Procédures légères

9 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, et chacune commence par une coupe du bout de la queue à quatre semaines. 6 760 d'entre elles sont ensuite exposées à une douleur thermique ou mécanique sur une patte ou la queue, dont 5 400 toutes les quinze minutes pendant deux heures, tandis que 900 subissent une douleur modérée d'une patte pendant 45 minutes et 3 600 une inflammation d'une patte durant de quatre heures à sept jours. 9 000 reçoivent en plus une à cinq injections d'un composé dérivé de venins d'anémone de mer, de mygale ou de serpent. Aucune ne reçoit d'analgésique, le porteur écrivant qu'il ne peut pas en envisager l'emploi dans des procédures qui ont pour objet l'étude de la douleur.

Objectifs

Notre équipe étudie les mécanismes de la perception douloureuse, et en particulier le rôle de détecteurs joué par des protéines membranaires des neurones sensoriels innervant la peau, les canaux ioniques, en développant leur pharmacologie. A partir d‘une bibliothèque de venins animaux, nous avons déjà identifié plusieurs peptides (d‘anémone de mer, de mygale et de serpents) qui ont donné lieu à des publications de haut niveau scientifique. Dans le cadre d'un projet collaboratif, des dérivés de peptides naturels que nous avons découverts doivent être testés dans la perspective d’un prochain développement clinique.

Bénéfices attendus

Ces études précliniques chez l’animal, qui permettent seule l'étude de la réalité physiologique dans un contexte intégré, sont nécessaires à la poursuite d’études cliniques pour développer de nouveaux composés anti-douleur, ce qui est crucial face à la crise mondiale des opioïdes et à l'augmentation des addictions et morts par overdoses.

Procédures

Toutes les souris (9500) subiront à l'age de 4 semaines le prélèvement du bout de queue pour déterminer leur génotype (30’’) et le stress de contentions répétées pendant les tests comportementaux. A l'age de 7 à 15 semaines dans le cadre des tests comportementaux, 6760 souris seront exposées à une douleur légère thermique ou mécanique sur une patte ou la queue de durée < 2 minutes et de laquelle elles pourront s'échapper (mesure d'un seuil de douleur), dont 5400 de façon répétée toutes les 15 minutes pendant 2h. 900 souris subiront une douleur modérée d'une patte pendant 45 minutes et 3600 souris subiront une inflammation d'une patte ne s’accompagnant d’aucun comportement traduisant une douleur spontanée (de 4h à 7 jours). 9000 souris subiront de 1 à 5 injections d’un agent pharmacologique (30’’), dont 3000 sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Nuisance légère pour prélèvement de bout de queue pour génotypage, stress léger de la contention après habituation pour les tests comportementaux et l'anesthésie gazeuse, nuisances légères des injections pharmacologiques, nuisance modérée de l'inflammation induite sur une patte arrière et de la douleur ou de l'hypersensibilité inflammatoire ressentie sur la queue ou une patte arrière.

Devenir

Les souris impliquées dans la production des souris expérimentales (500 souris) seront mises à mort à l'issue de leur période physiologique de reproduction (8 mois pour les femelles, 15 mois pour les mâles). Ils permettront des prélèvements d'organes post-mortem pour des analyses biochimiques. Ce sont de plus des animaux OGM qu’il est interdit de disséminer hors des établissements de recherche. C’est aussi le cas pour les animaux ayant suivi les procédures expérimentales (9000) qui ont de plus subi des injections pharmacologiques, des tests invasifs et certains une hypersensibilité douloureuse chronique qui empêche aussi toute réutilisation. Toutes les souris seront donc mises à mort à l'issu des procédures et permettront des prélèvements post-mortem.

Remplacement

Au préalable, nous avons réalisé le maximum d'expériences in vitro sur les canaux ioniques dans des lignées cellulaires en culture, puis sur des cultures primaires de neurones sensoriels de rongeurs. Mais, pour savoir si ces peptides peuvent avoir un intérêt thérapeutique, des expériences de comportement et de pharmacologie chez la souris sont nécessaires, pour avoir accès à la complexité physiopathologique de l'intégration du message douloureux et de la pharmacologie in vivo. Utiliser la souris comme modèle permet d’utiliser des modèles pathologiques de référence, ainsi que d’étudier des animaux transgéniques chez lesquels un gène d’intérêt, codant pour une protéine cible du composé pharmacologique à tester, a été invalidé (knock-out). Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal sont nécessaires à la poursuite d’études cliniques pour développer de nouveaux analgésiques.

Réduction

Le design des méthodes de reproduction a été optimisé pour pouvoir produire sur les 5 ans de la durée du projet les souris expérimentales ainsi que d’inclure un croisement pour maintenir le fond génétique. Le projet s’étalant sur 5 ans, le nombre réel des reproductions et des animaux reproducteurs pourra être réduit en fonction des portées déjà produites et étudiées auparavant. Les animaux reproducteurs pourront être aussi utilisés pour produire des souris dans le cadre d’autres projets du laboratoire, ou pour renouveler les lots de reproducteurs, et seront mis à mort à la fin de leur période de reproduction pour permettre des prélèvements de tissus post-mortem. L‘objectif de Réduction a également été pris en compte en réduisant le nombre d‘animaux prévisionnel au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs tout en intégrant des aléas expérimentaux. Le nombre d’animaux expérimentaux sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile ou redondante par des résultats précédents obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique mondiale permanente) ne sera pas conduite. Les expériences prévues sur les souris transgéniques ainsi certaines procédures testant la capacité motrice ne seront conduites qu’avec les composés et par les voies d’injection induisant un effet analgésique. De plus, la réalisation d’une procédure est conditionnée par le résultat préalable d’une autre. Ainsi, le nombre d’expériences ainsi que le nombre maximal de souris prévues pourra être réduit.

Raffinement

Toute souris qui présenterait des signes d'infection au niveau de la queue dans la semaine qui suit le prélèvement pour génotypage sera traitée par des soins vétérinaires adaptés jusqu'à guérison. Si la plaie persiste au-delà d’une semaine, la souris sera mise à mort. Dans le cadre de l'objectif de Raffinement, la longue expérience de notre groupe dans les études des mécanismes de la douleur chez l'animal nous permet de proposer des tests comportementaux complémentaires mettant en jeu différentes modalités douloureuses ou motrices avec une sévérité légère à modérée. Les animaux sont habitués aux tests de façon à réduire leur stress et obtenir des mesures reproductibles et fiables. Les protocoles prévoient parfois un suivi des effets pharmacologiques sur 5 jours, mais cette durée sera réduite en cas d’absence d’effet ou d’effet transitoire. Les animaux sont mis à mort dès la fin de l’expérience de comportement associée à de la pharmacologie in vivo. Grâce à un suivi quotidien de chaque animal tout au long de chaque procédure, tout animal qui présenterait des signes de comportement anormal ou d‘une pathologie quelconque serait mis à mort. Nous ne pouvons en effet pas envisager l’emploi d’analgésique dans nos procédures qui ont pour objet l’étude de la douleur.

Choix des espèces

Les expériences de comportement et de pharmacologie in vivo sont réalisées chez la souris pour pouvoir utiliser des animaux transgéniques (knock-out) pour déterminer la spécificité de l’effet des composés testés et en utilisant des modèles pathologiques de référence. Au sevrage, à 4 semaines, un prélèvement de tissus (extrémité de la queue) permettra une analyse génétique. Les expériences comportementales seront conduites sur des adultes entre 7 et 15 semaines. Cet âge permettra aussi la comparaison avec des expériences déjà publiées.

Automutilation, stéréotypie sévère, prostration, perte de plus de 20 % du poids, diarrhée sanglante : la grille de points limites énumère ce qui déclenche la mise à mort des 1 316 souris de ce projet, dont 1 012 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes. Elles subissent des ponctions de moelle osseuse sous anesthésie, jusqu'à une par mois pendant toute leur vie, ainsi qu'une irradiation suivie quelques heures plus tard d'une greffe de moelle, les animaux d'élevage recevant en plus une coupe de queue pour génotypage. Le suivi va de un à trente mois d'âge pour comprendre le rôle d'une enzyme dans les leucémies aiguës, le porteur renvoyant à la littérature pour justifier l'effectif sans donner de calcul.

Objectifs

Notre moelle osseuse produit toutes les cellules du sang (globules blancs, globules rouges et plaquettes) à partir de cellules immatures nommées cellules souches hématopoïétiques (CSH). Notre gène d'intérêt code pour une enzyme essentielle dans la régulation de la stabilité d’un large panel de substrats, l’impliquant ainsi dans un grand nombre de processus physiologiques, de manière directe ou indirecte. Comme dans d’autres cancers, les Leucémies sont la conséquence de dérégulation de l’expression de protéines clés contribuant à la transformation leucémique des cellules sanguines. Des études de la littérature complétées de nos travaux les plus récents ont permis de décrire une expression altérée de la protéine d'interêt chez les patients atteints de Leucémies Aiguës. Notre équipe a ainsi développé des modèles animaux permettant de reconstituer et ainsi d’étudier l’histoire naturelle de la maladie. Précisément, l’objectif de notre projet de recherche est donc de comprendre le rôle de la protéine d'interêt dans le développement normal des cellules sanguines et d’identifier son implication lors de la transformation leucémique. Cette étape majeure nous permettra ensuite de développer de nouveaux médicaments candidats pour le traitement des Leucémies Aiguës. Dans l’ensemble, ce projet devrait permettre de mieux comprendre ainsi que de cibler les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent le développement des Leucémies Aiguës.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de la protéine d'intérêt dans l'hématopoïèse normale et ainsi vérifer si elle pourrait être une bonne cible thérapeutique dans les Leucémies Aiguës.

Procédures

Le prélèvement de moelle osseuse et/ou de sang ainsi que les transplantations de moelle osseuse dans des souris receveuses irradiées au préalable se feront sous anesthésie (animal surveillé jusqu'au réveil). Les prélèvements de moelle osseuse, effectués sous anesthésie générale et locale, durent moins de deux minutes et sont réalisés au maximum une fois par mois au cours de la vie de la souris et sont des procédures de degré de sévérité modérée. Les expériences de transplantation nécessitent une irradiation des souris. Cette procédure de degré de sévérité modérée, réalisée une seule fois au cours de la vie de la souris, dure moins de 2 minutes. Les souris sont transplantées avec de la moelle quelques heures après l'irradiation pour garantir leur survie. Elles sont surveillées attentivement dans les heures qui suivent l'irradiation, et du gel hydratant est ajouté dans la cage durant la première semaine. Les animaux de l'élevage (USP7+/+ et USP7+/-) nécessaires à la préparation des lots expérimentaux, subiront la biopsie de queue pour déterminer leur génotype.

Impact sur les animaux

L'invalidation totale de la protéine d'intérêt est létale donc nous n'utiliserons que les animaux possédant une expression de moitié de la protéine d'intérêt (viables et ayant un développement normal) ainsi que leurs homologues sauvages. Ces souris ne présentent aucun phénotype dommageable. Les animaux de l'élevage (USP7+/+ et USP7+/-) qui ont été nécessaires à la préparation des lots expérimentaux de notre DAP subissent la biopsie de queue pour déterminer leur génotype. Dans ces conditions, le prélèvement pourrait être de douleur légère de courte durée pour les animaux concernées.

Devenir

A l’âge voulu, les souris seront euthanasiées pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Nous avons validé au laboratoire, in vitro, que la protéine d'intérêt impacte la prolifération des cellules leucémiques et contribue à la résistance aux traitements. Afin de déterminer l'impact de cette enzyme sur un organisme entier, nous allons utiliser des souris où le gène de cette enzyme est muté. Nous allons également utiliser les cellules de ces souris pour réaliser les tests de différenciation ex vivo. Les modèles murins sont utilisés majoritairement par la communautéscientifique internationale pour étudier les cellules souches hématopoïétiques dans des pathologies hématologiques.

Réduction

Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée et sur la base d'expériences réalisées in vitro avec des lignées leucémiques afin d'optimiser nos protocoles pour réduire au maximum le nombre d'animaux. Des études de la littérature nous permettent également de déterminer le nombre minimum de souris nécessaires afin que l'expérience ait une valeur scientifique et n'ait pas besoin d'être reproduite.

Raffinement

En plus des considérations éthiques, nous n'employons que des personnes formées à la manipulation des animaux et soucieux du bien-être de l'animal. Les animaux sont hébergés en cages ventilées, selon les normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement dans chaque cage (parmi igloo, batônnets de bois, coton, sizzle nest), et un statut sanitaire contrôlé trimestriellement. Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont utilisées, les procédures (de degré de sévérité modérée de cette DAP) sont réalisées sous anesthésie et analgésie quand cela est possible, et l’utilisation de tapis chauffants limite l’hypothermie lors des anesthésies. Les animaux utilisés sont choisis en bonne santé et sans phénotype dommageable. L’encadrement est réalisé par du personnel compétent, et l’état de santé des animaux contrôlé quotidiennement. Toute altération du bien-être (prostration, perte de poids, piloerection, blessures) des animaux réformés les écarte de toute utilisation de training. Les observations des animaux permettent d'appliquer des points limites précis et des critères d'arrêt des souffrances : APPARENCE GENERALE : Pas de toilette, posture recroquevillée. COMPORTEMENT : vocalisations, automutilation, stéréotypie sévère, souris immobile, prostrée. SIGNES CLINIQUES : perte de poids > 20% ou émacié, difficulté respiratoire sévère. ZOOTECHNIE : propreté cage : diarrhée sévère et sang, cage humide après 2 jours; absence de prise de boisson et alimentation.

Choix des espèces

Nous allons mener des études longitudinales tout au long de la vie des animaux, incluant des périodes à un jeune âge (1, 3, 6 et 12 mois) ainsi que pendant le vieillissement (souris âgées de 24 à 30 mois). Ces différents stades représentent l'évolution de l'hématopoïèse, à la fois chez l'Homme et chez la souris (hématopoïèse jeune, adulte et clonale).

Choisis parce que leur œil ressemble à celui de l'humain, macula comprise, et pour éviter le recours aux primates, 35 mini-porcs Yucatan de six mois sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Vingt-six d'entre eux reçoivent une brûlure de la rétine au laser sur les deux yeux, puis jusqu'à quatre imageries et quatre angiographies sous anesthésie générale, trois électrorétinogrammes d'une heure et quatre ponctions de la chambre antérieure de chaque œil. Vingt subissent en plus une injection sous la rétine précédée d'une vitrectomie, geste que le porteur assortit d'un risque de décollement non résolu de l'ordre de 5 %, avec perte de vision à la clé. Tous sont tués pour que leurs yeux soient prélevés, alors que le RNT annonce qu'aucune douleur n'est attendue après la brûlure au laser, au motif que ce geste se pratique en clinique d'ophtalmologie.

Objectifs

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est la première cause de perte de vision chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays industrialisés, et c’est la troisième cause de malvoyance dans le monde. Environ 8% de la population française en est touchée. La DMLA affecte la macula, une petite zone de la rétine qui permet de voir les détails avec précision. Il existe deux formes principales de DMLA : la forme exsudative (ou humide), qui peut être traitée avec des injections, et la forme non-exsudative (ou sèche), pour laquelle il n’y a actuellement pas de traitement. Les injections pour la DMLA exsudative ne concernent qu’environ 10% des cas, et bien qu'elles puissent aider, elles sont contraignantes, coûteuses, et leur efficacité diminue avec le temps. Par ailleurs, la DMLA non-exsudative peut évoluer vers la forme exsudative, entraînant une perte de vision plus rapide. Depuis peu, on considère la DMLA comme une maladie auto-immune, car les cellules immunitaires de la rétine (appelées microglies) jouent un rôle important dans l’évolution de la maladie. Ces microglies migrent vers les zones endommagées de la rétine et provoquent des réactions inflammatoires. Elles sont aussi impliquées dans la croissance anormale de vaisseaux sanguins, ce qui aggrave la forme exsudative de la DMLA. Une molécule appelée CCL2, produite par les microglies, semble jouer un rôle clé dans ce processus inflammatoire et de prolifération des vaisseaux sanguins. L'idée est donc de développer un traitement qui ciblerait directement cette molécule pour empêcher l’apparition de nouveaux vaisseaux et réduire l’inflammation, ce qui pourrait prévenir ou ralentir l’aggravation de la maladie.

Bénéfices attendus

La nouvelle stratégie de traitement pour prévenir l'évolution de la DMLA vers sa forme humide (exsudative) est unique. Sans entrer en concurrence avec le traitement existant (injections répétées d’un anticorps dirigé contre la protéine stimulant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins), il viendrait compléter l'arsenal thérapeutique en diminuant fortement le nombre de patients nécessitant ce traitement chronique lourd qui a une efficacité partielle sur le long terme. Ce nouveau traitement pourrait ainsi améliorer la vision des patients sur le long terme. Si ce traitement s'avère efficace, il pourrait être administré de manière moins risquée, comme par des injections dans l’œil, ce qui faciliterait son utilisation pour un grand nombre de patients. De plus, des tests simples disponibles lors de consultations permettent de repérer les patients à haut risque de développer une DMLA humide, avec parfois plus de 50% de chances. Ce traitement pourrait aussi ralentir la forme sèche (atrophique) de la DMLA, forme pour laquelle il n’existe pas de traitement, et où des cellules immunitaires s'accumulent sous la rétine. Pour tester cette approche, l'utilisation du miniporc est préférée aux rongeurs pour des raisons scientifiques et aux primates pour des raisons éthiques, économiques et écologiques. À terme, l'objectif est de remplacer autant que possible les primates dans la recherche sur les maladies de la rétine. Un autre aspect important du projet est de développer un traitement ciblant les microglies (cellules immunitaires de la rétine). Leur rôle dans les maladies neurodégénératives et inflammatoires est de plus en plus reconnu, et les vecteurs en développement permettront de les atteindre directement pour réduire l’inflammation et traiter la DMLA ainsi que d’autres maladies inflammatoires du cerveau.

Procédures

(i) Brûlure superficielle de la rétine avec un laser argon 520nm sous anesthésie générale : Geste réalisé une seule fois sur les deux yeux de 26 animaux. La procédure dure 5 minutes par œil. (ii) Imagerie rétinienne sous anesthésie générale : Pour les animaux gardés le plus longtemps, cet examen sera fait jusqu’à 4 fois maximum sur chaque individu. L’examen dure 30 minutes par animal. (iii) Angiographie du fond d’œil sous anesthésie générale : Pour les animaux gardés le plus longtemps, ce geste sera réalisé jusqu’à 4 fois maximum. La procédure dure 30minutes avec l’injection par voie intraveineuse de deux colorants, suivi par une imagerie de la rétine. L’angiographie sera réalisée à la suite des imageries rétiniennes. (iv) Multifocal electroretinogramme (mfERG) : Pour les animaux gardés le plus longtemps, cet examen sera fait jusqu’à 3 fois maximum sur 26 animaux. L’examen dure 1 heure par animal. (v) Injection sous-rétinienne sous anesthésie générale : L’injection sera réalisée 1 fois sur les deux yeux de 20 animaux. La procédure dure maximum 1h30. (vi) Ponction de chambre antérieur (PCA) sous anesthésie générale : Pour les animaux gardés le plus longtemps, ce geste sera fait sur les deux yeux jusqu’à 4 fois sur chaque individu. La durée de la procédure est 5 minutes et sera fait à la suite des imageries rétiniennes (ii). (vii) Prélèvements sanguins : Pour les animaux gardés le plus longtemps, des prélèvements seront effectués jusqu’à 4 fois maximum au niveau d’une veine de l’oreille ou de la jugulaire (en fonction du volume nécessaire). La durée de la procédure est 5 minutes et sera fait en amont des imageries (ii).

Impact sur les animaux

(i) Brûlure superficielle de la rétine avec un laser : Aucune douleur à la suite de ce traitement n’est attendu (étant donné que cette procédure se fait régulièrement en clinique d’ophtalmologie). Un chirurgien ophtalmologue réalisera cette intervention avec l’assistance des animaliers. (ii) Angiographie du fond d’œil : l’injection intraveineuse d’un des colorants peut entrainer des nausées et vomissements. Nous traiterons les animaux avec un antiémétique en amont de cette injection. (iii) Injection sous-rétinienne (ISR) : Une vitrectomie centrale est nécessaire pour faciliter l’accès du produit à l’espace sous-rétinienne. Il y a un risque non-négligeable (5% sur l’œil de macaque) que le décollement de la rétine ne se résolve pas. Cela induirait une légère perte de vision potentiellement stressante pour le porc. Un chirurgien ophtalmologue réalisera toutes les injections avec l’assistance des animaliers. Le bon recollement de la rétine sera suivi en imagerie rétinienne à la suite de l’injection. Une injection locale d’un anti-inflammatoire sera réalisée à la fin des ISR afin d’éviter une réponse inflammatoire suite à l’injection des vecteurs. Deux pommades ophtalmiques composées de Vitamine A et d’un antibiotique sont appliquées à la suite de l’intervention pour minimiser l’irritation de la cornée. (iv) Anesthésies répétées : les anesthésies répétées peuvent stresser les animaux, elles seront espacées d’au moins une semaine pour laisser un temps de récupération aux animaux, ces anesthésies seront réalisées et surveillées par un vétérinaire et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les yeux sur lesquels s'appuieront des analyses post-mortem.

Remplacement

La rétine est une structure complexe formée de plusieurs couches de neurones et de cellules qui la nourrissent. Il est impossible de la recréer parfaitement en laboratoire (in vitro), c'est pourquoi on utilise des modèles animaux pour étudier comment elle fonctionne et tester des techniques de transfert de gènes. Avant de passer à des tests sur les animaux (in vivo), nous avons d'abord obtenu un maximum d'informations en travaillant sur des cellules en laboratoire. Le vecteur utilisé (outil pour transférer des gènes) a été sélectionné après avoir été testé sur des cellules de souris et humaines en laboratoire, puis sur des souris via des injections dans la rétine dans une étude précédente.

Réduction

En choisissant le meilleur vecteur (outil pour transférer des gènes) en laboratoire avant de faire des tests sur des animaux, nous avons réduit le nombre d'animaux nécessaires. En travaillant sur des cellules de microglies de souris et de porc, nous avons optimisé l'efficacité du vecteur, ce qui a permis d'utiliser moins d'animaux. Le nombre d'animaux utilisés est déterminé en fonction de la précision de nos analyses statistiques et de résultats que nous obtenons dans nos études précédentes.

Raffinement

Pour provoquer une petite cicatrice sur la rétine avec un laser, nous utilisons un équipement adapté avec une longueur d'onde de 532 nm, afin que les lésions soient petites et ne causent ni douleur ni perte de vision après le réveil de l’animal. Les zones touchées par le laser seront observées en temps réel avec un appareil spécialisé, en évitant soigneusement la zone centrale de la macula, responsable de la vision précise. L’opération sera réalisée par un chirurgien ophtalmologue, et un vétérinaire surveillera l’anesthésie. Toutes les interventions sur les animaux se feront sous anesthésie générale, avec des analgésiques supplémentaires si nécessaire pour minimiser toute gêne. L'état de santé des animaux sera surveillé en continu pour détecter toute douleur, grâce à une grille d’évaluation de la douleur qui nous permettra de réagir rapidement et d'adapter les soins ou d'envisager une euthanasie si nécessaire. Les animaux seront logés dans des conditions respectant les réglementations, avec accès libre à la nourriture et à l’eau. Ils vivront en groupe dans des box enrichis par divers jeux et objets pour stimuler leur bien-être, comme des balles ou des objets à mâcher. Si un animal doit être isolé, nous renforcerons l’enrichissement de son environnement.

Choix des espèces

Les rongeurs n'ayant pas de macula, ils ne sont pas de bons modèles pour étudier la DMLA. En revanche, l'anatomie de l'œil du mini-porc Yucatan est très proche de celle de l'homme, notamment au niveau de la macula, des vaisseaux sanguins de la rétine, et de la taille de l'œil, ce qui en fait un modèle idéal pour tester des traitements contre la DMLA. Nous utilisons des mini-porcs Yucatan âgés de 6 mois et pesant entre 20 et 30 kg. La plupart des études utilisent des porcs plus jeunes (3 mois), car leur prise de poids rapide complique les manipulations. Cependant, il a été prouvé que les nouveaux vaisseaux sanguins se développent mieux chez les porcs plus âgés. C'est pourquoi nous avons choisi des porcs de 6 mois, après leur maturation sexuelle. Grâce à leur corpulence plus réduite, les mini-porcs Yucatan restent faciles à manipuler, même à cet âge.

Fournir à des clients académiques et industriels des souris porteuses d'un système immunitaire humain, par lots pouvant atteindre cent individus : 14 000 souris immunodéficientes vont être utilisées à cette fin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les nouveau-nées reçoivent une injection de cellules souches humaines trois à quatre jours après leur naissance, après une irradiation ou un traitement qui détruit les cellules de leur moelle osseuse. Des prélèvements sanguins suivent, jusqu'à un toutes les deux semaines, et le porteur indique attendre l'apparition de la maladie du greffon contre l'hôte, avec les lésions tissulaires qui l'accompagnent. Les souris de la phase de validation sont tuées, celles de la phase de production sont expédiées aux partenaires, parfois en avion, sur des lots calibrés selon les "besoins commerciaux".

Objectifs

Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules humaines pour obtenir des souris humanisées car elles sont particulièrement tolérantes à l’implantation de cellules ou tissus. Les souris sont dites « humanisées » lorsqu’elles développent un système immunitaire humain après la greffe des cellules humaines. Le développement et la production de souris humanisées par injection de cellules souches humaines consiste à proposer des modèles expérimentaux pertinents et adaptés en recherche biomédicale sur les maladies inflammatoires aux utilisateurs finaux (académiques et industriels). L’une des particularités de ces modèles est le développement de plusieurs sous populations de globules blancs humains restant présents pendant plusieurs mois chez l’animal injecté, permettant ainsi de réaliser des études plus longues. Ainsi ce type de modèle permet l’étude de nombreuses pathologies dans lesquelles le système immunitaire joue un rôle majeur chez l’Homme dans des domaines tels que la production de cellules du sang, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccination, l’oncologie et les maladies auto-immunes. Ces modèles permettent également l’amélioration de traitements et des méthodes de diagnostics notamment en oncologie, le cancer étant la première cause de mortalité prématurée ; mais aussi les maladies inflammatoires chroniques et certaines maladies d’origines infectieuses. Parmi les traitements, l’immunothérapie fait partie de ces nouveaux traitements innovants qui a révolutionnée la prise en charge des patients atteints de cancer. L’oncologie n’est pas le seul domaine dans lequel l’immunothérapie a eu des effets prometteurs et encourageants, les maladies inflammatoires chroniques ainsi que certaines maladies d’origines infectieuses sont sensibles à l’immunothérapie. Le recours à ces souris humanisées devrait permettre d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques nécessitant des modèles expérimentaux au plus proche de la situation humaine et permettant l’étude des réactions inflammatoires.

Bénéfices attendus

Le développement des souris humanisées pour le système immunitaire permet d’améliorer la compréhension des mécanismes pathologiques et immunologiques, d’identifier des marqueurs biologiques caractéristiques et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour l’Homme. Les modèles de souris « humanisées » sont donc des modèles très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques. Depuis quelques décennies, le modèle humanisé est notamment très présent dans les études de nouvelles thérapies innovantes, dites immunothérapies. Il s’agit de thérapie qui se basent sur le fonctionnement du système immunitaire et de sa compréhension afin de combattre la pathologie du patient. Il n’est plus question de viser directement l’infection ou la tumeur, mais d’activer/booster le système immunitaire. De grand espoirs sont fondés notamment sur la médecine dite « personnalisée », pour laquelle ces modèles permettraient de greffer le système immunitaire et la tumeur d’un patient à des souris pour tester plusieurs thérapies avant l’administration du traitement le plus efficace au patient.

Procédures

Une partie des animaux recevront des injections d’un produit réduisant les cellules de la moelle osseuse ou une dose d’irradiation comme pré-traitement. Pour chacune des procédures dans la phase de validation, une injection unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue ou dans le foie en fonction de l’âge de l’animal. Pour toutes les procédures, des prélèvements sanguins seront effectués à plusieurs reprise jusqu’à 1 fois toutes les deux semaines post-humanisation dans la veine sous-mandibulaire. Pour chacune des procédures dans la phase de production, une injection intraveineuse unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue ou dans le foie en fonction de l’âge de l’animal. Chaque geste sera réalisé en moins d’une minute pour diminuer au maximum le stress et la douleur.

Impact sur les animaux

Après production et validation des contrôles qualités, les souris seront expédiées aux partenaires. Ces déplacements peuvent induire un certain stress par la manipulation et les bruits inhabituels. Lors du protocole d’humanisation les injections ou les rayons X, pourront induire un bref état de stress et/ou de douleur. Un ou plusieurs prélèvements de sang seront réalisés sur de petit volume et ave un écart d’au moins deux semaines entre les prélèvements, ce qui pourra aussi induire un stress et/ou une douleur transitoire. Un effet secondaire connu lié à l’injection de cellules humaines du sang se déclare chez la souris injectée. Il s’agit de l’apparition de la maladie du greffon contre l’hôte, amenant à des lésions tissulaires à travers une réponse inflammatoire.

Devenir

Les animaux de la phase de validation seront mis à mort (points limites atteints ou fin de protocole). Les animaux de la production seront expédiés à nos partenaires pour une utilisation continue ou gardés en fin de validité si un suivi de l’humanisation dans le temps est nécessaire.

Remplacement

Pour le moment, ce type de modèle n’est pas remplaçable car il s’agit d’un modèle complexe et innovant mimant le système immunitaire humain, mélangeant de nombreux mécanismes encore méconnus qui nécessitent encore des avancées en recherche fondamentale. Actuellement, il n’existe pas d’équivalent aussi complet in vitro, ex vivo ou in silico. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine en limitant le recours aux modèles de primates non-humains.

Réduction

Les modèles testés sont déterminés en fonction des tendances et besoins sur les avancées scientifiques en lien avec les pathologies citées en introduction, par conséquent aux besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux auprès de nos partenaires. Nous avons utilisé un test statistique afin de déterminer le nombre d’animaux à inclure dans nos sous-groupes. Les paramètres utilisés sont tirés de la recherche bibliographique et de nos données internes ou partenariat relatives au processus. Pour la partie mise au point ou amélioration de protocole, nous testerons un ou différents paramètres pour un modèle donné. Pour chaque modèle, le nombre de groupes de souris entrant en protocole pourra varier en fonction des paramètres suivants : •Nouveau-nés versus juvéniles (entre le sevrage et la maturité sexuelle), •Techniques de traitement : produit réduisant les cellules de la moelle osseuse versus irradiation ou absence de traitement (en fonction du modèle), •Dose de traitement : jusqu’à 5 doses différentes testées, •Quantité de cellules souches humaines : jusqu’à 3 quantités différentes, •L’injection d’un mélange de donneurs de cellules souches humaines versus l’injection d’un donneur unique, •L’ajout ou non d’un agent booster du système immunitaire humain. Pour chaque test, un groupe contrôle sera ajouté, compris entre 1 et 10 souris, pour observer l’impact de nos protocoles sur les animaux et servir de témoins dans nos analyses. Pour un modèle donné, les paramètres testés seront choisis en fonction des données bibliographiques, des données internes et des spécificités du modèle, équivalent à 20 souris maximum par sous-groupes. Si les résultats ne sont pas concluants, des tests complémentaires pourront être menés pour évaluer la dose administrées ou l’impact des quantités de cellules humaines injectées lors de l’humanisation. Pour la partie production, des lots de souris produites seront proposées aux partenaires sur des souches préalablement étudiées et connues par notre établissement, répondant aux besoins commerciaux. Un nombre maximal de 100 souris par lot pourront être produites, toute demande supérieure fera l’objet d’une commande spécifique demandée par le client (Les commandes spécifiques seront réalisées dans le respect du protocole de la souche concernée et le bien-être des souris).

Raffinement

Un hébergement sous barrière sanitaire de niveau élevé est appliqué (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Le maintien de conditions d’hygiènes strictes exemptes de pathogènes et d’opportunistes étant la clé pour éviter l’expression du phénotype dommageable des animaux immunodéficients et limiter les nuisances associées. En fonction du pré-traitement choisi, un analgésique pourra être injecté si les animaux présentent des signes de douleur. En cas manipulation répétés sur les nouveaux nés, il sera nécessaire d’imprégner l’odeur de chaque cage par application de sciure souillé sur les gants du manipulateur pour éviter l’abandon des nouveaux nés par la mère. Concernant les prélèvements sanguins, les animaux seront prélevés de manière répétée jusqu’à 1 fois toutes les deux semaines à partir de 2 semaines post-humanisation au niveau de la veine sous mandibulaire pour que le prélèvement soit le moins invasif possible. Le volume maximal prélevé respectera les recommandations de 7,5% du volume sanguin de la souris afin que les souris puissent être prélevées 1 fois toutes les deux semaines en alternant le coté de prélèvement. Si nécessaire, une injection de sérum physio pourra être réalisé après chaque prélèvement pour rétablir la volémie des animaux et leur permettre une récupération plus rapide. Une attention particulière sera apportée à tout animal présentant des signes potentiellement avant-coureurs de la maladie du greffon pour appliquer des points limites. Après production, les souris seront expédiées aux partenaires. Pour limiter le stress occasionné par le transport, des processus d’envoi ont été établi. Pour des transports de moins de 24 heures à 48heures, tous nos colis contiennent de la litière, de l’enrichissement de l’aliment et un gel de transport. Pour les transports plus longs comme ceux en avion, la quantité d’aliment et de gel de transport est doublé.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets de nos partenaires. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, relativement peu coûteux à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils représentent un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est bien caractérisé et très comparable au génome humain, avec 90% des gènes humains qui ont un équivalent chez la souris. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. Que ce soit pour la mise au point ou la production, les souris pourront entrer dans le protocole à des âges différents. Cet âge sera choisi en fonction du protocole le plus pertinent pour une souche donnée. Les souris pourront être humanisées soit à l’état nouveau-né ou soit entre le sevrage et la maturité sexuelle. Pour une humanisation à l’état nouveau-né, les souris recevront une injection de cellules souches humaines entre 3 et 4 jours après naissance. Pour une humanisation entre le sevrage et la maturité sexuelle, les souris recevront une injection de cellules souches humaines entre la 3ème et la 8ème semaine après la naissance.

550 souris et 400 rats vont être utilisés pour que des expérimentateurs apprennent des gestes sur eux, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, tous tués à l'issue et certains réutilisés d'une session à l'autre. Pendant deux semaines, chaque animal reçoit du solvant par gavage jusqu'à dix fois, ou par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse caudale ou rétro-orbitaire, puis subit des séries de une à trois ponctions sanguines sur vingt-quatre heures. Des femelles gestantes et des souriceaux nouveau-nés sont inclus, et les prélèvements au sinus rétro-orbitaire ne cessent définitivement que lorsque l'œil apparaît mi-clos, asséché ou collé. Les mannequins de formation existent mais "ne permettent pas d'appréhender l'intégralité des gestes" ni de reproduire le comportement d'un animal vigile, ce dont le porteur conclut que l'emploi d'animaux non-humains est "indispensable".

Objectifs

Pour permettre une avancée des programmes de Recherche et Développement, qu’ils soient internes ou pour des clients, des études in vivo sont effectuées. Dans ces études, le profil pharmacocinétique et les propriétés pharmacologiques de nouvelles molécules sont évalués. Leur but ultime est de répondre à un besoin thérapeutique non comblé pour diverses pathologies. Ces études sont menées chez le rongeur (souris ou rats). Elles nécessitent l’emploi de diverses techniques d’administration et de prélèvement de sang pour étudier les molécules d’intérêts qui auront été préalablement sélectionnées sur la base de tests in vitro. Une bonne réalisation de l’ensemble de ces gestes apparaît donc comme étant primordiale. L’objectif de ce projet est de former et de valider tout expérimentateur présentant un besoin pour une ou plusieurs techniques d’administration et/ou de prélèvement non maîtrisée(s) ou un maintien de compétences.

Bénéfices attendus

Le stress chez l’animal peut avoir un impact majeur sur la qualité des résultats obtenus. De par une formation et une validation du personnel en amont, ce projet permettra de réduire le stress et la souffrance animale pouvant être causés par un geste mal réalisé. Ainsi, il contribuera à raffiner les techniques, préserver le bien-être animal, augmenter la robustesse des résultats dans les programmes de Recherche et Développement et à réduire in fine le nombre d’animaux nécessaires dans les études in vivo.

Procédures

1/ Administration de solvant pendant 2 semaines soit par gavage oral, soit par injection sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse (1 fois/jour maximum) : 10 fois pour la voie orale, 6 fois pour la voie sous-cutanée, intrapéritonéale et intraveineuse caudale, 4 fois pour la voie intraveineuse rétro-orbitaire, durée : quelques secondes 2/ Micro-prélèvements de sang réalisés sur animal vigile, une série d’1 à 3 ponction(s) sur 24 heures (veine caudale, submentale ou saphène), 2 ou 3 séries maximum sur une période de 2 ou 4 semaines, durée : quelques secondes 3/ Prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse à la veine subclavière, jugulaire ou au sinus rétro-orbitaire, 1 ou 2 prélèvement(s) maximum sur une période de 2 ou 4 semaines, durée : environ 2-3 minutes 4/ Anesthésie gazeuse pour les prélèvements sanguins puis la mise à mort, une fois dans une procédure, durée : environ 5 minutes

Impact sur les animaux

Au cours d’une session de formation chez le rongeur (souris ou rat), les effets indésirables associés aux différentes techniques d’administration et de prélèvement sont : - un inconfort lié au geste - un stress lié à l’anesthésie, seulement pour certaines voies d’administration/prélèvement - un hématome au point de ponction lors d’un prélèvement de sang

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale.

Remplacement

À ce jour, les mannequins de formation (souris et rats) ne permettent pas d’appréhender l’intégralité des gestes requis dans nos études in vivo, tous les stades de développement d’un animal, ni même de mimer le comportement d’un animal vigile au cours de sa manipulation. C’est pourquoi, l’emploi d’animaux est indispensable. À noter qu’en amont de toute formation, les personnes à former prendront connaissance des différents gestes à réaliser par le biais de vidéos, bibliographie et/ou procédures.

Réduction

Pour chaque session de formation, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant d’atteindre l’objectif fixé : une validation du personnel aux différents gestes techniques. Il sera fonction du nombre de personnes à former par an. De plus, pour certaines procédures, sous réserve de l’absence de signes cliniques et dans le respect des exigences réglementaires, les animaux issus d’une session de formation pourront faire l’objet d’une réutilisation, ce qui participera à diminuer le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant toute manipulation. Hébergement : Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (enrichissement jetable ou autoclavable). Pour les femelles gestantes, un enrichissement adapté à la nidation sera fourni. Durant la période périnatale, les changes seront limités au maximum afin de ne pas perturber la mise bas ou l’interaction mère-petits. Si le nouveau-né reste à l’écart de la mère, il faudra impérativement le remettre dans le nid. Administration et prélèvement : Afin de palier l'inconfort lié à certains gestes, un programme d'anesthésie sera effectué. En cas de signes de douleur, une analgésie sera réalisée et s’accompagnera d’un arrêt temporaire des administrations/prélèvements. Pour le sinus rétro-orbitaire, une goutte d’anesthésique local sera instillée sur l’œil de l’animal 1 à 2 minutes avant chaque administration ou prélèvement. Les administrations/prélèvements au sinus rétro-orbitaire seront définitivement arrêtés lors de l’observation d’un œil mi-clos/asséché/collé. Le traitement impliquera un nettoyage quotidien de l’œil à l’aide d’une compresse imbibée de sérum physiologique suivi du dépôt d’une goutte de gel ophtalmique jusqu’à la guérison de l’œil. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse pouvant être infligées aux animaux, une surveillance journalière ainsi que des points limites précoces et spécifiques ont été établis conduisant à la mise à mort anticipée de l’animal. Lors de la mise à mort, les animaux seront placés sous anesthésie profonde.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utiliserons des souris et des rats à un stade adulte, de la même façon que dans la majorité des études in vivo des programmes de Recherche et Développement. Certains de nos modèles in vivo requièrent des souris au stade nouveau-né ainsi des souriceaux seront également employés.