Procédures légères
Evaluation du rôle de l’interleukine 2 dans des modèles de maladies inflammatoires auto-immunes chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une souris paralysée ou amaigrie jusqu'à un quart de son poids est mise à mort dès qu'un point limite est atteint. 2 500 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Les expérimentateurs déclenchent chez elles soit une maladie qui mime la sclérose en plaques, avec une paralysie remontant des pattes arrière vers l'avant, soit un lupus qui part d'une inflammation de l'oreille et se généralise sur huit semaines. S'y ajoutent des prélèvements sanguins jusqu'à quotidiens et jusqu'à trois ponctions de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie. Les traitements plus efficaces annoncés sont renvoyés au moyen terme et au conditionnel, tandis que le porteur qualifie d'"indispensable" l'accès aux organes qui interdit de garder ces souris en vie.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre de nos recherches sur les maladies inflammatoires auto-immunes, qui constituent un enjeu majeur de santé publique. Il a pour objectif de faire progresser les connaissances en explorant les mécanismes inflammatoires communs à plusieurs de ces maladies. Dans la sclérose en plaques (SEP), l'organe inflammé est le système nerveux central, tandis que dans le lupus systémique, différents organes sont affectés. Ces deux maladies sont très invalidantes : la SEP est la deuxième cause de handicap acquis chez les jeunes adultes, après les traumatismes, et elles touchent majoritairement les jeunes femmes. Si les traitements ont connu des avancées, aucune thérapeutique ne permet encore de soigner ces maladies, les traitements actuels sont peu efficaces sur l'aggravation des symptômes avec le temps. Dans ce contexte, il est indispensable de poursuivre les efforts de recherche pour développer de nouveaux traitements. Pour cela, une meilleure compréhension du développement de la maladie, obtenue par l'étude de modèles pertinents chez la souris, constitue un prérequis essentiel. Nous proposons, dans ce projet, d'étudier le rôle d'une molécule, l'interleukine-2 (IL-2), dans la régulation des mécanismes inflammatoires impliqués dans la SEP et le lupus. La thérapie par l’IL-2 a montré un potentiel considérable lors d’essais cliniques chez l'homme en tant que traitement de ces deux maladies. Cependant, les cibles cellulaires de ce traitement ne sont pas encore toutes bien identifiées ce qui limite la compréhension des mécanismes biologiques sous-jacents freinant l'optimisation et l'élargissement de son usage thérapeutique. À l'aide de modèles souris mimant ces maladies, nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes thérapeutiques de l'IL-2 au niveau cellulaire.
Bénéfices attendus
Nos travaux permettront de faire progresser les connaissances sur la physiopathologie de la SEP et du lupus, notamment en explorant les mécanismes inflammatoires impliqués. Le projet vise également à mieux comprendre les mécanismes thérapeutiques de l'IL-2. À moyen terme, ces travaux pourraient mener au développement de thérapies plus efficaces et mieux ciblées pour traiter les maladies inflammatoires auto-immunes, en optimisant l'utilisation de l'IL-2.
Procédures
Après immobilisation, les animaux au sevrage seront prélevés au niveau de queue ou de l’oreille (geste réalisé en moins d'une minute). Pour l’induction de la SEP, les animaux endormis recevront une ou deux injections sous la peau (geste réalisé en moins d'une minute) et deux injections abdominales après l’induction (jour 0 et jour 2, geste réalisé en moins d'une minute). Le traitement sera injecté quotidiennement (immobilisation rapide de l'animal, moins de 30 secondes) pendant maximum 4 semaines. Pour l’injection de cellules immunitaires, les souris seront endormies avant l’injection (pas plus d’une minute par souris). Pour le déclenchement d’un lupus, une immobilisation sera réalisée le temps d'appliquer la crème sur l'oreille (environ 30 secondes 3 fois par semaine) ou de faire une injection abdominale (geste réalisé en moins d'une minute, 3 fois par semaine). Les prélèvements sanguins répétés seront réalisés sur animaux immobilisés (environ une minute), à raison d’un prélèvement hebdomadaire ou quotidien en fonction du volume prélevé. Le prélèvement de liquide céphalo-rachidien (liquide dans lequel baigne le cerveau) après endormissement de l'animal (20 minutes) maximum 3 fois au cours de l'expérimentation avec 7 jours d'intervalle minimum.
Impact sur les animaux
Toutes les lignées de souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Le prélèvement au niveau de la queue ou de l’oreille peut entrainer de la douleur et du stress chez l’animal. L’induction de la maladie qui mime la SEP consiste à déclencher une réaction immunitaire au niveau du système nerveux central avec apparition d’une paralysie progressive mais transitoire (rémission partielle) allant des membres postérieurs vers les membres antérieurs. Cette procédure engendre un affaiblissement de l’animal avec une perte de poids transitoire dès le début de l’apparition des symptômes (J9-J10) pouvant atteindre jusqu’à 25%. L‘induction d’un lupus consiste à déclencher une inflammation, d’abord locale au niveau de la peau, puis généralisée entraînant l'affaiblissement de l'animal (perte de poids progressive à partir de 3 semaines de traitement qui peut atteindre 20% après 8 semaines de traitement). Pour les deux modèles (SEP et lupus), si l’un des points limites que nous avons définis est atteint, la souris sera mise à mort selon une méthode réglementaire.
Devenir
L'accès aux organes ainsi qu'aux fluides biologiques d’intérêts est indispensable. Il nous est donc impossible de garder en vie les animaux concernés par l’étude.
Remplacement
L’évaluation de l'efficacité du traitement sur les réponses immunitaires au cours de maladies auto-immunes inflammatoires nécessite l’utilisation d’animaux et l’accès aux différents organes touchés par la maladie : organes du système immunitaire (rate, ganglions, moelle osseuse), organes du système nerveux central (SNC : moelle épinière et cerveau) et rein, peau, poumon, glandes salivaires... Cette évaluation n’est pas possible en dehors de l'animal car ces pathologies complexes touchent de multiples organes simultanément (SNC, reins, système immunitaire, système vasculaire…). Les atteintes des tissus ne peuvent pas être modélisées en dehors de l'animal.
Réduction
Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Des projets précédant nous ont permis de déterminer précisément le nombre d’animaux nécessaires pour avoir des résultats significatifs. De plus, le laboratoire possède déjà une expertise dans l’induction de la SEP chez la souris ce qui nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisé lors de la mise en place de cette nouvelle étude. Pour le lupus, nous choisirons la méthode permettant d’induire efficacement une maladie chez tous les animaux. Les analyses sur les fluides biologiques (sang) à l'aide de micro-prélèvements (petits volumes) et des techniques de dosages combinées et ultrasensibles, permettront de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs tout en améliorant la qualité des données obtenues.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adéquates : locaux spécialisés, cages de dimension réglementaire, eau et nourriture à volonté. Les animaux sont maintenus maximum à 5 par cage. Un suivi quotidien des animaux comprenant une évaluation de leur bien-être, une mesure de leur poids et une évaluation de leur comportement, permettra de pouvoir contrôler correctement leur état de santé. Les procédures expérimentales du projet utilisent des méthodes éprouvées, précises, rapides et réalisées par du personnel formé, ce qui limite les effets de stress et douleurs chez les animaux. Les analyses biologiques réalisées dès les premiers stades de la maladie, serviront d'outils diagnostics ce qui permettra de réduire le temps d'expérimentation et donc la souffrance animale.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris. Ce modèle animal nous permet de déclencher des pathologies auto-immunes inflammatoires (sclérose en plaques ou lupus) pour étudier les mécanismes biologiques de ces maladies et évaluer l'efficacité de traitements avant l'évaluation chez l'homme. Chez l'homme, les maladies auto-immunes peuvent se déclencher chez l'adulte jeune ou âgé. Nous induirons donc ces maladies sur des animaux de 8 à 12 semaines (âge correspondant à des souris adultes jeunes) ou de 14 mois (âge correspondant à de vieilles souris).
Epreuve CAV1 (Adénovirus Canin de type 1) par voie intra-veineuse chez le chien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Vaccinés une à cinq fois, puis infectés par l'adénovirus canin injecté dans une veine sous anesthésie, 50 chiens subissent ensuite des prélèvements sanguins répétés et une observation clinique quotidienne, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Des chiots de quatre à sept semaines peuvent être inclus, hébergés avec leur mère ou une nourrice. Les chiens non vaccinés forment le groupe témoin et développent la maladie sans protection, avec diarrhées, apathie, hypothermie et douleur abdominale. Aucun ne ressort du bâtiment de confinement, tous sont tués en fin d'étude pour des raisons de biosécurité.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité d’un vaccin destiné au chien contre l’Hépatite de Rubarth. Pour qu’un vaccin soit autorisé, il faut notamment démontrer que celui-ci apporte un effet bénéfique sur l’animal pour la pathologie considérée. Les études sont réalisées sur l’espèce cible (chien) pour s’approcher au mieux des conditions réelles d’utilisation (Pharmacopée Européenne et réglementations des pays destinataires). Pour démontrer l’efficacité d’un vaccin contre cette pathologie canine, une phase d’épreuve suit la phase d’administration du vaccin. L’épreuve correspond à l’administration d’un agent pathogène pour reproduire expérimentalement la pathologie.
Bénéfices attendus
La finalité de ces études est de permettre le développement de vaccins efficaces contre l’Hépatite de Rubarth et donc de réduire l’impact des maladies infectieuses chez les chiens.
Procédures
Les nuisances prévues sur les animaux sont les suivants : - Administration du vaccin : 1 à 5 fois avec 2 à 5 semaines d’intervalle, sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 1 minute. - Administration de l’agent pathogène en intra-veineuse, 1 sur tous les animaux anesthésiés, acte inférieur à 10 minutes - Prélèvements sanguins plusieurs fois pendant l’étude sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 1 minute. - Observation clinique quotidienne sur tous les animaux en vigile, 5 minutes/animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : - La contention et la répétition d’actes techniques (administrations et prélèvements) peuvent occasionner un stress et éventuellement de la douleur. - Le développement de la pathologie peut donner lieu à des signes cliniques sévères (diarrhées, apathie, hypothermie, douleur abdominale) notamment chez les animaux non-vaccinés = animaux témoins dans les études d’efficacité.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin d'étude, pour des raisons de biosécurité liées à la catégorie de risque de l’agent biologique (ARG2), aucun chien administré (même protégé) ne peut ressortir du batiment (confinement BSL2).
Remplacement
Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre de candidats à tester in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
Pour les études réglementaires, le nombre d’animaux est fixé par les textes. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste de façon à minimiser le nombre de chiens tout en permettant d’interpréter les résultats des études. 3 à 4 candidats vaccin pourront être traités
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique est prévue dans le but de limiter le stress des animaux et de stabiliser leur état physiologique (sauf cas exceptionnels subordonnés au protocole expérimental). Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans le cas d’études sur jeunes animaux (moins de 7 semaines d’âge), les animaux seront hébergés avec leur mère ou une nourrice. Les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La contention et les actes techniques sont réalisés par un personnel hautement qualifié. Ils peuvent avoir recours à une anesthésie et/ou une analgésie si l’acte ou l’animal le nécessite. Pour l’administration de l’agent pathogène en intra-veineuse, une anesthésie légère d’une durée d’environ 10 minutes est réalisée pour permettre la pose d’un cathéter et l’administration lente de la souche d’épreuve. Pour les chiots (inférieurs à 6 mois), le volume administré est de 1.0mL. Pour les animaux adultes, le volume administré ne dépassera pas 10mL. Une surveillance accrue des animaux juste après cette administration (~2 à 3h) pour s’assurer du bon réveil des animaux et du bon déorulé de l’administration. Des points limites spécifiques de la pathologie sont définis. Ces critères sont en constante évolution de manière qu’ils reflètent au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires. Le personnel est formé et compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans son état physiologique optimal. Une observation, a minima, quotidienne des animaux est réalisée. Elle porte sur les points suivants : apparence physique externe, comportement spontané, comportement provoqué/réponse aux stimuli externes et détection des signes cliniques de la maladie. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.
Choix des espèces
L’évaluation sur espèce cible (chien) est une exigence règlementaire et le modèle optimal pour réaliser les études à ce stade de connaissance. En générale la vaccination s’effectue à 7 semaines d’âge, mais des animaux de 4 semaines pourront être inclus (animaux nés sur site ou chez un fournisseur). Dans ce cas les chiots seront hébergés avec leur mère ou une nourrice. Dans les études de durée d’immunité, les chiots sont vaccinés jeunes puis observés jusqu’à l’âge adulte pour tester la durée de protection conférée par le médicament. Pour la mise au point de modèle d’épreuve, des animaux adultes (> 12 mois) peuvent également être utilisés.
Evaluation de candidats médicaments dans des modèles de neurodégénérescence chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2417
Un lot d'animaux déjà lésés est conservé pour tester deux substances à la suite, à trois doses, ce que le porteur présente comme une utilisation continue. 3 437 rongeurs vont être utilisés, 1 020 souris et 2 417 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, tous tués à l'issue parce que les symptômes neurodégénératifs induits sont jugés incompatibles avec un maintien en vie. Les modèles reposent sur des injections de substances neurotoxiques, des chirurgies cérébrales de 30 à 60 minutes, une alimentation contenant un composé toxique pendant cinq semaines, puis jusqu'à trois heures de tests moteurs par jour pendant huit semaines. Le porteur décrit des déficits moteurs et mnésiques ainsi qu'une agressivité transitoire de trois semaines après administration du neurotoxique du modèle Alzheimer, et affirme que les candidats les plus prometteurs sélectionnés sur cultures de neurones doivent ensuite être éprouvés sur des animaux.
Objectifs
Le projet consiste à évaluer l'efficacité de nouveaux candidats à inhiber l'apparition de symptômes moteurs ou cognitifs (traitement neuroprotecteur et neurorégénérateur) sur des modèles animaux mimant des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques ou une lésion cérébrale telle qu'une ischémie cérébrale. Ces maladies à un stade avancé sont invalidantes, voire mortelles en fonction de la position du caillot au niveau cérébral. Il n’existe, à ce jour, aucun traitement pour stopper la progression de la maladie de Parkinson ou d'Alzheimer ou protéger les cellules lors d'une ischémie cérébrale. Des traitements thrombolytiques utilisés rapidement après l'apparition d'une ischémie cérébrale permettent de désagréger le caillot formé et rétablir la circulation sanguine. Des traitements symptomatiques sont également utilisés lors de poussées inflammatoires dans la sclérose en plaques ou pour limiter les symptômes (remplacement de la dopamine chez les parkinsoniens et augmentation des niveaux d'acétycholine pour la maladie d'Alzheimer). Des traitements immunomodulateurs sont également utilisés pour diminuer la fréquence des poussées et la progression de la sclérose en plaque. La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité et l'espérance de vie des patients. Pour ce faire, les troubles neurologiques peuvent être induits par l'administration d'une substance chimique neurotoxique par voie orale, par voie systémique, directement au niveau intra-cérébral ou par une action mécanique (occlusion d'une artère cérébrale par exemple).
Bénéfices attendus
La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de maladies neurodégénératives ou ayant subi une accident vasculaire cérébral (AVC). A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitements curatifs pour lutter contre la maladie de Parkinson ou la maladie d'Alzheimer. Les médicaments disponibles sur le marché permettent de limiter les symptômes dans un premier temps mais leurs utilisations restent limitées car ils ne stoppent pas la progression des maladies. Les traitements disponibles pour limiter la progression de la sclérose en plaques ne permettent pas de stopper complétement la maladie. Les traitements thrombolytiques utilisés lors d'un AVC permettent de rétablir la circulation sanguine mais aucune thérapie n'est disponible pour limiter les séquelles physiques. Il est donc important de pouvoir proposer des modèles translationnels pour pouvoir tester de nouveaux candidats médicaments dans ces différentes pathologies très invalidantes.
Procédures
Pour chaque procédure, les candidats médicaments sont administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat médicament. Le modèles de maladie de Huntington est induit par l’administration chronique de la substance réactive sur 5 jours; chaque administration dure environ 1 à 2 secondes. Des tests comportementaux moteurs (durée max =60 minutes et entre 1 et 3 tests sur 1 à 5 jours) peuvent être réalisés avant euthanasie des animaux et prélèvement d'organes. Pour mimer la sclérose en plaque, les animaux sont nourris avec des aliments contenants la substance réactive sur une durée de 5 semaines. Des tests comportementaux moteurs peuvent être réalisés pendant ces 5 semaines (maximum de 3 tests sur 1 heure, 1 fois par semaine). A la fin des expériences, des prélèvements d'organes peuvent être réalisés après euthanasie des animaux. Certains modèles de la maladie d'Alzheimer, de Parkinson, des modèles de mort cellulaire ou d'accident vasculaire nécessitent une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. Cette intervention dure entre 30 et 60 minutes. Les animaux sont ensuite évalués dans différents tests moteurs (durée maximum = 3 heures par jour, 1 à 2 séries de tests par semaine sur 8 semaines maximum) ou non-moteurs (tests mnésiques réalisés quotidiennement pendant environ 1 h sur 4 à 5 semaines). Des prélèvements d'organes peuvent être réalisés après euthanasie des animaux. Pour chaque modèle, les animaux recevront une substance test de manière aigue ou de manière chronique au cours de l’expérience. Classiquement, les administrations par bolus durent de l’ordre de la seconde. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude (1 à 2 prélèvements avec au minimum une semaine d'intervalle, chaque prélèvement dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier ou de l'induction d'une anesthésie gazeuse. L'injection d'une substance neurotoxique peut induire une douleur post-opératoire chez l'animal. Des problèmes de cicatrisation peuvent également être observés, notamment si l'animal se gratte. Les modèles utilisés pour mimer certains aspects de la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington ou la sclérose en plaque peuvent induire des déficits moteurs légers à modérés (incoordination motrice). Dans les modèles de la maladie de Parkinson ou d'Alzheimer, les déficits attendus peuvent être d’ordre mnésique. Une agressivité transitoire peut être observée suite à l'administration de la substance neurotoxique dans le modèle de la maladie d'Alzheimer (comportement observé sur environ 3 semaines et qui diminue dans le temps). Certains tests mnésiques nécessitent un rationnement en nourriture pouvant causer un léger stress chez l'animal, mais pas de perte de poids (rationnement adapté pour éviter la perte de poids et récompense sous forme de nourriture donnée pendant le test). Le modèle d'accident vasculaire entraîne des déficits moteurs légers (difficulté à marcher, à coordonner les mouvements mais l'animal bouge quasiment normalement), modérés (réduction des déplacements) ou sévères (l'animal ne bouge presque pas).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences car ces modèles induisent des symptômes neurodégénératifs, incompatibles avec le maintien en vie des rongeurs dans de bonnes conditions.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives exploratoires permettant de screener un grand nombre de traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de limiter le nombre d'animaux utilisés et de sélectionner les meilleurs candidats médicaments. Ces tests ont été mis en place au laboratoire. Néanmoins, l'efficacité des traitements les plus prometteurs doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux), permettant l'évaluation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux, par exemple.
Réduction
Dans ce projet, des modèles cellulaires sont utilisés pour pouvoir séléctionner les meilleurs candidats médicaments et pouvoir limiter le nombre d'animaux à tester sur des modèles plus complexes. Dans le cas des études chez l'animal vivant, les substances à tester ont déjà subi une phase de sélection afin de réduire le nombre d'animaux vivants testés. Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées. Les données seront analysées statistiquement avec des tests appropriés. Enfin, pour certains tests, un lot d'animaux est lésé et est gardé pour tester plusieurs substances à la suite (utilisation continue pour tester 2 substances à 3 doses).
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Pour chaque phase chirurgicale, une anesthésie sera associée à un protocole d'analgésie avant le début de la chirurgie jusqu'à 48 heures après l'opération. Un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire. Une substance analgésique est également injectée au niveau de la zone à inciser au niveau du crâne. L’animal sera placé sur une couverture chauffante au début de l’anesthésie jusqu'à reprise de la marche pour maintenir sa température corporelle. Dans la plupart des modèles de neurodégénerescence, l'évaluation comportementale peut être complétée par des marquages histologiques au niveau cérébral afin de raffiner le modèle. Les animaux sont maintenus en groupe pendant toute la durée des expériences, avec un environnement enrichi dans les cages d'hébergement. Des points limites stricts ont été définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
Les études sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Par exemple, les substances anti-parkinsoniennes mises sur le marché ont été découvertes en utilisant des modèles pré-cliniques chez le rongeur. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études réalisées et aussi en fonction de la disponibilité de la molécule. On utilisera de préférence la souris lorsque la molécule est en quantité limitée. Dans certains cas, le modèle a été démontré pertinent que chez une espèce. Les animaux transgéniques inclus dans ce projet sont bien décrits dans la littérature et permettent de modéliser une maladie neurodégénérative d'ataxie-télangiectasie. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis la période post-sevrage jusqu'à l'âge adulte.
Développement d’un modèle expérimental d’infestation par Ascaridia galli chez la poulette
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Mettre au point un modèle d'infestation par le ver Ascaridia galli chez la poulette future pondeuse : 2 450 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance surtout modéré. Placées en animalerie dès leur premier jour de vie, elles reçoivent entre 14 et 26 jours des suspensions de parasites infestants par la bouche ou par le cloaque, sur animal éveillé, parfois trois jours de suite, puis sont suivies jusqu'à 56 jours après inoculation. Le porteur indique que de fortes infestations peuvent déchirer la paroi intestinale et provoquer une septicémie mortelle, et prévoit des doses censées rester en dessous de ce seuil. Les témoins sont tuées elles aussi, parce qu'hébergées dans la même animalerie, et le modèle obtenu sera mis à disposition des structures qui développent des vermifuges ou renouvellent les autorisations de molécules existantes.
Objectifs
L’élevage de volailles en plein air augmente les risques d’exposition des oiseaux à des parasites, notamment des vers dénommés helminthes. Parmi ces derniers, Ascaridia galli et Heterakis gallinarum sont les vers les plus fréquemment retrouvés dans les élevages. Heterakis, de petite taille et vivant dans les caecums des oiseaux, a un très faible potentiel pathogène alors qu’Ascaridia est un grand ver qui vit préférentiellement dans l’intestin grêle mais qui peut coloniser la totalité du tube digestif dans les fortes infestations, jusqu’à se retrouver quelquefois dans l’œuf de la poule pondeuse. Néanmoins, sa pathogénicité n’est pas parfaitement connue, car les études concernant son impact sur la santé et les performances des oiseaux ont été réalisées soit en exposition naturelle, soit en environnement non maîtrisé (bâtiment d’élevage), soit sur des stades larvaires et pas avec des vers adultes qui sont potentiellement les plus dommageables. Le but de ce projet est de développer un modèle validé et reproductible d’infestation expérimentale contrôlée avec Ascaridia galli chez la poulette future pondeuse, afin de mieux connaître le cycle de développement de ce parasite, son impact sur la santé et la croissance en fonction de la charge parasitaire, et de tester d’éventuels candidats au contrôle des infestations dans les élevages.
Bénéfices attendus
Ce projet a une visée fondamentale avec l’objectif d’améliorer les connaissances sur le cycle et le potentiel pathogène d’A. galli qui est très fréquent dans les élevages et dont la présence risque d’augmenter du fait des pratiques d’élevage en plein-air qui se développent en réponse à une attente sociétale. Il vise aussi à développer un nouvel outil d’évaluation de produits anti-parasitaires, des anthelminthiques, chimiques ou naturels, et de le mettre à disposition des structures souhaitant développer de nouvelles solutions anthelminthiques ou renouveler les autorisations de molécules existantes.
Procédures
Inoculations par voie orale ou cloacale de suspensions contenant des parasites infestants sur animaux vigiles. La durée de l'inoculation est inférieure à cinq secondes et la durée de la contention, inoculation comprise, est inférieure à la minute. Soit une seule inoculation par animal, soit inoculations quotidiennes consécutives sur deux ou trois jours.
Impact sur les animaux
La pathogénicité d’Ascaridia galli est mal connue, mais ce ver n’est pas décrit comme entraînant de la mortalité, sauf éventuellement en cas de très fortes infestations pouvant provoquer un déchirement de la paroi intestinale, causant une septicémie pouvant conduire à la mort. Les infestations seront réalisées à des doses qui ne devraient pas permettre d’atteindre de tels niveaux, et le suivi quotidien des critères de santé des animaux permettra de détecter l’apparition de signes cliniques afin de prendre les mesures adaptées pour gérer la santé et le bien-être des oiseaux, quitte à envisager une mise à mort compassionnelle si nécessaire.
Devenir
Mise à mort de tous les sujets : infestés avec des parasites ou témoins hébergés dans la même animalerie que les sujets infestés, pendant des durées longues risquant de les contaminer.
Remplacement
Des modèles in vitro existent pour mesurer l’effet de molécules sur l’activité musculaire des vers, mais ils ne permettent pas de mesurer l’impact de ces vers sur les performances zootechniques ni sur la santé des oiseaux parasités. De plus, ils ne reproduisent pas l’environnement (microbiote, mucus, enzymes…) que le ver rencontre dans le tube digestif de l’oiseau, obligeant les résultats obtenus in vitro à être confirmés in vivo.
Réduction
Les premiers essais seront réalisés avec des effectifs restreints pour chaque modalité afin de déterminer les meilleures conditions d’implantation des vers adultes, sans atteindre des effectifs nécessaires à des analyses statistiques sur les performances zootechniques. Une fois le modèle validé, il servira à évaluer l’impact des vers sur les performances des animaux et les effectifs seront adaptés pour analyser statistiquement les résultats zootechniques.
Raffinement
Les oiseaux seront hébergés dans des cages conformes aux conditions exigées en expérimentation animale, en groupes homogènes, avec un éclairage naturel, complété par un éclairage artificiel en période de jours courts, une période d’obscurité de nuit de durée continue minimale de 6 heures, une maîtrise de la température ambiante conforme aux exigences requises en fonction de l’âge des oiseaux, une gestion de la pression et un suivi de l’hygrométrie. Des cordelettes seront suspendues dans les cages, ainsi que des CD, afin que les oiseaux puissent les manipuler. Des perchoirs de même longueur que les mangeoires seront installés dans chaque cage. Les points limites définis dans les procédures seront appliqués strictement pendant toute la durée de chaque essai.
Choix des espèces
Les volailles sont les hôtes naturels de ce parasite. Le choix de la poulette future pondeuse d’œufs de consommation pour le modèle se justifie par le fait que ce sont les poules pondeuses qui sont les plus exposées à ces parasites, avec des conséquences possibles sur la production d’œufs et leur santé. Les oiseaux seront mis en place à l’âge d’un jour, après éclosion et récupération au couvoir, afin d’éviter toute contamination accidentelle avec des helminthes. Ils seront élevés en animalerie protégée et seront inoculés avec les vers entre 14 et 26 jours d’âge et le suivi sera effectué pendant au maximum 56 jours après inoculation (âge maximal de 70 jours). Ce délai correspond à la période prépatente maximale, c'est-à-dire le délai entre l'ingestion de la larve infestante jusqu'à l'apparition des œufs dans les fientes, décrite dans la littérature scientifique pour Ascaridia galli.
Formation à l’imagerie préclinique chez la souris: Raffinement et Réduction
- Formation professionnelle
Quatre-vingts souris sont tuées parce que le produit de contraste injecté reste plusieurs semaines dans leurs organes, les quatre-vingts autres, passées à l'échographie, sont réutilisées par l'équipe. 160 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est anesthésié jusqu'à 40 minutes, cathétérisé à la queue, rasé et dépilé, puis soumis à un scanner et à des séances d'échographie de 20 à 25 minutes. Ces gestes servent à former quatre-vingts personnes aux techniques d'imagerie sur petits animaux, à raison de deux sessions par an pendant cinq ans.
Objectifs
Ce projet consiste à former le personnel à l’imagerie préclinique du petit animal. Les personnes qui veulent faire de l'imagerie pour leur projet ont besoin de connaitre le déroulé d'une expérience et de mieux comprendre les tenants et les aboutissants de ce type d'expérience afin de traiter leurs données de la façon la plus appropriée possible.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont que les participants puissent : • Appréhender le potentiel et les principales limitations de différentes modalités d’imagerie préclinique • Sélectionner la modalité d’imagerie préclinique la plus appropriée pour répondre à leur problématique physiologique donnée • Préparer de façon efficace leur étude en imagerie préclinique • Acquérir et analyser leurs images
Procédures
• Anesthésie des animaux : durée maximale 40 min/animal, 160 animaux • Cathéterisation caudale : durée maximale 2 min/animal, 160 animaux • Imagerie CT sans et avec produit de contraste : durée maximale 2 fois 1 à 4 min/animal, 160 animaux • Rasage, dépilation, rinçage et séchage : durée maximale 5 min/animal, 160 animaux • Echographie B-mode et Doppler : durée maximale 25 min/animal, 160 animaux • Echographie avec produit de contraste : durée maximale 20 min/animal, 160 animaux
Impact sur les animaux
Le stress est minimisé par l'implication d'un personnel qualifié à l'expérimentation animale. Les souris sont facilement stressées, la manipulation de l'animal nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage. Les nuisances ou effets indésirables seront évalués par les responsables de la formation. Les différentes injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection (mais réaliser sous anesthésie). A l’issue de la formation, les animaux seront euthanasiés après une profonde anesthésie gazeuse.
Devenir
Les 80 souris ayant reçu l’agent de contraste seront mis à mort car cet agent est rémanent et reste dans les organes pendant plusieurs semaines. Les 80 animaux utilisés pour l'imagerie échographique seront réutilisés dans notre équipe.
Remplacement
L'objectif de la formation est de former le personnel à l'imagerie préclinique du petit animal. Lors du cours théorique, des photos/ vidéos seront présentées. Cependant, lors des travaux pratiques, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in-silico.
Réduction
Dans le cadre de cette formation, nous organisons deux sessions par an à raison de huit personnes par session, et de deux animaux/ binôme/modalité d’imagerie sur une periode de cinq ans, nous formerons 80 personnes et utiliserons 160 souris (80/ modalités d’imageries). Nous insisterons sur le fait que le recours aux modalités d'imagerie précliniques permet une exploration longitudinale sur les mêmes groupes d’animaux diminuant ainsi drastiquement le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe, en présence d'enrichissement (morceaux de carton et/ou tube plastique). Les animaux seront observés une fois par jour. Toutes les stratégies d’analgésie, d’anesthésie et de soin seront mises en œuvre. Si nous constatons des bagarres dans les cages, nous procéderons à une séparation des individus pendant une durée maximale d'une semaine et l'animal restera en contact visuel, auditif et olfactif des autres congénères. En cas de blessure, nous appliquerons un nettoyant et un désinfectant sur la plaie jusqu’à cicatrisation complète. Durant la manipulation, l'animal sera anesthésié en gazeux, une protection oculaire lui sera appliquée. Le rongeur sera maintenu sur un tapis chauffant et/ou un lit thermorégulé durant l'imagerie. Dans le cadre de la formation, nous insisterons sur le fait que le recours aux modalités d’imageries précliniques permet de limiter l’utilisation de techniques invasives (ex. biopsie) ou des techniques d’exploration nécessitant l’euthanasie des animaux (ex. histologie).
Choix des espèces
La souris C57/Bl6 est une des principales espèces utilisées dans les laboratoires en raison de l'existence de différents modèles murins de pathologies neurologiques, cardiologiques et oncologiques utilisant ce fond génétique. Nous utiliserons des souris adultes mâles et femelles de 6 semaines en raison des fonctions physiologiques matures.
Etude des fonctions d’un gène dans le développement, la régénération et la maintenance des fonctions musculaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Au sevrage, chaque animal subit une biopsie de la queue sous anesthésie, et une partie reçoit quatre injections à un jour d'intervalle, une injection provoquant une lésion musculaire, ou une stimulation avec mesure de force sous anesthésie générale. Le porteur reconnaît que le phénotype dommageable de ces lignées peut altérer la qualité de vie et conduire à la mise à mort des animaux les plus atteints, les retombées annoncées restant la compréhension de mécanismes fondamentaux et l'identification éventuelle de pistes thérapeutiques. Sur l'effectif, il écrit qu'aucun test statistique préalable n'était possible et que le nombre a été calculé "au plus juste" d'après les projets précédents.
Objectifs
Le muscle est la cible de maladies génétiques affectant les fibres musculaires, les cellules souches musculaires, ou la jonction entre le nerf et le muscle. Ces atteintes sont responsables d'une perte progressive des fonctions motrices, d’invalidité et/ou de mortalité anticipée. Si les mécanismes aboutissant à l’altération des fonctions musculaires sont divers, il apparaît que certaines fonctions cellulaires constituent des cibles importantes pour lesquelles les mutations ont un effet particulièrement délétère. C’est notamment le cas des mitochondries, les usines énergétiques cellulaires qui produisent l’énergie à partir du glucose et des acides gras. Des perturbations des fonctions mitochondriales sont associées à une moins bonne formation du tissu musculaire, ainsi qu’à une moins bonne régénération lors des microtraumatismes entraînant un vieillissement musculaire prématuré. Ce projet a pour finalité de caractériser les fonctions d’un gène dans le maintien du fonctionnement des mitochondries dans les cellules musculaires. Nous avons précédemment généré des modèles animaux et décrit les conséquences sur le fonctionnement musculaire. La présente demande vise à poursuivre ces travaux, afin d’identifier le mécanisme d’action du gène d'intérêt et notamment caractériser les fonctions métaboliques (=liées aux mitochondries) perturbées. A terme, le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes liant la régulation des mitochondries et les myopathies, et de tester des thérapies ciblant notre gène d'intérêt.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux impliqués dans le développement et la régénération des muscles . Les gènes impliqués dans ces mécanismes sont généralement impliqués dans les maladies du système neuromusculaire comme les myopathies. Ils peuvent aussi être cibles pour l’identification de biomarqueurs ou de pistes thérapeutiques potentielles.
Procédures
Au moment du sevrage, les animaux subiront une biopsie à la queue, sous anesthésie (1 fois, le geste dure 1 minute). Des animaux subiront des injections (4 injections à un jour d'intervalle) pour inhiber le gène d'intérêt. Des animaux subiront l'injection d'un composé qui induit une blessure musculaire, sous anesthésie et analgésie (une seule fois). Des animaux subiront une stimulation musculaire et une mesure de force musculaire sous anesthésie générale (une seule fois).
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable chez certains animaux peut altérer la qualité de vie et dans les cas les plus sévères entraîner la mise à mort des animaux pour raison éthique. La piqure d'aiguille pour les injections intrapéritonéales entraînera une douleur légère de courte durée, et la contention au moment de l'injection entraînera un stress physique de courte durée. Certains animaux subiront une procédure de stimulation musculaire, sous anesthésie générale, qui entraînera un stress lié à la contention et une douleur légère suite à la stimulation musculaire. Certains animaux subiront une injection qui entraîne une lésion musculaire qui peut être douloureuse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car il s'agit de lignées transgéniques qui ne peuvent pas être remises en liberté ni réutilisées.
Remplacement
Des travaux ont été conduits dans l’équipe dans des modèles in vitro (cultures de lignées cellulaires) afin de valider nos hypothèses avant l’utilisation d’animaux. Le recours à l’animal et notamment aux modèles transgéniques permet d’identifier le rôle de certains gènes dans les processus de dégénération et remodelage tissulaire. Ces modèles offrent la possibilité de réaliser des analyses de tissus et même de l’organisme entier pour développer des stratégies thérapeutiques. Par ailleurs, la physiologie et le fonctionnement du système neuromusculaire impliquent des interactions complexes entre le muscle et les nerfs qui ne peuvent pas être reproduit in vitro à l’heure actuelle.
Réduction
Chaque fois que ce sera possible, nous coordonnerons les expériences réalisées par plusieurs expérimentateurs et dans la mesure du possible, nous procéderons à des prélèvements multiples sur le même individu. Les accouplements seront optimisés pour produire strictement le nombre d’individus nécessaires. Les animaux de génotype inutile à la reproduction seront incorporés dans les groupes contrôles, la majorité de nos lignées ayant le même fond génétique. Pour ce projet, il n’est pas possible de réaliser un test statistique préalable à la génération de cohortes, car pour l’ensemble les animaux seront utilisés pour des prélèvements de tissus et des expériences in vitro. Nous avons calculé au plus juste le nombre d’animaux nécessaires sur l’ensemble du projet, sur la base des expériences prévues et de nos projets précédents. Pour l’analyse des résultats, un test statistique adapté sera choisi.
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur par une routine d’élevage qui permet de diminuer le stress des animaux. Une manipulation régulière, par contention douce (dans le creux de la main ou dans un tube en carton servant d’enrichissement) sera privilégiée comme méthode de manipulation des animaux. La taille de la biopsie, à l’extrémité de la queue, sera limitée à deux millimètres. Lors des différentes procédures, un suivi régulier des animaux sera réalisé et pour toute manipulation susceptible d’entraîner du stress ou de la douleur, nous aurons recours systématiquement aux techniques d’anesthésie ou d’analgésie. Des points limites adaptés, prédictifs, permettront de détecter rapidement toute souffrance inutile des animaux. Nous utilisons un dispositif expérimental qui permet de réaliser une stimulation musculaire mais également de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux pour l’ensemble du protocole. Cette innovation réduit la variabilité expérimentale inter-animale. On peut estimer que, grâce à ce dispositif, le nombre d’animaux nécessaire à la conduite de ce projet est réduit et que la qualité des résultats est accrue.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l’Homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet d'évaluer la fonction contractile du muscle. Certains travaux ont montré que les étapes de la formation et de la régénération du muscle après induction d’une inflammation sont identiques chez la souris et chez l’Homme, rendant pertinent ce modèle pour notre étude. Les animaux pour la reproduction seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle et utilisés en reproduction préférentiellement jusqu’à l’âge de 6 mois, après quoi la fertilité diminue et les animaux seront réformés. En cas de besoin les animaux pourront être mis en reproduction après 6 mois, en l’absence de reproducteurs plus jeunes disponibles. Les tissus seront prélevés majoritairement sur des animaux prélevés à des âges standards dans la communauté scientifique : entre 8 et 12 semaines (jeune adulte). Une petite partie des animaux seront utilisés à l’âge de 64 semaines afin d’étudier l’effet du vieillissement sur la fonction musculaire. Cet âge est basé sur des études précédentes dans l’équipe où nous pouvons observer des lésions microscopiques du muscle sans altération marquée de la qualité de vie de l’animal.
Compréhension de la relation entre le mucus intestinal et le système myentérique dans la prévention par les acides gras oméga3 de l’hyperperméabilité intestinale induite par l’obésité alimentaire chez la souris fat-1 mâle et femelle
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris utilisées portent une modification génétique qui enrichit tous leurs tissus en acides gras oméga3, à un niveau que le porteur décrit comme inatteignable par l'alimentation. 232 souris vont être utilisées, 72 d'entre elles anesthésiées puis tuées sans reprise de conscience, les 160 autres soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime hyperlipidique pendant huit semaines, restent isolées en cage individuelle sur toute cette durée, subissent des gavages, un prélèvement submandibulaire sous anesthésie et une série de prises de sang à la queue toutes les quinze à trente minutes lors du test de tolérance au glucose. Toutes sont tuées par ponction intracardiaque à la fin de la huitième semaine, pour prélever sang et colon.
Objectifs
L’obésité alimentaire contribue à perturber la fonction barrière de l’intestin en détériorant la quantité et la qualité de la flore intestinale. En tant qu’aliments thérapeutiques, les lipides dits en oméga3 (particulièrement présents dans les poissons ou certaines huiles alimentaires) sont connus notamment pour améliorer cette fonction barrière. Dans ce contexte, nous étudions l’impact des lipides dits en oméga3 en particulier sur l’intégrité de la couche de protection qui tapisse l’intestin et la contribution de la flore intestinale. Nous avons montré précédemment que des souris mâles aux tissus riches en lipides en oméga3 sont protégées de l’obésité alimentaire, de l’altération de la perméabilité intestinale et du passage de molécules issues de bactéries de la flore intestinale dans le sang, molécules qui sont capables de provoquer une inflammation chronique de faible intensité. Chez la souris mâle, cette protection est transmissible à d’autres souris par la transplantation de la flore intestinale de souris aux tissus riches en lipides en oméga3. Chez la souris, un excès de lipides alimentaires ne provoque pas les mêmes troubles métaboliques chez les mâles et les femelles. Le poids corporel et l’assimilation du sucre sont moins altérés chez les femelles. Il s’avère donc nécessaire, de comparer chez des souris mâles et femelles aux tissus riches en lipides en oméga3 ou non comment l’obésité alimentaire et ses perturbations au niveau intestinal vont s’installer et si la flore intestinale est impliquée. L’obésité alimentaire entraîne également une modification du système nerveux intestinal. Cette modification pourrait également affecter l’intégrité de la flore intestinale et de la couche de protection qui le tapisse. Le système nerveux intestinal constitue donc une nouvelle cible d’étude, en particulier dans la compréhension des phénomènes contribuant à la mise en place des modifications de la perméabilité intestinale conduisant à une inflammation chronique de faible intensité. Ainsi, dans le contexte de lutte contre l’obésité, les objectifs de ce projet sont de comprendre le rôle des lipides dits en oméga3, chez la souris mâle et femelle dont les tissus sont riches en ces lipides, dans la protection contre l’inflammation chronique de faible intensité et de comprendre le rôle du système nerveux intestinal, de la couche de protection qui le tapisse et de la flore intestinale, différents éléments de la perméabilité intestinale.
Bénéfices attendus
L’obésité induit une altération de la perméabilité intestinale entrainant un passage de molécules de la flore intestinale dans la circulation sanguine, qui est en partie responsable d’une inflammation générale légère et chronique. L’étude de l’impact des lipides oméga3 est une piste privilégiée d’amélioration. Cependant, les études nutritionnelles, chez l’homme ou le rongeur, présentent de nombreux biais rendant les données peu concluantes. Les souris aux tissus riches en lipides oméga3 représentent donc une alternative de choix dans l’étude de l’impact de ces lipides sur les maladies associées à l’obésité alimentaire, bénéfice que nous avons déjà montré sur la prise de poids ou le diabète. Nous avons également récemment montré, chez la souris mâle, que le seul transfert de la flore de souris aux tissus riches en lipides oméga3 à des souris WT les protègent efficacement de ces pathologies mais également des altérations de la perméabilité intestinale et de la couche de protection qui le tapisse. Bien qu’il existe des différences entre sexes dans le développement des troubles métaboliques dus à l’obésité, aucune étude n’a encore exploré cet aspect chez la souris femelle afin de comprendre les différences observées. L’obésité alimentaire entraîne également une modification du système nerveux intestinal. Cette modification pourrait également affecter l’intégrité de la flore intestinale et de la couche de protection qui le tapisse. Le système nerveux intestinal constitue donc une nouvelle cible d’étude afin de comprendre les phénomènes contribuant à la mise en place des modifications de la perméabilité intestinale conduisant à une inflammation chronique de faible intensité. Ce projet a maintenant pour but, dans un contexte d’inflammation chronique due à l’obésité, de comprendre le rôle des lipides oméga3, chez le mâle et la femelle, dans l’amélioration de la fonction barrière de l’intestin et sur la structuration de la couche qui le tapisse l’intestin et sur le système nerveux intestinal. Il est également important de déterminer la contribution de la flore intestinale. En effet, ce projet pourrait permettre l’identification de bactéries favorables, éventuelles futures cibles probiotiques, essentielles au bon fonctionnement de la barrière intestinale lors de l’obésité.
Procédures
Les animaux seront manipulés de façon hebdomadaire afin d’évaluer leur poids. De plus, - Au début du régime, les animaux seront placés en cages individuelles avec couvercle filtrant ou collectives - Aux semaines 1 et 8 des fèces seront collectés (3 à 4 crottes sur une durée d’une dizaine de minutes) - Prélèvement de sang à la semaine 7 d’expérimentation, 4 heures après le gavage avec une solution de Dextran-FITC niveau de la région submandibulaire afin de mesurer la perméabilité intestinale. Chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde. - Prélèvement de sang, 4 heures après le gavage avec une solution de glucose, à la semaine 8 d’expérimentation. Le prélèvement est réalisé au niveau de la partie terminale de la queue de la souris aux temps 0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes après le gavage au glucose pour mesurer la glycémie (chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde). - Un prélèvement terminal sera effectué à la fin de la semaine 8 via une ponction intracardiaque nécessitant une à deux minutes par animal.
Impact sur les animaux
Afin d’éviter la dominance d’un des congénères pouvant limiter l’accès à la nourriture et empêcher le brassage de microbiote entre les animaux, les souris seront placées en cage individuelle munie d’un couvercle filtrant pour la durée de l’étude nutritionnelle (8 semaines). L’obésité provoquée par un régime hyperlipidique peut être source de difficultés pour les animaux rendant le toilettage ou l’accès à l’eau de boisson difficile. Le prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la partie terminale de la queue (à l’aide d’une aiguille 26G) pour la mesure de la glycémie lors du test de tolérance au glucose), le prélèvement submandibulaire après anesthésie à l’isoflurane et les gavages oro-gastriques (pour les instillations de microbiote) sont des gestes pour lesquelles peu ou pas de douleur est attendue puisqu’ils seront réalisés par un personnel maitrisant très bien ces gestes techniques et les animaux seront observés plusieurs fois dans la journée (en cas de fausse route l'animal montre des signes de souffrance assez rapidement). Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la Structure chargée du Bien-être Animal de la plateforme de Zootechnie. Nous leur donnerons comme enrichissement de milieu dans toutes les cages des carrés de coton pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Une observation générale quotidienne des animaux sera effectuée et une observation et manipulation individuelle hebdomadaire sera réalisée à l'occasion de la pesée et de l'entretien des animaux. Ainsi, si une souris est en souffrance nous pourrons agir rapidement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue du projet afin de réaliser des prélèvements de différents tissus (sang, colon)
Remplacement
Un modèle de souris transgénique dont les tissus sont intrinsèquement riches en lipides en oméga3 est un modèle précieux car cette souris possède un niveau d’enrichissement dans ses tissus qui n’existe dans aucun autre modèle murin et qui est non atteignable par des stratégies alimentaires. D’une part, l’ubiquitisme de l’enrichissement tissulaire en lipides en oméga3 et d’autre part les taux tissulaires obtenus rendent impossible le remplacement de ce modèle de souris par des modèles in vitro. De plus, le protocole décrit vise à étudier le système nerveux intestinal lors de l’altération par un régime riche en lipides de la fonction barrière de l’intestin en relation avec la formation de la couche qui le tapisse (mucus). Il est impossible de complètement modéliser ce processus et ces interactions à travers des approches in vitro. En effet, si la co-culture de cellules entériques gliales et de lignées cellulaires coliques secrétant de mucus pourrait être envisagée, un tel modèle ne permettrait pas de reproduire in vitro la complexité des interactions entre le système nerveux intestinal et les cellules qui secrètent le mucus, mucus qui apparait bicouche avec une structuration très organisée in vivo. Cette structuration très organisée représente un enjeu essentiel pour le maintien de la perméabilité intestinale et le dialogue entre le système nerveux intestinal, le mucus et la flore microbienne qui y vit. Cette étude est par ailleurs menée dans un contexte d’obésité alimentaire. Ce contexte est difficile à modéliser en raison de la complexité des impacts métaboliques observés et de la diversité des approches de régimes utilisés. Cet aspect ne peut donc également pas s’affranchir de l’utilisation d’animaux. Enfin, aucune étude n’a encore exploré chez la souris femelle cet aspect bien qu’il ait été montré des différences entre les sexes dans le développement des troubles métaboliques induits par un régime obésogène. Cette étude est donc unique dans l’approche de l’étude de l’impact des lipides en oméga3 sur le système nerveux intestinal et le mucus intestinal dans un contexte d’obésité alimentaire et de ses pathologies associées.
Réduction
Les effectifs ont été optimisés sur la base des coefficients de variabilité reportés dans la littérature et les différences attendues entre les différents groupes pour les paramètres clés de l’étude. Lors de la conception des protocoles expérimentaux nous avons déterminé le nombre de 12 et 8 animaux par groupe nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. Afin de réduire le nombre d’animaux intégrables dans le protocole, en amont de la production des animaux, les souris WT sont croisées entre et elles et les souris Fat-1 homozygotes entre elles générant des descendants tous intégrables dans le protocole et ceux sans génotypage.
Raffinement
En raison de la nuisance et de la souffrance modérée induite par l’isolement en cage individuelle durant toute la durée de l’expérimentation (8 semaines), une attention particulière sera apportée à l’enrichissement du milieu . Toutes les souris auront accès à des enrichissements de milieu dans chaque cage, constitués de carré de coton et/ou papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Une attention particulière sera également portée à la surveillance de la prise de nourriture et aux comportements liés au stress. Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée en secteur conventionnel et intégration dans le projet. A la suite des interventions (OGTT, instillations de microbiote par gavage ou gavage avec le Dextran-FITC) chaque animal sera examiné. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée.
Choix des espèces
La détermination de l’impact d’un régime obésogène sur la perméabilité intestinale et la relation entre microbiote/mucus est primordiale à notre étude. Cet aspect ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux afin de mimer au mieux un contexte d’inflammation bas grade. Bien que relativement éloignée de l’Homme, l’espèce murine est l’espèce animale de référence dans ce domaine de recherche et la plus utilisée en recherche préclinique avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le modèle de souris transgénique fat-1 est un modèle précieux qui rend cette étude unique dans l’approche de l’impact des lipides en oméga3 sur la prévention de l’hyperperméabilité intestinale induite par un régime obésogène. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids supérieur à 20g. En effet, nous nous intéressons à l’obésité et aux conséquences métaboliques associées développées par les jeunes adultes car il a été montré que l’augmentation en France de l’obésité touche toutes les tranches d’âge mais que la fréquence semble plus élevée dans les tranches 25-34 et 35-44 (de l’ordre de 8% par an). De telles données sur le jeune adulte ont été également confirmées aux Etats-Unis et récemment en France. De plus, les études précédentes mettant en évidence la transmission de la résistance partielle de l’induction de l’obésité alimentaire par le microbiote de souris fat-1 à des souris WT au laboratoire a porté sur l’animal jeune adulte. Nous souhaitons pouvoir inscrire ces nouvelles expérimentations dans notre objectif thématique plus global.
Etude de différents plans d’alimentation pour les jeunes veaux mâles d’origine laitière
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Vendus vers les ateliers d'engraissement de veaux de boucherie ou exportés dès l'âge de 14 jours, les veaux mâles nés dans les troupeaux laitiers font ici l'objet d'essais alimentaires entre leur troisième et leur quatorzième jour de vie. 480 veaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun n'étant tué pour l'étude, chacun rejoignant ensuite l'élevage du site selon les pratiques commerciales. Cinq essais comparent quatre plans d'alimentation. Le porteur annonce des diarrhées et un stress liés au jeune âge, et affirme qu'aucune méthode d'évaluation indirecte ne traduit la réponse d'un veau à un régime, ce qui rend selon lui le recours à l'animal "indispensable".
Objectifs
Avec 3,4 millions de vaches laitières, la France se situe au 2e rang de la production laitière européenne après l'Allemagne. Ce cheptel donne naissance à environ 1,5 millions de veaux mâles par an. Si les veaux femelles sont pour la plupart destinés au renouvellement du troupeau laitier et donc gardés par l'éleveur naisseur, les veaux mâles sont majoritairement vendus vers des ateliers d'engraissement de veaux de boucherie (61% des veaux mâles) ou exportés (20%). La réglementation en vigueur sur le transport des animaux vivants (Réglement (CE) n° 1/2005) impose un certain nombre d'exigences au niveau de la transportabilité des jeunes veaux. Dans les faits, les veaux mâles sont vendus par le naisseur à un âge de 14 jours minimum. Durant ces 14 premiers jours, si l'apport de colostrum dans les premières heures de vie de l'animal est généralement bien maîtrisé, l'alimentation qui suit cette phase est mal connue et très hétérogène d'un élevage à l'autre. Par conséquent et afin d'optimiser la conduite alimentaire du jeune veau pour répondre au mieux à ses besoins, il est nécessaire d'acquérir des références techniques dans des conditions controlées. L'objet du projet consiste à étudier différents plans d'alimentation portant sur des veaux de 3 à 14 jours d'âge.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d'acquérir des références sur l'alimentation des veaux mâles d'origine laitière dans leur plus jeune âge (3 à 14 jours), phase alimentaire aujourd'hui mal connue sur ces animaux et souvent mal maîtrisée dans les élevages naisseurs. Les résultats obtenus permettront de fournir aux éleveurs laitiers des recommandations techniques afin d'apporter à ces animaux une alimentation qui réponde le mieux à leurs besoins nutritionnels.
Procédures
QuerlLes animaux recevront différents plans d'alimentation entre 3 et 14 jours d'âge. Ces plans d'alimentation seront composés d'un aliment d'allaitement du commerce, d'un aliment concentré, d'un fourrage et de l'eau, le tout étant distribué à volonté. Tous les plans d'alimentation mis en oeuvre et comparés entre eux et les aliments utilisés répondront aux besoins des veaux (en apport d'énergie, de protéines, de minéraux et vitamines, d'eau et de fibres). Sur les 60 mois du projet, 5 essais seront mis en oeuvre mettant en comparaison 4 plans d'alimentation.
Impact sur les animaux
La période de 3 à 14 jours est une phase critique pour les jeunes veaux. En élevage, les pratiques alimentaires durant cette période sont très diverses et leurs conséquences sur la santé et le bien-être sont méconnues. Les effets éventuels indésirables attendus sur cette phase sont : 1) apparition des diarrhées et 2) stress des animaux lié à leur jeune âge.
Devenir
Aucun animal ne sera euthanasié pour les besoins de l'étude. Chaque animal intégrera l'élevage du site conformément aux pratiques des élevages commerciaux.
Remplacement
Le projet porte sur l'acquisition de références sur l'alimentation des jeunes veaux mâles issus du troupeau laitier. Il n'existe pas actuellement de méthodes d'évaluation indirecte permettant de traduire la réponse de l'animal à différents plans d'alimentation. De ce fait utiliser l'animal comme modèle est indispensable pour répondre à la problématique de cet essai.
Réduction
En l'état actuel des connaissances sur la littérature scientique existante, aucun essai n'a porté sur la comparaison de différents plans d'alimentation sur des jeunes veaux mâles agés de 3 à 14 jours. En se basant sur les références disponibles sur des veaux plus âgés (entre 14 jours et 180 jours d'âge), le nombre d'animaux minimum nécessaire pour observer une différence significative de 100 g/j sur les croissances entre 2 modalités alimentaires mises en comparaison est de 24 veaux. Chaque année, au plus, 4 modalités de 24 veaux seront mises en comparaison.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera réalisé afin de s'assurer de leur bonne santé. Des mesures adaptées (aliments, médicaments) seront appliquées selon les symptômes observés après diagnostic vétérinaire (diarrhée, fièvre,...).
Choix des espèces
Le projet porte sur l'acquisition de références sur l'alimentation des veaux mâles d'origine laitière dans leur plus jeune âge (3 à 14 jours). De ce fait, c'est l'espèce bovine qui est choisie pour l'étude. Les animaux commenceront les essais dès l'âge de 3 jours et ce jusqu'à 14 jours.
Utilisation du poisson zèbre pour l’étude des métastases EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Injectés de cellules tumorales quarante-huit heures après la fécondation, des embryons de poisson zèbre passent ensuite une à deux heures par jour sous anesthésie et sous microscope, quinze jours durant, isolés dans leur bac. D'autres, injectés au stade d'une seule cellule, développent des mélanomes et sont imagés sous intubation pendant quatre heures, une fois toutes les deux semaines, de la huitième à la cinquante-deuxième semaine de vie. 1 040 poissons zèbres sont concernés, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit chez les adultes malades une nage dégradée, des abcès, des œdèmes, des difficultés respiratoires et un éloignement de leurs congénères, et indique que le vieillissement accéléré provoque un amincissement et une mort prématurée. Tous sont tués en fin de procédure, pour les prélèvements et pour éviter que les tumeurs ne continuent à croître.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier les interactions entre les cellules tumorales circulantes et l'endothélium dans le réseau vasculaire, la sortie des vaisseaux de ces cellules et leur croissance métastatique. Il s'attache notamment à définir la contribution des facteurs sécrétés par les tumeurs et le rôle des cellules non cancéreuses (endothéliales, fibroblastiques et immunitaires) dans ces processus . L'embryon de poisson zèbre permet de visualiser les étapes précoces de la formation des métastases: sortie des vaisseaux sanguins (extravasation), invasion, prolifération dans l'animal vivant. Nous allons comparer le comportement de lignées de cellules tumorales de différentes origines et ayant différentes propriétés biomécaniques et déterminer leurs interactions avec différents composants de la circulation et de la niche métastatique (vaisseaux sanguins, plaquettes, globules rouges, macrophages, neutrophiles etc..). De plus, nous comptons évaluer le rôle de facteurs secrétés par les cellules tumorales, en particulier les vésicules extracellulaires, dans ces processus. Finalement nous allons déterminer si ces processus se déroulent de la même manière chez des poissons jeunes et chez des poissons ayant un vieillissement accéléré. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d'accroitre les connaissances fondamentales sur les étapes précoces de la formation des métastases.
Procédures
Groupe 1: Une injection au stade embryonnaire (48 heures après fécondation). Durée 10 secondes (EU1). Imagerie non invasive au maximum une fois par jour (EU1). Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 2: Deux injections au stade embryonnaire (48 heures après fécondation) (EU1). Durée 10 secondes chacune. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour (EU1). Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 3 Une injection au stade embryonnaire (au stade une cellule) (EU1). Durée 10 secondes. Photographie une fois par semaine au maximum (EU1), sous anésthésie. Imagerie par microscopie sous intubation avec anésthésie et analgésie, jusqu'à une fois toutes les deux semaines (EU2). Durée 4 heures. De 8 à 52 semaines maximum. Groupes 4 et 5: prélèvements d'un petit morceau de nageoire sur animaux anésthésiés pour génotypage (EU1).
Impact sur les animaux
Chez l'embryon ou la larves, on peut observer un retard de développement suite à l'injection, mais cela reste très rare. Les larves de moins de 15 jours peuvent souffrir de l'isolement. Chez l'adulte, la formation de mélanomes peut entrainer des changements de comportement généralement associés au stress ou à une maladie. Ceux-ci comprennent : une diminution de la qualité de la nage (moins droite et régulière, moins rapide), la formation d'abcès ou d'oedèmes, des difficultés de respiration (visibles par un rythme anormal de dilatation des branchies) ou de prise de nourriture. Les animaux malades peuvent également s'éloigner de leurs congénères. Le vieillissement accéléré conduit à un amincissement des individus et une mort prématurée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer des prélèvements et pour éviter que les tumeurs ne continuent à croître et entrainent plus de nuisances.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable à la réalisation de ce projet car il n'existe pas de modèle permettant de reproduire in vitro toute la complexité du microenvironnement entre le moment où la cellule tumorale quitte la circulation envahit un nouveau tissu et le colonise. Néanmoins, certaines étapes ou certaines interactions sont étudiées in vitro. Nous avons par exemple développé un système de microfluidique permettant de reproduire les interactions entre cellules tumorales soumises à un flux et cellules endothéliales. Nous utilisons également un modèle d'invasion en matrice de collagène in vitro, ainsi que des systèmes de co-culture cellules tumorales-cellules immunitaires. Nous utilisons des lignées de cellules tumorales dérivées de mélanome ou de carcinome mammaire.
Réduction
Nous utilisons des systèmes d'imagerie qui permettent un suivi longitudinal d’un même animal et donc une réduction du nombre total d’animaux nécessaires. Une étude exhaustive des données récentes de la littérature n'a pas permis d'identifier une équipe réalisant des expériences similaires ailleurs dans le monde. Nous avons établi le nombre d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Un traitement analgésique et anesthésique est prévu avant imagerie des adultes. Les larves en procédure seront hébergés individuellement pour permettre leur suivi longitudinal. Les adultes en procédure seront hébergées en groupe de 10 à 20 pour conserver les interactions sociales essentielles à leur bien être. Les aquariums, en particulier lorsque les larves sont isolées, sont enrichis avec des fonds imprimés représentant des cailloux de rivières. Certains adultes sont isolés pendant 12h pour vérifier qu'ils récupèrent bien des séances d'imagerie. Dans ce cas, ils sont hébergés par 2, mais séparés par une vitre pour leur permettre de maintenir un contact visuel et réduire leur stress. Lors de leur transport, les animaux sont conservés dans leur eau d'origine et une fois arrivés sur place un temps de récupération est prévu.De plus larves et adultes seront nourris quotidiennement avec de la nourriture vivante, ce qui induit des comportements de chasse et augmente le bien être. Cet enrichissement est particulièrement important pour limiter le stress dans les rares cas où les animaux doivent être isolés (plaie ou blessure apparente). Tous les animaux utilisés sont obtenus par croisements sur place et sont donc habitués à notre animalerie.
Choix des espèces
Depuis quelques années, il apparait que la progression tumorale chez le poisson zèbre présente d'importantes similarités avec l'homme, d'un point de vue génétique et histologique. Par ailleurs, le poisson zèbre présente l'avantage, notamment par rapport à la souris, de permettre l'observation des tumeurs par imagerie non-invasive dans l'animal vivant. Nous avons récemment montré que des cellules de mélanomes de poisson zèbre sécrètent des vésicules extracellulaires très semblables à celles sécrétées par des lignées de mélanomes humaines (en morphologie et en contenu protéique). Nous avons également montré que nous pouvions suivre ces vésicules extracellulaires marquées par fluorescence dans l'embryon vivant. Nos expériences portent majoritairement sur les stades embryonnaires et larvaires, mais aussi sur les adultes pour certaines investigations.
Impact d’une délétion d’un marqueur de l’insuffisance rénale chez les souris atteintes par la maladie de Dent
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pour savoir si la suppression d'un marqueur de lésion rénale ralentit la maladie de Dent, 1 505 souris vont être utilisées, dont 130 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles passent cinq jours en cage à métabolisme individuelle, subissent une mesure de filtration rénale sous anesthésie suivie de deux heures d'observation, une mesure de composition corporelle en tube clos et un prélèvement sanguin que le porteur décrit comme pouvant provoquer une hémorragie, voire la mort. Le groupe suivi jusqu'à dix mois repasse cette série entière à quatre, sept et dix mois. Les souris écartées faute du bon génotype sont tuées sans prélèvement, et le poids, l'apparence et le comportement relevés chaque jour en cage à métabolisme servent à fixer le moment de la mise à mort.
Objectifs
La maladie de Dent de type 1 est une maladie rénale rare caractérisée par une perte urinaire de protéines et de calcium, la présence de calculs rénaux, et une insuffisance rénale progressive. Jusqu'à présent, il n'existe pas de traitement spécifique pour cette maladie. Une souris modifiée génétiquement présentant les mêmes traits cliniques observés chez les patients a été générée. Cette souris présente dans l’urine et des reins de fortes quantités d’un marqueur de lésion rénale mais connu comme jouant aussi un rôle actif dans l’apparition de dommages rénaux. L’objectif de ce projet est de déterminer si ce marqueur joue un rôle actif aussi dans la maladie de Dent, et si sa délétion permet de ralentir la progression de la maladie et freiner l’apparition de l'insuffisance rénale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’importance d’un marqueur de lésion rénale dans l’évolution de la maladie de Dent 1, une pathologie conduisant à l’insuffisance rénale. Il n’existe pour le moment que des traitements symptomatiques de la maladie, en vue d’améliorer la fonction rénale des patients atteints par la maladie de Dent. En faisant appel à l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés, celui-ci aura un impact significatif sur la santé humaine car il permettra d’apporter de nouvelles perspectives conduisant au développement de pistes thérapeutiques, en vue d’améliorer la fonction rénale des patients atteints par cette pathologie.
Procédures
Un premier lot de souris recevra ou non un traitement dans leur nourriture en croquette. Ces souris ne changeront plus de régime alimentaire jusqu'à la fin de leur vie. A 4 mois, une mesure non invasive de composition de la masse corporelle sera effectuée en plaçant les souris dans un tube clos pour la mesure (environ 2 minutes). Ensuite, une mesure de la filtration rénale sera effectuée impliquant une anesthésie gazeuse, la pose d’un capteur de fluorescence maintenu par un adhésif adapté, une injection intra-veineuse du traceur fluorescent (environ 10 minutes) puis un suivi sur animal vigile d’environ 2 heures. Après, ces souris seront placées en cage à métabolisme individuelle dans une enceinte spécifique permettant de prélever l’urine durant 5 jours (3 jours d’habituation et 2 jours de d'expérience). A l’issue de cet hébergement, un prélèvement sanguin de faible volume sera réalisé sur souris vigiles (environ 1 minute). Ensuite, les animaux seront soit euthanasiés (groupe 4 mois) ou retourneront en stabulation en attendant la prochaine phase d’analyse (groupe 10 mois). En effet, le groupe 10 mois, repassera par la même série d’analyses précédemment décrites à 7 mois et à 10 mois avant euthanasie et prélèvements. Un second lot de souris recevra ou non un traitement dans leur nourriture en croquette. Ces souris ne changeront plus de régime alimentaire jusqu'à la fin de leur vie. A 4 ou 10 mois, les organes seront récupérés après l’euthanasie effectué sous anesthésie et analgésie. Des animaux auront potentiellement un phénotype dommageable. Durant l’élevage une biopsie sera nécessaire pour effectuer l’identification génétique de ces animaux (quelques secondes sur animal vigile).
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques utilisées présentent un phénotype dommageable avec une pathologie rénale pouvant induire une diminution de la filtration rénale, une augmentation de l’excrétion de solutés tels que les protéines et le calcium, augmentation de la fibrose rénale qui n’entraînent pas de douleur. Une biopsie sera nécessaire afin d’identifier génétiquement les animaux qui seront utilisés. Celle-ci est susceptible d’entrainer une douleur légère de courte durée. Une partie des animaux recevront un traitement incorporé dans leur croquette habituel, lors du changement de régime cela pourrait causer un léger stress et entrainer une diminution de la consommation en raison de la néophobie des souris. Les souris seront placées dans un tube clos pour la mesure de la composition corporelle pouvant engendrer un léger stress le temps de la mesure de résonance magnétique. Les souris seront anesthésiées et reçoivent une injection intraveineuse pour réaliser la mesure de l’activité de leurs reins. Cette intervention est susceptible de générer une hypothermie et un risque de détresse respiratoire ainsi qu’une douleur au réveil au site d’injection. Les souris seront placées en cage à métabolisme, ce type d’hébergement peut générer un stress en raison du changement d’environnement. Les souris subiront un prélèvement de sang qui est susceptible de causer une douleur de courte durée associée à la piqûre de l’aiguille, mais pouvant également causer une hémorragie dans de rare cas, voire la mort.
Devenir
L’euthanasie est requise pour réaliser des prélèvements en vue des analyses pour répondre à la question scientifique. Une autre partie des animaux sera euthanasié sans prélèvement en fin de période de reproduction ou en raison de l’absence du gène d’intérêt après l’identification génétique.
Remplacement
Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux pour des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront de déterminer l’effet des traitements sur leur phénotype rénal (notamment les modifications du débit de filtration glomérulaire, des contenus urinaires et plasmatiques, les altérations histologiques et moléculaires des cellules rénales) en comparaison avec celui des animaux non traités.
Réduction
Ce projet a une durée de 5 ans, et nécessitera la génération de 1505 souris (couvrant l’ensemble des demandes). Nous avons calculé le nombre d’animaux au plus faible grâce à un calcul de puissance et de notre expérience passée. Pour une interprétation fiable des résultats il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques robuste. Pour raffiner nos animaux au maximum nous réaliseront le plus d’expérience possible par animal. Les souris exclues des procédures en raison d’un génotype non conforme ou non pertinent pour les procédures ou le maintien de la lignée pourront être réaffectées à d’autres projets au sein de l’animalerie ou de l’équipe, notamment pour la récupération d’organes ou comme animaux de réforme ; si aucune réaffectation n’est possible, elles seront euthanasiées.
Raffinement
Durant leur hébergement en stabulation et en élevage, les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. L’environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal, des cylindres en carton, des bouts de bois et/ou des maisons. L’hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l’établissement utilisateur. Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites nécessitant une euthanasie de l’animal. De plus, la mesure de leur débit de filtration glomérulaire sera effectuée sous anesthésie avec réveil. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux recevront une anesthésie sans réveil. Par ailleurs, la gestion de la douleur sera prise en compte avec la mise en place d’une grille de score, de la définition de points limites et la réalisation des certaines procédures sous anesthésie et analgésie. L’ensemble des expériences sera mené en présence de personnels hautement qualifiés dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur. Au moment du pucage, les animaux vigiles sont prélevés d’un bout d’oreille à l’aide d’un poinçon d'oreille afin d’éviter une manipulation supplémentaire. Ces manipulations ont lieu dans une pièce dédiée, au calme. Le geste est effectué sur un animal très jeune afin de limiter la douleur et car il a une cicatrisation rapide. Le geste est parfaitement maitrisé par les zootechniciens et est fait rapidement avec un poinçon adapté et désinfecté après chaque animal. L’animal est surveillé immédiatement après cet acte pour s’assurer qu’il ne saigne pas et est bien repris en charge par sa mère. Le bout d’oreille est envoyé à l’analyse de génotypage.
Choix des espèces
Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car seuls des modèles animaux nous permettront d’évaluer l’effet d’une invalidation d’un marqueur de lésions rénales visant à ralentir l’évolution de la maladie. Nous utiliserons des souris mâles contrôles et transgéniques âgés de 4, 7 et 10 mois afin d’évaluer l’effet de l’invalidation d’un marqueur de lésions rénales sur l’évolution de la maladie. Nous utiliserons aussi des femelles contrôles et transgéniques suivies à 4, 7 et 10 mois afin de s’assurer que leur phénotype ne diffèrent pas de celui observé chez les femmes portant la maladie.
Décontamination par transfert d’embryons de lignées murines EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Tuées à cinq semaines parce que le prélèvement de leurs ovules l'exige, les femelles donneuses ne sont qu'une part des 5 305 souris de ce projet : les mâles vasectomisés sont tués à deux ans lorsqu'ils cessent d'être de bons reproducteurs, les femelles receveuses à quatre mois après le sevrage des souriceaux, une sur trois partant en laboratoire d'analyse pour le contrôle sanitaire. Le niveau de souffrance déclaré va de léger à modéré. Les procédures tiennent en deux injections d'hormones pour les donneuses, une vasectomie de dix minutes pour les mâles, une chirurgie de réimplantation d'embryons de dix minutes pour les receveuses. L'objet du projet est un service rendu aux animaleries, rendre des lignées exemptes de pathogènes pour qu'elles circulent entre établissements. Le porteur écrit que la décontamination d'une lignée "nécessite obligatoirement qu'elle soit respirante", et conclut que la souris ne peut pas y être remplacée.
Objectifs
Les animaleries d'hébergement gèrent leur statut sanitaire. Suivant le statut sanitaire d'une animalerie, il se peut que des animaux ne puissent pas être transférés d'un établissement utilisateur vers un autre ce qui peut être un frein à un projet et au bon déroulement de la recherche scientifique. De plus, harmoniser le statut sanitaire des animaux permet de diminuer l'hétérogénéité entre les individus et donc d'améliorer les résultats des différents projets. Pour pallier à ce problème de statut sanitaire, la plateforme scientifique propose à la communauté scientifique de réaliser la décontamination de leurs animaux. Ceci signifie : rendre des animaux dépourvus de pathogènes spécifiques pour pouvoir permettre leur importation dans le maximum d'animalerie du monde entier.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont 1) permettre des importations d'animaux dans un grand nombre d'animalerie grâce à leur statut sanitaire exempts de pathogènes et d'opportunistes spécifiques 2) contribuer aux développements et aux collaborations dans les projets de recherche 3) réduire les biais dans les résultats scientifiques en diminuant l'hétérogénéité entre les animaux. Les lignées décontaminées sont nécessaires dans le cadre de nombreux projets scientifiques préalablement validés qui permettront de répondre à des questions scientifiques précises et aux enjeux de santé/société (domaines de recherche : pathologies respiratoires, musculaires, du système nerveux, métaboliques, cardiovasculaires ou génétiques).
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales d'hormones (vigil, 2x par femelles donneuses, quelques secondes) ou une chirurgie de vasectomie sous anesthésie et analgésie (1x par mâle, 10 minutes) ou une chirurgie de réimplantation d'embryons sous anesthésie et analgésie (1x par femelles receveuses, 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales pourront induire un stress et une douleur de courte durée aux animaux. Les chirurgies peuvent induire des difficultés post-opératoire comme des douleurs ou une mauvaise cicatrisation. Les anesthésies pourront engendrer une baisse de la thermorégulation. L'hébergement individuel des mâles pourra engendré un stress.
Devenir
Une femelle receveuse sur trois sera exportée en laboratoire d'analyse pour obtenir les résultats sanitaires et valider la procédure de décontamination des animaux. Les autres animaux seront euthanasiés à la fin du projet : les mâles vasectomisés lorsqu'ils ne seront plus de bons reproducteurs (2 ans), les autres femelles receveuses (deux sur trois) à 4 mois de vie après le sevrage des souriceaux car elles ne pourront pas avoir une seconde chirurgie puis les femelles donneuses d'ovules à 5 semaines de vie car le prélèvement nécessite l'euthanasie.
Remplacement
Actuellement il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Un organisme vivant est donc nécessaire pour mener à bien les divers projets scientifiques autorisés au sein de l'établissement. La souris est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. La décontamination d'une lignée murine nécessite obligatoirement qu'elle soit respirante. La souris ne peut donc pas être remplacée dans ce projet.
Réduction
5305 animaux pourront être utilisés dans ce projet pour les 5 ans. Le nombre de mâles et de femelles utilisées par lignée pour les transferts d'embryons est le minimum requis pour obtenir les animaux d'intérêt suite à la redérivation. Les mêmes mâles vasectomisés sont utilisés pendant 2 ans. Les lignées décontaminées seront utilisées dans un projet de recherche autorisé. La plateforme scientifique propose la cryoconservation de sperme si une lignée n'est plus utilisée dans un projet de recherche. Ceci permet de conserver une lignée de manière non respirante et donc d'éviter de produire des animaux uniquement pour le maintien d'une lignée. Il n'y a pas de tests statistiques ou de calcul de puissance mais cela sera systématiquement appliqué dans le cadre de l'utilisation continue des animaux au sein des projets de recherche qui découlent de ces élevages.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Tout sera mis en oeuvre pour limiter au maximum les nuisances. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les chirurgies sont réalisées par des spécialistes sous anesthésie et analgésie pour garantir le bien être des animaux. L'analgésie est poursuivie en post-opératoire et des croquettes humidifiées seront disposées au fond de la cage pendant 1 semaine. Les animaux nécessitant un hébergement individuel bénéficieront de 3 enrichissements dans leur cage. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. La surveillance attentive quotidienne sera accompagnée de points limites définis.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. En effet, il existe de nombreux modèles génétiquement modifiés pour de très nombreuses pathologies humaines. Les mâles vasectomisés sont vasectomisés à 5 semaines. Les femelles receveuses sont utilisés à partir des 8 semaines car elles doivent être matures sexuellement. Les femelles donneuses d'ovule sont utilisées à 5 semaines. Les injections d'hormones doivent se faire sur des femelles prepubères pour maximiser le nombre d'ovules relachés et, ainsi, améliorer le taux de reusite de la décontamination. Les mâles pour accouplement sont utilisés entre 8 et 15 semaines.
Travaux Pratiques en formation technologique niveau Licence – Souris – Comportement
- Enseignement supérieur
Former des étudiants de licence à la pharmacologie des psychotropes mobilise 1 500 souris sur cinq ans, 300 par année universitaire. Elles relèvent d'un niveau de souffrance léger à modéré et sont toutes tuées à l'issue, leur placement "n'étant pas envisagé à l'heure actuelle". Chaque souris reçoit une administration par voie orale, sous-cutanée ou intrapéritonéale une fois par semaine, puis passe deux à trois heures en enceinte d'observation ou en test comportemental, jusqu'à huit fois dans l'année. Deux cents d'entre elles subissent en plus un test d'évaluation de l'humeur. L'analyse du comportement des souris ne serait, selon le porteur, pas remplaçable par des techniques de simulation.
Objectifs
Les laboratoires de recherche privés ou académiques comptent dans leurs rangs de nombreux techniciens qui interviennent directement dans la mise en oeuvre de projets scientifiques utilisant des animaux vivants. Ces projets ont pour but d’améliorer à la fois nos connaissances mais aussi la santé humaine ou animale. Le BUT Génie Biologique, parcours Biologie Médicale et Biotechnologies (BUT GB BMB) vise à former des techniciens supérieurs qui sont recrutés par les laboratoires. La formation porte en moyenne chaque année sur environ 200 étudiants (2nde et 3ème année de BUT Génie Biologique, parcours Biologie Médicale et Biotechnologies). L’objectif de ce projet est d’assurer les compétences des agents recrutés et de former au mieux les étudiants sur la base de travaux pratiques (TP) chez le rongeur dans le cadre de situations d'apprentissage et d'évaluation. Les étudiants seront formés à la pharmacologie des psychotropes via une analyse comportementale, en passant par l’apprentissage des techniques élémentaires d’administration et de mise en place d'un protocole d'études précliniques. 6 procédures expérimentales sont prévues, réalisées sur animaux vigiles suite à une administration voie intrapéritonéale, voie sous-cutanée ou orale. Du fait des requis pour la formation de techniciens en expérimentation animale, aucune méthode alternative non-animale n’est ici adaptée. L'espèce choisie est celle qui la plus utilisée dans les travaux de recherches fondamentales ou appliquées, à savoir la Souris. Le degré de gravité des procédures appliquées est léger à modérée, ces procédures n'utilisant que des souris vigiles auxquelles seront administrés les produits étudiés puis observées dans les différents tests réalisés. Le nombre d’animaux pour mener à bien ces objectifs est, par année universitaire, de 300 souris soit 1500 pour 5 ans. En conformité à la règle des 3R, le nombre d’animaux par TP est limité à la quantité minimale suffisante pour obtenir des données exploitables et analysables (compétences attendues de nos apprenants).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont la montée en compétences de nos étudiants qui doivent acquérir les gestes expérimentaux basiques sur l'animal de laboratoire, expérimenter dans le cadre d'études pré-cliniques en évaluant l'effet des xénobiotiques en pharmacologie notamment sur l'animal de laboratoire et participer à l'évaluation de l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques (référentiel de compétences du BUT GB BMB publié en Juin 2023). Cela permet de former des étudiants à même de s'insérer professionnellement en tant que techniciens, assistants ingénieurs dans des structures utilisant les animaux de laboratoire dans leurs projets, notamment en recherche et développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour des pathologies humaines ou animales.
Procédures
La principale intervention sur les animaux prévues est l'administration des molécules par voie intrapéritonéale (IP), sous-cutanée (SC) ou orale (PO) des molécules testées, ou du véhicule (sérum physiologique). Un animal est soumis une fois par semaine à une administration (IP, SC ou PO), administration rapide et maitrisée, puis mis dans une enceinte pour observation (procédures 1.2.3.) ou être soumis à des tests comportementaux (procédures 4.5.6) pour une durée maximale de deux à trois heures.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont pour tous les animaux, une douleur légère lors des administrations de produits (injection de courte durée) et, pour 200 d'entre eux (sur la totalité du projet), un test d'évaluation de l'humeur sera en plus réalisé.
Devenir
A l'issue des procédures les animaux sont mis à mort selon de façon appropriée, le replacement des souris n'est pas envisagé à l'heure actuelle.
Remplacement
Les étudiants analysent le comportement de souris, ce qui n’est pas remplaçable par des techniques de simulation, ceci après avoir appris les gestes de préhension et administration de molécules tout d'abord de façon théorique à l'aide de films et démonstrations puis sur animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au minimum par TP soit de 6 à 20 animaux selon les procédures (procédures 1 à 5, d’une durée de 2 heures, 6 à 10 animaux sont prévus par procédure, procédure 6, d’une durée de 3 heures, 20 animaux sont prévus). Chaque procédure est reproduite 40 fois (par an, avec 8 groupes de TP et 5 séances tournantes en parallèle) mais un animal ne subit une procédure que 8 fois (8 groupes TP, avec minimum une semaine entre chaque procédure),
Raffinement
Chaque poste de travail (une procédure pour un bi-trinome d'étudiants) est éloigné l'un de d'un autre. Avant manipulation, les animaux sont maintenus dans leur groupe (cage de stabulation) et y sont remis après celle-ci. Pendant la séance, les animaux sont différenciés par marquage sur la queue. Les cages sont enrichies par diverses objets. Chaque animal n'est utilisé qu'une fois par semaine et observé avant retour dans l'unité de stabulation. Une des procédures utilise l’administration d’une molécule par voie orale, si cela est possible elle se réalise selon la méthode MDA (Micropipette-guided Drug Administration). Si pendant et hors des procédures expérimentales, un point limite est atteint (attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité); toute altération de l’état général (tumeur, excroissance, prolapsus); perte de poids > 20%), l'animal est isolé, surveillé et le cas échéant, mis à mort.
Choix des espèces
Seule la Souris est utilisée pour ce projet afin de de permettre aux étudiants de se familiariser avec cette espèce la plus utilisée (plus des 2/3) en recherche fondamentale et appliquée, notamment dan sle cadre des études précliniques réglementaires en recherche et développement en industrie pharmaceutique. Les animaux utilisés sont des animaux jeunes (8 à 15 semaines) classiquement utilisés pour ces expérimentations.