Procédures légères

Un score de 2 sur un seul critère clinique, ou de 4 sur la somme des critères, déclenche la mise à mort. 2 205 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 885 d'entre elles et modéré pour 1 320. Elles reçoivent de la vincristine, un anticancéreux qui abîme les nerfs périphériques, puis subissent dix séries de tests de sensibilité tactile aux filaments de von Frey, de sensibilité thermique sur plaque chauffante et de coordination au rotarod, auxquelles s'ajoutent dix mesures électrophysiologiques sous isoflurane avec des stimulations de 4 à 10 millivolts. Le projet porte sur les douleurs neuropathiques, et le porteur écrit qu'aucun analgésique ne sera administré parce qu'il fausserait les résultats, tout en affirmant que les souris traitées à la vincristine "ne présenteront pas de phénotype de douleur".

Objectifs

Ce projet vise à étudier des mécanismes responsables de l’apparition des douleurs neuropathiques, en particulier dans le cadre de neuropathies toxiques comme dans les traitements chimiothérapeutiques à la Vincristine. Ce projet est justifié par la mauvaise compréhension actuelle des mécanismes à l’origine de ces douleurs qui altèrent considérablement la qualité de vie des patients. Ce projet permettra d’étudier les réponses immunitaires mises en jeu, d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de faire le parallèle avec une étude clinique menée en parallèle chez les patients. Pour vérifier le rôle de certains acteurs, certaines molécules et inhibiteurs seront administrés à des souris traitées à la vincristine.

Bénéfices attendus

Notre laboratoire possède une expertise reconnue dans les modèles de développement de neuroinflammation chez la souris. Cette étude comparative, s’intéresse aux développements de neuropathies inflammatoires et toxiques, dont les mécanismes impliqués sont encore très mal compris. Nos résultats pourront améliorer nos connaissances pré-cliniques du développement de ces douleurs neuropathiques et permettront de transposer ces connaissances vers la clinique. Nous souhaiterions identifier de nouveaux biomarqueurs et permettre la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les humains.

Procédures

Les douleurs neuropathiques des animaux traités à la vincristine seront évaluées par des tests de la sensibilité tactile avec les filaments de Von Frey, de la sensibilité thermique avec la plaque chauffante et de la coordination motrice avec le rotarod. Chaque test sera réalisé 10 fois tout au long des 2 mois maximum de suivi de l'animal. Des mesures d'électro-neuromyogramme seront également réalisées par l’utilisation d’un dispositif de stimulation et de recueil dédié aux mesures électrophysiologiques. Pour cela l’animal sera maintenu endormi sous isoflurane et sur un tapis chauffant tout au long de la mesure. Les stimulations seront réalisées à des voltages progressifs de 4mV à 10mV. Les mesures seront brèves, 10 minutes par animal en intégrant l'installation des électrodes et les stimulations. Comme pour les tests comportementaux, les mesures électrophysiologiques seront réalisées 10 fois tout au long des 2 mois maximum de suivi des animaux.

Impact sur les animaux

Le modèle de développement de neuropathies toxique (Vincristine) va conduire à des inflammations périphériques et centrales, associées à une atteinte des nerfs périphériques. Cette atteinte transitoire du SNP est responsable d'une modificatuin des sensibilités tactile et thermique, sans atteinte des capacités motrices. Ces symptômes des neuropathies, similaires à ceux observés chez l’Homme, se maintiendront environ 2 à 3 semaines après le début des injections. Aucune données de la littérature n'a démontré le niveau de stress des animaux durant cette période inflammatoire. Néanmoins, nous limiterons la manipulations des animaux au minimum durant cette période. Par la suite, les symptômes vont se résorber spontanément en une à deux semaines jusqu'à ce que les animaux retrouvent une sensibilité tactile et thermique normales.

Devenir

Mise à mort des souris pour l'ensemble des 5 procédures. Pour chaque procédure, les souris utilisées en série 1 permettront la réalisation d'une étude comportemntale longitudinale, avec une mise à mort à la fin. Pour les séries 2 à 4, les souris seront utilisées pour la réalisation de prélèvements tissulaires à différents temps pertinents de l'expérience vis à vis des mécanismes cellulaires qui nous intéressent.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental afin d’étudier l’inflammation et la pathologie nerveuse (destruction des gaines de myéline, neuro-inflammation et infiltration cellulaire) au niveau de l’organisme entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico. Dans le cadre de ce projet s’intéressant au développement des douleurs neuropathiques et mécanismes associés, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires périphériques et centrales et ses conséquences sur le système nerveux périphérique. Néanmoins, nous avons identifié récemment les neutrophiles comme cellules majeures du développements des douleurs neuropathiques, ces cellules sont actuellement isolées à partir de moelle osseuse de souris et/ou de sang total humain pour être cultivées et étudiées in vitro. Bien que les expériences in vitro soient utilisées dès que possible, aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et la communication cellulaire entre les différents acteurs de la réponse immunitaire. Actuellement, l’expérimentation animale est la seule alternative pour comprendre les interactions des systèmes nerveux/immunitaires et d’examiner la pathologie au niveau moléculaire, cellulaire et comportementale, aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou in silico.

Réduction

Notre objectif est de conserver une analyse statistique robuste tout en réduisant le nombre d’animaux par lot. - L’étude comportementale est l’approche qui nécessite le plus d’animaux afin de valider la significativité de nos résultats : le groupe de souris traitées comportera n=15 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux pour le groupe contrôle (souris naïves) à n=10. -L’étude par dosages immunologiques sera réalisée à différents temps stratégiques tout au long des 2 mois : des dates de prélèvements sont prévus afin d’obtenir un profil immunologique recouvrant toute la période d’expérimentation. Nous réduisons le nombre d’animaux par prélèvement à n=10 souris/groupe C57Bl6 et n=5/groupe KO. -L’étude histologique, comme pour les dosages, sera réalisée à différents temps de l’expérience : 8 points de prélèvements sont prévus afin de comprendre la dynamique histologique dans notre modèle. De même, nous réduisons le nombre de prélèvements à n=5 souris/chaque groupe. -L’étude d’isolement et caractérisation cellulaire par cytométrie en flux sera également réalisée à différents temps de l’expérience : 9 points de prélèvements sont prévus afin d’identifier des mécanismes cellules spécifiques. De même, nous réduisons le nombre de prélèvements à n=10 souris/groupe C57Bl6 et n=5/groupe KO. Pour comparer de manière pertinente les groupes expérimentaux souris contrôles vs souris traitées, une analyse statistique nous a permis de déterminer le nombre suffisant d'animaux à utiliser.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage à cap standard au nombre maximum de 6 souris par cage avec une période d'adaptation de 7 jours minimum, idéalement 14 jours. Nous disposerons dans les cages dès le début de l'expérience, deux types d'enrrichissement, l'un pour la réalisation du nid et le second pour satisfaire le besoin des souris de ronger. En accord avec la SBEA, nous ferons varier chque type d'enrichissement pour limiter l'habituation et l'ennui des animaux. Selon nos expériences antérieures, soutenues par les données de la littérature, les animaux injectés avec la Vincristine ne présenteront pas de phénotype de douleur comme la prostration, les poils hérissés et la paralysie. Nous ne prévoyons pas d’administrer des analgésiques car ils pourraient influencer et donc invalider les résultats expérimentaux. Par exemple, le paracétamol, l'aspirine ont un effet inflammatoire sur le foie notamment. La morphine n'est pas indiquée car elle induit une dépression de la fonction pulmonaire. La dexamethasone ou les médicaments non-stéroidiens de type inhibiteur de Cox2 ou de prostaglandine tels que l’ibuprofen ou le diclophenac interfèrent avec l'inflammation. Une grille de score clinique sera renseignée pour l'injection de la vincristine et une seconde grille pour les injections des modulateurs, afin d’évaluer les éventuels signes de souffrance (prostration, poils hérissés, perte de poids...). Selon nos expériences antérieures, soutenues par les données de la littérature, les animaux injectés avec la Vincristine ne présenteront pas de phénotype de douleur visible, avec une prise alimentaire normale et donc sans perte de poids. Les animaux seront mis à mort dès que le point limite sera atteint, soit un score de 2 pour l’un des critères, soit un score de 4 sur la somme des critères.

Choix des espèces

La souris de fond génétique C57BL/6 est un modèle reconnu dans le cadre des études des pathologies neurologiques. L’existence de nombreuses lignées transgéniques, dont les lignées cGAS ou STING -/- que nous utiliserons, et la disponibilité d’outils moléculaires spécifiques (eg. Anticorps spécifiques, sondes moléculaires…) ont apporté ces dernières années une meilleure compréhension des neuropathologies et ont conduit aux développements de nouvelles pistes thérapeutiques. Les animaux utilisés seront âgés de 8 à 24 semaines afin d’avoir un système immunitaire et un système nerveux matures et des comportements adultes.

Mesurer si des crues simulées modifient la morphologie et la nage des jeunes truites : 400 truites fario sont utilisées, 160 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 240 dans des procédures modérées, toutes tuées à l'issue. Chacune est marquée à l'élastomère coloré sous anesthésie, élevée trois mois en chenal expérimental, la moitié subissant des simulations de crue, puis capturée par pêche électrique et testée une heure en milieu contrôlé. Le porteur décrit la pêche électrique et le marquage comme stressants sans surmortalité constatée par le passé, et rappelle que les simulations restent d'une amplitude inférieure aux crues naturelles. La mise à mort sert à prélever les pièces sclérifiées situées près du cerveau et des nageoires pour identifier les familles, les résultats étant destinés à alimenter une réglementation sur la franchissabilité des obstacles qui ignore aujourd'hui les juvéniles.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer l’impact d’événements hydrologiques extrêmes sur le développement morphologique des poissons (Salmonidés), pouvant entrainer des modifications fonctionnelles tel que le comportement, les performances de nages et la prise alimentaire. Le changement climatique se traduit entre autres par l’augmentation de la fréquence, de l’imprévisibilité et de l’intensité d’événements hydrologiques affectant l’ensemble des écosystèmes de rivière (physico-chimique, nourriture disponible, habitat disponible, sédimentologie...). Au-delà des éventuelles réponses adaptatives, de telles variations de débits peuvent à court terme affecter précocement les patrons développementaux des jeunes Salmonidés, conditionnant ainsi leur morphologie. Etant donné les fortes contraintes morpho-fonctionnelles des organismes, un tel changement de morphologie est suspectée pouvoir modifier le comportement des individus, leurs performances locomotrices et de dispersion précoce, notamment en lien avec les pièges thermiques. À plus long terme, une survie différentielle peut conduire à la sélection de poissons présentant des morphotypes particuliers, des comportements et des performances spécifiques, affectant la trajectoire évolutive et la dynamique des populations, possiblement en lien avec leur capacité de résistance/persistance. Il est ainsi nécessaire de mieux comprendre ces mécanismes et leurs interactions dans la gestion des populations face au changement climatique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se rapportent à l’écologie et l’évolution des poissons juvéniles soumis à des événements extrêmes d’hydrologie dans une perspective de changement climatique. L’expérience permettra de quantifier 1) l’effet d’événements hydrologiques sur le développement (morphologie) et la dispersion des juvéniles. 2) Comment cette morphologie affectée par de tels évènements climatiques peut changer les aptitudes phénotypiques des poissons (dispersion, morphologie, comportements et capacités locomotrices). 3) Déterminer si ces aptitudes phénotypiques conditionnent les capacités de dispersion dans les cours d’eau, notamment en relation avec la franchissabilité d’obstacles. 4) Nous pourrons également mettre en évidence si les variations phénotypiques observées résultent d’un processus de plasticité phénotypique ou d’adaptation, permettant une meilleure mise en perspective des trajectoires évolutives des populations de poissons menacées face au changement climatique. 5) Enfin, les capacités des juvéniles à franchir des barrières naturelles ou artificielles de hauteurs (saut) vitesses (nage) variées pourront alimenter la réglementation concernant les Informations sur la Continuité Écologique (ICE) et plus particulièrement l’évaluation de la franchissabilité d’obstacle qui ne prends aucunement en compte les juvéniles dans l’évaluation.

Procédures

Les animaux seront soumis à un marquage individuel d’une durée de quelques secondes sous anesthésie, selon un mode opératoire ne durant pas plus de 5 minutes entre le début de l’anesthésie et le réveil. Ce marquage coloré sera conservé par le poisson durant toute l’expérimentation. Durant les 3 premiers mois de croissance en chenal expérimental, la moitié des poissons seront soumis à des simulations d’événement hydrologique d’une amplitude moindre que ceux naturellement subit dans des milieux naturels. Après cela, les individus seront collectés une seul fois à l’aide d’une pêche électrique dans le but d’étudier leurs comportements et leurs capacités locomotrices en milieu contrôlé (2 séquences de test ne durant pas plus d’une heure au total, subit une seule fois par individu).

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles pour les animaux concernent la capture/recapture au moyen d’une pêche électrique. Les individus se remettent généralement très rapidement de cette pêche conduite par une équipe technique expérimentée, sans séquelles ni effets indésirables. Le marquage individuel sous anesthésie par V.I.E est également stressant mais a souvent été réalisé par le passé sur ces jeunes stades, n’occasionnant pas de surmortalités. Les tests comportementaux prévus en milieu contrôlé (aquarium/auge) peuvent également induire au moment de la manipulation un stress modéré qui sera spécifiquement suivi afin de ne pas altérer les résultats. Enfin, les simulations d’événement hydrologique au sein du chenal sont d’une amplitude moindre que ceux naturellement subit dans les cours d’eau dont sont issus les poissons.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de l'expérience, afin de réaliser les prélèvements nécessaires pour le phénotypage. En plus des thématiques déjà présentées, l’analyse des pièces sclérifiées (situées dans des capsules otiques, près du cerveau) sera réalisé et nécessite la mise à mort des individus. De plus, des prélèvements de nageoires seront réalisés pour la détermination génétique des familles (géniteurs).

Remplacement

Ce projet s’intéresse aux interactions entre les individus vivants et leur environnement. Il est donc indispensable de travailler sur des organismes intégrés, entiers et en interaction (aucune possibilité de substitution par organoïdes ni approche in silico). Le modèle d’étude choisi est la truite fario Salmo trutta, espèce commune avec un statut de préoccupation mineure. Elle est abondante en France et possède un pouvoir invasif important dans certaines régions du monde. Afin de minimiser l'impact sur les populations naturelles, les poissons utilisés seront issus de pisciculture produisant des individus proches de ceux retrouvés à l’état sauvage.

Réduction

L’expérimentation présentée ici se divise en deux procédures dont chacune d’elle portera sur des individus ayant grandi dans des conditions hydrologiques contrastées (traitement avec hydrologie stable Vs. hydrologie variable). Les deux effectifs utilisés (240 pour la procédure 1 et 160 pour la procédure 2) correspondent à un strict minimum permettant de répondre aux attentes scientifiques (étude de la réponse morphologique, notamment par origine/géniteurs/biefs) tout en accommodant des contraintes techniques (méthode de morphométrie géométrique). De plus, les effectifs ont été définis de façon à ce que les analyses statistiques envisagées présentent une puissance suffisante.

Raffinement

La première phase de l’expérimentation aura lieu dans un chenal expérimental conçu pour la croissance des salmonidés. Les alevins avec vésicule vitelline seront enfouis dans le substrat afin de créer une émergence directement dans le chenal et de ne pas induire de stress supplémentaire par le changement de milieu au cours du début de la vie. Cela permet également aux individus de se nourrir naturellement à partir de la communauté d’invertébrés ayant naturellement colonisé le milieu environnant. Chaque groupe de 60 individus sera maintenu dans un bief du chenal pour une densité de 2,14 individus/m², similaire à celle observée en milieu naturel pour les truites 0+. Le chenal est alimenté par l'eau du ruisseau adjacent, avec la même qualité physico-chimique (jugée trés bonne) et la même densité en ressources alimentaires. Le marquage par injection d'élastomère et la biométrie seront effectués sous anesthésie, à l’aide de matériel adapté (micro-aiguille), par une équipe expérimentée, selon un mode opératoire ne durant pas plus de 5 minutes entre le début de l’anesthésie et le réveil. Durant cette période, leur peau sera maintenue humide grâce à l’utilisation d’un textile imbibé. Les individus seront gardés en observation dans un lieu de réveil afin de contrôler la bonne récupération suite à l’anesthésie. La capture par pêche électrique sera réalisée par une équipe expérimentée et habilitée avec un matériel et un champ électrique adapté aux juvéniles de salmonidae. Si plusieurs passages de pêche sont nécessaires pour capturer les poissons, ils seront espacés d’une demi-journée afin de ne pas créer des stress répétitifs proches dans le temps. La seconde phase de l’expérimentation en milieu contrôlé sera réalisée dans des aquariums alimentés par de l’eau du ruisseau adjacent avec la même qualité physico-chimique. Les principaux paramètres physico-chimiques seront cependant régulièrement suivis (plusieurs fois par jours) pour s’assurer de cela et l’eau sera continuellement oxygénée à l’aide de bulleurs. L’eau de chaque aquarium expérimental sera partiellement renouvelée entre le passage de chaque poisson. Durant cette étape, il n’est pas possible d’amener d’enrichissement dans les aquariums, faute de quoi le suivi vidéo des mouvements ne serait pas possible. La durée du test est cependant réduite au maximum (15 minutes) afin de limiter le stress induit.

Choix des espèces

La truite fario Salmo trutta est une espèce d’eau froide, faisant d’elle un modèle dans l’étude des réponses adaptative des populations aux changements climatiques. De plus, elle possède un fort intérêt culturel (pêche de loisir), économique (consommation, aquaculture) et écologique (trait d’histoire de vie, variabilité intra-spécifique et aire de répartition). C'est par ailleurs une espèce modèle en écologie évolutive, et l'interprétation des résultats obtenus dans ce projet bénéficiera de l'abondante bibliographie. Dans le cadre de cette étude, des mécanismes de plasticités phénotypiques de l’espèce ont déjà pu être observés. Enfin, la reproduction artificielle de cette espèce est bien maîtrisée, ce qui permet d'utiliser des individus issus de piscicultures, proches des populations sauvages, plutôt que d’affecter des stocks naturels. Les animaux utilisés seront des alevins au stade 0 + (en fin de résorption vitelline au début de l’expérimentation puis juvéniles en fin d’expérimentations 4 mois plus tard). Il s’agit du stade où les processus développementaux permettent la plus importante croissance relative, la plus à même de conduire à des remaniements phénotypiques structurels pérennes qui pourront affecter l’écologie des poissons sur le long terme.

Jusqu'à deux chirurgies cérébrales de une à six heures par animal, six injections espacées de 48 heures, une heure de tête maintenue fixe pour présenter des odeurs juste devant le nez : 3 630 souris adultes subissent ces procédures, dans un projet qui mobilise 9 860 souris au total, 6 230 à un niveau de souffrance léger et 3 630 à un niveau modéré. Le protocole consiste à séparer brièvement des souriceaux de leur mère, parfois sous sédation, et à observer ce que la mère fait d'eux ou de leur odeur, pour situer le rôle de l'ocytocine dans le cortex olfactif. Les 3 630 femelles adultes sont tuées pour prélever leur cerveau, et 1 700 souriceaux le sont aussi faute de pouvoir survivre sans leur mère. Les 4 530 souriceaux restants sont gardés vivants et "proposés à la communauté des utilisateurs" de l'établissement pour un usage futur.

Objectifs

L’ocytocine est une molécule libérée par les neurones du cerveau, connue pour son rôle dans la lactation et lors de l’accouchement. Cependant, des études récentes montrent que l’ocytocine a aussi une action sur le cerveau lui-même, et que cette action favoriserait les comportements sociaux et maternels. Ainsi, l’ocytocine est considérée comme une hormone ayant un effet « pro-social » mais ses mécanismes d’action sont encore méconnus. L’objectif de cette étude est de comprendre comment l’ocytocine agit sur les neurones du cerveau lors des comportements maternels. Chez la plupart des mammifères, l’olfaction joue un rôle central pour les interactions entre individus et en particulier entre adultes et leurs progénitures. Chez la souris, le cortex olfactif présente une densité exceptionnelle de récepteurs à l’ocytocine par rapport à d’autres régions cérébrales, notamment chez les femelles, avec une densité accrue chez les mères par rapport à des femelles vierges. Aux vues de cette forte expression chez les mères, nous faisons l’hypothèse que l’ocytocine dans le cortex olfactif est impliquée dans les comportements maternels chez les souris femelles. Pour tester cette hypothèse, nous réaliserons des expériences de comportement en présence de souriceaux âgés de 1 à 10 jours ou de leurs odeurs, et nous manipulerons la transmission ocytocinergique dans le cortex olfactif pour tester le rôle de l’ocytocine dans ces comportements. Nous enregistrerons également l’activité des neurones du cortex olfactif en parallèle de la respiration lors de ces expériences. Nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. Le grand nombre de neurones enregistrés via cette méthode nous permettra de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des tests statistiques et des études pilotes pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires à nos expériences. Pour tester le rôle de l’ocytocine, nous ciblerons les neurones qui libèrent de l’ocytocine ou bien ceux qui répondent à l’ocytocine. Pour cela, des injections d’agents pharmacologiques seront nécessaires et nous devrons faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau grâce à des adénovirus injectés au préalable. Nous quantifierons l’expression des comportements maternels et l’activité des neurones tout en veillant au bien-être des souris et souriceaux.

Bénéfices attendus

Chez les Mammifères, la mise en place des comportements maternels est essentielle pour la survie des petits et de l’espèce en général. Chez l’Homme, il est notamment connu que le lien entre mère et enfant est facilité par la neurohormone nommée oxytocine, libérée dans la circulation sanguine de la mère lors de l’accouchement. Nous savons également que les odeurs jouent un rôle important et bénéfique dans le lien entre mère et enfant, un lien qui peut être affecté dans certaines situations, notamment lors de certains accouchements par césarienne (les taux d’oxytocine libérés sont alors plus limités). Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cerveau s’adapte lorsqu’il s’agit de mettre en place des comportements maternels et le rôle des odeurs dans ce processus. A terme, il pourrait permettre de mettre en place des stratégies pour faciliter l’établissement de ces comportements chez l’Homme dans des situations problématiques liées à la maternité. Cette perspective est d’autant plus réaliste que l’administration d’ocytocine par voie intranasale est déjà réalisée chez des enfants autistes pour améliorer leurs relations sociales.

Procédures

Les souris seront utilisées lors de tâches comportementales en présence de souriceaux ou de leurs odeurs. Ces tâches de courte durée (1h environ) auront lieu quotidiennement pendant les phases d’expérimentation (durée maximum de 2 mois). Notre étude nécessitera de réaliser des injections (moins de 3min par injection/jour, environ 6 injections par souris espacées d’un minimum de 48h) chez les souris adultes. Avant les tâches, les souris seront progressivement habituées aux injections et à la contention associée. Dans une série d’expérience, afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir leur tête en position fixe au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. La durée de contention par maintien de la tête n'excédera pas 1h et sera réalisée après une habituation progressive. Afin de comprendre le fonctionnement du cerveau lors des tâches réalisées, certaines souris seront équipées d’implants cérébraux qui permettent d’enregistrer l’activité de dizaines de neurones en cours de comportement. L’implantation de ces équipements et la réalisation de ces expériences nécessitent la réalisation de chirurgies en amont des tâches (maximum 2 chirurgies par animal, durée 1-6h). A la fin de l'expérimentation, les souris seront soumises à une perfusion afin de préserver les tissus cérébraux et d'effectuer des contrôles histologiques (durée de la procédure inférieure à 20min, réalisée sous traitement anesthésique et analgésique).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet seront mises en présence de souriceaux (ou d’odeurs de souriceaux) et nous observerons leur comportement pour quantifier leur capacité à en prendre soin. Les souriceaux pourront être brièvement séparés de leur mère le temps de réaliser ces tests, ce qui correspond à un stress modéré car réduit dans la durée. Pour limiter ce stress, il sera parfois possible de sédater ou anesthésier les souriceaux, ce qui nécessite d’injecter des substances médicamenteuses via des injections sous-cutanées réalisées à l’aide d’aiguilles très fines. Afin de pouvoir tester le rôle de l’ocytocine dans ces comportements, nous utiliserons des méthodes qui permettent de cibler les neurones capables de libérer de l’ocytocine ou bien les neurones qui répondent à l’ocytocine lorsqu’elle a été libérée. Pour cela, nous devrons faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau des souris adultes grâce à l’expression d’adénovirus injectés au préalable et des injections d’agents pharmacologiques seront nécessaires. Ces injections représentent potentiellement une légère nuisance pour les animaux car elles nécessitent de les maintenir immobiles pendant la durée de l’injection (contention). Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. Un hébergement en cage individuelle enrichie sera parfois nécessaire pour éviter que ces électrodes ne soient pas détruites par les congénères. Les souris pourront être connectées via un câble fin au système d’enregistrement ce qui peut générer une légère gêne. De plus, les odeurs étant très volatiles, il nous faudra maintenir la tête des souris proches de la source d’odeurs dans certaines expériences, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée.

Devenir

L’euthanasie des 3630 souris adultes en fin d’expérimentation sera nécessaire pour prélever leur cerveau et faire l’analyse post-mortem des tissus cérébraux. Cette procédure sera réalisée par des expérimentateurs compétents et soucieux du bien-être animal, sous anesthésie profonde avec le degré d’analgésie recommandé par les services vétérinaires. La mise à mort sera ainsi indolore pour les animaux, avec une perte de conscience rapide. Les souriceaux seront aussi mis à mort à la fin des procédures si les mères ne peuvent pas être gardées en vie jusqu'au sevrage car ils ne peuvent être gardés en absence de leur mère (1700 souriceaux concernés). Il est possible de retarder l’euthanasie de la mère pour attendre le sevrage et ensuite les replacer au sein de la communauté des utilisateurs. Si la mère n’est pas utilisée pour des contrôles histologiques, les souriceaux seront gardés en sa présence et proposés à la communauté des utilisateurs pour une utilisation future potentielle, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés dans l’établissement (4530 souriceaux concernés).

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements maternels : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 9860 (3630 souris adultes et 6230 souriceaux) sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris dans des tests comportementaux différents, avec ou sans intervention sur le système ocytocinergique. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences et raffiner notre approche statistique.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début des tests comportementaux, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment aux contentions et injections). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésie et analgésique permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent. Les femelles accouplées seront séparées des mâles et mises en compagnie des « accompagnantes » dès l’arrêt de l’accouplement. Si une accompagnante est agressive, elle sera immédiatement remplacée. Lors des tâches comportementales : si des comportements agressifs envers les petits sont détectés, l’expérience sera immédiatement interrompue. Les souriceaux seront maintenus sur tapis chauffant pour les courtes périodes inter-essais, dans les rares cas où ils ne pourraient pas être retournés à leur mère. Ils seront frottés avec le matériau de leur nid d’origine avant d’être rendus à leur mère afin de favoriser leur ré-intégration (suivi de leur bien-être et points limites définis au préalable).

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans une fonction cognitive complexe, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’effet positif de l’ocytocine sur les comportements sociaux a notamment été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme. Les odeurs jouent un rôle important dans le lien mère-progéniture, aussi bien chez l'Homme que chez la Souris. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Des souriceaux seront utilisés comme stimuli au cours des expérimentations car elles visent à comprendre les bases neurobiologiques des comportements maternels.

Greffer à des souris le microbiote fécal de patients déprimés pour voir si la dépression se transmet par l'intestin : 240 souris mâles sont utilisées, 60 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 180 dans des procédures modérées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau et séquencer leur microbiote. Elles reçoivent des gavages, des recueils de crottes en cage de collection, puis une série de tests censés mesurer un comportement de type anxieux et dépressif. Le second volet compare deux antibiotiques, la minocycline qui franchit la barrière hémato-encéphalique et la sarécycline qui ne la franchit pas. Le porteur qualifie les nuisances de modérées et le stress des tests de léger, annonce des points limites "précoces" appliqués strictement, et laisse les tests eux-mêmes sans nom, leur durée allant de cinq minutes à trois jours.

Objectifs

Dans le contexte de l'axe intestin-cerveau (soit le lien bidirectionnel entre notre intestin et notre cerveau), notre hypothèse est que le microbiote intestinal pourrait jouer un rôle central dans le développement de la dépression et l’anxiété. Pour tester cette hypothèse, nous utiliserons d’abord un modèle de souris « humanisé », les souris recevront alors du matériel fécal provenant soit de sujets sains soit de patients déprimés. . Suite à la greffe fécale, le comportement des souris sera évalué dans une série de tests visant à mesurer les comportements de type anxieux et dépressif. Ceci nous permettra d’évaluer le rôle causal du microbiote dans la symptomatologie dépressive et anxieuse. Ensuite, nous nous concentrerons sur les potentielles propriétés antidépressives de certains antibiotiques. Plus précisément, la minocycline est un antibiotique qui traverse facilement la barrière hémato-encéphalique (BHE, la barrière qui protège le cerveau) et dont l'effet antidépresseur serait lié à ses propriétés anti-inflammatoires au niveau du cerveau. À ce jour, il reste à déterminer si les effets antidépresseurs de la minocycline passent en partie par le microbiote intestinal. Pour tester cette hypothèse, nous utiliserons un modèle de souris anxio-dépressif (modèle de souris CORT) qui repose sur l’administration de la corticostérone, tout en comparant les effets de la minocycline et de la sarecycline (un antibiotique de la même classe qui ne traverse pas la BHE). D’un point de vue général, ce projet pourrait déboucher sur de nouvelles stratégies ciblant le microbiote pour le traitement de la dépression.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer l'impact du microbiote intestinal sur la réponse au traitement et d'identifier des bactéries candidates qui pourraient être utilisées comme adjuvants pour la réponse au traitement. Ce travail offre une occasion unique d'élargir nos connaissances dans le domaine hautement compétitif de l'axe intestin-cerveau. Les connaissances générées par ce projet seront, à long terme, bénéfiques pour la communauté scientifique, les industries alimentaires et pharmaceutiques et le grand public, en réduisant le fardeau économique considérable lié à la gestion de la santé mentale.

Procédures

Une partie des souris recevront des gavages. Un gavage dure approx 10 secondes. Nous effectuerons des recueils fécaux (3 crottes) sur animal vigil, dans des petites cages de collection (5 min max). Des tests comportementaux seront effectués sur les animaux afin d’évaluer le comportement de type anxio-dépréssif. Chaque souris fera chaque test une fois pendant la durée du protocole. La durée des tests comportementaux varie entre 5 minutes et 3 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux sont modérées. Les tests comportementaux n’induisent pas de douleur mais un stress léger. Le gavage pour les transplantations fécales sera fait par des chercheurs expérimentés, réduisant donc le risque d’une fausse route ou de lésion mécanique. Néanmoins, bien que le geste technique soit maitrisé par les expérimentateurs, il peut y avoir exceptionnellement des lésions mécaniques.

Devenir

Suite au dernier test comportemental, les souris seront euthanasiés pour analyse post mortem des cerveaux et le séquençage du microbiote.

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances modéliser in vitro ou in silico les mécanismes biologiques des troubles anxio-dépressifs n’est pas possible. En effet, il s’agit de relier le microbiote aux désordres centraux qui peuvent associés. Par ailleurs, dans le cadre de ce présent projet, il s’agit d’évaluer également la participation des bactéries intestinales et de la barrière digestive dont le système nerveux entérique. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier les interactions entre ces différents organes, le microbiote intestinal et le comportement anxio-dépressif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique, en se basant sur la littérature précédente dans le même domaine.

Raffinement

Au cours des semaines une surveillance quotidienne sera entreprise pour veiller au bien-être des animaux (quantité de boisson et de nourriture adéquats). Un suivi du poids des animaux, de la qualité de la fourrure des animaux et de la quantité de boisson ingérée sera pratiqué de façon hebdomadaire (poids, fourrure) ou tous les trois jours (prise de boisson). Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués tout au long du projet.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la pathologie dépressive sont proches de ceux observés chez l’homme. Cette espèce est largement utilisée dans la littérature comme modèle. Le modèle de rongeur rendu dépressif par l’administration chronique de corticostérone dans l’eau de boisson a été développé et validé au sein du laboratoire chez la souris. Nous n’utilisons que des souris mâles afin de pallier les éventuelles perturbations induites par le cycle oestrien. Les animaux seront des adultes âgés de 6-8 semaines au moment de la réception, comme nous sommes intéressés par les effets comportementaux à l’âge adulte.

Concilier carrière sportive et carrière reproductive des juments de valeur, et ramener en France une technique de fécondation in vitro que les éleveurs vont chercher à l'étranger : 80 équidés sont utilisés, 20 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 60 dans des procédures modérées. Les donneuses subissent une à deux ponctions folliculaires par voie vaginale sous sédation, environ 40 minutes chacune, les receveuses une injection de synchronisation, toutes six échographies. Le porteur décrit une douleur ponctuelle malgré l'anesthésie, une inflammation ou une douleur pelvienne possible ensuite, et des risques d'infection locale ou de saignement interne. Aucune jument n'est tuée, toutes sont gardées vivantes et réutilisées pour d'autres protocoles, dans un projet que le porteur rattache aux "coûts de production" de la filière équine, la sauvegarde de races locales menacées venant ensuite.

Objectifs

Depuis 60 ans la filiere équine cherche à optimiser la reproduction des equidés afin de concilier carriere sportive et reproductive. La superovulation n'étant pas fiable dans l'espèce équine, le taux de récupération des embryons est d'environ 75 % et le taux de gestation attendu après transfert est d'environ 50 à 75 %. Une seconde option consiste à produire des embryons in vitro. Cette étude concerne le développement de 2 techniques de production in vitro d’embryons : 1) intra Cytoplasmic Sperm Injection (ICSI) par injection d’un spermatozoïde dans le cytoplasme de l’ovocyte. Dans l'espèce équine cette procédure, qui nécessite un équipement de micromanipulation coûteux et un personnel expérimenté, est la seule technique qui permet actuellement une production in vitro efficace d'embryons équins dans un cadre clinique mais elle n'est pas disponible en France. Les éleveurs français qui ont recours à cette technique doivent donc envoyer les ovules collectés dans différentes cliniques étrangères. 2)FIV (Fécondation in Vitro) : récemment une méthode a été mise au point, permettant le développement d'embryons. Des taux élevés de blastocystes ont été obtenus et la naissance de trois poulains en bonne santé a été rapportée par une équipe américaine. Tout en offrant une excellente occasion d'étudier les aspects fondamentaux de la fécondation, l'application pratique de la FIV dans un cadre clinique pose encore des défis supplémentaires : 1) jusqu'à présent, la FIV n'est possible qu'avec du sperme fraîchement éjaculé, alors que la flexibilité et le potentiel d'application du sperme refroidi ou congelé-décongelé sont bien plus importants ; 2) seule une longue période de pré-incubation des spermatozoïdes de 22 heures a permis de réussir la FIV 3) avec seulement trois poulains nés, on sait peu de choses sur les effets à long terme de la FIV utilisant ce protocole de traitement du sperme sur la santé du poulain, ou sur la différence entre la FIV et l'ICSI en termes d'épigénétique L'objectif de ce projet est donc d'établir et de valider la faisabilité et l'innocuité de la technique de FIV et ICSI, avec du sperme frais et congelé.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet a deux attentes: 1) optimiser la reproduction des équidés. Les coûts de production dans un élevage imposent d'optimiser la gestion des reproducteurs. Lorsque les reproducteurs ont une grande valeur génétique mais sont peu ou pas fertiles, la production d’un embryon nécessite des techniques de procréation assistée. C’est le cas pour des juments ayant des problèmes d’ovulation (le follicule se lutéinise sans libérer l’ovocyte) ou de tractus génital (oviducte ou utérus) empêchant la remontée des spermatozoïdes vers l’ovocyte, le transport de l’embryon vers l’utérus ou son implantation. C’est aussi le cas pour des étalons ayant une semence de mauvaise qualité ou des étalons morts pour lesquels le stock de paillettes congelées ne permet pas d'inséminer un grand nombre de juments 2) participer à la sauvegarde des espèces menacées dont les effectifs sont en constante diminution, au point de mettre en péril certaines races locales (anes:Grand Noir du Berry, chevaux de trait: Boulonnais ...)

Procédures

Des échographies seront réalisées sur tous les animaux (6 répétitions de ce geste par animal); l'acte dure 2 à 3 minutes. Une seule injection sous-cutanée (durée : 10 secondes) sera réalisée chez les juments receveuses pour les synchroniser et permettre le transfert embryonnaire. 1 à 2 ponctions folliculaires pour les donneuses d'ovocytes la durée de l'acte est d'environ 40mm avec la sedations et la préparation au niveau périnéale (la vulve est soigneusement désinfectée, rincée et séchée, la queue est bandée, pose de la sonde urinaire).

Impact sur les animaux

Lors de la ponction folliculaire, les juments peuvent être soumises à plusieurs nuisances. Tout d'abord, la manipulation et la contention nécessaires pour immobiliser l'animal engendrent un stress. Cette ponction, réalisée à l'aide d'une aiguille introduite à travers la paroi vaginale sous guidage échographique, peut occasionner une douleur ponctuelle malgré l’anesthésie. Une sensation de pression peut également être ressentie. Cette pratique peut provoquer des effets secondaires, tels que de la somnolence, une désorientation passagère ou un inconfort transitoire lié à l’anesthésie. Après l’intervention, une légère inflammation ou une douleur pelvienne passagère peut survenir. Les risques de complications incluent des infections locales, des saignements internes rares ou des irritations dues à la manipulation des organes reproducteurs. L’induction de l’ovulation se fait par voie sous-cutanée, ce qui peut générer du stress lors de la contention ainsi qu’une légère douleur au niveau du site d’injection. Lors de la fécondation, la préparation de l’appareil reproducteur et l’introduction d’un cathéter ou d’un endoscope peuvent entraîner un inconfort local. Ces manipulations, parfois répétées, peuvent aussi générer une gêne ou un stress supplémentaire. Bien que rares, des complications comme des infections ou des inflammations utérines peuvent survenir.

Devenir

Tout les animaux sont gardés en vie et réutilisé pour d'autres protocoles après examens vétérinaires

Remplacement

L'objectif est de développer et améliorer une technique de production in vitro d'embryons équins par FIV et ICSI. Le développement de ces techniques peut se faire en partie avec des ovocytes collectés sur des juments abattues dans des abattoirs commerciaux. Toutefois, les résultats obtenus avec des ovocytes collectés dans les abattoirs ou in vivo par ponction folliculaire sont parfois différents. Notre objectif étant de produire des embryons à partir de femelles en carrière sportive ou de femelles subfertiles, nous devons mettre au point et améliorer nos techniques sur des ovocytes collectés in vivo par ponction, sans abattage des animaux. Les embryons équins seront transférés dans des juments receveuses car il n’existe pas actuellement de système in vitro permettant le développement embryonnaire au-delà de 8 jours.

Réduction

Les lot sont établis en fonction du nombre minimal d'animaux requis pour obtenir des embryons FIV et ICSI. Un à trois embryons transférables peuvent être obtenus à la fin de la période de développement in vitro, pour chaque séance de ponction folliculaire d'une jument au début du projet. Grâce à l'expérience, ce chiffre devrait croître.

Raffinement

Notre procédure sera raffinée, minimisant les interventions. Les juments seront logées en bâtiment conventionnel sur aire paillée avec accès au pâturage, en visibilité et contact des congénères pour rendre le plus agréable possible leur environnement expérimental pendant toute la durée du projet. Les ponettes voient plusieurs fois par jours les animaliers et les expérimentateurs qui surveillent attentivement leur comportement. L’enrichissement du milieu est assuré par des brosses, des jeux, des bouts de bois à ronger. Les animaliers ont suivi une formation à la manipulation éthologique des animaux : les animaux sont habitués aux différentes procédures et les vivent sans stress. Les femelles soumises aux ponctions recevront un traitement à base de sédatifs, d'analgésiques, d'anti-inflammatoires et d'antibiotiques. Ce traitement sera précisé dans la description des procédures. Les animaux seront surveillés tout au long des procédures et après les procédures afin d'écarter tout probléme avant leur remise en troupeau.

Choix des espèces

Notre objectif étant d'améliorer les rendements de production et développement in vitro d'embryons équins grâce à la FIV et l'ICSI afin de répondre aux attentes de la filière équine française , nous sommes obligés d'utiliser cette espèce pour notre projet. Nous utiliserons des femelles adultes, pubères et cycliques pour collecter les ovocytes de bonne qualité, aptes à être fécondés (donneuses). Nous utiliserons des femelles jeunes (moins de 10 ans), cycliques pour assumer le développement embryonnaire et la gestation jusqu'au stade 25 jours (receveuses). A 25 jours l'activité cardiaque peut être visualisée lors d'un examen gynécologique. Cette activité est gage de bon développement embryonnaire et viabilité de l'embryon au départ. Toutes les juments gestantes après le transfert embryonnaire seront gardés pour le poulinage.

5 800 souris vont être utilisées pour caractériser une lignée présentée comme modèle de la maladie d'Alzheimer, 4 192 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 1 608 dans des procédures modérées, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Chaque animal testé reçoit dix-huit injections intra-abdominales quotidiennes, répétées à 6 et 12 mois pour une partie des groupes, passe 48 heures seul en cage métabolique à 3, 6, 12 et 16 mois, et doit nager dans un liquide opaque quatre fois par jour pendant cinq jours pour retrouver une plateforme. Les femelles reproductrices reçoivent deux injections d'hormones de superovulation, leurs embryons et leurs nouveau-nés étant prélevés pour des cultures de cellules. Le porteur écrit vouloir mettre en place des cellules issues de patients "dès que cela sera possible" pour remplacer le modèle murin, tout en programmant 5 800 souris sur cinq ans.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer entraîne une disparition progressive des neurones dans les régions du cerveau qui gèrent certaines capacités, comme la mémoire, le langage, le raisonnement ou encore l’attention. Les cellules perdent leurs fonctions, puis meurent. En disparaissant, les neurones ne peuvent plus programmer efficacement un certain nombre d’actions, les pertes de mémoire, troubles du comportement et autres symptômes apparaissent alors. Ainsi, certaines facultés sont altérées et réduisent peu à peu l’autonomie de la personne. Mais si la maladie d’Alzheimer apparaît plus souvent chez les personnes âgées, elle n’est pas pour autant une conséquence normale du vieillissement. Notre projet d'étude consiste à caractériser un nouveau modèle de souris de maladie d'Alzheimer pour mimer au mieux la maladie et donc essayer de comprendre plus précisement tous les acteurs qui sont en jeu. Ce projet de caractérisation comprendra l’élevage du modèle de souris qui nous permettra de définir s'il est affecté ou non par la mort neuronale décrite chez les patients, l'étude de la maladie à l'aide de cultures de neurones et de microglie (les cellules protectrices des neurones) issues des embryons ou nouveau-nés de ces souris et sa caractérisation comportementale, c'est-à-dire le manque de motivation ou de mémorisation des animaux, retrouvées chez les patients, et biochimique (l'étude de tous les acteurs impliqués dans la maladie d'Alzheimer).

Bénéfices attendus

Ce projet devrait apporter des informations importantes sur tous les acteurs impliqués dans la maladie d'Alzheimer dans un modèle de souris mimant au mieux la maladie. Son but est de caractériser une nouvelle lignée, d’un point de vue comportemental (manque de motivation et de mémorisation) mais aussi en étudiant d’importantes étapes de la maladie d'Alzheimer dans le cerveau comme la mort neuronale. A partir de neurones et de microglie (les cellules protectrices des neurones) provenant des embryons ou des nouveau-nés du modèle de souris, nous étudierons également ces mécanismes de dégénérescence. Ce nouveau modèle, encore peu décrit, nous permettra sur le long terme d’étudier plus en profondeur les dysfonctions impliquées dans la maladie d'Alzheimer pour au final une meilleure compréhension de son développement.

Procédures

Les femelles utilisées pour le recueil d'embryons ou de nouveau-nés subiront un traitement par injection intra-abdominale (2 injections de 10 secondes à 48 heures d’intervalle) d'hormones de superovulation pour optiminer la fécondation, soit 2 injections x 1 dans sa vie. Les animaux impliqués dans la caractérisation comportementale (manque de motivation ou de mémorisation) subiront un traitement par injection intra-abdominale (10 secondes) 1x/jour pendant 18 jours (à 6 et 12 mois), soit 18 injections x 2 dans sa vie. Un autre groupe sera traité à 16 mois, soit 18 injections x 1 dans sa vie. Ces animaux subiront également des mesures d’activité et de distance parcourue dans la roue à l'aide de cages métaboliques (à 3, 6, 12 et 16 mois, 2 jours/2 nuits, 48 heures) pour mesurer le manque de motivation. Ils subiront aussi un test de mémoire qui consiste en 5 jours d’apprentissage (4 essais/jour de 60 secondes maximum) où l'animal devra mémoriser où se situe une plateforme dans un récipient avec un liquide opaque, puis un test où la plateforme est retirée, comportant 3 essais d’une minute le même jour. Enfin, 7 animaux de chaque âge et de chaque groupe subiront une anesthésie/analgésie par injection intra-abdominale qui permet d'obtenir rapidement une anesthésie très profonde qui dure entre 30 et 40 minutes pour des perfusions intracardiaques de produits fixants les tissus de l'animal permettant de récupérer leurs cerveaux et d'observer différents acteurs impliqués dans la maladie d'Alzheimer.

Impact sur les animaux

Notre nouveau modèle de souris de maladie d'Alzheimer devrait présenter des défauts cognitifs à un âge tardif. Nous ne savons pas encore si ce modèle est suceptible d’engendrer des effets indésirables au cours du vieillissement. Nous évaluerons donc la mort neuronale chez ces animaux jusqu’à l’âge de 16 mois. Les femelles utilisées pour le recueil d'embryons ou de nouveau-nés subiront un traitement par injection intra-abdominale (2 injections de 10 secondes à 48 heures d’intervalle) d'hormones de superovulation. Ces gestes entraineront de la contention (maintien de l'animal immobile pour l'injection) et peuvent entrainer de la douleur. Les mesures d'activité à l'aide de cages métaboliques, pour évaluer le manque de motivation, consistent à isoler les souris dans des cages individuelles 2 jours et 2 nuits consécutifs (48 heures) pour comptabiliser leurs mouvements. Ce test peut générer un état d’anxiété lié à l’isolement social. Au cours du test de mémorisation, les souris sont contraintes à nager dans l’eau, pour trouver une plateforme, qui est un environnement stressant pour les souris. La durée de chaque mesure est d'une minute, 4 fois par jour pendant 5 jours durant la phase d'apprentissage où la plateforme est présente. Et une minute, 3 fois par jour pendant 1 jour pendant la phase de test où la plateforme est retirée. Les animaux subiront un traitement par injection intra-abdominale (1x par jour pendant 18 jours à 6 et 12 mois ; 1x par jour pendant 18 jours à 16 mois pour un autre groupe d'animaux). Ce geste entrainera également de la contention et peut entrainer de la douleur. Enfin pour les perfusions intracardiaques de fixateurs permettant de récupérer leurs cerveaux et d'observer différents acteurs impliqués dans la maladie d'Alzheimer, les animaux seront profondément anesthésiés et l’exsanguination (perte d'une grande quantité de sang) entrainera la mort.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer leur cerveau et effectuer les analyses biochimiques et histologiques nécéssaires au projet scientifique.

Remplacement

Pour caractériser notre nouvelle lignée de souris, nous ne pouvons pas remplacer les animaux. De plus notre projet de recherche comportent des études comportementales (manque de motivation et de mémorisation), que nous devons effectuer sur les animaux. Cependant, dès que cela sera possible, notre laboratoire souhaite mettre en place l’utilisation de fibroblastes (cellules de la peau) ou de cellules souches (capables de se transformer en n'importe quelles cellules) de patients atteints de la maladie d'Alzheimer pour compléter puis remplacer notre modèle de souris.

Réduction

L’ensemble des animaux produits pendant ces 5 années servira pour les cultures de neurones et de microglie (les cellules protectrices des neurones) et pour la caractérisation comportementale (manque de motivation et de mémorisation) et biochimique (étude de tous les acteurs impliqués dans la maladie d'Alzheimer). Nous utiliserons des tailles d’échantillons garantissant une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans le respect éthique de la règle des 3R (remplacement, réduction et raffinement). Le nombre de souris pour chaque procédure est déterminé avec un logiciel. Notre étude comportementale requiert des groupes de 15 à 18 animaux minimum. Cependant, pour réduire le nombre d’animaux, quand cela est possible, les mêmes groupes de souris seront utilisés pour plusieurs tests comportementaux et pour les analyses biochimiques. De plus, nous utiliserons les mêmes mâles et femelles en accouplement jusqu’à ce que les naissances diminuent. Pour les cultures de neurones et de microglie, nous accouplerons 2 femelles pour 1 mâle. Les femelles non prises seront réutilisées pour l’accouplement suivant, tout comme les mâles seront réutilisés jusqu’à une baisse de fertilité généralement attendue à 12 mois.

Raffinement

Les souris sont hébergées collectivement (jusqu'à 5) dans la zone de production de l’animalerie dans des cages comportant une maisonnette ainsi que de la ouate favorisant la nidification avec un cycle d’éclairage normal. Elles sont nourries et abreuvées à volonté. Les animaux sont régulièrement manipulés et observés par les animaliers lors du change ou par les expérimentateurs lors des pesées. La mise en place d'une grille de score et des points limites adaptés à l’hébergement et aux procédures seront appliqués. Les animaux qui auront atteint le point limite seront retirés de l'élevage ou de la procédure, traités à l'aide d'antalgique ou sérum physiologique en cas de déshydratation. Si les symptômes persistent plus d'une journée, ils seront mis à mort. Les femelles utilisées pour le recueil d'embryons ou de nouveau-nés seront habitués à l'expérimentateur 1 fois par jour pendant une semaine avant les injections. Pour tester les souris isolées dans les cages métaboliques, nous utiliserons un dispositif où les souris peuvent s'apercevoir d'une cage à l'autre. De plus chaque cage possède une roue ce qui est un enrichissement de l'environnement. Enfin, pour les souris contraintes à nager dans l'eau, une phase d’habituation sera réalisée avant le début du test. La température de l'eau sera fixée à 22°C et dès la sortie de l'eau, les souris seront séchées sur un papier absorbant.

Choix des espèces

La maladie d'Alzheimer est une maladie complexe caractérisée notamment par des altérations comportementales et cognitives. Plusieurs modèles chez la souris existent et sont largement utilisés. Ils reproduisent très bien les symptômes observés chez les patients humains. Utiliser ces modèles mimant au mieux la maladie d'Alzheimer reste pertinent et indispensable pour une meilleure compréhention de la pathologie. Ce projet ayant pour but la caractérisation d’une nouvelle lignée de souris (très peu de publications existent actuellement), nous utiliserons des embryons pour les cultures de neurones, des souriceaux pour les cultures de microglie (les cellules protectrices des neurones) et des souris adultes de 3, 6, 12 et 16 mois pour la caractérisation comportementale (manque de motivation et de mémorisation) et biochimique (étude de tous les acteurs impliqués dans la maladie d'Alzheimer). Ce projet nous permettra par la suite de cibler une fourchette d’âges plus précise pour les projets à venir.