpha et beta) qui démontrent une grande homologie de symptômes avec ceux observés chez l'homme atteint de drépanocytose. Nous utiliserons des animaux âgés de 3-4 semaines et des animaux âgés de 6-8 semaines pour nous permettre d'étudier les stades précoces (adolescence) et tardifs de la maladie (adulte).
Etude des symptômes de douleur dans des maladies neurodégénératives
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes les souris passent d'abord des tests comportementaux, un tous les deux jours pendant quinze jours, de cinq à trente minutes, pour mesurer leurs seuils de douleur. Une partie est ensuite opérée du cerveau, trente minutes pour installer le modèle parkinsonien, quarante pour enregistrer l'activité des neurones, trente pour colorer les circuits. 2 205 souris sont concernées, dans des procédures allant du léger au sévère et dont 446 relèvent du niveau sévère, avec une perte de poids attendue chez les parkinsoniennes et des défauts de mémoire à partir de huit mois chez les souris Alzheimer. Toutes sont tuées à la fin pour analyse des tissus.
Objectifs
Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, le vieillissement de la population s’accélère partout à travers le monde. Combiné à l'allongement de l'espérance de vie, il en découle une augmentation des problèmes de santé liées au vieillissement, notamment les douleurs chroniques. En effet, la prévalence de la douleur chronique augmente avec l’âge. Elle passe de 6 pourcents chez l’enfant à 19 pourcents au sein de la population adulte, et dépasse les 30 pourcents après 65 ans pouvant aller jusqu’à 75 pourcents dans la maladie d’Alzheimer et de 86 pourcents dans la maladie de Parkinson. Ces symptômes de douleurs sont donc fortement accentués lors du vieillissement pathologique. Ils aggravent les symptômes de ces pathologies et de ce fait, impactent négativement la qualité de vie des patients, représentant un problème sociétal majeur. L’objectif de ce projet est d’étudier les réseaux cérébraux de la douleur dans des modèles animaux de la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson afin de mieux de comprendre les mécanismes du développement des douleurs chroniques favorisant l’identification de stratégies thérapeutiques efficaces.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer se caractérisent par de nombreux symptômes incluant des douleurs chroniques qui ont un fort impact sur la qualité de vie des patients, entre autre, en aggravant les autres symptômes connus dans ces pathologies. Nous cherchons à comprendre certains mécanismes dans le cerveau qui induisent le développement de ces douleurs chroniques car ce n’est pas connu à l’heure actuelle. Comprendre les mécanismes de développement de ces symptômes est une première étape essentielle pour pouvoir ensuite développer des stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces. Ces travaux auront également pour bénéfice de mettre en lumière l’existence de ces symptômes, encore peu reconnus lors de la prise en charge clinique de ces pathologies, en particulier chez les patients Alzheimer.
Procédures
1) L’ensemble des souris participeront à des tests comportementaux, pour évaluer leurs capacités sensorielles pouvant être impactées par les modèles pathologiques (un test tous les deux jours pendant 15 jours, durée 5 à 30 minutes). 2) La mise en place du modèle de souris parkinsoniennes se fait par chirurgie du cerveau (1 chirurgie de 30 minutes incluant l'anesthésie). 3) Sur une partie des souris, l'activité des neurones du cerveau sera évaluée nécessitant une chirurgie du cerveau (1 chirurgie de 40 minutes incluant l'anesthésie). 4) Sur une partie des souris, l'étude permettant de colorer les neurones pour mieux connaitre leur organisation nécessite une chirurgie du cerveau (1 chirurgie de 30 minutes incluant l'anesthésie).
Impact sur les animaux
- L’ensemble des souris participera à des tests comportementaux qui peuvent induire un stress léger lors du déplacement des animaux vers les salles expérimentales et induire une douleur légère lors de l’évaluation des seuils de douleur des souris. - La mise en place du modèle de souris parkinsoniennes se fait par chirurgie du cerveau pouvant induire un stress modéré lors du déplacement des souris vers la salle chirurgicale, lors de l’anesthésie et du réveil post-chirurgical. - Le modèle de souris parkinsoniennes implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur induisant une perte de poids. - Le modèle de souris Alzheimer présente des défauts de mémorisation à partir de l’âge de 8 mois. - Les deux évaluations mesurant l'activité des neurones du cerveau peuvent induire un stress léger lors du déplacement des animaux vers les salles expérimentales.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyse des tissues.
Remplacement
Il n'existe aucune alternative expérimentale nous permettant d'éviter l'utilisation d'animaux vivants pour évaluer les transmissions de signaux naturels dans le cerveau tels que dans ce projet. Les études comportementales prévues ne peuvent se faire que sur des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe de manière à le réduire au maximum tout en garantissant la validité statistique des résultats, et sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été estimé par des expériences antérieures ayant permis d’obtenir un nombre de données sur chaque animal suffisant pour réaliser les analyses statistiques prévues. Les souris seront testées individuellement (une souris par jour) et les résultats analysés rapidement suite au test. Si les résultats obtenus permettent de conclure nos hypothèses, l’ensemble des animaux prévu ne sera pas utilisé.
Raffinement
1) Les souris auront une semaine d'habituation à la salle où elles sont hébergées avant de commencer les expériences. 2) Les souris seront habituées à la nouvelle pièce expérimentale une heure avant la réalisation des tests évaluant le comportement des souris et ceux permettant l'étude de l'activité des neurones afin de réduire le stress léger lié aux changement d’environnement. 3) Les tests comportementaux mesurant les seuils de douleur des animaux seront arrêtés dès les premiers signes de gênes de la souris. 4) les chirurgies sur le cerveau seront effectuées sous anesthésie générale avec une double couverture anti-douleur (générale et locale). 5) Un soin spécial (hydratation et nourriture enrichie) est mis en place pour limiter l'impact du modèle parkinsonien sur la perte de poids des souris. 6) les souris Alzheimer présentent des problèmes de mémoires à partir de l'âge de 8 mois et un vieillissement précoce à partir de l'âge de 12 mois. Les souris utilisées dans ce projet ne seront pas testées après l'âge de 8 mois pour minimiser l'impact de la pathologie sur leur bien être. 7) une échelle de cotation basée sur des signes indicatifs de gêne ou de douleur sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir le point limite, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles génétiquements modifiés mimant certaines pathologies humaines. Dans le cas des souris Alzheimer, le modèle génétiquement modifié de ce projet exprime des mutations génétiques connues chez l'humain impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie. De plus, les parties du cerveau impliquées dans la mémoire sont les mêmes chez la souris et chez l'homme. Le modèle de souris parkinsoniennes est également justifié par des similarités des parties du cerveau impactées dans la maladie de Parkinson. Nous utiliserons des souris adultes de 3, 6 et 8 mois pour évaluer l’impact du développement de la pathologie sur la sensibilité à la douleur et le fonctionnement des parties du cerveau impliquées dans la réduction de la sensation de la douleur chez les souris Alzheimer et parkinsoniennes.
Elevage de rongeurs développant un modèle d’immunodéficience (1/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 3000
Expédiés vers d'autres laboratoires, gardés pour un usage interne ou mis à mort selon les besoins de l'élevage, 901 000 souris et 3 000 rats immunodéficients vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Leur seule procédure décrite est une biopsie sur animal vigile pour le génotypage, l'essentiel de l'activité étant la reproduction, la fécondation in vitro et la cryoconservation des gamètes sur deux établissements. Ces rongeurs sont dépourvus de défenses immunitaires pour accepter sans les rejeter des greffes de tumeurs ou de cellules humaines, ce qui les rend sensibles à la moindre contamination et impose un élevage sous barrière sanitaire. Le porteur écrit avoir calculé les effectifs sur son savoir-faire et ses données historiques, et précise qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.
Objectifs
Dans le développement de la recherche pour traiter les maladies humaines, les modèles de souris dépourvues d’un système immunitaire, c’est-à-dire des éléments du sang permettant de lutter contre les infections et les tumeurs sont devenus de plus en plus nombreux. Ce sont des souris immunodéficientes, donc dépourvues d’un système de défense contre des éléments étrangers au corps de la souris. Grâce à un système immunitaire très faible, ces modèles de souris peuvent recevoir des morceaux d’organes, des morceaux de cancers, ou les éléments du sang d’autres espèces comme l’Homme sans que ces éléments étrangers soient attaqués et détruits par le système de défense de la souris. Le but de ce projet est d’élever ces modèles de souris immunodéficientes afin de pouvoir les utiliser dans des projets qui peuvent imiter toutes sortes de maladies humaines. Ces animaux pourront servir par exemple à comprendre comment certaines maladies fonctionnent, à chercher des nouveaux traitements contre le cancer. Ces animaux peuvent aussi servir à reconstituer dans le corps de la souris un système de défense contre les microbes (système immunitaire) provenant de l’Homme pour étudier des maladies touchant le système immunitaire humain, ou pour trouver des traitements utilisant ce système de défense humain. De nouvelles méthodes dans le domaine de la lutte contre le cancer utilisent justement le système de défense humain et lui apprennent à attaquer les cancers afin de les détruire. Cela peut donc être reconstitué dans le corps de la souris, avec un système immunitaire humain, et un cancer humain, avant d’être testé chez des personnes atteints de cancer. Ces animaux dépourvus de système de défense contre les éléments étrangers sont susceptibles de développer dans la nature des maladies, c’est pourquoi elles sont élevées dans des conditions sanitaires élevées afin qu’elles ne soient pas malades. Les animaux issus de cet élevage pourront servir dans notre établissement à créer certains modèles, comme les modèles avec un système immunitaire humain, ou alors pourront être directement redirigés vers d‘autres centre de recherche qui pourront les utiliser dans le cadre de leurs recherches spécifiques, comme la recherche contre le cancer ou la recherche sur les maladies du système immunitaire humain.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux présentant des déficiences immunitaires à divers degrés et par des voies différentes provoquées par la délétion qualitativement ou quantitativement d'un ou plusieurs gènes. Certains modèles sont génétiquement modifiés afin de les rendre plus immunodéficients et de leur permettre de tolérer des tissus ou des cellules d’autres espèces, notamment humains. Ces modèles de souris et de rats permettent de reconstituer un système immunitaire humain, et permettent la greffe de tissus humains, comme des tissus tumoraux, au plus proche de la maladie humaine, et sont donc très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques dans le domaine de la cancérologie et de l’immunité.
Procédures
Les souris et les rats sont immunodéficients donc sans certaines cellules de l’immunité impliquées dans la défense de l’organisme contre les microorganismes extérieurs (pathogènes, opportunistes). Ces animaux sont maintenus dans des structures avec un niveau sanitaire élevé (SOPF signifiant sans une liste de pathogènes et d'opportunistes) afin de ne pas développer de phénotype dommageable. Pour certains animaux, une biopsie est réalisée sur animal vigile pour son génotypage. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, EU1 pour l'élevage et EU2 pour les prestations de sciences de la reproduction (accouplement, fécondation in vitro, et cryopréservation des gamètes).
Impact sur les animaux
Les animaux sont immunodéficients et sont donc particulièrement sensibles aux organismes extérieurs (microorganismes pathogènes, opportunistes) pouvant amener des infections et une dégradation de leur état.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur ou utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort (gestion de l'élevage).
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de cancers ou de maladies auto-immunes ou de maladies infectieuses, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
L’hébergement est réalisé dans des conditions sanitaires élevées SOPF, c’est-à-dire exemptes d’organismes pathogènes ou opportunistes. Dans ces conditions, les animaux ne déclarent pas de pathologie liée à leur immunodéficience. Un hébergement standard est réalisé (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Pour des lignées particulièrement fragiles, un enrichissement complémentaire est mis en place (matériel de nidification supplémentaires) et les densités au sevrage peuvent être diminuées. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Une attention particulière est apportée aux barrières sanitaires et aux contrôles sanitaires permettant de garantir le statut sanitaire SOPF nécessaire au maintien en bonne santé de ces souches immunodéficientes. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris et des rats sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Etablissement de données de référence hématologiques et d’imagerie médicale chez la Poule pondeuse
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Soixante-dix minutes d'anesthésie générale d'affilée et un prélèvement de 10 mL de sang : 13 poules pondeuses vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, et toutes seront réutilisées dans un autre projet. Elles reçoivent un cathéter dans la veine de l'aile ou de la patte, passent un scanner de 5 minutes puis une IRM d'une heure, une première prise de sang étant faite sur animal vigile. L'objectif est de constituer des images et des valeurs de référence chez la poule, de mesurer l'effet de l'isoflurane sur les paramètres sanguins et de tester en éprouvette la compatibilité des sangs entre individus. Le porteur justifie l'espèce par la demande croissante de soins vétérinaires pour les poules gardées comme animaux de compagnie, la médecine d'élevage étant selon lui inadaptée à un individu unique.
Objectifs
Les poules domestiques voient leur popularité augmenter auprès des particuliers qui ne les considèrent plus seulement comme animal de production mais aussi comme animal de compagnie. Il y a donc une demande de plus en plus forte d’un niveau élevé de soins vétérinaires pour ces animaux. Néanmoins, la majorité des connaissances vétérinaires chez cette espèce provient de la médecine d’élevage, inadaptée à la gestion d’un individu unique ou d’un petit groupe d’individus. Les images normales et mesures de référence chez la poule ont récemment été décrites pour les techniques de radiographie et d’échographie. A l’heure actuelle, il n’existe dans la littérature scientifique aucune étude s’intéressant à la pratique d’imagerie avancée (Tomodensitométrie TDM et Imagerie par résonnance magnétique IRM) chez la poule, en dehors d'une étude de 1989 sur la TDM. Cependant la résolution de l’examen à l'époque rend cette étude peu utile en pratique. Les autres études TDM chez la poule se concentrent sur un organe particulier (appareil respiratoire, rate, certains os) mais aucune ne décrit les résultats pour une région entière (cavité abdominale, squelette complet, etc…),ce qui est essentiel pour l’interprétation clinique. Pour l’IRM, les données chez la poule sont quasi inexistantes . Aucune étude ne compare les résultats de ces deux techniques complémentaires par le type de tissu présentant la meilleure résolution. Il y a donc un réel besoin d’études décrivant l’anatomie normale de la poule utilisant ces deux techniques afin de permettre leur utilisation et interprétation optimales en clinique. Par ailleurs, s’il est connu que l’anesthésie gazeuse à l’isoflurane affecte les paramètres hématologiques des mammifères, cela n’a été que peu étudié en médecine aviaire, et aucune donnée n'est disponible pour la poule. La connaissance de ces potentielles altérations revêt une importance certaine dans la surveillance anesthésique et la planification du risque chez cette espèce. Enfin, la compatibilité sanguine inter-individuelle en vue d'une transfusion est peu étudiée chez les oiseaux (groupes sanguins non décrits). Une première étape est donc l'étude de compatibilité des sangs (via des tests de mélange de sangs in vitro) pour évaluer la présence ou non d'incompatibilité entre individus de cette espèce.
Bénéfices attendus
L’objectif est de réaliser des examens d’imagerie TDM et IRM chez des poules saines afin de pouvoir décrire les images normales chez cette espèce et comparer l’apport en clinique des deux techniques d'imagerie. Ces résultats pourront servir de point d’ancrage à de futures études portant sur le diagnostic spécifique d'affections en utilisant les techniques TDM et IRM. Cette étude permettra par ailleurs d’évaluer l’effet de l’anesthésie gazeuse sur les paramètres hématologiques de la poule afin d’adapter au mieux en pratique la surveillance anesthésique et la planification du risque anesthésique chez cette espèce. Enfin, cette étude permettra d’évaluer l’existence ou non d’incompatibilité transfusionnelle entre divers individus et pourra servir d’étude préliminaire pour une étude plus poussée sur l'existence d’éventuels groupes sanguins chez cette espèce.
Procédures
Placement d’un cathéter intraveineux dans la veine ulnaire ou métatarsienne médiale (3 min environ) puis examen d’imagerie médicale (scanner 5 min) et IRM (60 min) sous la même anesthésie générale (soit un total d’environ 70 min d’anesthésie générale). 2 prélèvements sanguins (1 min à chaque fois, 0,2 et 10 mL respectivement), un vigile, le 2ième se faisant au cours de l’anesthésie générale mentionnée ci-dessus.
Impact sur les animaux
Une douleur légère est attendue lors de la ponction sanguine préanesthésique, ainsi qu’un léger stress lié à la 1ère contention et la manipulation des animaux (en maintenant les ailes plaquées au corps). Une douleur légère liée la piqûre pour mise en place du cathéter et la seconde prise de sang en fin de procédure (effectuées sous anesthésie générale) peut éventuellement être ressentie. Mort à l’anesthésie possible bien qu’extrêmement rare avec des animaux sains et de cet âge. Le réveil anesthésique chez les oiseaux est très rapide et les animaux retrouvent un comportement normal dans les quelques minutes suivants l’arrêt de l’anesthésie gazeuse.
Devenir
La procédure prévue n’aura aucun impact à court, moyen ou long terme sur l’état de santé de l’animal permettant donc sa réutilisation dans un autre projet, ce dernier étant de classe modérée.
Remplacement
Les objectifs de l’étude étant de décrire l’anatomie par imagerie TDM et IRM de la poule, l’effet de l’anesthésie gazeuse sur les paramètres hématologiques de cette espèce et la possible existence d’incompatibilité transfusionnelle chez cette espèce, il n’est pas possible de substituer un modèle non animal. L’utilisation pour la bonne interprétation de l’examen d’imagerie d’un produit de contraste, nécessite par ailleurs que l’animal soit vivant et l’étude de l’effet de l’isoflurane sur des paramètres sanguins ne peut de même se faire que sur un animal vivant.
Réduction
Le calcul du nombre d’individus à inclure a été réalisé sur l’objectif de comparaison des paramètres hématologiques avant et après l’anesthésie gazeuse. Réalisé à partir de tests statistiques, ce calcul révèle qu’un nombre de 12 individus est suffisant pour révéler une différence d’hématocrite jugée cliniquement significative. Ce nombre permet également la réalisation d'un nombre préliminaire de tests in vitro de compatibilité sanguine suffisant pour évaluer l’existence ou non de réactions. Enfin, concernant l’étude d’imagerie, les poules utilisées dans l’étude seront toutes de la même race et donc du même format. Ce nombre de 12 permettra de rapporter des valeurs indicatives pour chacunes des mesures d’imagerie et d’évaluer la concordance de certaines de ces mesures entre les deux techniques d’imagerie. Cependant, et bien que non attendu, un 13ième individu est prévu mais ne sera utilisé qu'en cas d'exclusion d'un individu de l'étude.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en enclos collectif, en groupe homogène, en cycle jour/nuit avec minimum 6h de nuit, dans une animalerie dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés. Ils bénéficient d’une période d’acclimatation de 7 à 10 jours, mises à profit pour habituer les poules à la présence de l’Homme et à leur manipulation lors des opérations de change et lors de la collecte des œufs. Sont mis à disposition dans la salle comme enrichissement de la litière en copeaux de pin permettant les activités de fouissage, des perchoirs (au moins 30 cm par poule), des disques compacts suspendus et des pondoirs (1 pour 2-3 poules) et au moins 4 points d’eau. Les poules sont observées quotidiennement pendant leur hébergement puis deux fois par jour pendant 3 jours après une anesthésie. Afin de limiter le stress, les examens d’imagerie et les prises de sang (sauf la 1ère) sont réalisés sous anesthésie générale. Ainsi, aucun stress ou douleur n’est attendu autre que le stress de la manipulation et la douleur légère pouvant être ressentie lors des ponctions de veine sous anesthésie générale. Seule la 1ère prise de sang sera réalisée sur animal vigile. Mais dans tous les cas, l’application d’un anesthésique local sous forme de gel en regard de la veine à ponctionner sera préalablement réalisée. Les fréquences cardiaques et respiratoires sont surveillées pendant toute la durée de l’anesthésie et des points-limites précoces ont été définis basés sur ces paramètres amenant à une action graduée.
Choix des espèces
Les poules domestiques constituent l’espèce-cible pour laquelle ce projet a été développé (application clinique directe). Des poules adultes seront utilisées car cela correspond à la situation la plus fréquemment rencontrée en clinique vétérinaire.
Elevage de souris immunodéficientes pour étudier le développement de cancers humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Dépourvues de système immunitaire par construction, donc exposées à toute infection bactérienne ou virale, 7 030 souris sont élevées cinq ans durant pour fournir des receveuses de greffes de cellules cancéreuses humaines. Leur seule procédure déclarée est la mise en accouplement, répétée sur plusieurs cycles, dans un niveau de souffrance léger. Elles vivent en confinement sous atmosphère filtrée, en isolateur ou en cage ventilée, manipulées aux gants et à la pince désinfectée. Toutes sont tuées à la fin de l'élevage, le porteur indiquant qu'elles seront alors trop âgées pour être placées dans d'autres procédures.
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier les mécanismes biologiques impliqués dans le développement normal et pathologique de différents types de cellules humaines, en particulier de certains cancers humains, comme les cancers du sang appelées leucémies. Certaines expériences, par exemple, nécessitent la transplantation de cellules humaines malades chez les animaux, pour créer des modèles expérimentaux in vivo permettant d’étudier et de traiter le développement du cancer ciblé par de nouvelles stratégies thérapeutiques, potentiellement applicables dans le futur aux patients. Ces projets reposent donc sur la greffe de cellules humaines normales ou cancéreuses, issues de patients, qui ont besoin d'une environnement particulier pour se développer, sans être rejetées pour le système immunitaire de l'hôte (ici la souris) transplanté. On parle de xénogreffe. Nous réalisons ces élevages localement afin de pouvoir disposer de souris bien intégrées dans leur environnement, non stressées par un voyage, en nombre suffisant et que nous avons préalablement testées pour leur capacité à accepter les greffons humains.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont de disposer de modèles animaux murins de qualité, en bonne santé, non stressées et bien intégrées dans notre animalerie, que nous avons testées au préalable pour être de bonnes receveuses de cellules humaines normales et cancéreuses, permettant d'avoir des résultats scientifiques reproductibles rapidement et donc d'utiliser moins d'animaux. En outre, la production locale de ces trois lignées pourra aider à comprendre plus rapidement comment traiter des cancers pour lesquels à l’heure actuelle les traitements sont à améliorer. Le fait de les produire en local permet aussi un gain de temps dans l’étude et la recherche de traitement.
Procédures
Les souris seront mises en accouplement pour plusieurs cycles de reproduction pendant les 5 ans de la procédure.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées sont immunodéficientes (sans système immunitaire), elles sont donc théoriquement sensibles aux infections bactériennes et virales. Les effets indésirables pourraient être en lien avec une infection (amaigrissement, poil terne, isolement, changement de comportement lors de l’allaitement)
Devenir
Les souris utilisées pour la reproduction seront euthanasiées en fin de procédure d'élevage car ces animaux seront trop âgés pour être replacés dans d'autres procédures expérimentales.
Remplacement
Les projets que nous développons étudient le développement physiologique normal et pathologique du sang (notamment le développement de certains cancers du sang comme les leucémies). Quand cela est possible nous réalisons des expériences de culture cellulaire. Toutefois certains aspects ne peuvent pas être réalisés dans une boite de culture (in vitro) car ils nécessitent d’être étudiés dans un organisme entier et font notamment appel à la complexité des interactions entre cellules dans un organe entier ou entre différents organes qu'il n'est pas possible de générer autrement que dans un modèle animal. Il n'y a donc pas d'alternative non animale aux élevages de ces souris, même si nous faisons de notre mieux pour étudier les questions déjà ex-vivo avant de poser des questions in-vivo.
Réduction
Nous essayons de rationaliser notre production d'animaux, donc de ne pas avoir trop de couples en route, afin d'éviter une sur-production par rapport à la demande pour les projets en cours. Si les productions de souriceaux sont optimales pour répondre aux besoins des projets expérimentaux, nous régulons la production en diminuant le nombre de couples. Le nombre d’animaux prévu pour ces élevages dépend des projets de recherche dans lesquels ils sont utilisés. Nous l'avons calculé en prenant comme base des travaux de recherche réalisés au sein de notre laboratoire sur les dernières années et en essayant de programmer au mieux nos futurs projets.
Raffinement
Les souris immunodéficientes sont élevées et accouplées en confinement, sous atmosphère filtrée, donc exempt de pathogènes, soit en isolateur, soit en cages de portoir ventilé. Les changes des cages sont réalisés sous poste de sécurité microbiologique afin de réduire au maximum les risques de contact avec des agents infectieux. L'eau de boisson est une eau filtrée en bouteille du commerce et l'alimentation est stérilisée par irradiation. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées avec des gants et des pinces aseptisées à l'alcool.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris qui sont des mammifères de petite taille à l'âge adulte, faciles à élever et à reproduire en captivité. Leurs génétique et comportement sont bien connus ce qui permet de mesurer facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux en captivité et d'y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques adossés aux élevages. Dans ce protocole nous avons besoin de souris adultes, en âge de reproduction, qui sont une espèce bien intégrée. Les souches de souris que nous élevons n'ont pas (ou peu) de défense immunitaire ce qui permet à des greffons cellulaires d'origine étrangère (nous travaillons avec des cellules humaines normales et cancéreuses et on parle de xénogreffe) de s'implanter et de se développer.
Etude de la discrimination des perceptions dans un modèle de Schizophrénie chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer jusqu'à trois mois en restriction hydrique cinq jours par semaine et deux heures par jour en contention. Les procédures vont du niveau léger au niveau sévère, que subissent 440 d'entre elles. S'y ajoutent une biopsie de la queue, une chirurgie stéréotaxique de trois heures pour injecter et implanter dans le cerveau, six à vingt-et-une injections intrapéritonéales, jusqu'à neuf anesthésies gazeuses et trois tests nommés, exploration, anxiété et attention, ce dernier de 45 minutes. Le porteur annonce l'identification de "cibles thérapeutiques nouvelles et précises" pour les troubles neuropsychiatriques, quand la soif et la perte de poids provoquées par la restriction en eau sont, elles, décrites au présent.
Objectifs
Percevoir avec précision la réalité extérieure est essentiel à notre survie. En particulier, les modifications de la perception sont une des caractéristiques majeures de la plupart des troubles neuropsychiatriques et neurodéveloppementaux, eux-mêmes source de souffrance et d’exclusion sociale. Bien qu'elles soient fondamentales, les bases biologiques d'une perception précise ou altérée sont très peu comprises. Dans cette étude, nous allons étudier le rôle du cerveau dans la perception. Nous évaluerons les mécanismes qui conduisent au fonctionnement et au dysfonctionnement des neurones, grâce à l'utilisation d'un modèle de souris à haut risque de troubles neuropsychiatriques. Cette recherche fera progresser nos connaissances limitées sur la façon dont les troubles neurodéveloppementaux modifient les circuits neuronaux sensoriels et affectent ainsi la perception. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de cmprendre l’implication du cerveau dans la mémoire sensorielle chez la souris, modèle bien adapté pour mimer la physiologie et certains aspects de la pathologie humaine. L’utilisation de modèles murins transgéniques appropriés apportera des données au niveau cellulaire, anatomique et fonctionnel en identifiant les structures cérébrales mises en jeu. Mieux comprendre ces structures permettra d’appréhender les processus de mémorisation et de perception, mais aussi une meilleure compréhension des maladies psychiatriques dans lesquelles ils sont altérés. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.
Procédures
Biopsie de queue: 1 fois de moins d'une seconde. Injection sous-cutanée : 3 fois pour la chirurgie stéréotaxique, durée 5 secondes. Chirurgie pour injection stéréotaxique intracérébrale et implantation, 1 fois d'environ 3 heures. Etudes du comportement, 1 fois chacun: d’exploration (10 minutes), d’anxiété (10 minutes) et d’attention (45 minutes), répartis sur 2 à 3 jours. Regime hydrique: 5 jours/semaine, de 2 semaines à 3 mois. Contention pendent comportement de perception: 1 fois/jour d'environ 2 h, pour 5 jours pendent 2 semaines à 3 mois. Injection intra-péritonéale: 6-21 injections, durée 5 secondes, 1 fois/jour. Anesthesie gaseouse légér avec reveil: 5-9 fois de 15-45 minutes, 1 foi/jour.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue peut entraîner une douleur légère de courte durée. L’anesthésie peut entraîner un stress léger de courte durée. Les injections intrapéritonéales d’anesthésiques et d’analgésiques peuvent entraîner un stress léger de courte durée. Une douleur modérée peut être associée à l’acte chirurgical. Les taches comportementales peuvent entraîner un stress modéré. Le régime de restriction hydrique entraine de la soif et une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort: 1) pour prélever le cerveau en vue d'études physio-histologiques sur les souris expérimentales; 2) à la fin de la période de reproduction chez les souris utilisées pour les croisements.
Remplacement
Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Des analyses a priori de puissance statistique permettent de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. D'autres tests statistiques a posteriori choisis en fonction des distributions des populations nous permetent de comparer les moyennes et identifier des différences deux à deux entre groupes expérimentaux et génotypes. Les tests statistiques permettent également de trouver des corrélations entre les variables étudiées.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux de plusieurs animaux afin d'éviter tout stress produit par un isolement social, dans un environnement avec matériel pour faire un nid. L’état de sante des animaux et leur accès à l’eau et nourriture sont surveillés quotidiennement. La chirurgie et le post-opératoire se déroulent dans des conditions qui protègent la santé de l'animal, en lui protégeant de l’hypothermie grâce à un tapis chauffant et de la déshydratation avec une du serum physiologique. Des analgésiques sont utilisés avant et après la chirurgie, et sur les jours suivants. A la fin de la chirurgie, après le réveil complet, l'animal est replacé dans sa cage collective avec de la nourriture et de l'eau ad libitum. Les animaux sont habitués à leur manipulation afin de réduire leur stress.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour l'exploration du comportement car les régulations cellulaires mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies cellulaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Pour les expériences, nous utiliserons des souris adolescentes et adultes entre 5 semaines et 8 mois car c'est au cours du jeune âge adulte que la plupart des altérations de la perception sensorielle apparaissent dans les troubles neurodéveloppementaux.
Influence de la race et de la répartition des apports nutritifs au cours de la lactation sur les réserves corporelles, leurs variations et l’aptitude des vaches laitières à produire et se reproduire en système herbager
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
150 vaches laitières de trois races vont être utilisées pendant deux ans dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, et toutes restent en vie à l'issue. Elles sont bloquées au cornadis pour douze prises de sang, pesées chaque semaine et notées chaque mois sur leur état corporel. L'expérience consiste à faire varier leurs apports énergétiques à différents moments de la lactation, pour mesurer comment elles mobilisent leurs réserves, produisent du lait et se reproduisent. Le porteur rattache ce travail à la durabilité des élevages et revendique de montrer aux éleveurs que la conduite d'un grand troupeau à l'herbe est possible en France.
Objectifs
Cette expérimentation pluriannuelle prévue sur 2 ans (2024-2026) vise à évaluer le rôle des réserves corporelles et de leur gestion différenciée au cours de la lactation sur la carrière et les performances des vaches laitières. En début de lactation, les vaches laitières mobilisent plus ou moins leurs réserves corporelles pour pallier au déficit énergétique, conséquence d’une capacité d’ingestion insuffisante. Ces réserves corporelles sont par la suite reconstituées afin de préparer la lactation suivante. Le début de lactation correspond aussi chez les bovins à la période de reproduction qui se déroule entre 40 et 90 jours de lactation afin d’obtenir, si possible un veau par an. Or, un excès de mobilisation des réserves corporelles, en durée et/ou en intensité, s’avère défavorable au succès des différentes étapes de la reproduction (reprise de cyclicité, expression des chaleurs, fécondation, nidation, …). La mobilisation des réserves corporelles dépend de nombreux facteurs, plus ou moins maitrisables et influencés par l’éleveur. Parmi ceux-là, l’état corporel au vêlage, le potentiel de production laitière (notamment la race) et le niveau des apports alimentaires en début de lactation sont des leviers d’action possibles. Si des recommandations existent en matière d’état corporel optimum aux diverses étapes du cycle lactation-reproduction, les règles de gestion mises à la disposition de l’éleveur pour assumer ces objectifs recommandés sont quasi inexistantes. Il importe donc de mieux décrire l’influence de ces réserves corporelles, les facteurs de variation et de définir des moyens d’action, notamment au travers la conduite alimentaire et la répartition des apports au cours de la lactation. L’objectif de cette expérience est donc de moduler l’état corporel des vaches laitières grâce à des niveaux d’apports énergétiques différents à divers moments de la lactation chez 3 races laitières aux aptitudes différentes
Bénéfices attendus
L'alimentation des vaches laitières en système herbager est un axe fort de la durabilité des élevages français, tant du point de vue de la réduction de l'empreinte carbone de l'élevage que de sa contribution à la biodiversité et la qualité des paysages grâce aux prairies. Ce projet vise justement à apporter aux éleveurs des indicateurs clés de la conduite de ces systèmes, à partir d'une analyse multicritères. Ce projet vise aussi à montrer aux éleveurs que la conduite d'un grand troupeau à l'herbe est possible en France.
Procédures
Pour la caractérisation fine des animaux, des prélèvements sanguins seront effectués 12 fois au cours de l’expérimentation sur les femelles, maintenues au cornadis. Les mesures de poids (une fois par semaine) se feront sans geste technique autre que le déplacement et la contention des animaux. Pour la mesure de la note d'état, les vaches seront maintenues au cornadis une fois par mois. Voici le temps estimé pour chaque acte : Prise de sang : 2 minutes Mesure du poids : 1 minutes Mesure de la note d'état : 5 minutes
Impact sur les animaux
la principale nuisance attendue sur les animaux est liée à la contention nécessaire aux différentes procédures décrites. Celle-ci est minime puisque les animaux sont habitués dès le plus jeune âge aux manipulations. A celle-ci s'ajoute également la douleur possible liée à la prise de sang.
Devenir
Les procédures n’entravent pas le devenir de l’animal et n’ont qu’un effet limité et de court terme sur son bien-être. Aussi, l’ensemble des animaux inclus dans cette expérimentation va poursuivre une vie normale d’un animal de rente dans un troupeau de bovins laitiers.
Remplacement
Les mécanismes étudiés mettent en jeu des interactions complexes au sein de l'animal, en interaction avec le système d'élevage qu'il est impossible de reproduire dans un modèle cellulaire, de culture d'organe ou in silico.
Réduction
Les analyses statistiques prévisionnelles, intégrant de l’espérance d’écart entre traitements et la variabilité inter vaches connue, ont permis de définir le nombre minimum d’animaux nécessaires par lot expérimental, à savoir un effectif de 50 vaches par race. La pluri-annualité de cette expérimentation permet d’autre part de réduire l’effectif nécessaire chaque année et limite les besoins en renouvellement, donc la réforme des animaux.
Raffinement
Chaque intervention a été pensée de manière à limiter les nuisances pour les animaux (limitation des volumes de sang prélevés, vaches bloquées en groupe au cornadis pour limiter le stress…) . Les procédures impliquées dans le projet sont de sévérité légère et appliquées par des opérateurs expérimentés. Les conditions d'hébergement et d'alimentation répondent aux normes d’élevage en intérieur avec une aire paillée et une ration de fourrages en accès libre ad libitum. La majeure partie de l'année, les animaux sont au pâturage, non restreints et avec un accès à l'eau et à l'ombre dans toutes les parcelles grâce aux nombreux arbres implantés dans et autour des parcelles. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. La prophylaxie et le traitement des animaux en cas d’affection ne sont pas modifiés par la mise en oeuvre du projet. Tout animal présentant un trouble de santé sera soigné en fonction de la pathologie conformément aux pratiques de l'élevage, et, au besoin, le vétérinaire praticien sera consulté. Les animaux sont gardés en vie en fin d'expérimentation.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est le bovin. Il s’agit de femelles de race Holstein, Jersiaise et Normande, grandes races laitières françaises (et internationale pour la Holstein et la Jersiaise). Ces animaux ne sont pas transgéniques et ont été obtenus par des méthodes de reproduction utilisées en élevage classique. Les animaux seront des adultes en lactation car la production de lait est nécessaire pour répondre aux questions scientifiques.
Test de molécules innovantes pour le traitement de la narcolepsie de type 1 chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tester des molécules développées par des compagnies pharmaceutiques sous contrats de confidentialité, 440 souris privées du gène de l'orexine vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes subissent à six jours une coupe du bout de la queue pour génotypage. Cent vingt d'entre elles sont ensuite opérées deux heures sous anesthésie générale pour recevoir un implant, puis gavées avec les molécules testées, et quatre-vingts subissent en plus une privation de sommeil de 48 heures. Le porteur écrit que tous les animaux des deux procédures sont tués et leur cerveau prélevé, quand les données déclarées avec le résumé comptent 220 souris rendues à l'élevage.
Objectifs
Les patients atteints de narcolepsie de type 1 (avec cataplexie) ont une qualité de vie très dégradée. A ce titre, il est nécessaire de développer des traitements ciblés et efficaces. A ce jour, tout développement de nouveau traitement nécessite d’être testé sur un modèle animal avant d’envisager des tests chez l’homme. Ce projet est développé dans le cadre de contrats de confidentialités et de collaboration. La narcolepsie-cataplexie est une maladie neurologique rare qui se caractérise par une hypersomnolence pendant la journée et une intrusion de composantes du sommeil paradoxal pendant l’éveil. Nous avons montré que cette pathologie est la conséquence de la dégénérescence des neurones à hypocrétine aussi connus sous le nom d’orexine. Les neurones à hypocrétine sont des neurones de l’éveil ayant une double action. Ils activent tous les systèmes d’éveil et suppriment le sommeil. L’un des symptômes majeurs est la cataplexie. Les épisodes de cataplexie sont des pertes de tonus musculaire pendant l’éveil, qui peut conduire à la chute, à des blessures. Aussi, le développement d’un traitement ciblé et original, permettant de supprimer la somnolence et les cataplexies, facile à prendre et avec peu ou pas d’effets secondaires, est une nécessité afin d’améliorer la qualité de vie des patients, réduire le coût sociétal lié à la pathologie et de réduire les risques de trauma chez les patients d’autant plus qu’ils avancent en âge. Plusieurs compagnies pharmaceutiques travaillent sur le développement de molécules originales qui agiraient sur les récepteurs à hypocrétine/orexine. L’efficacité d’une première molécule a été récemment publiée mais a engendré une certaine toxicité. D’autres molécules ont donc besoind’être testées.
Bénéfices attendus
Le bénéfice est majeur puisque notre projet permettra de sélectionner une molécule efficace qui induira de l’éveil, reduira la fragmentation du sommeil et abolira les cataplexies. Elle pourra alors être envisagée pour le développement d’un traitement de la narcolepsie de type 1.
Procédures
Tous les animaux (n=440) seront soumis, à l’âge de 6 jours, à un prélèvement d’un bout de la queue pour génotypage. Un peu plus de 25 % de ces animaux (n=120) seront ensuite soumis, à l’âge adulte, à une seule intervention chirurgicale sous anesthésie générale avec réveil, d’une durée estimée à 2h. Quatre-vingt d’entre elles subiront également à l’âge adulte une restriction de sommeil pendant 48h. Les molécules thérapeutiques seront données par gavage sur animal vigile à toutes les souris sélectionnées (n=120).
Impact sur les animaux
Tous les animaux (n=440) seront d’abord génotypés. Cette procédure induit des nuisances du fait de la manipulation de l’animal, et qu’un petit bout de queue est coupé. Les souris sélectionnées ayant le bon génotype (n=120) subiront à l’âge adulte une chirurgie implantatoire, sous anesthésie générale. Les nuisances attendues sont la manipulation de l’animal avant la chirurgie, la chirurgie elle-même, la récupération de l’anesthésie générale en post-opératoire ainsi que la douleur post-opératoire due à la plaie. Dès la veille de la chirugie et pendant toute la procédure, les souris sélectionnées seront maintenues en cage individuelle du fait de leur implant. La nuisance attendue est l’isolement. Quatre-vingt des 120 souris sélectionnées subiront également à l’âge adulte une restriction de sommeil. Les nuisances attendues sont le manque de sommeil. Les molécules thérapeutiques seront données par gavage à toutes les souris sélectionnées. Les nuisances attendues sont la manipulation de l’animal pendant le gavage et le gavage lui-même.
Devenir
Tous les animaux des 2 procédures seront mis à mort. Les cerveaux seront ensuite prélevés post mortem pour analyse.
Remplacement
Il s’agit d’une étude pré-clinique nécessaire pour tester chez l’animal vivant l’effet des molécules en amont de tout test clinique. Le sommeil et les cataplexies sont des phénotypes complexes mettant en jeu de nombreuses structures cérébrales et plusieurs organes (cerveau, muscles) nécessitant pour son étude l’animal entier. Les cataplexies sont déclenchées par des émotions positives, leur étude nécessite donc que l’animal soit vigile. Aucun modèle in vitro ne permet à ce jour de remplacer l’animal vigile pour l’étude de ces comportements.
Réduction
Nos données expérimentales précédentes montrent que 10 souris sont nécessaires pour l’obtention d’une puissance statistique suffisante. Les enregistrements de sommeil des souris seront organisés et archivés sur notre serveur central. Nous générerons ainsi une base de données qui permettra à terme de réduire le nombre d’animaux puisqu’elle sera utilisée comme référence et contrôle pour les projets suivants sur ce même type d’animaux et de problématique similaire. Les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests d’analyses statistiques afin de valider de façon robuste et objective les variations observées.
Raffinement
Pour minimiser le stress individuel et maintenir les interactions sociales, les souris sont hébergées par groupes dans leur pièce de vie. Cependant, si un individu est agressif il est alors séparé du groupe. Le cas échéant, les animaux séparés sont placés dans une cage double munie d’un séparateur grillagé. De cette façon, les animaux ne sont pas totalement isolés et peuvent interagir avec leurs congénères sans toutefois pouvoir s’agresser mutuellement. Des enrichissements systématiques sont mis en place pour le bien-être de l’animal. Un jour avant la chirurgie sous anesthésie générale et pour toute la durée de la procédure, les animaux sont séparés, 1 par compartiment dans une cage double et suivis régulièrement avec une attention quotidienne lors de la phase postopératoire (suivi du poids, de la mobilité et du comportement) grâce a l’utilisation d’une grille de score post-opératoire. Notre préoccupation est d’évaluer quotidiennement, grâce aux fiches de scorage, l’évolution des paramètres physiologiques afin de détecter toute dégradation de l’état de santé général. Celles-ci constituent le point limite des expérimentations avec mise à mort des animaux pour prévenir toute souffrance.
Choix des espèces
La souris orexin-knock-out est un modèle animal reconnu de la pathologie étudiée. Elle exprime l’ensemble des symptômes observés chez l’homme. Dans tous les cas, il s’agira de souris adultes (10-12 semaines au début de la procédure) ayant atteint leur maturité cérébrale, possédant déjà un système locomoteur mature, un cycle circadien et ultradien veille-sommeil stabilisé et consolidé, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et d’une manière générale dans la littérature chez la souris dans ce domaine des neurosciences.