Procédures légères

Les souris utilisées ici sont génétiquement construites pour développer d'elles-mêmes des lymphomes et des tumeurs intestinales dès leur première année de vie. Elles sont 1 614, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et des occlusions intestinales sont possibles. Un régime riche en gras alterné deux semaines par mois accélère l'apparition des adénocarcinomes, ce qui permet de ramener les groupes de trente à vingt souris, auxquelles s'ajoutent jusqu'à seize injections intraveineuses sous anesthésie sur huit mois. Toutes sont tuées, et une partie ne sera jamais analysée : ces souris-là meurent dans le cadre de l'entretien de la lignée.

Objectifs

Les cancers MSI (pour microsatellites instables) sont des tumeurs fréquentes, présentant des niveaux élevés de mutations notamment dans des séquences répétées de l’ADN appelées microsatellites. Ces tumeurs sont caractérisées par l’inactivation du système de réparation de l’ADN appelé MMR (pour MisMatch Repair). Il existe un syndrome héréditaire appelé syndrome de Lynch, dû à une mutation sur un des gènes impliqués dans ce système de réparation et qui cause le développement de tumeurs MSI chez les patients atteints de ce syndrome, entre 20 et 50 ans. L’objectif de ce projet est d’étudier les conséquences d’un traitement d’immunothérapie sur l’initiation et la progression tumorale de type MSI. En effet, il s’avère que les cellules tumorales utilisent un système de contrôle en charge de réguler la réponse immunitaire (appelé ICK), normalement prévu pour éviter des inflammations trop importantes ou des maladies auto-immunes, afin d’échapper à la réponse immunitaire antitumorale. Ce type de tumeurs répondent généralement bien aux traitements d’immunothérapie anti ICK et ce type de traitement est proposé aux patients atteints de cancer colique MSI au stade métastatique. Avec ce projet nous voulons démontrer qu’un traitement d’immunothérapie anti ICK préventive induit une augmentation de la réponse immunitaire antitumorale en ralentissant le développement des cancers MSI. Avec ce projet nous proposons de tester plusieurs nouvelles monothérapies/bithérapies et d’évaluer les mutations des cellules tumorales qui échappent au traitement en espérant à termes ouvrir des nouvelles pistes thérapeutiques pour les malades de cancers coliques de type MSI.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’élucider dans un point de vue fondamentale l’expression des protéines exprimées par les cellules tumorales lui permettant d’échapper au système immunitaire ICK et d’un point de vue clinique et thérapeutique de valider l’intérêt d’un traitement préventif utilisant une immunothérapie anti ICK afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer colique MSI (pour Microsatellites instables) notamment d’origine héréditaire. Ce projet pourra ouvrir à termes de nouvelles perspectives thérapeutiques innovantes pour les patients avec un cancer MSI résistant aux chimiothérapies standards.

Procédures

Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome) dans la première année de vie. D’autres modèles développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables après induction par injection d’une solution en intrapéritonéale sur animal vigile (5 fois à raison de quelques secondes par animal). Le modèle de greffes de cellules tumorales impliquera une anesthésie et une injection sous-cutanée unique de cellules effectuées (7-8 minutes par animal). Une partie des animaux recevront un régime riche en gras à raison de 2 semaines par mois et retrouveront un régime classique les 2 semaines suivantes tout au long du projet. Tous les animaux recevront différents traitements par injections intraveineuse sur animal anesthésiés à raison toutes les 2 semaines pendant maximum 8 mois (environ 1 minutes temps par animal, 16 fois maximum).

Impact sur les animaux

Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome/tumeur intestinale). Les effets indésirables sont donc principalement liés à ce développement tumoral. Les principaux symptômes du lymphome sont une augmentation de la taille des organes lymphoïdes comme la rate, le thymus et le foie ainsi que dans certains cas des ganglions. Pour l’adénocarcinome/tumeur intestinale, il s’agit d’une tumeur qui reste localisé et n’envahi pas les tissus/organes à distance (pas de métastase). Les souris dans ce contexte peuvent faire des occlusions intestinales. Un autre modèle murin utilisé au cours de ce projet impliquera l’injection de cellules tumorales en sous-cutanée dans des souris commerciales et effectué sous anesthésie de courte durée pouvant induire un léger stress thermique, un risque d’arrêt cardiorespiratoire (très rare). Le risque d’une croissance tumorale importante pouvant entrainer dans les cas les plus sérieux : une nécrose des tissus (peu probable d’après notre expérience), des difficultés de mobilité, ou encore une perte de poids. L’alternance entre régime standard et régime riche en gras pourra induire un léger stress en raison du changement d’alimentation (néophobie de la souris). Les injections nécessaires à l’induction de certains modèles par injection intrapéritonéale pourront induire un stress et une douleur de courte durée lié à la piqure de l’aiguille. L’administration des différents traitements par injection intraveineuse seront effectuées sous anesthésie de courte durée pouvant induire un léger stress thermique, un risque d’arrêt cardiorespiratoire (très rare) et également un risque de lésion/infection au site d’injection. Les traitements devraient réduire les effets liés au développement tumorale avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités.

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires adaptée afin de prélever des tissus pour analyse. Une partie des animaux ne seront pas analysés puisqu’ils seront euthanasiés dans le cadre de l’entretien de la lignée.

Remplacement

Un organisme vivant est indispensable pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement tumoral qui est au cœur de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Dans le cas d’un projet qui vise à étudier l’effet d’une nouvelle immunothérapie, il est nécessaire travailler sur un modèle in vivo car mieux adaptés à l'observation des effets globaux sur un sujet vivant et en particulier pour ce qui concerne l’initiation et la progression tumoral ainsi que les effets autres qui pourraient se manifester sur l’organisme.

Réduction

Le projet impliquera un total de 1614 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures d’élevage et expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Par exemple, pour les modèles génétiquement modifiés l’utilisation de la stratégie du régime riche en gras alterné permet d’accroitre la fréquence du développement des adénocarcinomes qui sont nécessaires dans ce projet, ce qui permet de réduire la taille des groupes à 20 souris (contre 30 sous régime standard). Il apparait nécessaire de mettre en observation 20 souris par groupe pour espérer mettre en évidence un impact significatif du traitement dans le cadre de notre expérience en restant respectueux de la règle des 3R. Pour les expériences impliquantes des greffes de cellules tumorales, les groupes seront réduits à 10-15 souris. Ces cohortes devraient nous permettre de mettre en évidence l'impact des traitements par immunothérapie simple ou combiné en respectant la règle des 3R. Si l'impact est significatif, ce que nous espérons, il ne sera pas utile de répéter l'expérience.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite). Les contraintes induites par le manipulateur dans ce protocole sont faibles (uniquement l’injection des traitements). Elles sont réalisées par du personnel formé et compétent et avec du matériel adapté en condition stérile. Durant les phases de traitement la surveillance sera augmentée afin de mettre en évidence toute intolérance liée au traitement. Un suivi pondéral des animaux sera réalisé afin de mettre en évidence une éventuelle perte/prise de poids. Pour le modèle de xénogreffe sous-cutanée, nous mettrons également en place un suivi bi-hebdomadaire de la croissance tumorale avec des points limites associés. La principale douleur pouvant être subit par les animaux concerne surtout le développement naturel des tumeurs. Ainsi, grâce au suivi et à la très bonne connaissance des modèles murins utilisés, nous pouvons détecter les premiers signes d’un développement tumoral. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : Les souris sont des animaux modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Pour notre projet, l'utilisation des modèles murins est la seule approche permettant d'intégrer le développement tumoral MSI et la complexité de la réponse aux traitements de chimiothérapie. Justification des stades : Les études se feront avec des animaux adultes. Les modèles animaux qui développent des tumeurs spontanément seront à partir d’environs 8-10 semaines. Les souris auront alors atteint un poids et une taille favorable pour réaliser les gestes techniques. De plus, la mise en œuvre d’un traitement à partir de 8-10 semaines nous permettra d’évaluer l’efficacité d’un traitement préventif. Pour le modèle de greffe sous-cutanée de cellules tumorales, les souris seront traitées par immunothérapie dès 6 semaines et la greffe sera réalisée à 9 semaines de vie. Cela nous permettra d’évaluer l’efficacité d’un traitement préventif.

Nées dans l'élevage de l'équipe, d'une lignée génétiquement modifiée porteuse d'une mutation responsable d'une paraplégie spastique héréditaire, et croisée toutes les dix générations avec des souris d'un élevage extérieur, 3 086 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après une coupe du bout de la queue pour le génotypage, elles reçoivent selon les groupes un médicament mêlé aux croquettes pendant sept mois, ou une dose unique par gavage de leur mère gestante. Une partie passe trois séries d'un test de mémoire et d'un test de coordination motrice, que le porteur ne nomme pas, chacune suivie d'une prise de sang sous anesthésie, et un groupe subit jusqu'à 14 prises de sang, une toutes les deux semaines. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs tissus ou des embryons, comme les couples reproducteurs quand leur fécondité diminue. Le porteur juge "indispensable" le recours aux souris, tout en disant utiliser des méthodes in vitro "dès que possible".

Objectifs

Les paraplégies spastiques héréditaires sont des maladies neurodégénératives d’origine génétique caractérisées par une mort neuronale, mais aussi parfois des troubles de développement du cerveau. Ces maladies sont très hétérogènes et sont causées par des mutations dans environ 80 gènes différents. Elles touchent environ 3 personnes sur 100.000 en Europe, avec un début généralement à l’âge adulte mais qui peut apparaitre dans l’enfance. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour la prise en charge de ces pathologies. Nous travaillons sur une des formes les plus fréquentes de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles de développement du système nerveux. Nous utiliserons un modèle animal (souris) pour cette forme de paraplégie spastique héréditaire. Nous avons déjà montré que ce modèle présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau et il récapitule les principaux signes observés chez les patients. L’objectif du projet est de mieux caractériser les différentes étapes d’évolution de la maladie, de son développement à la mort neuronale, et d’évaluer dans un modèle animal des stratégies thérapeutiques qui pourraient permettre de prévenir l’apparition des symptômes et la mort neuronale.

Bénéfices attendus

Nous travaillons sur une des formes les plus fréquente de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles du neurodéveloppement et actuellement aucun traitement ne peut être proposé aux patients. Un premier aspect du projet permettra de tester l’efficacité de deux médicaments sur la mort neuronale dans le modèle animal de la maladie. Si nous pouvons démontrer qu’au moins un de ces deux médicaments retarde la mort neuronale, notre projet pourrait permettre d’avancer vers une stratégie thérapeutique pour les patients atteints de cette paraplégie spastique héréditaire. Par ailleurs, nous savons que la maladie que nous étudions est associée à de légers défauts de développement du cerveau, mais nous ne savons pas si, et dans quelle mesure, ces défauts participent à l’apparition des symptômes de la maladie. Notre projet pourrait permettre de répondre à cette question. Comme le diagnostic des patients a généralement lieu à l’adolescence, après la phase de développement, la compréhension du rôle du développement permettra de mieux expliquer la maladie aux patients et d’améliorer leur prise en charge.

Procédures

La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un petit prélèvement de l’extrémité terminale de la queue sera effectué sur les jeunes animaux. Cet acte sera réalisé rapidement (moins d’une minute par animal) et une seule fois sur chaque animal. Nous réaliserons des traitements pour évaluer leur impact sur l’évolution de la maladie. Une approche sera un traitement chronique pendant 7 mois qui sera administré par incorporation dans les croquettes pour éviter des gestes invasifs. Une autre approche sera une administration unique par gavage de la mère gestante à un moment précis du développement embryonnaire (une fois, inférieur à une minute). Une partie des animaux sera soumise à trois séries de 2 tests comportementaux sur des animaux vigiles (à l’âge de 6 semaines, 4 mois et 8 mois). Le premier test est répété pendant 5 jours et vise à étudier les troubles de la mémoire (3minutes maximum par session, 2 fois 5 jours) ; le second test est répété pendant 3 jours et vise à tester la coordination motrice (5 minutes maximum par session, 5 fois 3 jours). A l’issue de chaque série de tests comportementaux, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie générale (3 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement). Un groupe d’animaux sera soumis à des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie générale toutes les 2 semaines (14 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement) L’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire en fin de procédure expérimentale.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour le génotypage peut générer une légère douleur chez l’animal et un risque rare de saignement. Pour l’étude de l’effet thérapeutique de médicaments, des effets secondaires (diarrhées, perte de poids) pourraient être associés au traitement. Pour l’étude sur la contribution du développement à la maladie, nous administrerons un médicament par gavage, ce qui peut générer une gêne et un inconfort et des effets indésirables liés à la molécule administrée. Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. Les prélèvements de sang peuvent générer un stress, une douleur et un inconfort lié à la piqûre, et leur répétition peut engendrer une déshydratation. Il existe un risque d’hématome après le prélèvement. L’anesthésie générale mise en place pour les prélèvements sanguins sera associée à une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque rare de dépression cardiorespiratoire. La mutation génétique portée par les souris porteuses de 2 copies du gène muté peut générer des souffrances après de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.

Devenir

Les couples ayant permis les générations des animaux seront euthanasiés lorsqu'une diminution significative de la reproduction est observée. A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem ou prélever des embryons.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons dans la mesure du possible des modèles in vitro qui évitent l’utilisation d’animaux. En effet, nous utilisons des modèles in vitro qui miment le développement du cerveau et qui permettent de répondre à certaines questions sur la contribution de ce développement sur la maladie que nous étudions. Cependant ce modèle in vitro ne permet pas de répondre à toutes les questions car : (i) le comportement des neurones diffère selon leur environnement in vitro et in vivo ; et (ii) la mise en place de l'organisation du cerveau ne peut pas être reproduite in vitro. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de mener des expériences comportementales. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable pour notre projet, mais nous utiliserons le modèle in vitro dès que possible afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans le cadre de la maladie que nous étudions, il existe un modèle de souris permettant d’évaluer les différents aspects que nous souhaitons étudier dans ce projet et ainsi obtenir des données transposables chez l’homme. L’étude de l’effet thérapeutique de médicaments sur les symptômes de la maladie ne peut se faire que sur un modèle animal et ne peut pas être remplacé par un modèle in vitro. De même, l’étude de l’influence d’un développement anormal sur l’organisation du cerveau adulte et ses conséquences comportementales ne peut se faire qu’avec des modèles animaux. Il n’existe pas de méthodes expérimentales n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettent d'étudier le développement du cerveau et ses effets sur des troubles moteurs et cognitifs. Ces éléments rendent l’utilisation de l’animal indispensable pour notre étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte la lignée de souris génétiquement modifiée nécessaire à l'étude et en réduisant au plus le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables et valides. Nous affinerons les analyses statistiques en fonction de données à analyser. De plus, afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. En nous basant sur nos études précédentes, nous estimons qu’il nous faudra de 8 à 20 animaux par groupe en fonction des analyses à réaliser. Ainsi, au total, nous estimons qu’il faudra 3086 animaux pour obtenir des résultats significatifs dans ce projet. Toutefois, si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux, tous ne seront pas utilisés, ni produits. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires pour nos lots expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce et seront observés quotidiennement. Les animaux que nous utilisons sont génétiquement modifiés. Comme seules les souris porteuses de 2 copies du gène muté présentent un phénotype dommageable, nous privilégierons un schéma de croisement permettant de limiter le risque d’expression du phénotype dommageable seulement aux animaux nécessaires pour les lots expérimentaux. Le maintien de la lignée privilégiera les animaux avec une seule copie du gène muté. Les animaux porteurs de 2 copies du gène muté seront particulièrement surveillés pour détecter tout signe précoce d’expression du phénotype dommageable, notamment des difficultés locomotrices et une prostration qui sont 2 signes caractéristiques liés à la mutation. La biopsie pour génotypage sera la plus petite possible et réalisée sur un animal jeune (cicatrisation rapide). Il s’agit d’un geste rapide, réalisé au calme et parfaitement maitrisé. Pour le maintien de notre lignée, afin d’éviter toute dérive génétique, toutes les 10 générations, nous croiserons notre lignée de souris avec des souris sauvages provenant d’un élevage extérieur. Les souris qui recevront des traitements à visée thérapeutique seront traitées à des doses déjà utilisées dans des publications et n’entrainant pas d’effets délétères. Ces souris seront néanmoins surveillées dans les jours qui suivent l’intervention pour vérifier qu’elles continuent à s’alimenter. De plus, les traitements chroniques seront administrés par incorporation à la nourriture afin de diminuer la manipulation des animaux. Pour réduire le stress en lien avec les prélèvements de sang ils seront réalisés sous anesthésie générale. Pour les animaux soumis à des prélèvements répétés, après chaque prélèvement une injection de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir toute déshydratation. Des points limites spécifiques à chaque procédure sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Un protocole d’analgésie sera utilisé lors de l’euthanasie des souris afin qu’elle se fasse sans douleur et sur un animal pré-sédaté.

Choix des espèces

Dans le projet, nous utiliserons un modèle de souris déjà caractérisé et qui récapitule les principaux symptômes observés chez les patients atteints de la forme de maladie que nous étudions. L’étude de ce modèle nous permettra donc d’obtenir des données transposables chez l’homme. Le modèle de souris utilisé présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau. Ce modèle est donc parfaitement adapté pour répondre à notre question scientifique, et il est impossible de répondre à cette question sans l’utilisation d’un modèle animal. Afin d’étudier les différentes composantes de la maladie et l’impact d’un traitement à différents âges sur son évolution, nous étudierons des animaux à partir du stade embryonnaire jusqu’à l’âge de 8 mois. La mutation génétique des animaux sera vérifiée à l’âge de 7 à 10 jours.

Cathéter veineux posé sous anesthésie jusqu'à une heure, deux injections par jour pendant environ un mois, séances de conditionnement de vingt minutes à deux heures par jour pendant jusqu'à quatre mois : 2 510 souris et rats vont être utilisés pour tester des candidats médicaments contre l'addiction. 1 910 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 600 d'un niveau léger, et 120 pourront être réutilisés après accord du vétérinaire, les autres étant tués lors d'un prélèvement terminal de sang ou de cerveau. Les tests comportementaux sont nommés, visites de compartiments et appuis sur leviers, et les animaux non-humains y sont rationnés en nourriture. Le porteur décrit les symptômes de sevrage attendus, hypothermie, tremblements, baisse d'activité, perte d'appétit pendant environ sept jours, et qualifie la restriction alimentaire de légère au motif qu'elle n'empêche pas la croissance pondérale.

Objectifs

La pharmacodépendance (dépendance aux substances psychoactives) représente une préoccupation majeure de santé publique. La plupart du temps, les drogues provoquent dans un premier temps des sensations de plaisir qui induisent un désir de renouveler l’expérience et conduisent certains sujets à ne plus pouvoir contrôler leur consommation. La pharmacodépendance réfère à un comportement pathologique de consommation, ayant des conséquences physiologiques, psychologiques et/ou sociales néfastes pour la personne et son entourage. La pharmacodépendance représente un problème majeur de Santé publique également de par le nombre très élevé de patients atteints ; à titre indicatif, selon les chiffres de 2022 publiés par l'Observatoire français des drogues et des tendances addictives (OFDT), 25,5% des adultes fument tous les jours et 10% boivent quotidiennement de l’alcool. Toujours selon l'OFDT, concernant les médicaments psychotropes (anxiolytiques, antidépresseurs, hypnotiques), 21% de la population de plus de 15 ans a bénéficié d'un remboursement de psychotrope au moins une fois dans l'année en 2017 en France ; or, ces médicaments peuvent être associés à un risque de mésusage ou d'abus. Enfin, les drogues illégales sont également expérimentées ou consommées de manière abusive par des millions de personnes en France. Or, les conduites addictives ont de multiples conséquences sanitaires et sociales (maladies, handicaps, suicides, violence, isolement, précarité...) et entraînent une mortalité évitable. Tout ceci souligne l'importance, outre les campagnes de prévention, de développer des traitements permettant de réduire la dépendance aux drogues (licites, illicites ou médicamenteuses) ainsi que les symptômes liés à l'arrêt de leur consommation (sevrage). L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité anti abus/dependance de candidats médicaments dans des modèles mimant l'abus, la dépendance, ou le sevrage de drogues.

Bénéfices attendus

La prise en charge de la pharmacodépendance repose généralement sur l’association d’un traitement médicamenteux, d’un suivi psychologique et d’un accompagnement social, mais il n'existe actuellement pas de traitement efficcae à 100% contre les problématiques liées à l'addiction ou au sevrage de drogues. Les procédures décrites dans ce projet permettent d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans des modèles mimant l'abus, la dépendance, ou le sevrage de drogues. Ces traitements seront évalués contre la dépendance induite par différentes drogues, en fonction de leurs spécificités et objectifs cliniques (par exemple contre la morphine ou le remifentanyl pour évaluer l'effet d'un traitement potentiel contre l'addiction aux opiacés/opioïdes, ou contre la nicotine pour évaluer l'effet de traitement anti-tabagisme...).

Procédures

Les substances à évaluer, les contrôles positifs et les contrôles négatifs sont administrées par bolus (environ 1 seconde) ou infusion intraveineuse d’une durée de quelques secondes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours ou semaines (minimum 1 injection à maximum 2 injections par jour pendant environ 1 mois), selon le traitement étudié. Les procédures peuvent également nécessiter une ’implantation sur animal vigile ou sous anesthésie (durée de quelques secondes à quelques minutes selon le site d’implantation) et/ou la pose d’un cathéter veineux ou d'un dispositif pour infusion lente sous anesthésie (durée maximum d'1 heure). Par ailleurs, des prélèvements de sang (durée de quelques secondes à 3 minutes) pourront être réalisés selon une fréquence déterminée dans la limite des considérations éthiques (de manière standard, un prélèvement par jour et pas plus de 10% du volume sanguin au cours de l’étude). Les phases de test comportemental surviennent le plus souvent quotidiennement durant toute la durée de la procédure et peuvent consister en une simple observation de l'animal sans manipulation ou en des phases de conditionnement et de tests (visites de compartiments ou appuis sur leviers) dans des dispositifs spécifiques (minimum de 20 minutes par jour pendant 10 jours à maximum 2 heures par jour pendant environ 4 mois, selon la procédure). De plus, pour certaines procédures, les animaux sont rationnés en nourriture pendant toute la durée de l’expérience soit environ 4 mois.

Impact sur les animaux

Les administrations, les phases chirurgicales (implantation sur animal vigile ou sous anesthésie) ou les prélèvements sanguins peuvent entrainer un stress ou une douleur légère. Dans le test de sevrage, l'animal peut ressentir des symptômes associés au sevrage pharmacologique (tels que l’hypothermie, des tremblements, une diminution de l’activité locomotrice, une perte d’appétit, etc…). Ces symptômes apparaissent généralement dans les 24 heures suivants l’arrêt du traitement et peuvent persister pendant toute la durée suivant la phase d'administration (en général 7 jours). Dans les autres tests, les animaux sont placés dans des dispositifs spécifiques (boites de conditionnement) pour une durée de 10-20 minutes à 2 heures, ce qui peut induire un stress lors de la première exposition du fait de la nouveauté de l'environnement (auquel les animaux s'habituent rapidement). Dans les procédures de conditionnement opérant, les animaux sont soumis à une légère restriction alimentaire qui peut augmenter la sensation de faim, mais n'empêche pas leur croissance pondérale.

Devenir

Pour les procédures légères et modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Les animaux soumis à un prélèvement terminal seront ethanasiés car le prélèvement d'une grande quantité de sang ou d'organes vitaux (tel que le cerveau) affecte le maintien en vie dans de bonnes conditions.

Remplacement

Ces tests ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils nécessitent l'étude de traitements expérimentaux dans un système complexe (interaction avec et entre les différents organes et systèmes physiologiques, que ce soit dans la phase de consommation ou de sevrage de drogues) et permettent l’étude des potentiels effets secondaires. Cependant, il existe des tests in vitro et in silico permettant de sélectionner en amont des molécules efficaces et dont la toxicité n’est pas avérée.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites spécifiques aux procédures et clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Pour toute procédure nécessitant une phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. En cas de prélèvements de sang, une anesthésie légère sera appliquée afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.

Choix des espèces

Aujourd'hui encore, Les rongeurs (rats et souris) demeurent l'espèce privilégiée pour évaluer l'efficacité des nouveaux candidats médicaments sur l'addiction et la pharmacodépendance. En effet, les rongeurs présentent des mécanismes neurobiologiques similaires à ceux rencontrés chez l'Homme, et il a été démontré leur capacité à s'auto-administrer plusieurs drogues de classes différentes, parfois jusqu'à cumuler les 3 principaux critères diagnostiques du Manuel diagnostique et statistique des troubles mentaux (DSM) symptomatiques d'une recherche compulsive et d'une perte de contrôle sur la prise de drogue. Principalement rongeurs (rats, souris) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historique et à la littérature scientifique. Ceci afin d'étudier les traitements potentiels aussi bien chez le jeune que chez l'adulte.

Le ventre rasé et badigeonné d'un produit allergisant et irritant sur animal vigile, puis les oreilles traitées sous une anesthésie profonde d'environ quarante minutes, 1 470 souris vont être utilisées dans un modèle d'eczéma de contact. 1 380 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 90 d'un niveau léger, et toutes seront tuées pour prélever oreilles, ganglions, rate et sang. S'y ajoutent jusqu'à quinze applications cutanées, des mesures d'oreille cinq fois par semaine sous anesthésie gazeuse, sept injections dans l'abdomen et une injection dans le sinus de l'œil. Le porteur écarte tout anti-inflammatoire, qui perturberait la réponse étudiée, et prévoit de tuer immédiatement les souris qui se grattent trop, sans préciser combien d'entre elles seront gardées jusqu'à six mois après l'induction de l'allergie.

Objectifs

Les eczémas allergiques tels que l’eczéma de contact (colorants, produits chimiques, nickel…) ou l’eczéma atopique (acariens, moisissures, poils de chien/chat…) se caractérisent par des lésions cutanées et sont dues à une réaction allergique. Ces eczémas touchent plus de 15% de la population. La cause des eczémas est complexe et reste mal comprise à ce jour. Ces dernières années, une population de cellules immunitaires (appelées Trm), ayant une fonction de mémoire à long terme et résidant dans les tissus a été mise en évidence. Ces cellules particulières patrouillent dans la peau à l’interface entre l’organisme et l’environnement. Il a été montré que ces cellules sont impliquées dans la récidive et la sévérité de l’eczéma. En effet, une des caractéristiques cliniques de l’eczéma est qu’il se développe sous forme de poussées, entrecoupées de périodes de rémission. Lors des poussées, dont la sévérité augmente généralement au cours du temps, les lésions reviennent préférentiellement sur les sites antérieurement atteints. Cette étude vise à mieux comprendre les mécanismes permettant aux Trm de s’établir et de persister à très long terme dans la peau. Deux stratégies seront utilisées pour moduler ces mécanismes dans un modèle d’eczéma de contact allergique : 1. l’application cutanée de molécules modulant le cycle de vie des Trm, 2. l’utilisation de souris portant des Trm génétiquement modifiés. Cette étude vise également à mieux comprendre le devenir des Trm dans l'organisme grâce à l'utilisation de souris portant des Trm fluorescents permettant de les localiser dans l'organisme. Puisqu’il a été montré que les Trm sont impliqués dans la récidive et la sévérité de l’eczéma, nous espérons que mieux connaitre ces cellules nous permettra à terme de développer de nouvelles solutions thérapeutiques permettant de les éliminer et donc de traiter cette pathologie à sa source. En effet, les traitements actuels préconisés dans ces eczémas (notamment les dermocorticoïdes (anti-inflammatoires)), bien que permettant de soulager les symptômes de l’eczéma, ne permettent pas d’empêcher les récidives de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’eczéma et une meilleure compréhension du cycle de vie des Trm. Il pourra servir en outre de preuve de concept de l’intérêt de cibler les Trm pour traiter l'eczéma ou d'autres maladies inflammatoires chroniques. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes permettant de stopper la récurrence des poussées d’eczémas.

Procédures

Dans la plupart des procédures, les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre rasé au début des procédures. Cette procédure (rasage + application du produit) sera réalisée sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. 5 jours après, les mêmes animaux recevront une application du même produit sur leurs oreilles. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie profonde (durée de l'anesthésie : environ 40 minutes), induite après injection d'un produit anesthésiant (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Dans la plupart des procédures, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine, pendant 2 semaines. Ces mesures seront effectuées sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes). Dans certaines procédures, les animaux recevront une application cutanée au niveau des oreilles (15 applications maximum - durée de la procédure d'application : 30 secondes), sur une durée maximale de 5 semaines. Ce traitement sera réalisé sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes). Dans certaines procédures, les animaux seront pesés 2 fois (durée de la pesée : 30 secondes). Dans la plupart des procédures, les animaux recevront des injections à l'abdomen (7 injections maximum) . Ce traitement sera réalisé sur animal vigile (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Dans l'une des procédures, les animaux recevront une injection dans le sinus de l'oeil (durée de l'injection : 30 secondes). Cette procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes), après application d'un anesthésiant local (durée de l'application de l'anesthésiant : 30 secondes). Dans cette procédure, les animaux seront également soumis à un prélèvement sanguin (durée du prélevement : 30 secondes), après application d'un anesthésiant local (durée de l'application de l'anesthésiant : 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur au point d’injection lors des injections intra-péritonéales et intraveineuses ; ii) le stress généré par l’anesthésie et/ou l'application d'un produit par voie épicutanée ; iii) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang et les injections intraveineuses ; iv) une légère inflammation au niveau de l'oeil suite à l'injection intra-veineuse ; v) une légère inflammation (pouvant induire un grattage léger) au niveau des oreilles ou du ventre, après application du produit allergisant.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever leurs oreilles, leurs ganglions (et éventuellement leur rate et leur sang). Ces différents organes sont ensuite utilisés pour analyser la réponse immunitaire.

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet de récapituler de manière satisfaisante la complexité de la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés, dans le cadre de l’allergie. En effet, les cellules que nous étudions dans ce projet sont des cellules initialement circulantes, qui pénètrent dans le tissu suite à la ré-application de l'allergène sur la peau de l'animal et recirculent ensuite progressivement dans l'organisme.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe expérimental et 5 animaux par groupe contrôle est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximum d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra diminuer en fonction des résultats obtenus. Par exemple, certaines procédures ne seront réalisées qu'en cas de succès d'autres procédures.

Raffinement

Afin d'optimiser le bien-être des souris, nous réaliserons une observation clinique des animaux 5 fois par semaine (durant les 2 premières semaines de chacune des procédures) puis de manière hebdomadaire jusqu'à la mise à mort des animaux. Nous attacherons ainsi une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés (anesthésie générale ou locale) pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non. L'application d'un produit anti-inflammatoire ou cicatrisant n'est pas envisageable pour les souris présentant des lésions d'eczéma car cela risquerait de perturber le déroulé de la réponse inflammatoire et donc d'impacter les cellules étudiées dans cette étude. Dès lors, les animaux présentant des signes de grattage excessif seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier les pathologies inflammatoires telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes et en raison de l’existence d’une grande variété de lignées transgéniques. De plus, de nombreux produits, spécifiques à l'immunologie ne sont disponibles que chez la souris. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de molécules inflammatoires ou l’induction de différentes populations de cellules mémoires. De plus, les travaux de recherche sur les cellules étudiées dans ce projet sont également réalisés chez la souris. Dès lors, dans l’optique de pouvoir confronter nos résultats à ceux obtenus par d’autres, l’utilisation du modèle murin est indispensable à notre étude. Idéalement, nous utiliserons des animaux adultes de 6 à 12 semaines: le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature au moment de l’induction de la réponse immunitaire. Toutefois, des animaux d’un âge maximum de 1 an au moment du début des procédures pourront être utilisés (en particulier lorsqu’il s’agit des lignées d’animaux transgéniques), afin d’utiliser au mieux les animaux disponibles. En effet, selon nos expériences antérieures, les cellules étudiées dans ce projet ont un comportement similaire chez des souris d’1 an et chez des animaux plus jeunes. Dans certaines procédures, une partie des animaux seront gardés jusqu’à 6 mois après induction de la réponse allergique.

90 souris femelles vont être utilisées dans ce projet, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. 60 d'entre elles reçoivent deux injections d'hormones pour produire davantage d'embryons, et 40 seront tuées pour récupérer ces embryons. 30 autres subissent une chirurgie de réimplantation d'une quinzaine de minutes, avec une agrafe dans le dos, puis seront tuées après la naissance des petits, tandis que 20 femelles sans bouchon vaginal repartent en zone d'élevage. Le porteur annonce comme bénéfice une amélioration des conditions d'hébergement des lignées et écrit qu'il n'est "pas possible de remplacer l'utilisation d'animal" puisque le projet consiste précisément à décontaminer des lignées de souris.

Objectifs

Cette technique de décontamination, permet à des lignées hébergées en animalerie conventionnelle (zone exempt de pathogènes responsables de maladie qui peut se transmettre de l'animal à l'homme ou de l'homme à l'animal) d'être transférées en animalerie protégée EOPS (zone exempte d'organismes pathogènes spécifiques) et donc d'être étudiées au niveau immunitaire sans interférence des stimulis du milieu environnant. Tous les éléments entrant en contact avec les animaux sont ainsi contrôlés: air filtré, nourriture irradiée, eau de boisson filtrée, litière autoclavée, procédures strictes d'habillement et de circulation des personnes fréquentant l'animalerie. Les lignées ainsi décontaminées sont ensuite récupérées par les chercheurs afin de poursuivre leurs études phénotypiques dans le cadre de leurs projets. La décontamination de lignées se fait par transfert d'embryons et est basée sur le principe que l'embryon est protégé par sa membrane pellucide de tout contaminant présent chez la mère. Les lavages successifs des embryons permettent d'éliminer tout contaminant éventuellement présent autour de l'embryon lors de sa collecte.

Bénéfices attendus

La décontamination de lignées de souris par transfert d'embryons permet de modifier le statut sanitaire des lignées et donc leurs conditions d'hébergement, qui sont ainsi améliorées, sans perdre le génotype des animaux. Des souris hébergées dans des conditions d'animalerie conventionnelle sont exposées en permanence à des stimulations de leur système immunitaire par l'environnement (air, litière, nourriture, eau de boisson, personnes fréquentant l'animalerie). Ces stimulations ont forcément un impact sur les réponses immunitaires des animaux. Les études scientifiques qui portent sur des modèles de souris et qui s'intéressent à l'effet de mutation génétique sur les réponses immunes doivent s'affranchir des stimulations non contrôlées des animaux par leur environnement. La décontamination de ces lignées permet leur hébergement en animalerie protégée dans des conditions extrêmement contrôlées (air filtré, eau de boisson filtrée, nourriture irradiée, litière autoclavée, procédures strictes d'habillement et de circulation des personnes en contact avec les animaux).

Procédures

Au cours de ce projet, les différents femelles utilisées seront soumises à: - 2 injections intrapéritonéales lors du parcours de superovulation pour les 60 femelles fertiles des lignées à décontaminer - 1 chirurgie de réimplantion d'embryons lors du transfert d'embryon d'une durée de 15 minutes maximum et 3 administrations sous-cutanées sous anesthésie gazeuse pour les 30 femelles pseudo-gestantes.

Impact sur les animaux

La piqûre d'aiguille pour l'injection des hormones aux femelles recevant le protocole de superovulation entraine une douleur légère et de courte durée et un stress physique de courte duré. La piqûre d'aiguille pour l'injection de la buprénorphine aux femelles recevant les embryons entraine une douleur légère et de courte durée et stress physique de courte duré. L'intervention chirurgicale des femelles recevant les embryons entraine un stress physique ainsi qu'une gêne liée à la présence de l'agrafe sur le dos.

Devenir

A la fin de la procédure "Superovulation et prélèvement d'embryon": 20 animaux seront replacés en zone d'élevage (20 femelles des lignées à décontaminer non bouchées). Au cours de ce projet, 70 animaux seront euthanasiés (40 femelles fertiles des lignées à décontaminer seront euthanasiées pour recupérer les embryons + 30 femelles réimplantées aprés naissance des petits)

Remplacement

Ce projet consiste à décontaminer des lignées de souris. Il n'est donc pas possible de remplacer l'utilisation d'animal. La décontamination des lignées intervient dans le contexte de recherches fondamentales visant à comprendre, dans sa globalité et sa complexité, le contrôle de la réponse immune et les lymphoproliférations. Ces études ne peuvent s'effectuer que sur des modèles animaux car les modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires ne suffisent pas pour l'étude des systèmes complexes et multi-localisés tel que le système immunitaire. La décontamination des lignées permet de contrôler l'impact du milieu environnant sur les animaux et limiter les stimulations du système immunitaire car tous les éléments entrant en contact avec les souris sont contrôlées (air filtré, nourriture irradiée, eau de boisson filtrée, litère autoclavée, procédures strictes d'habillement et de circulation des personnes fréquentant l'animalerie).

Réduction

Les femelles utilisées pour la production d'embryons vont recevoir un traitement hormonal afin d'augmenter le nombre d'embryons récoltés, ceci permet de limiter le nombre de femelles utilisés. Le nombre de 6 femelles par expérimentation de décontamination a été determiné en prenant en compte les expérimentations passées. Ce nombre permet d'avoir un nombre suffisant de femelles bouchées et par conséquent un nombre suffisant d'embryons nous permettant d'avoir des résultats dès la première expérimentation. Les femelles ne présentant pas de bouchon vaginal seront remises dans leur zone d'hebergement afin d'être utilisées pour d'autres expérimentations du laboratoire.

Raffinement

Les animaux bénéficient d'enrichissement dans les cages conformes aux recomandations de la structure bien être de l'établissement. Le personnel est formé à l'expérimentation (manipulation, injection) ainsi qu'à la chirurgie sur le petit animal et maintien ses compétences au cours du temps. Ainsi, toutes les précautions sont prises pour induire un minimum de douleur chez l'animal. La surveillance des animaux en expérimentation est renforcée les jours suivants afin de s'assurer du bien être animal. Un protocole de gestion de la douleur est établi et mis en place dès que le score de douleur établi lors des surveillances quotidiennes le prévoit. Aprés la chirurgie, des croquettes humides sont placés dns la cage afin que l'animal puisse avoir accés à l'eau et à la nourriture le temps de recouvrer une mobilité normal (moins de 24h).

Choix des espèces

L'utilisation des souris est justifiée dans les projets du laboratoire les utilisant et faisant l'objet d'autres demandes d'autorisation de projets. De fait, le présent projet visant à décontaminer des lignées de souris pour les soumettre à un environnement microbien plus strict ne peut se faire que sur l'espèce Mus musculus. Les animaux seront utilisés entre 2 et 12 mois qui correspond, chez la souris, à l'âge correct à optimal de fertilité. De plus, à cet âge, les femelles receveuses d'embryon supportent bien la chirurgie.

Endormies au masque, implantées une fois avec des cellules tumorales sous la peau, dans le péritoine ou dans la bouche, puis attrapées trois fois par semaine pour le suivi, 2 520 souris vont être utilisées dans ce projet sur le microenvironnement immunitaire des tumeurs. Suivent douze injections de substrat pour l'imagerie par bioluminescence, trois injections d'immunothérapie et deux administrations nasales d'un vaccin expérimental. 1 376 souris relèvent d'un niveau de souffrance léger, 1 144 d'un niveau modéré. Toutes seront tuées pour prélever les tumeurs et un grand nombre d'organes associés, le porteur indiquant que 70 % des expériences s'arrêtent au dixième jour, avant les premiers signes de douleur.

Objectifs

Notre projet a pour but de comprendre les mécanismes liés aux cellules immunitaires se trouvant à l’intérieur des tumeurs et en particulier aux lymphocytes qui sont les cellules immunitaires tueuses de tumeurs. A l'intérieur des tumeurs, la capacité tueuse des lymphocytes est inhibée par l'expression de molécules, appelées "checkpoints", à la surface des lymphocytes. Nous cherchons à comprendre les mécanismes menant à l'expression des "checkpoints" sur les lymphocytes. Nous cherchons à tester dans nos modèles précliniques l’efficacité de traitements bloqueurs de chekpoints (dont certains sont déjà utilisés en clinique) ainsi que d’un vaccin anti-cancer et comprendre ce que leur utilisation déclenche dans l’organisme. Nous planifions d’utiliser des modèles précliniques tumoraux permettant d’étudier 1) le développement des tumeurs primaires localisées sous la peau des souris (modèle classique d'oncologie préclinique), 2) le développement des tumeurs primaires localisées en orthotopique (c’est-à-dire dans l’organe duquel les cellules tumorales sont issues, comme par exemple intra-oral pour les tumeurs de cancers oraux).

Bénéfices attendus

En utilisant ces modèles précliniques de cancer, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires caractéristiques des lymphocytes "tueurs de tumeurs". Nous comprendrons comment les tumeurs contournent leur activité cytotoxique en induisant l'expression des checkpoints. Pour cela, nous avons besoin que les tumeurs évoluent dans leur environnement de prédilection, à savoir dans leur organe d'origine. D'où l'utilisation des modèles d'implantations orhtotopiques, qui nous permettent de positionner les cellules tumorales dans leurs organes d'origine. Ainsi, en ciblant, de façon appropriée à chaque type tumoral, les checkpoints exprimés par les lymphocytes, et en développant des vaccins permettant d'activer ces mêmes lymphocytes, nous pourrons proposer une amélioration des stratégies thérapeutiques déjà en place. Cela pourrait permettre, à terme, de faire évoluer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de cancers oraux, du col de l'utérus, des ovaires.

Procédures

Les animaux sont soumis: 1) à des procédures d'implantations de cellules tumorales (implantation sous-cutanée (SC), implantation orthotopique intra-péritonéale (IP), implantation intra-orale (IO), 2) à des procédures d'injection intra-péritonéale de composants de type: anesthésiant, substrat de l'enzyme exprimée par les cellules tumorales, immunothérapies (anticorps inhibiteurs de checkpoints), et 3) à une procédure d'administration intra-nasale de vaccin - Les procédures d’implantation de cellules tumorales ne seront effectuées qu'1 seule fois par animal, chacune dure environ 5 min par animal. - Les procédures d’ injection d'anesthésiant IP seront effectuées 2 fois par animal (1 fois à l'implantation du cancer), elles durent 2 min par animal. L’injection de substrat sera effectuée 12 fois par animal (à chaque mesure lors du suivi par caméra bioluminescente), sur souris déjà anesthésiée et dure 2 min par animal. 2): l'immunothérapie sera injectée 3 fois par animal, elle dure 2 min par animal. – L’administration du vaccin sera effectuée 2 fois par animal, sur animal anesthésié, elle prendra 5 min par animal.

Impact sur les animaux

L’injection des tumeurs requiert une intervention modérée et nécessite une contention (indolore) puis un positionnement sur les masques pour induction d’endormissement. L’injection des lignées tumorales dans les différents organes nécessite de piquer avec une aiguille de très faible diamètre, et n’aura lieu qu’une seule fois, sur des animaux endormis, évitant ainsi douleur ou stress. Pour l’injection des traitements, les animaux recevront maximum 3 doses, au début du développement de leur tumeur avec une préhension des souris à chaque fois (temps limité à moins de 30sec) et une piqûre avec une aiguille de très faible diamètre (douleur légère et de courte durée). Pour les mesures de suivi de développement tumoral, les animaux seront régulièrement attrapés (3x/semaine, induisant un léger stress). Nous veillerons à ce que le même expérimentateur suive et traite les souris, afin de créer au maximum une habituation, limitant le stress lié à la contention et à l’injection.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, le développement des tumeurs sera suivi chez les animaux et les animaux seront mis à mort pour prélèvements. Les tumeurs, ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs, seront prélevés juste après l'euthanasie.

Remplacement

Notre étude vise à explorer les mécanismes immunitaires dans les tumeurs épithéliales de plusieurs origines afin de développer des immunothérapies (anticorps et vaccin) et de comprendre la résistance des tumeurs aux immunothérapies actuelles. Le modèle d’étude doit nécessairement refléter la complexité multi-cellulaire d'une tumeur avec son microenvironnement. Nous ne pouvons pas in vitro (ni dans des organoïdes, ni dans une flasque de culture in vitro) reconstituer un microenvironnement complet autour des cellules tumorales, qui contiendrait un réseau complexe multicellulaire et reflèterait la réalité d’une tumeur chez un patient.

Réduction

Afin de Réduire le nombre d’animaux en expérimentation, une étude complète de la littérature actuelle concernant notre projet a été effectuée pour de ne pas reproduire des résultats d’expériences déjà effectuées sur des animaux. Par ailleurs, nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats, standardiser et limiter le nombre d’expériences à effectuer à 2, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Nous désignons également nos manips afin d'obtenir un maximum d'informations par animal testé, ce qui évite l'utilisation d'animaux supplémentaires. Le groupe témoin sera utilisé pour comparaison avec plusieurs lots d’animaux afin de diminuer l’utilisation inutile d’animaux.

Raffinement

Pour optimiser le raffinement, notre long recul (>18ans) sur ces modèles permettra un suivi et une évaluation au plus juste de l’inconfort et de l’éventuelle apparition de souffrance. En effet, 70% des expériences seront arrêtées à J10, bien avant les 1ers signes de douleur. Dans les 30% d’expériences de suivi longitudinal, aucune nécessité de maintenir les animaux en souffrance, ainsi les animaux seront euthanasiés avant d’atteindre le point limite. Les procédures seront réalisées par des expérimentateurs formés à l’expérimentation animale et au bien-être animal. Ces procédures seront réalisées sous anesthésie, pour éviter le stress et la douleur. La préhension des animaux se fera en dirigeant doucement sur notre main posée en coupelle dans la cage, avant de la poser sur une grille et d’effectuer la contention. Puis une fois endormis, les animaux seront posés sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Du gel oculaire sera déposé sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. Une attention particulière sera portée à la récupération post-implantation des tumeurs : les cages ne seront enclenchées sur les portoirs ventilés qu’une fois les animaux bien réveillés afin d’éviter une baisse de température liée à la ventilation dans les cages. Egalement en post-opératoire, les souris recevront une alimentation enrichie dans des contenants déposés au sol afin qu’elles n’aient pas à se redresser pour se nourrir. Les conditions d’hébergement se feront selon les recommandations européennes, dans des cages collectives. Des objets appropriés (tubes cartons, lanières papier kraft, papier absorbant.) seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, de diminuer leur stress, de faciliter leur thermorégulation et de leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations quotidiennes comportementales et physiologiques des souris. Même si les points limites ne devraient pas être atteints pour nos procédures, nous veillerons à éviter toute souffrance ou détresse chez les animaux. Dès les 1ers signes anticipant l’apparition du point limite, la décision d’euthanasier l’animal sera prise et aucun animal ne sera maintenu en souffrance.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme modèle d’étude selon plusieurs critères : -La litérature scientifique, définissant le système immunitaire murin comme pertinent pour étudier et comprendre le système immunitaire humain. -leur petite taille qui facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (où plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie). -la biodisponibilité des souris transgéniques permettant d’étudier des mécanismes immunitaires en détail. Les souris adultes peuvent être utilisées pour le projet (à partir de 6 à 8 semaines). En effet, nous nous intéressons à la pathologie du cancer épithélial humain chez l’adulte.

Anesthésiées 90 minutes, exposées à Candida albicans, puis injectées avec des substances ciblant certaines cellules, 1 310 souris vont être utilisées pour étudier les macrophages de la langue. 1 190 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance modéré, les 120 autres d'un niveau léger. Le porteur qualifie le champignon d'inoffensif et annonce qu'aucun effet notable n'a été observé, hors de légères réactions inflammatoires temporaires, ce qui cadre mal avec la gravité modérée déclarée pour la quasi-totalité de l'effectif. Toutes seront tuées pour prélever les organes à analyser, et le porteur compte parmi ses mesures de réduction le fait d'utiliser toutes les souris nées des accouplements selon leur profil génétique.

Objectifs

Ce projet vise à examiner le rôle immunitaire des macrophages dans la langue. Il comporte plusieurs objectifs spécifiques. Tout d’abord, une cartographie de la réponse immunitaire : cette étape implique l'identification et la localisation des macrophages et autres cellules immunitaires dans la langue après infection par un champignon commensal (un micro-organisme qui vit en équilibre avec son hôte sans lui causer de dommages). Nous étudierons également l'origine et le comportement dynamique des macrophages nouvellement formés lors de la colonisation par ce champignon commensal.

Bénéfices attendus

La langue est un organe complexe qui remplit des fonctions vitales pour l'hôte, comme la détection des saveurs, la mastication et la parole. En raison de sa position anatomique, la langue est l'un des premiers organes exposés aux microorganismes présents dans la nourriture ou en suspension dans l'air. Malgré cela, l'immunité de la langue reste mal comprise. Les macrophages sont des cellules immunitaires multifonctionnelles qui ont récemment retenu l'attention des chercheurs en raison de leur capacité à réguler la réponse immunitaire. Les macrophages de la langue, en particulier, sont encore largement méconnus. Ce projet vise à 1) élucider le rôle spécifique des macrophages de la langue dans la défense immunitaire contre Candida albicans, un champignon naturellement présent dans le corps humain, mais qui peut provoquer des infections sous certaines conditions. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour renforcer la réponse immunitaire locale et prévenir les infections fongiques ; 2) comprendre pourquoi les macrophages de la langue sont générés en l'absence de leurs facteurs nutritifs (comme l'IL-34) et comment ce champignon commensal influence ce processus. Ces informations cruciales sur la régulation de cette population immunitaire pourraient conduire à de nouvelles connaissances fondamentales sur l’origine de ces cellules. Les résultats de ce projet pourraient avoir des implications cliniques significatives, notamment pour les populations vulnérables telles que les nourrissons, les personnes âgées et les individus immunodéprimés. Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires locaux pourrait aboutir à des interventions préventives ou thérapeutiques plus efficaces, réduisant ainsi la morbidité associée aux infections fongiques orales.

Procédures

Les souris subiront plusieurs interventions selon les protocoles. Tout d'abord, elles recevront une injection d’anesthésique dans le ventre, suivie d'une exposition à un champignon inoffensif, pour une durée d'environ 90 minutes. Certaines souris recevront une injection d'une substance qui cible certaines cellules spécifiques, tandis que d'autres recevront un médicament contre le champignon par injection et dans l'eau qu'elles boivent. Enfin, chez les souris nouveau-nées, un petit tatouage sera réalisé et un morceau de queue sera prélevé. Chaque intervention, sauf celles impliquant le champignon, sera courte (quelques minutes), et les souris seront surveillées après chaque procédure pour s'assurer de leur bien-être.

Impact sur les animaux

L’évaluation de l’action des macrophages contre les champignons inclut l’utilisation de Ca101, une souche de champignon inoffensif. L’utilisation de cette souche est relativement récente, mais nos partenaires de recherche l’utilisent régulièrement. Ils ont observé que ce champignon colonise de manière durable les souris, sans causer de problèmes majeurs ni de perte de poids. En ce qui concerne les effets indésirables attendus, aucun effet notable n'a été observé chez les souris, à l'exception de légères réactions inflammatoires temporaires, qui devraient se résorber rapidement sans impact à long terme.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux sont mis à mort afin de prélever les organes d’intérêt pour analyse.

Remplacement

L´utilisation du modèle animal est indispensable ici, car il n´est pas possible de reproduire la complexité des interactions entre les cellules immunitaires et le champignon au niveau lingual en culture cellulaire. Par ailleurs, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées reposent exclusivement sur l´utilisation de souris génétiquement modifiées.

Réduction

Nous avons soigneusement calculé le nombre de souris nécessaires pour cette étude afin de garantir des résultats fiables tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Pour cela, nous utilisons des méthodes adaptées qui permettent d’obtenir des conclusions précises avec le moins de souris possible. De plus, toutes les souris nées lors de l’accouplement seront utilisées selon leur profil génétique, ce qui contribue à réduire le nombre total d’animaux impliqués dans l’étude. Cet engagement envers le principe de réduction souligne notre responsabilité éthique envers le bien-être animal.

Raffinement

Notre animalerie possède le statut EOPS (Élevage et Optimisation des Souris Pathogènes Spécifiques), ce qui nous aide à réduire les variations causées par les infections. Les souris sont logées dans des cages de 530 cm², accueillant jusqu'à 5 souris adultes, ce qui favorise leur vie sociale et leurs comportements naturels. Nous utilisons du coton ou des cartons pour leur permettre de faire des nids. Les conditions de vie sont optimales, avec une température de 21 °C et un environnement calme. Lors des procédures 1, 3, 4 et 5, les souris seront anesthésiées pendant 90 minutes sur un coussin chauffant, avec un gel oculaire pour protéger leurs yeux. La souche de Candida albicans que nous utilisons permet une colonisation durable sans effets indésirables significatifs. Des mesures strictes, comme une surveillance accrue et une alimentation hydratée, sont mises en place pour garantir le bien-être animal. En cas de signes de souffrance, une mise à mort précoce pourra être envisagée pour éviter des douleurs prolongées. Les injections sur les animaux éveillés seront réalisées par un personnel expérimenté pour réduire le stress. Les souriceaux seront génotypés par un prélèvement de tissu dans la queue, effectué sur des animaux âgés de 7 à 10 jours.

Choix des espèces

Le modèle murin, Mus musculus, est un mammifère dont 99 % des gènes sont orthologues à ceux de l’homme. Les techniques de mutagénèse conditionnelle sont exclusivement disponibles chez la souris et validées pour l’étude physiopathologique des gènes. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour offrir des enseignements précieux sur le fonctionnement du système immunitaire des deux espèces, avec des applications cliniques potentielles. De plus, la taille, la rapidité du cycle reproductif et la génétique de la souris en font le modèle idéal pour les études envisagées. Dans ce cadre, seuls des souris adultes seront utilisées afin d’étudier les mécanismes spécifiques au système immunitaire adulte.