Procédures légères

5 248 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, pour une seule intervention chacune, une injection dans l'abdomen, parfois deux à vingt-quatre heures d'intervalle. Les femelles gestantes reçoivent le produit destiné à perturber ou à marquer la production des cellules sanguines de leurs embryons, dont le système immunitaire est ensuite analysé jusqu'à l'âge adulte. Le porteur qualifie la douleur de légère et de courte durée, et signale l'isolement des mâles reproducteurs comme un autre effet indésirable. L'effectif découle du nombre de portées nécessaires, et le porteur annonce une méthode de traçage cellulaire qui devrait le diviser par deux à moyen terme.

Objectifs

Il a été démontré que les perturbations de l'environnement maternel peuvent entraîner des changements durables dans les cellules au cours du développement, contribuant au développement de maladies à l'âge adulte. La plupart des perturbations pendant la grossesse (mutations génétiques, infections, diète) provoquent de l’inflammation chez la mère qui peut passer la barrière placentaire et perturber l’embryon en cours de développement. L’objectif général de ce projet est donc de mieux comprendre (1) les mécanismes contrôlant la mise en place du système sanguin et immunitaire au cours du développement embryonnaire et (2) leur réponse suite à des perturbations pendant la grossesse. Notre projet vise donc à la fois à approfondir les connaissances fondamentales sur le développement du système immunitaire pendant la vie fœtale et à appliquer ces connaissances à des questions d’ordre médicale en utilisant la souris comme modèle pour l’analyse de pathologies humaines d’origine génétique ou infectieuse. A ce jour, comment l’inflammation de la mère affecte le système immunitaire en cours de construction de l’embryon et quelle sont les conséquences à long terme, c’est à dire dans la vie adulte, sont méconnues. L’objectif du projet est de répondre à 3 principales questions : + Comment sont produites l’ensemble des cellules sanguines de l’embryon ? + Pourquoi certaines mutations génétiques perturbent l’hématopoïèse de l’enfant et beaucoup moins celle de l’adulte ? + Comment une infection virale en cours de gestation peut perturber le fonctionnement du système de production des cellules sanguines adulte et sur quelle période ?

Bénéfices attendus

Grace à ce projet, nos approfondirons nos connaissances sur la mise en place du système hématopoïétique de l’embryon. En particulier, nous mettrons en évidence comment des infections pendant la grossesse, telles que les infections virales chez la femme enceinte, perturbent la production de cellules immunitaires à court et long terme au cours de la vie post-natale. De plus, une partie importante du projet présente une orientation plus médicale. Il s’agit en particulier de l’étude de maladies génétiques touchant la petite enfance. Ce projet nous permettra d’identifier les cellules à l’origine de certaines maladies pédiatriques dans des modèles murins adaptés. Une meilleure compréhension de ces pathologies pourra bénéficier, à long terme, à des domaines plus appliqués de la recherche médicale, particulièrement dans le domaine de la pédiatrie. .

Procédures

La seule intervention prévue sur les animaux est une injection intrapéritonéale de produits. Les animaux vigiles seront pris en main quelques secondes pour l’injection intra-abdominale. Celle-ci sera généralement unique. Si deux injections sont nécessaires, elles auront lieu å un intervalle d’au moins 24h.

Impact sur les animaux

Les injections de petit volume requièrent une contention manuelle et l’introduction d’une aiguille en intra-abdominale. Une seule procédure requerra deux injections distantes d’au moins 24 heures. Réalisée selon les bonnes pratiques vétérinaires, ces gestes provoquent chez les animaux une douleur légère et de courte durée.

Devenir

Tous les animaux soumis à une procédure seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour analyser leur système immunitaire dans différents organes et ils ne pourront donc être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

A ce jour, il n’y a aucune alternative non animale disponible pour étudier le développement des fœtus à partir du deuxième trimestre de gestation chez les Mammifères. Comprendre comment se construit le système immunitaire in utero nécessite d’étudier des interactions multiples entre organes et types cellulaires au cours de tout le processus de gestation. Ceci ne peut donc pas être reproduit dans des modèles in vitro de type organoïdes. De plus, pour comprendre comment des perturbations au cours de la grossesse impactent la santé des individus, nos études nécessitent l’étude d’organismes entiers.

Réduction

Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en tenant compte de notre expérience, - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats interprétables, permettant d'atteindre une signification statistique. Pour affiner cette estimation, nous disposons de l’aide et des recommandations d’un service de biostatistique qui nous guide pour calculer au plus juste l’effectif nécessaire à chaque type d’expérience afin d’éviter une utilisation excessive d’animaux ou, à l’inverse, une sous-estimation de ce nombre qui entrainerait l’obtention de résultats ininterprétables. De plus, nous mettons en place dans ce projet une nouvelle approche de traçage cellulaire permettant de combiner le marquage et suivi de deux populations distinctes dans un même individu. Ceci permettra, à moyen et long terme, de réduire de moitié les animaux nécessaires. En effet, actuellement deux cohortes indépendantes utilisant chacune un seul système de marquage sont nécessaires et grâce à notre nouvelle approche une seule permettra de combiner les deux.

Raffinement

Les seules interventions pouvant provoquer une gêne physique sont les injections intra-abdominales. Pour limiter les nuisances au maximum, ces injections seront réalisées par du personnel formé à cette procédure. Les seringues seront à usage unique. Les injections seront réalisées dans une pièce isolée de façon à ne pas provoquer de stress sur le reste des animaux. Un autre effet indésirable sur le bien-être animal est la solitude des mâles reproducteurs. De façon à limiter les effets néfastes de cet isolement, les femelles seront laissées aussi longtemps que possible avec les mâles. De plus, l’enrichissement des cages sera maximalisé selon les recommandations du service du bien-être animal de notre animalerie. Enfin, les animaux ne seront pas conservés isolés sur une longue période, mais plutôt de façon épisodique au moment du renouvellement des accouplements.

Choix des espèces

• Les souris sont des petits Mammifères qui partagent de nombreuses similarités avec l’homme. • La souris est l’espèce la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants sur le développement in utero des mammifères. • Elles constituent un modèle très maîtrisé par l’ensemble des équipes de recherche • Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux. • Relativement facilement consanguines, ce qui permet une meilleure homogénéité dans nos populations. • De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées) pour étudier l’hématopoïèse. • Des modèles de maladies humaines, à la prévention ou à la thérapie desquelles nous souhaitons tout particulièrement contribuer, ont été développés chez les souris de laboratoire (exemple : Mutations génétiques). Le but général de ce projet est d’étudier les perturbations de la production des cellules sanguines au cours du développement embryonnaire précoce et d’analyser leurs conséquences sur le système immunitaire tout au long de la gestation et, ensuite, chez le nouveau-né et au cours de la vie adulte. La production des cellules sanguines commence, chez la souris entre le 8ème (E7,5) et le 9ème (E8.5) jour de gestation, sur une durée totale de 19-20 jours. De ce fait, les injections faites aux femelles gestantes pour perturber la production des cellules sanguines ou pour marquer génétiquement les cellules concernées, seront faites essentiellement entre le 9ème et 10ème jour (E8,5 à E9,5) et les embryons seront analysés à intervalles réguliers (E9,5 à E18,5 = veille de la naissance). Pour l’analyse des conséquences sur le système immunitaire après la naissance, les stades choisis seront P2 (2ème jour après la naissance), P15 (15ème jour après la naissance) et P42 (6 semaines après la naissance). Ces stades ont été choisis car ils représentent des stades clés du développement post-natal chez la souris : un stade juste après la naissance (P2), un stade avant le sevrage (P15) et un stade adulte post-puberté (P42).

Équipées d'électrodes-aiguilles sous la peau du crâne pendant deux heures d'anesthésie générale, 30 souris rayées africaines passent un audiogramme de quatre à cinq heures au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objectif est d'établir les seuils auditifs de cette espèce sauvage, préalable annoncé à l'étude de sa communication vocale ultrasonore. Le porteur écrit qu'à la fin de la procédure les souris n'auront subi aucune atteinte à leur intégrité physique ou mentale, tout en signalant les risques liés à l'anesthésie et une désorientation pouvant durer une heure au réveil. Les 30 individus sont ensuite replacés dans l'élevage, aucun n'étant tué à l'issue.

Objectifs

La souris est un modèle très utilisé dans le cadre des études portant sur les troubles psychiatriques affectant les interactions sociales et la communication (e.g. trouble du spectre de l’autisme). Cependant, malgré de nombreux projets utilisant le modèle murin à cette fin, le système de communication de la souris est encore peu compris. Effectivement, nous ignorons encore le fonctionnement et l’importance de la communication vocale ultrasonore chez la souris : quelles informations sont transmises ? Comment sont encodées et décodées ces informations ? Comment la communication ultrasonore affecte -t ‘elle la vie d’un individu (sélection d’un partenaire sexuel, gestion de conflit, collaboration sociale, …) ? L’objectif de ce projet est d’explorer et comprendre le système de communication de la souris rayée africaine , une espèce de souris sauvage, très intéressante pour la flexibilité de son système social. La richesse et la complexité de ses interactions sociales ont probablement favorisé la mise en place d’un système de communication tout aussi riche et complexe. Cette espèce est de surcroît diurne, s’observe facilement dans son environnement naturel et se maintient bien en captivité, ce qui en fait un excellent modèle pour des études en milieu naturel et en laboratoire. Cependant, nous ignorons encore tout des capacités auditives de cette espèce, alors que la détection des signaux sonores est un mécanisme central de tous système de communication. Notre objectif est d’établir l’audiogramme de la souris rayée africaine, afin de connaître les capacités de perception auditives de cette espèce. Pour atteindre cet objectif, nous travaillerons avec des animaux vivants en laboratoire, en bon état de santé physique et mentale, et pratiqueront un test d’audiogramme par réponse auditive du tronc cérébrale (également connu sous le nom de procédure de l’ABR pour Auditory Brainstem Response).

Bénéfices attendus

Ce projet permet l’étude et la compréhension du système de communication vocale de la souris rayée africaine. Cette espèce a la particularité d’avoir un système sociale flexible (selon les contraintes du milieu et le pressions de compétition, les individus alternent entre un mode de vie solitaire ou en groupes familiaux). La richesse et la complexité des interactions sociales qui en découlent ont probablement favorisé le développement de bonnes capacités cognitives permettant aux souris de naviguer dans ces réseaux sociaux denses. Ainsi il est possible que l’étude de la communication de cette espèce dévoile l’existence de capacités vocales complexes d’apprentissage et de contrôle. Ces capacités vocales sont particulièrement rares dans le règne animal, et particulièrement chez les mammifères où elles ont été prouvées chez l’humain, l’éléphant, la chauve-souris et certains mammifères marins, des espèces difficilement étudiables en laboratoire. Si la souris rayée dispose de ces capacités, elle représenterait alors un modèle de choix pour l’étude et la compréhension de leur mise en place, leur fonctionnement et leur utilité. De plus, la souris rayée africaine est utilisée dans son milieu naturel comme une espèce modèle pour étudier l’adaptation au changement climatique, et comment leurs flexibilité comportementale et physiologique permet de s’adapter à son environnement. Notre projet permettra d’avoir une meilleure connaissance du modèle à court terme, et par la suite de mieux comprendre la communication chez la souris à plus long terme.

Procédures

Au laboratoire, 30 individus participeront à un audiogramme par réponse auditive du tronc cérébral, une procédure qui impliquera une anesthésie générale. Pendant cette procédure les souris seront équipées d’électrodes-aiguilles sous-cutanée qui détectent l’activation des fibres nerveuses auditives en réponse à un son. A la fin de cette procédure les souris seront vivantes et n’auront pas subi d’atteinte à leur intégrité physique ou mentale. Pour cet audiogramme les souris ne participent qu’une fois à l’expérience, qui dure entre 4 et 5 heures au total (ce qui inclue les temps de préparation et de réveil des souris, le test de l’ABR en lui-même durera entre 1 et 2 heures).

Impact sur les animaux

Au laboratoire : L’expérience de l’audiogramme neuro-physiologique (test de l’ABR : Auditory Brainstem Response) impliquera une anesthésie générale d’une durée de deux heures. Des risques liés à l’anesthésie sont possibles. Des électrodes-aiguilles sous-cutanée seront placées au niveau de la tête de la souris pendant la procédure. Au réveil les souris pourront être désorientées (jusqu’à une heure).

Devenir

A la fin de la procédure les animaux seront en vie et n’auront pas subi d’atteinte physique ou psychologique empêchant de les replacer au sein de l’élevage.

Remplacement

Le projet vise à étudier les capacités de perception auditives de la souris rayée africaine, il est donc nécessaire de travailler avec des animaux de cette espèce vivants et en bon état de santé physique et mental. Les résultats obtenus du précédent projet étudiant la communication vocale de cette espèce nous encouragent à poursuivre l’étude de ce modèle et à établir son audiogramme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés correspondra au nombre minimum d’individus nécessaires à la réalisation d’analyses statistiques. Dans un premier temps les analyses viseront à déterminer les seuils d’auditions pour chaque individu et chaque groupes (mâles, femelles, groupe d’âge différent). La comparaison des seuils d’auditions se fera à l’aide de tests de Student

Raffinement

Les individus seront anesthésiés, avec une analgésie adaptée, pour limiter la douleur, le stress, et les risques liés à la procédure. Au cours des expériences les souris seront surveillées en permanence. Cette surveillance sera directe pendant les temps de préparation de l’animal et l’induction de l’anesthésie. Pendant la réalisation de l’audiogramme, les souris, alors anesthésiées, seront placées dans une chambre anéchoïque. L’expérimentateur ne pouvant rester dans la même pièce, des caméras seront installées pour surveiller à distance la souris et pouvoir réagir de manière appropriée en cas de besoin (par exemple si la souris se réveille avant la fin de la procédure). Une surveillance directe et continue d’au moins une heure sera assurée à la fin de l’expérience, pour s’assurer du bon état de l’animal jusqu’à ce qu’il retrouve des capacités mobiles et un comportement normal. En tout temps, y compris en dehors des périodes d’expérimentations, des visites régulières de surveillance (au minimum quotidiennes), sont effectuées par les expérimentateurs ou le personnel qualifié du laboratoire. La fréquence de ces visites sera renforcée dans les jours suivant la procédure (une visite toutes les 2 heures le lendemain, puis 3 visites par jours au cours de la semaine suivante). Au cours de ces visites, l’expérimentateur s’assurera que les animaux ne présentent aucun signe de détresse ou de mal-être (poil hérissé, prostration, tremblement, blessures…). Si un animal présente des signes physiques de douleur ou de mal-être, ou des comportements anormaux, il ne participera pas/plus aux expériences. Dans le cas où son état ne s’améliorerait pas, il serait euthanasié selon les méthodes réglementaires approuvées. Les animaux impliqués dans l’expériences seront pesés la semaine précédent l’expérience, puis 2 fois par semaine dans le mois suivant la procédure, pour assurer un suivi et prévenir toute perte de poids.

Choix des espèces

La souris rayée africaine est un bon modèle pour étudier la communication animale. C’est une espèce diurne, utilisant un habitat semi-ouvert, qui s’observe facilement dans son milieu naturel. C’est un rongeur, facile à maintenir et reproduire en captivité en gardant une structure sociale en groupes familiaux, proche des groupes présents dans la nature. Elle représente donc un bon modèle de laboratoire. Cette espèce a fait l’objet de nombreuses études biologiques visant à comprendre son comportement social. On dispose donc de connaissances robustes concernant cette espèce, nous permettant de l’étudier de manière précise et ciblée. Cette souris présente une flexibilité sociale rare et un comportement vocal riche, particulièrement intéressants pour l’étude de la complexité des réseaux sociaux, à la différence des souris de laboratoire classiquement utilisées, présentant parfois des comportements sociaux et vocaux altérés. Il est indispensable d’établir son audiogramme pour mener à bien des recherches sur sa communication. La gestation de la souris rayée africaine est d’environ 23 jours. Les jeunes sont sevrés au bout de 28 jours après leur naissance, et sont pleinement adultes à 3 mois. Seuls les adultes d’au moins 3 mois participeront aux expériences, afin de tester des individus qui ont fini leur croissance et leur développement.

Toutes mises à mort à différents stades de la gestation pour que leurs embryons soient prélevés, 492 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'intervention tient en un gavage oral de vingt à trente secondes, répété une fois à vingt-quatre heures d'intervalle, qui inactive des gènes dans les organes reproducteurs de l'embryon. Les prélèvements ont lieu aux dixième, onzième, douzième et treizième jours de gestation, aux étapes où se décide la formation des testicules ou des ovaires. Sur le remplacement, le porteur affirme que les cultures cellulaires et les organoïdes ont "montré leurs limites en aboutissant à des résultats erronés", tout en s'engageant à les employer si de nouvelles conditions de culture satisfaisantes apparaissent.

Objectifs

Chez l’homme (et la souris), les organes reproducteurs sont les testicules chez l’homme et les ovaires chez la femme. Au cours du développement, ces organes sont tout d’abord identiques dans les deux sexes ; ils sont dits « indifférenciés ». C’est un processus appelé détermination du sexe qui décide si ces organes deviendront des testicules ou des ovaires, en fonction du sexe de l’embryon. Ce processus est déclenché par des gènes spécifiques, le gène SRY pour la formation des testicules et le gène WT1 pour les ovaires. Une fois que les testicules ou les ovaires sont formés, ils vont influencer le développement de tout le corps en le « masculinisant » ou en le « féminisant ». Cependant plus de 50% des problèmes graves liés à la formation des organes reproducteurs (comme les inversions de sexe, où le sexe anatomique ne correspond pas au sexe génétique), on ne connaît pas encore la cause. Cela montre que les mécanismes qui contrôlent la détermination du sexe sont encore mal compris. Notre objectif est d’éclaircir ces mécanismes. Des études préliminaires suggèrent que de nouveaux gènes pourraient jouer un rôle dans ce processus, mais leur fonctionnement reste mystérieux. Pour comprendre le rôle de ces facteurs, nous allons étudier comment des mutations dans certains gènes influencent le développement des organes reproducteurs chez la souris. Cela va permettre d’identifier les causes de certains troubles du développement des organes reproducteurs encore inexpliqués, et d’anticiper si ces mutations conduisent à des maladies telles que des cancers. Ce projet est entièrement dédié à l'application des principes directeurs des 3R pour la recherche sur les animaux (réduire, remplacer, raffiner) et adhérera strictement aux lois et réglementations nationales et internationales et nous remplaçons les modèles animaux chaque fois que cela est possible.

Bénéfices attendus

De nombreuses pathologies de la détermination du sexe restent incomprises en raison de notre méconnaissance des réseaux génétiques contrôlant ce processus, et les cliniciens restent souvent sans réponse quant au diagnostic et à la prise en charge de bébés atteints d’anomalies du développement sexuel. Ce travail permettra à terme d'avancer dans la compréhension de ces pathologies et de proposer de nouveaux diagnostics. Il permettra aussi d’anticiper les conséquences de mutations de ces gènes et de proposer des solutions thérapeutiques et un suivi appropriés des problèmes d'insuffisances hormonales, d'infertilité (devenue un problème majeur en santé publique) et des prédispositions aux cancers gonadiques des patients.

Procédures

Les femelles gestantes seront soumises à l’administration d’un produit par gavage oral pour inactiver des gènes spécifiquement dans les organes reproducteurs embryonnaires. Cette administration sera répétée à 24 heures d’intervalle. Le gavage oral est réalisé en 20 à 30 secondes maximum. Cela concerne 492 souris.

Impact sur les animaux

Le gavage oral sera répété à 24 heures d’intervalle, entraînant un stress et un inconfort temporaires de gravité légère.

Devenir

Toutes les femelles gestantes traitées seront mises à mort afin de prélever les embryons aux stades embryonnaires précoces nécessaires aux analyses.

Remplacement

Ce projet a été élaboré et sera réalisé dans le respect de la règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) : le recours à l'expérimentation animale est essentiel pour la biologie du développement et l'étiologie de la différenciation sexuelle: en effet, les techniques de culture cellulaire ou organoïdes ne permettent pas d'appréhender le développement dynamique de certains organes qui nécessite vascularisation et contexte tridimensionnel et ont montré leurs limites en aboutissant à des résultats erronés. Cependant si de nouvelles conditions de culture satisfaisantes sont élaborées, nous les utiliserons dans la perspective de remplacer les souris par ces nouvelles technologies.

Réduction

Afin d’obtenir des résultats reproductibles nous estimons que nous aurons besoin de 8 embryons par expérience et par génotype, ce qui correspond à trois réplicats pour l’histologie et cinq réplicats pour les analyses quantitatives. En cas d’imprévus, nous anticipons de collecter 10 embryons par expérience et par génotype. Pour les expériences d’analyses transcriptomiques, nous anticipons 10 embryons par génotypes pour avoir suffisamment de matériel. Pour ces analyses nous n'étudierons que 2 stades de développement correspondants au stade précédent l’apparition du phénotype (ensemble des caractères observables) et au stade ou le phénotype est visible. Ces stades seront préalablement définis grâce aux analyses immunohistologiques afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La qualité de la contention, l’usage d’un matériel stérilisé permet d’assurer un gavage efficace et rapide, limitant le stress imposé à l’animal par la procédure. Le personnel a été formé pour cela et cette procédure est utilisée en routine au laboratoire, ce qui limite le temps de contention. Les solutions sont maintenues à la température corporelle de 37°C pour éviter tout inconfort de la femelle et les doses ont déjà été déterminées pour n’induire aucun effet néfaste sur la santé, lié directement à l’ingestion. Ces mesures sont accompagnées de la mise en place d’un protocole d’observation permettant de déceler précocement tout inconfort des animaux durant les expériences. Les animaux seront hébergés par deux ou par trois dans des cages comportant différents types d’enrichissement comme des objets à ronger et des igloos pour se faire un nid de façon à garantir leur bien-être et leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons tous les outils à notre disposition et déjà au point pour pouvoir étudier la fonction des gènes d'intérêt dans les organes reproducteurs de souris. Les femelles gestantes seront euthanasiées à différents moments de la gestation couvrant tout le développement des organes reproducteurs embryonnaires : le début de la formation des organes reproducteurs (10 jours de gestation), le début de la différenciation des testicules (11 jours de gestation), et des ovaires (12 jours) et au stade d’initiation de la division des ovocytes chez la femelle (13 jours).

Issues de lignées sélectionnées sur leur réponse immunitaire depuis 1994, 4 200 poules et coqs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit une prise de sang, à la veine alaire ou au sinus occipital, pour établir son pedigree, puis une seconde en fin de cycle de reproduction. Deux cents d'entre eux reçoivent en plus une injection de phytohémagglutinine sous la peau de l'aile, dont l'épaississement est mesuré au comparateur digital pendant 24 heures, la sélection reposant sur l'ampleur de cette inflammation. Aucun modèle alternatif n'existe selon le porteur, qui prévoit de replacer les reproducteurs vivants à l'âge de réforme, de les vendre "dans la mesure du possible", ou de les tuer.

Objectifs

Ce projet présente les différentes opérations réalisées pour renouveler et entretenir les lignées de poules sélectionnées sur leur réponse immunitaire et une lignée témoin. Elles sont toujours actuellement soumises à un processus de sélection. Les lignées réponses immunitaires ont été initiées en 1994 pour servir de matériel unique à l’identification des mécanismes et des gènes impliqués dans les réponses immunitaires. C'est un matériel expérimental original pour appréhender les relations complexes entre caractères de santé et leur contrôle génétique. Elles ont été utilisées pour des tests de résistance à des maladies, croisées avec d'autres lignées, analysées pour des recherches de signatures de sélection. Ce projet porte sur l’élevage des jeunes et adultes de ces modèle animaux uniques.

Bénéfices attendus

L’étude de ces lignées permettra à terme de mieux comprendre (court/moyen terme) l’origine du niveau de réponses immunitaires et de faciliter la mise au point d’approches efficaces de lutte se basant sur la modulation de la sélection génétique, en complément des méthodes prophylactiques, déjà existantes, en identifiant des marqueurs génétiques ou microbiens qui pourront être utilisés en sélection ou bien pour mettre au point une modulation du microbiote intestinal par l’alimentation ou les pratiques d’élevage. Ces approches permettront de limiter la propagation des maladies en élevage et donc de limiter de nombre de troupeaux abattus, et de réduire la contamination humaine via l’ingestion de produits aviaires contaminés (viande, œufs).

Procédures

Une prise de sang, à la veine alaire ou au sinus occipital, sera effectuée entre 2 et 18 semaines d'âge pour pouvoir génotyper les animaux et ainsi déterminer leur pedigree. Une seconde prise de sang sera réalisée en fin de cycle de reproduction pour évaluer la réponse vaccinale. L’intervention a une durée inférieure à une minute. Pour les 200 animaux d'une des lignées , la sélection est basée sur le niveau de réponse immunitaire par réponse inflammatoire de sensibilité dermique retardée, en utilisant la réponse sur la variation d’épaisseur à l'aide d'un comparateur digital sur 24h de la membrane alaire suite à une injection de phytohémagglutinine par voie sous-cutanée (ou intra-dermique). Cette injection est réalisée à 10 semaines d’âge.

Impact sur les animaux

Les prises de sang alaires et l'injection de phytohémagglutinine (PHA) pourront être une source de stress, en raison de la contention nécessaire et de la piqûre. Les prises de sang peuvent éventuellement engendrer des hématomes.

Devenir

Nous utilisons ici nos individus pour permettre la production d'une descendance. Arrivés à l'âge de réforme, les animaux n'ayant pas subi d'intervention majeure, nous envisageons de les replacer en vif ou de les valoriser pour leur viande qui est tout à fait consommable.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de maintenir 3 lignées dont l’étude permet la compréhension des rôles combinés des réponses immunitaires chez la poule. Il n’existe pas, à notre connaissance, de modèle alternatif permettant de remplir ces objectifs.

Réduction

Les effectifs de reproducteurs utilisés permettent en théorie de gérer la consanguinité déjà très élevée de nos populations. Par calcul, les tailles efficaces des populations devraient être plus importantes, cependant la variabilité génétique de notre caractère est peu renseignée. L'objectif des maintiens des populations est de disposer d'animaux.

Raffinement

Les poules et les coqs hébergés en groupe bénéficient d’un milieu enrichi, notamment par des perchoirs et de la proximité avec leurs congénères, permettant des échanges visuels, olfactifs et auditifs. Les animaux feront l’objet de surveillance classique et toute manifestation de détresse ou de maladie prise en considération pour envisager le retrait des animaux (mise à l'infirmerie) ou leur euthanasie si besoin. Dès l'éclosion, les animaux sont élevés en groupe au sol puis en cages collectives à partir de 18 semaines. Les cages collectives hébergeant les poules et les coqs seront équipées de divers enrichissements, tels que des perchoirs, des blocs à picorer, des chaînettes métalliques et des bandelettes de tissu pour stimuler le jeu. Un isoloir sera également présent à une extrémité des cages pour offrir aux animaux un espace de cachette. Pour prévenir le picage, des répulsifs antipicage pourront être appliqués sur les animaux concernés. Une surveillance soutenue sera assurée plusieurs fois par jour pour détecter précocement toute détérioration du bien-être. Un arbre de décision, destiné à faciliter la gestion quotidienne des animaux (en cas d'atteinte ou non du point limite), a été développé et sera fourni aux animaliers en charge du suivi des animaux. Raffinement de la procédure : Cas de la prise de sang au sinus occipital : afin de réduire le risque de lésions cérébrales pouvant être associé à la réalisation d'un prélèvement de sang au sinus occipital, le préleveur utilisera une garde qu'il positionnera sur son aiguille afin d'éviter toute possibilité d'enfoncer l'aiguille trop profondément. La facilité de visualisation de ce site d'injection évite l'arrachage de plumes douloureux pour les animaux. Un point de compression de 30-60s sera effectué pour limiter également la formation d'un hématome. Deux expérimentateurs seront mobilisés pour une prise de sang afin de permettre la réalisation d'une contention appropriée par l'un pendant que l'autre réalisera la prise de sang. Les personnes en charge du prélèvement de sang au sinus occipital auront reçu une formation spécifique à ce geste et seront des personnes le réalisant régulièrement afin de maximiser la fluidité des gestes. Cas de la prise de sang effectuée à la veine alaire : un point de compression sera effectué et deux expérimentateurs seront mobilisés.

Choix des espèces

Le projet vise la compréhension de la réponse immunitaire chez l’animal, la complexité du déterminisme de ce critère nécessite une approche globale (voies physiologiques impliqués, leurs régulations et interactions) et ne peut donc être abordée que par une approche sur les animaux. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 9 moins, moment auquel ils seront mis en reproduction pour produire les poussins de la génération suivante. Lorsque leurs descendants auront 15 jours d’âge, ces reproducteurs mâles et femelles sont vendus dans la mesure du possible ou euthanasiés.

Comprendre pourquoi les oiseaux développent si peu de cancers, en prélevant chez eux des cellules qui seront ensuite irradiées en laboratoire : 60 huîtriers pies sauvages sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Capturés dans le cadre d'un programme de baguage déjà en place, ils subissent une prise de sang à la veine alaire, un prélèvement de plumes et une incision de la peau du patagium sous anesthésie locale, les trois actes dans les cinq minutes suivant la capture quand c'est possible. Tous sont relâchés ensuite, sur autorisation du programme de baguage. Le porteur classe la mise en culture de ces cellules primaires au titre du remplacement, alors que l'obtention des cellules passe par la capture et l'incision d'oiseaux sauvages.

Objectifs

Explorer la biodiversité procure un moyen fondamental de comprendre comment l’évolution a conduit à la sélection de certains traits animaux, de l’échelle cellulaire à celle de l’organisme entier, et qui sont à la base de la diversité des longévités observables dans la nature. Les oiseaux sont un des exemples emblématiques d’une longévité paradoxale en regard de traits physiologiques qui sont pathologiques chez l’Homme (comme l’hyperglycémie chronique). Dans un autre contexte, ce genre d’approche biomimétique s’est avérée fructueuse pour expliquer le paradoxe de Peto, qui tente d’apporter une réponse au fait que des animaux de grande taille et longévifs, donc caractérisés par un nombre de divisions cellulaires (et donc de risques d’accumulation d’erreur de duplication dommageables pour la cellule) plus nombreux tout au long de leur vie, présentent pourtant des prévalences de cancer réduites. Cette capacité à éviter l’immortalisation cellulaire et la formation de tumeurs a été corrélée à plusieurs adaptations cellulaires (rat-taupe et acide hyaluronique) ou de signalisation induisant l’apoptose de cellules transformées (Eléphant, duplication des gènes P53). Le présent projet s’appuie sur une observation remarquable : la prévalence du cancer chez les oiseaux est de loin inférieure à celle des mammifères (en moyenne, les taux les plus élevés (15%) correspondent à une prévalence faible chez les mammifères), et elle est même nulle pour un grand nombre d’espèces (source : Species 360, ZIMS). Notre projet a pour objectif d’explorer les mécanismes cellulaires qui peuvent expliquer ces faibles prévalences. Pour ce faire, nous allons nous intéresser à une espèce, l’huitrier-pie Haematopus ostralegus, qui présente une particularité cellulaire en lien avec les risques d’immortalisation des cellules : un allongement des télomères au cours de l’âge, dont l’érosion fait pourtant partie des mécanismes limitant les capacités de division et la vie des cellules somatiques. Nous voulons (i) explorer les variations des profils protéomiques cellulaires au cours de l’âge pour voir comment ces animaux se protègent de l’accumulation attendue des dommages cellulaires avec le temps et (ii) déterminer les réponses cellulaires in vitro à un stress génotoxique (irradiation), qui peut mettre en évidence des capacités de résistance face aux risques d’immortalisation cellulaire.

Bénéfices attendus

Selon les dernières données disponibles (Species 360), les oiseaux présentent des prévalences de cancer extrêmement faibles en comparaison aux mammifères. Notre projet vient amorcer l'étude encore vierge des mécanismes potentiels pouvant expliquer cette résistance.

Procédures

Des prélèvements seront effectués sur animaux vigiles (sanguins sur veine alaire avec capillaires, prélèvement de plûmes de couverture et de peau du patagium après anesthésie locale). Ces 3 prélèvements seront réalisés sur les mêmes individus si possible, pour les prises de sang et de plumes dans les 5 minutes après la capture. La réalisation finale du prélèvement de peau se fera selon les avis du porteur du projet et l'état de stress des individus, pouvant être annulé si besoin en lien avec le respect du bien-être animal. L'adaptation du protocole se fera avec les avis des responsables du programme personnel de baguage de l'espèce.

Impact sur les animaux

La principale nuisance est celle induite déjà par le prélèvement de peau du patagium. Il s’agit de deux types de nuisances potentielles : la première liée à la douleur induite par l’incision de la peau, la seconde liée aux risques d’infections. La douleur induite par le prélèvement de peau sera réduite par l’utilisation d’un anesthésique cutanée appliqué avant le prélèvement (voir procédure PE1). La seconde est contrôlée par la désinfection longue de la zone prélevée, nécessaire pour obtenir des prélèvements non contaminés de cellules.

Devenir

Tous les animaux seront relachés après les procédures selon les autorisations accordées au programme de baguage du porteur de programme personnel.

Remplacement

Nous devons recourir à l’animal entier pour récolter des cellules primaires sur lesquelles seront réalisées les mesures et les irradiations. Un prélèvement de cellules primaires produira plusieurs cultures, permettant à la fois la constitution d’une banque de cellules réutilisables et la réplication des mesures du présent projet. Le projet est ainsi en accord avec deux points de la règle des 3R : (i) de mettre en place une approche sur cellules en culture pour la partie expérimentale de l’étude qui évite le travail sur l’animal entier et pourra s’appliquer à d’autres modèles (=Remplacement).

Réduction

Le projet sera réalisé en accord avec deux points de la règle des 3R : (ii) nous utiliserons un nombre réduit d’animaux, dont la capture est prévue dans le cadre d’un programme personnel de baguage qui est en place depuis plusieurs années, et qui nous permet néanmoins d’avoir une puissance statistique suffisante en protéomique (n=6/groupe), et un rendement minimum de succès de mise en culture des cellules primaires (n=3 cultures/prélèvements). Les statistiques en protéomique nécessitent une analyse discriminante qui permet de traiter des fichiers de plusieurs centaines de lignes (protéines). Les statistiques en biologie cellulaires consisteront en des modèles mixtes permettant de prendre en compte les mesures répétées (avant et après irradiation) (=Réduction).

Raffinement

Pour le prélèvement de peau, nous utiliserons un anesthésique et un antiseptique comme décrit dans la procédure (=raffinement).

Choix des espèces

Nous utiliserons l’huitrier-pie pour les raisons suivantes qui en font le modèle parfait pour notre étude : 1) Espèce et population suivie par un programme personnel 2) Expérience de capture et de manipulation de ce modèle. 3) La taille adulte de l’espèce permet des prélèvements biologiques en adéquation avec les mesures envisagées (e.g. les prises de sang de 75 microlitres peuvent être réalisées de manière peu ou non invasive (sans seringue, aiguille et récupération des gouttes de sang avec un capillaire)). Ces prélèvements sont largement adaptés pour une espèce dont la masse corporelle moyenne est de 480g. 4) Dynamique particulière de la taille des télomères dans les cellules somatiques avec l’âge déjà connue (augmentation avec l'âge, ce qui est paradoxal vis à vis de risques de cancer réduits) Nous utiliserons annuellement 20 adultes pour avoir une première idée des effets de l'âge sur (i) les télomères et la télomérase, et (ii) les mécanismes de réponse des cellules aux stress expérimental que nous induiront.

Relâchées à la fin de l'expérience près du lieu où leurs œufs ont été récoltés, 124 seiches communes, des céphalopodes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont capturées deux fois à l'épuisette, et la moitié d'entre elles, 62 juvéniles, vit pendant 30 jours sous un son continu de 120 dB. Toutes subissent aussi un "test de surprise", une stimulation sonore graduelle de moins de deux minutes, pour mesurer l'effet du bruit d'origine humaine sur leur chasse et leur réaction aux perturbations sonores. Le porteur affirme que la perception du son "nécessite un organisme entier intègre". Il ne précise ni l'espèce ni le nombre des proies vivantes données chaque jour aux seiches.

Objectifs

L’Union Européenne identifie les bruits sous-marins comme une préoccupation environnementale importante, soulignant la nécessité de maintenir des niveaux de bruit qui ne nuisent pas aux écosystèmes marins. Le transport maritime a considérablement augmenté les niveaux de bruit sur les principales routes de navigation au cours des 50 dernières années. Compte tenu de l’évolution rapide du paysage sonore océanique, il est urgent de mener des recherches plus approfondies sur les effets du bruit anthropique sur la vie marine. Ces recherches sont essentielles pour élaborer des politiques efficaces et protéger la santé des océans. Actuellement, la plupart des études se concentrent sur l'effet des sons sur les vertébrés marins. Pour bien comprendre et atténuer les effets de la pollution sonore, il est essentiel d’élargir le champ de la recherche pour inclure un plus large éventail d’espèces et de fréquences sonores. Malgré leur importance écologique et économique, l'impact de l'augmentation du bruit anthropique sur les céphalopodes a été relativement peu étudié. Les céphalopodes, dont la seiche commune, détectent les sons et sont sensibles à leur environnement acoustique. Ce projet veut mettre en évidence l’impact du bruit chronique sur (1) le développement embryonnaire, et (2) la capacité de prédation chez la seiche commune.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à étudier comment le son pourrait affecter la phase de développement embryonnaire de la seiche commune : temps d’incubation, taux d’éclosion, et taille des nouveau-nés. Par ailleurs, ce projet ambitionne de déterminer l’impact du son sur la première alimentation, les capacités à s’adapter à de nouvelles proies, et la résilience du juvénile face aux perturbations d’environnement sonore.

Procédures

Sur la période d’expérimentation (30 jours), les juvéniles ((nombre= 124) subiront chacun deux captures à l’épuisette (nuisance légère d’une dizaine de seconde). Un lot de 62 individus sera soumis en continu à un son (120dB ; 1 Hz-1 kHz) durant toute la durée de l’expérimentation (nuisance légère, 30 jours). Tous les individus subiront un « test de surprise » qui consiste en une stimulation sonore graduelle (nuisance légère, moins de deux minutes).

Impact sur les animaux

Sur la période d’expérimentation (30 jours), les juvéniles ((nombre= 124) subiront chacun deux captures à l’épuisette (nuisance légère d’une dizaine de seconde). Un lot de 62 individus sera soumis en continu à un son (120dB ; 1 Hz-1 kHz) durant toute la durée de l’expérimentation (nuisance légère, 30 jours). Tous les individus subiront un « test de surprise » qui consiste en une stimulation sonore graduelle (nuisance légère, moins de deux minutes).

Devenir

A la fin de l’expérimentation, les animaux sont replacés dans le milieu naturel à proximité du lieu de récolte des œufs.

Remplacement

Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à appréhender l’impact du son sur le développement embryonnaire et le comportement de prédation chez la seiche commune. La perception du son et le développement des organes associés nécessite un organisme entier intègre. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle.

Réduction

La mise en place de collecteurs (support de ponte artificiel) relevés quotidiennement dans le milieu naturel permet de récolter le nombre d’œuf nécessaire pour la réalisation de cette expérimentation en s’affranchissant de la conservation d’un stock de géniteurs en laboratoire. Il n’y a donc pas de maintenance de géniteurs sauvages. Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. A la fin de l’expérimentation, tous les animaux sont replacés dans le milieu naturel à proximité du lieu de récolte des œufs.

Raffinement

Les juvéniles éclos sont placés dans des bacs répondant aux exigences de la Directive Déléguée. Un enrichissement environnemental est mis à disposition des animaux sous la forme d’une cachette (pièce pvc) et d’un tapis imitation « sable » sous les aquariums. De plus, les juvéniles sont nourris à satiété quotidiennement avec des proies vivantes leur permettant d’exprimer un comportement naturel de chasse. Le bien-être des animaux est évalué quotidiennement par une feuille de suivi permettant de quantifier l’expression de points limites en expérimentation.

Choix des espèces

Les céphalopodes sont les seuls mollusques possédant des capacités cognitives et des comportements élaborés. Les céphalopodes, dont la seiche commune, détectent les sons et sont sensibles à leur environnement acoustique. Le développement de la seiche commune est court et direct, aboutissant à des juvéniles bien développés à l’éclosion facilitant la mise en œuvre de cette étude.