Procédures légères

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées au niveau de souffrance léger. Elles reçoivent trois injections sous anesthésie et subissent trois prélèvements de sang, le porteur signalant qu'elles peuvent développer des ulcérations de la peau ou du muscle au point d'injection, ainsi que des décolorations de l'œil et des lésions de la cornée avant la prise de sang. Leur sang doit fournir des anticorps dirigés contre des fragments de protéines communs au virus d'Epstein-Barr et au SARS-CoV-2, anticorps qui serviront ensuite d'outils de laboratoire. Le porteur indique que ces anticorps ne peuvent être produits qu'à partir d'animaux vivants, et justifie la mise à mort par le fait qu'il ignore leurs effets sur l'organisme des souris et le risque de souffrance supplémentaire.

Objectifs

L'objectif de ce projet repose sur la production d'anticorps contre des séquences spécifiques de virus humains tels que Epstein-Barr (virus de l’herpès) et le SARS-CoV-2 (COVID-19). Ces anticorps sont un outil important pour étudier les maladies auto-immunes causées par ces virus.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra aux chercheurs de mieux connaître les effets du SARS-CoV-2 et de l'infection par le virus d'Epstein-Barr sur l'homme et leur relation avec le développement de maladies du système immunitaires, les maladies auto-immunes

Procédures

Trois injections sont réalisées sur animal anesthésié. Trois prélèvements sanguins sont effectués sur animal vigile. Temps : injections : 1 minute/souris Prélèvement sanguin : 2-5 minutes/souris

Impact sur les animaux

Les souris peuvent développer des lésions cutanées ou des ulcérations au niveau de la peau ou du muscle après l'injection, ainsi que des décolorations de l'œil et des lésions cornéennes avant le prélèvement de sang.

Devenir

Une fois l'immunisation terminée et le sang recueilli pour l'extraction des anticorps, les animaux ne pourront plus être utilisés à d'autres fins. À ce jour, nous ne connaissons pas encore les effets possibles de ces anticorps sur l'organisme ni s'ils pourront induire des altérations du système immunitaire susceptibles de provoquer des maladies chez la souris et donc d'entraîner une souffrance supplémentaire.

Remplacement

Notre récente étude a déjà identifié un groupe de peptides présents dans le protéome humain et partageant des séquences avec les virus Epstein-Barr et SARS-CoV-2. L'objectif du projet actuel est à présent de produire des anticorps contre les peptides caractérisés et de pouvoir étudier leur effet sur un organisme vivant complexe. Cela nécessite d’induire des anticorps contre ces peptides, ce qui ne peut être généré que chez -ou à partir- d'animaux vivants et de prélèvements de tissus à la fin de la procédure.

Réduction

Le nombre d'animaux employés est basé sur les travaux rapportés dans la littérature. Il a été établi pour nous permettre d’obtenir des anticorps en quantité suffisante pour poursuivre nos travaux.

Raffinement

À leur arrivée dans l'établissement, les animaux seront répartis en groupes sociaux dans des cages contenant l'enrichissement approprié (matériel de nidification, tubes, bâton à ronger). Ils y resteront pendant 2 semaines pour favoriser un bon acclimatement. L'injection et le prélèvement de sang seront effectués sous anesthésie gazeuse. Une solution saline sera injectée pour prévenir la déshydratation, et une goutte d'anesthésique sera appliquée sur l'œil. En cas de douleur musculaire, un analgésique sera administré. Nous avons défini les points limites pour déterminer le degré de souffrance que l'animal peut rencontrer après la procédure, incluant : perte de poids, lésions cutanées, température, expressions faciales et lésions oculaires.

Choix des espèces

Les souris ont un génome très proche de celui de l'homme, et leur système physiologique mime les observations faites chez l'homme. Aujourd'hui, la souris représente le meilleur modèle pour induire des anticorps comme outils. Des souris âgées de 6 à 8 semaines seront incluses. À cet âge, les souris sont considérées comme des adultes et leur système immunitaire est pleinement développé.

10 000 souris génétiquement modifiées vont être triées selon leur génotype, entre celles qui serviront aux protocoles ou à l'élevage et celles dont personne n'aura l'usage. À vingt et un jours, chacune se fait couper moins d'un millimètre du bout de l'oreille, sur animal vigile et sans anesthésie, dans une procédure classée au niveau de souffrance léger. Le porteur écrit qu'anesthésier les petits "ajouterait une nuisance non nécessaire", et que cette méthode restera en usage jusqu'à la validation d'un génotypage sur des poils. Les souris jugées non utiles sont mises à mort et proposées aux membres du laboratoire pour des prélèvements d'organes, le chiffre de 10 000 sur cinq ans n'étant rattaché à aucun besoin chiffré.

Objectifs

Ce projet vise à assurer la conservation des lignées de souris modifiées génétiquement présentes dans notre laboratoire et que nous utilisons dans nos différents projets de recherche. Avant de les utiliser pour des expériences ou pour créer de nouvelles générations, il est important de les caractériser précisément. Pour cela, nous devons identifier et prélever un échantillon sur chaque souris dans notre animalerie en utilisant une méthode qui nous permet de connaître très précisement les mutations dont ils sont porteurs.

Bénéfices attendus

La caractérisation génétique permet d’optimiser la gestion de l’élevage et de produire les animaux d’intérêt, c’est-à-dire nécessaire au maintien de la lignée et/ou aux protocoles expérimentaux.

Procédures

Pour chaque animal vigile (21 jours +/- 1 jour), 1 prélèvement de bout d’oreille inférieur à 1 mm sans anesthésie. Extrêmement rarement, pour vérifier des résultats ou en cas d'échec du génotypage, un prélèvement de bout d'oreille (

Impact sur les animaux

Le prélèvement d’un bout de l’oreille sur animal vigile est réalisé sur moins de 1mm et et par un personnel expérimenté pour limiter la douleur et le stress. En cas d’un deuxième prélèvement en dehors de l’âge limite (>21 jours +/- 1 jour) en cas d'échec du génotypage, l’individu est anesthésié profondément à l’isoflurane.

Devenir

Dés résultat de génotypage, les animaux non utiles seront mis à mort. Les animaux utiles pour les projets ou l'élevage seront maintenus en vie et seront en utilisation continue pour des expériences qui seront décrites dans des DAP spécifiques. Dans la mesure du possible, les animaux génotypés non utilisables sont proposés aux membres du laboratoire pour prélèvements d’organes.

Remplacement

Pas de remplacement possible sur le projet de prélèvement de tissus pour génotypage tant que la méthode de génotypage par prélèvement de poils n'est pas validée sur nos lignées. L’approche de remplacement est prise en charge dans chaque DAP expérimentale.

Réduction

La reproduction n’est utilisée que pour produire le nombre d’animaux prévue dans la DAP d’expérimentation considérée ou la DAP d’élevage nécessaire au maintien de la lignée. Les caractéristiques de reproduction propres à chaque lignée (nombre de petits par portée, nombre de modifications génétiques, ratio homozygote/hétérozygote…) sont prises en compte pour planifier la fréquence et le type de croisements.

Raffinement

Les gestes invasifs tel que la pose d’une bague et la biopsie sont réalisés par des personnels expérimentés, selon une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée, limitant stress, douleur et saignement. L'anesthésie n'est prévue que sur les animaux de plus de 21 jours. L'anesthésie chez les petits ajouterait une nuisance non nécessaire. Une surveillance et un suivi de la cicatrisation sont réalisés dans les jours suivant le prélèvement. Cette méthode de prélèvements de tissus sera utilisée jusqu’à validation des procédés de génotypage à partir de prélèvements de poils, procédure moins invasive.

Choix des espèces

Les lignées en élevage sont définies par les besoins des projets autorisés. Les animaux seront prélevés d’un bout d’oreille (

Un ovule de la taille d'un grain de blé est introduit au pouce dans le vagin de souris maintenues par la base de la queue, pendant deux minutes trente, jusqu'à trois fois pour la même femelle. 640 souris vont être utilisées dans ces procédures, classées au niveau de souffrance léger, pour tester si une molécule odorante, le lyral, empêche la fécondation et pourrait fournir une contraception sans hormone. Le porteur écrit que l'expérimentateur exerce un massage doux pour "apporter du bien être à l'animal pendant ce geste" et que la souris ne montre aucun signe de douleur, tout en prévoyant de surveiller pendant deux à trois semaines l'apparition de dermatites et de conjonctivites dues au caractère allergisant du lyral. Les femelles retournent au pool des accouplements après chaque essai, et les souriceaux qui naissent sont mis à mort immédiatement, sans que leur nombre apparaisse.

Objectifs

La contraception bénéficie de nombreuses méthodes. La pilule à base d'hormones qui est l'une des méthodes les plus utilisées dans notre société souffre à tort ou à raison d'une suspicion quant aux effets négatifs que l'usage répété d'hormone pourrait engendrer. Les travaux de recherche sur les récepteurs olfactifs (OR) capables de reconnaître des molécules odorantes, ont montré qu'un certain nombre d'entre eux étaient présents à la surface des spermatozoïdes de plusieurs mammifères dont l'homme et la souris. Il a été montré qu’un odorant, le bourgeonal, modifiait in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes humains et que le lyral, un autre odorant, modifiait lui aussi in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes de souris. Suite à ces travaux, nous avons cherché à savoir si in vivo l'addition de lyral dans le vagin des souris modifierait leur chimiotactisme. Pour cela, nous avons émis l’hypothèse qu’une surcharge de lyral dans le vagin de souris serait de nature à perturber la reconnaissance d’un ligand naturel à découvrir et limiterait la fécondation de l'œuf. Dans une série d’expériences préliminaires nous avons de fait observé que l’introduction de lyral liquide dans le vagin de souris perturbait la procréation : Ainsi, la copulation de 31 couples de souris, n’a donné naissance qu’à 176 souriceaux (13 femelles n’ayant eu aucune progéniture) alors que tous les couples témoins (n=31) ont été productifs et amené à la naissance de 372 souriceaux (résultats non publiés). A partir de ces résultats, statistiquement significatif, nous avons émis l'hypothèse qu'une molécule odorante introduite dans le vagin par un ovule pourrait être la source du développement d'une nouvelle méthode contraceptive non hormonale. Le présent projet a pour but de tester cette possibilité, ainsi le mode de l'utilisation via un ovule.

Bénéfices attendus

Les conséquences et bénéfices attendus sont à deux niveaux le premier dans le cadre de la pratique médicale, le second sur le plan de la recherche fondamentale. 1) Si le lyral introduit dans le vagin à l’aide d’un ovule diminue nettement la procréation, comme observé précédemment chez les souris ayant reçu du lyral liquide il est prévu de faire des essais cliniques d'utilisation d'ovules chargés d'un odorant reconnu par les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes humains, dans le but de développer une nouvelle méthode contraceptive sans hormone. 2) Sur le plan de la recherche fondamentale, une forte limitation de la taille des progénies confirmerait les résultats de nos expériences précédentes selon lesquels les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes ont un rôle biologique dans la fécondation de l'oeuf, ce qui n’a jamais été démontré. Cela ouvrirait la voie à la recherche de ligand(s) particuliers impliqués dans le chimiotactisme naturel des spermatozoïdes et dans la reproduction. Cela conduirait aussi à la recherche des cellules émettrices de ce ligand et plus encore permettrait d’envisager de nouvelles explications et hypothèses de travail relatifs à la stérilité de certains couples.

Procédures

L'expérimentation se limite à l'introduction d'un ovule de la taille d'un petit grain de blé dans le vagin de souris avant leur mise en accouplement. L'introduction sera réalisée manuellement et délicatement la souris est maintenue, sans contrainte par la base de la queue afin de permettre à l'expérimentateur d'accéder à la région vulvaire. L'ovule est introduit délicatement avec le pouce. L'expérimentateur maintient une légère pression avec son pouce sur la région génitale afin d'éviter une sortie de l'ovule et exerce un massage doux de la zone pour faciliter l'introduction complète de l'ovule et apporter du bien être à l'animal pendant ce geste. Le temps d'introduction complète est d'environ 2m30s et l'animal ne montre aucun signe de douleur ou de stress (pas de morsure, de réaction de fuite...) Le geste sera répété à une semaine d'intervalle ou plus, en cas de non copulation. La même souris femelle pouvant être utilisée jusqu’à 3 fois, si nécessaire.

Impact sur les animaux

Les expériences préliminaires que nous avons faites et qui consistaient en l'introduction directe de lyral dans l'espace vaginal de souris n'ont pas mis en évidence d'effets indésirables à court ou moyen terme chez les souris. La même dose sera utilisée dans cette expérience. L’introduction de la molécule via un ovule sera également sans effet. Aussi toutes les souris recevant un ovule (placebo ou test) seront quotidiennement observées pour noter tout changement dans leur comportement ou l'apparition de quelques symptômes qu'ils soient. Etant donné le caractère allergisant du lyral, une attention particulière sera donnée à l’apparition de démangeaisons et de conjonctivites pendant 2 à 3 semaines après introduction des ovules. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne de leur comportement afin de détecter toute gêne éventuelle, ou phénomène de nature allergisant (dermatites, conjonctivites). Si de tels problèmes étaient observés, risquant d’entrainer une douleur chez l’animal, l’expérience sera stoppée et celui-ci sera euthanasié.

Devenir

Après chaque accouplement, les souris seront remises dans le pool et utilisées pour d'autres accouplements. Les souriceaux seront immédiatement mise à mort.

Remplacement

Il est impossible de remplacer ces expérimentations chez la souris, préliminaires à des essais cliniques chez l'homme, par des tests in vitro dans la mesure où la question posée est celle de savoir si un ovule libérant dans le vagin une molécule odorante se fixant à la surface des spermatozoïdes pourrait empêcher la procréation en perturbant leur chimiotactisme en direction de l'œuf. A l’évidence, des expériences reposant sur fécondation in vitro ne permettrait pas de tester cette hypothèse.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables afin de valider les données obtenues.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une structure agréée qui tient compte de l'éthique animale. Les accouplements seront hébergés dans une armoire ventilée afin d'éviter les conséquences olfactives de l'utilisation de la molécule odorante sur les autres animaux présents dans la pièce d'hébergement. Le reste du temps l'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un environnement calme et d'une alimentation abondante. Une surveillance journalière des animaux sera réalisée pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Si des souris présentaient une réaction de nature allergisante, elles seraient immédiatement retirées de l'expérience. Par ailleurs, rappelons que les ovules sont de qualité pharmaceutique, fabriqués par une société pharmaceutique avec des produits autorisés par la pharmacopée et ainsi sans danger par elles-mêmes.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce animale pour laquelle on a clairement identifié les récepteurs olfactifs exprimés à la surface des spermatozoïdes. Par ailleurs nous avons choisi la souris Swiss CD1 car elle est très prolifique. Les portées sont régulièrement supérieures à 10 souriceaux, ce qui facilite la recherche d'un effet négatif sur la procréation. Les souris mâles et femelles utilisées auront entre 8 à 48 semaines.

Des tumeurs hépatiques apparaissent d'elles-mêmes à partir de six mois chez ces souris, sans qu'aucun geste expérimental ne leur soit infligé. 20 souris vont être utilisées dans cet élevage de lignée à phénotype dommageable, dans une procédure classée au niveau de souffrance léger. Le porteur affirme, en s'appuyant sur la littérature, que l'accumulation de graisse dans leur foie ne nuit pas à leur bien-être et qu'aucun signe de souffrance n'apparaît jusqu'à douze mois. Les souris utiles à la reproduction sont gardées en vie, les autres tuées avant l'apparition du carcinome, et le projet se limite à faire vivre la lignée, le croisement qui doit répondre à la question scientifique relevant d'une autre autorisation.

Objectifs

Le cancer du foie est la troisième cause de décès par cancer dans le monde. Avec 8500 nouveaux cas par an en France et plus de 7000 morts par an, le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le cancer hépatique le plus fréquent. Le CHC survient à cause d’une accumulation excessive de gras qui favorise le développement tumoral en induisant des modifications majeures dans le métabolisme des cellules du foie. Malgré les progrès thérapeutiques, l’incidence du CHC est en constante augmentation, ce qui constitue un réel problème de santé publique. Les mécanismes moléculaires menant au développement du CHC nécessitent donc d’être plus amplement caractérisés. Des études précédentes ont démontré qu'une protéine est impliquée dans la suppression des métastases lors du développement de la maladie. Récemment, une nouvelle fonction de cette protéine a été découverte. Ce projet de recherche vise donc à étudier le rôle de la nouvelle fonction de notre protéine d'intérêt dans le développement du CHC. Afin d’atteindre cet objectif, il nous faudra ultérieument croiser des souris qui n'expriment pas notre protéine d'intérêt avec des souris qui développent spontannément des tumeurs dans le foie (phénotype dommageable). La DAP ci-présente concernera uniquement l'élevage des souris qui développent le CHC.

Bénéfices attendus

L'élevage de la lignée murine qui développe spontannément des tumeurs dans le foie nous permettra de les croiser ultérieument avec d'autres souris. Ce croisement nous permettra d’élucider le rôle de la nouvelle fonction de notre protéine d'intérêt dans la physiologie et le cancer du foie. Comme notre protéine d'intérêt a des propriétés anti-métastatiques, elle constitue par conséquent une cible potentielle pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par ailleurs, cette protéine joue un rôle important dans l'homéostasie du foie et pourrait être impliquée dans l'obésité et le diabète.

Procédures

Les animaux ne seront soumis à aucune intervention puisqu'il s'agit d'une procédure d'élevage de souris à phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

De 0 à 6 mois, certaines souris accumuleront progressivement du gras au niveau du foie ce qui d’après la littérature ne nuit pas à leur bien-être. Dans ce modèle, le cancer du foie commence à apparaître à partir de 6 mois. Jusqu’à 12 mois d’âges, les animaux ne présenteront aucun signe de souffrance et leur qualité de vie ne sera pas impactée. Les animaux ne seront pas utilisés au delà de 12 mois.

Devenir

Les animaux nécessaires à l'élevage seront gardés en vie tandis que les autres seront euthanasiés. Les souris au phénotype dommageable seront euthanasiées avant le développement du cancer du foie.

Remplacement

Bien que nous ayons commencé à étudier les propriétés de notre protéine d'intérêt dans des cellules cancéreuses humaines, il n’est pas possible de reproduire tous les mécanismes sur lesquels nous travaillons dans ces modèles. En effet, la diversité des types cellulaire ainsi que la communication entre les différents organes présente à l'échelle d'un organisme entier ne sont pas reproductible in vitro. Par rapport au modèle de culture de cellules cancéreuses, le modèle souris permet donc d’appréhender l'ensemble des intéractions entre différent types cellulaires et organes qui sont essentielles dans le développement du cancer de foie.

Réduction

Pour réduire au maximum la survenue de petits qui développent des tumeurs hépatiques (phénotype dommageable), les individus seront génotypés puis les reproducteurs optimaux seront sélectionnés en fonction des besoins. Au cours de l’élevage, le nombre minimal d’animaux à phénotype dommageable sera généré pour assurer l'élevage de la lignée.

Raffinement

Les souris seront observées tous les jours afin de contrôler leur mobilité, l’apparence de leur fourrure ainsi leur comportement dans la cage. Concernant l'hébergement, les femelles seront regroupées ensemble tandis que les mâles seront isolés le moins possible. Les animaux seront euthanasiés avant l’apparition du CHC.

Choix des espèces

La souris est un modèle très pertinent pour l'étude du cancer du foie. En effet, le développement de tumeurs chez la souris est facilement réalisable, reproductible et constitue un modèle de référence dans le domaine de l’oncologie. Pour tester nos hypothèses de travail, l'élevage de ce modèle murin à phénotype dommageable est donc nécessaire. Dans ce modèle, les souris commencent à développer des tumeurs hépatiques à partir de 6 mois. Elles seront donc euthanasiées avant cet âge ou avant l’atteinte des points limites détaillés dans les procédures expérimentales. Puisqu’il s’agit d'élever des souris, nous avons besoins d’adultes sexuellement matures c’est-à-dire âgés de 6-7 semaines.

Un bout de queue coupé sur animal vigile, en quelques secondes et sans anesthésie, parfois complété d'une biopsie d'oreille quand le premier génotypage échoue : 2 500 souris subissent ce prélèvement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'opération sert à trier les souriceaux au sevrage selon qu'ils portent ou non l'invalidation du gène MLKL, dans deux lignées destinées à l'étude des hépatites. Le porteur qualifie la douleur de brève et d'intensité limitée, tout en signalant que son animalerie cherche activement d'autres méthodes de génotypage, à partir de poils, de salive ou de fèces. Aucune de ces 2 500 souris n'est tuée dans ce projet, 165 sont gardées comme reproductrices et 2 335 passent en "utilisation continue" vers d'autres protocoles expérimentaux.

Objectifs

L'objectif du projet est d'identifier en fonction de leur génotype les souris génétiquement altérées pour une cible (MLKL), protéine impliquée dans une voie de mort cellulaire programmée, la nécroptose. Deux lignées de souris seront exploitées. Au sein de l'une d'elles, la protéine MLKL ne s'exprime dans aucune cellule de tout leur organisme. Quant à la seconde lignée, seules les cellules principales du foie (hépatocytes et cholangiocytes) n'expriment pas la protéine MLKL. Ces souris seront générées pour d'une part maintenir les lignées et d'autre part pour être utilisées dans des projets scientifiques ayant pour but d'étudier l'implication de cette protéine exécutrice de la nécroptose dans des hépatites aigües ou chroniques.

Bénéfices attendus

Le projet permettra le génotypage de souris nécessaires au maintient des 2 lignées de souris et pour fournir des animaux pour différents projets scientifiques (utilisation continue vers des DAP d'expérimentation).

Procédures

Le projet permettra d'identifier par génotypage les animaux à partir d’un prélèvement unique d'une biopsie de queue, éventuellement complété d'un second prélèvement de biopsie d'oreille en cas d'échec exceptionnel du premier génotypage. La procédure de prélèvement s'effectue en quelques secondes sur animal vigile. Cela concerne 500 animaux par an.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont celles liées au prélèvement unique d'une biopsie de queue par individu, voir d'un éventuel second prélèvement au niveau de l'oreille. Ce type de prélèvement, qui s'effectue en quelques secondes seulement, n'induit qu'une douleur d'intensité limitée et est extrèmement brève. Elle peut entrainer une sensation d'inconfort, nuisance passagère qui n'entraîne pas de complications majeures.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie, non pas pour une réutilisation, mais pour utilisation continue pour les expérimentations (2335 animaux) ou pour maintien de la lignée (reproducteurs, 165 animaux).

Remplacement

Aucune alternative à un génotypage par PCR à partir d'un échantillon d'ADN isolé à partir d'un fragment de tissu de l'animal.

Réduction

Le nombre d'animaux subissant un prélèvement pour génotypage est réduit à son minimum: La production est lié au maintien des lignées et aux besoins des projets scientifiques. Les schémas d'accouplement sont optimisés pour ne produire que des animaux "utiles" porteurs de modifications génétiques d'intérêt.

Raffinement

Pour minimiser la douleur associée au prélèvement de l'extrémité de la queue des souris âgées de 3 semaines, l'équipe de l'animalerie travaille activement à l'exploration de nouvelles techniques de génotypage. Le prélèvement de tissu est réalisé par une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée de façon à limiter les effets indésirables (stress et douleur). Des approches alternatives, comme le prélèvement de poils, de salive ou de fèces, sont actuellement en cours d'étude.

Choix des espèces

Cette espèce (souris) permet de modéliser la pathogenèse humaine d'hépatites aigües ou chroniques sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cet animal. Par ailleurs, ce modèle murin permet de tester in vivo les conséquences de l’absence d’expression au sein de cellules d’une ou plusieurs protéines potentiellement impliquées dans ces pathologies. Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule manipulation). En cas de problème technique sur le prélèvement (défaut d'extraction de l'ADN par exemple), un deuxième prélèvement pourra être réalisé entre 5 et 12 semaines.

3 600 souris seront transférées vers des projets expérimentaux du laboratoire ou gardées pour maintenir les lignées, les 1 200 autres étant tuées parce qu'elles n'ont pas le génotype attendu ou qu'elles ne sont plus en âge d'être accouplées. 4 800 souris génétiquement modifiées vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Au sevrage, à trois semaines, chacune est immobilisée le temps de la pose d'une boucle à l'oreille et du prélèvement de l'extrémité de la queue pour le génotypage. Le porteur justifie le recours à cette espèce en affirmant que la souris partage 99 % de ses gènes avec l'humain.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser le génotype des souris génétiquement modifiées pour des gènes connus ou candidats pour leur implication dans le développement musculo-squelettique. Ces animaux sont générés pour être, par la suite, utilisés dans des projets de recherches expérimentaux autorisées.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'identifier les génotypes des animaux pour maintenir les différentes lignées de souris génétiquement modifiées nécessaires aux différents projets de recherche au sein du laboratoire et pour optimiser au mieux la gestion des élevages.

Procédures

Au moment du sevrage, les animaux vigiles seront pris en contention pour réaliser l'identification par pose de boucle à l'oreille et la biopsie caudale pour le génotypage. Ce geste ne dure que quelques secondes et n'est répété qu'une seule fois au cours de la vie de l'animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont liées au prélèvement de l'extrémité caudale de queue pour le génotypage pouvant entrainer une sensation d'inconfort et une douleur légère. Les animaux peuvent également ressentir un stress au moment de la contention de l'animal indispensable pour effectuer la pose de la boucle pour l'identification et le prélèvement pour le génotypage.

Devenir

Les animaux présentant le génotype souhaité seront utilisés pour le maintien des lignées ou intégreront les projets expérimentaux du laboratoire autorisés. Les animaux qui ne seront plus en âge d'être accouplés ou qui présenteront un génotype non souhaité seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur.

Remplacement

Il n'est pas possible de modéliser in vitro la complexité d'un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Les gènes impliqués dans le développement musculaire peuvent également avoir un impact sur le développement osseux et le métabolisme lipidique en particulier. La souris est un bon modèle pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies liées au développement musculaire et retrouvées chez les mammifères.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé de manière à maintenir la lignée au sein de l'animalerie et de fournir les animaux nécessaires pour les différents projets d'étude au sein du laboratoire. Les schémas d'accouplement ont été optimisés pour ne produire que les animaux génétiquement modifiés nécessaires pour alimenter les projets de recherche. En fin d'expérimentation, une cryoconservation des lignées sera effectuée de manière systématique par congélation de sperme.

Raffinement

L'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux. Le prélèvement de l'extrémité caudale de la queue est réalisé par du personnel qualifié maitrisant ces gestes techniques au moment du sevrage. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et quotidienne des animaux. En cas d'apparition d'une souffrance inattendue, d'un changement comportement, les animaux seront mis à mort dans les 24 heures suivants l'apparition des signes. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’isolement est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, batônnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Si un animal se retrouve isolé de manière imprévue, il bénéficiera de deux enrichissements. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix dans l'étude du développement musculaire du fait de la parenté génétique et d'un développement embryonnaire proche des mammifères dont l'homme. En effet, la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’Homme (et forte identité également avec d’autres mammifères sujets de nos travaux de recherche). De plus, les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en œuvre au cours du développement musculo-squelettique sont similaires entre la souris et l’Homme. Dans ce projet, les animaux seront mis en reproduction à partir de l’âge de 6 semaine pour les femelles et de 8 semaines pour les mâles, âges auxquels les animaux sont sexuellement matures et jusqu’à ce que les animaux commencent à présenter des difficultés à se reproduire (20 à 24 mois). Le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage, c’est-à-dire à l’âge de 3 semaines.

Deux ponctions à la queue à trois semaines d'intervalle, un rationnement maintenant les souris à 90 % de leur poids libre, des isolements de une à deux heures et un régime riche en gras et en sucre pendant quatre à six semaines : 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objectif déclaré est de relier des traits comportementaux, anxiété, prise de risque, capacités cognitives, prise de décision, au risque de développer un trouble du comportement alimentaire, avec l'idée de transposer les résultats à l'humain. Aucun prélèvement d'organe n'est prévu, et les souris sont tuées à la fin de la procédure parce que leur âge, plus de neuf mois, et leur régime empêchent de les réutiliser ailleurs. Sur la réduction, le porteur écrit seulement que "tous les efforts seront faits" et que le minimum sera utilisé, sans indiquer comment il arrive à 400 animaux.

Objectifs

L’objectif du projet est de faire ressortir des liens entre traits comportementaux et comportement face à la prise alimentaire. Plus spécifiquement, il s'agit de faire ressortir certains profils (caractère anxieux, prise de risque, capacités cognitives, choix et prise de décision) comme pouvant être à l’origine, voir prédictifs de trouble du comportement alimentaire. Nous nous intéresserons tout particulièrement au lien entre les trois processus suivants : Le décisionnel, le motivationnel, et le mnésique. Ces différents processus seront étudiés par divers études comportementales telles que : la mesure de l'anxiété, de la cognition, de la prise de décision par l'association d'un son à une action pour obtenir une récompense. Il s’agira in fine d’offrir une analyse originale et détaillée qui pourrait s’appliquer à divers modèles animaux de désordres alimentaires. Par la suite, l'idée est de transposer ces résultats chez l’Homme afin de connaître le lien entre caractère comportementaux et risque de déclencher un trouble alimentaire. Ce savoir permettrait à l’avenir, d’anticiper au maximum le développement de troubles alimentaires touchant aujourd’hui près de 600 000 jeunes en France.

Bénéfices attendus

Les troubles du comportement alimentaire sont des pathologies mentales graves caractérisées par d’importantes perturbations du comportement alimentaire et de la corpulence. Elles peuvent causer des dommages physiques et émotionnels pouvant conduire malheureusement à la mort. Elles touchent une part importante de la population, avec une augmentation considérable depuis ces 15 dernières années, et constituent un réel problème de santé publique. Il est donc indispensable d’approfondir nos connaissances sur cette physiopathologie afin d’identifier des perspectives thérapeutiques mais aussi préventives. Dans ce projet, la confrontation de l’étude comportementale avec l’étude métabolique permet de déterminer une éventuelle corrélation entre certains traits comportementaux (anxiété, impulsivité, habitude) et paramètres consommatoires et/ou métaboliques spécifiques. Il s’agira donc d’offrir une analyse originale et détaillée qui pourrait s’appliquer à divers modèles animaux de désordres alimentaires. Transposé à l’humain, ce projet apportera des connaissances sur les mécanismes à la base du comportement alimentaire et de ses altérations, afin d’éviter, le plus tôt possible (aspect préventif), l’apparition de pathologies liées à la consommation alimentaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang par ponction à la queue (ne durant que quelques secondes, le temps de prélever une goutte de sang) afin d’analyser leur taux de glucose et le métabolisme de chaque individu. Deux prélèvements à 3 semaines d'intervalle seront effectués au total sur chaque souris pour toute la procédure. Aucune autre intervention de type chirurgicale ne sera effectuée sur ces animaux.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable majeur n'est attendu dans cette procédure. Principalement car elle est constituée de tests classiquement reconnus pour leur innocuité. Il est à noter tout de même que de légères nuisances sont à prévoir : stress, rationnement alimentaire léger (maintien à 90% du poids ad libitum). Les animaux seront également amenés à subir une isolation ponctuelle et de courte durée (pas plus de 2h), nécessaire notamment à la mesure de leur consommation individuelle. Cela peut entrainer un stress léger, qui sera diminué par l'utilisation de séparateurs de cage, permettant la conservation d'un contact visuel, auditif et odorant avec leur congénères. Dans la deuxième partie, la prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisances, qui restent moindres, pour les souris. Comme par exemple : une prise de poids de 15% maximum, une augmentation de la masse grasse, une augmentation modérée des niveaux circulants d’insuline et de glucose induisant un début d'intolérance au glucose mais pas de diabète avéré. De plus, cette nuisance, identique à celle rencontrée chez l’Homme, est l’object précis de cette étude. Enfin, le suivi des paramètres intéressants, comme le taux de glucose, pendant toute la phase du régime hyperlipidique inclu deux prélèvements de faible quantité de sang (100microL) en utilisant la méthode de prélèvement la moins invasive possible (légère ponction à la queue).

Devenir

A la fin de la procédure, les souris sont agées de plus de 9 mois, et auront déjà suivi une batterie de tests comportementaux. De plus, les animaux auront consommé un régime riche en sucre et gras pendant près de 4 à 6 semaines, empéchant toute réutilisation auprès d'un autre projet. Aucun prélèvement de tissu ou organe n'est prévu dans ce projet. Tous les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l’utilisation de modèles animaux puisqu’il s’intéresse à des dimensions comportementales, et s’adresse donc au vivant. Ceci est particulièrement vrai pour des tests d’anxiété, cognitifs, ou de prise de décision, visant à observer des différences inter-individus. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle souris par des modèles in-vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux et le minimum de souris nécessaires pour atteindre une signification statistique sera utilisé.

Raffinement

Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire. Les souris seront hébergées tout au long de leur vie en cage collective avec un environnement enrichi et dans une animalerie agréée comportant une régulation de la température, de l’hygrométrie et du cycle jour/nuit. Lors d’expériences spécifiques et nécessaires impliquant une courte individualisation, des solutions sont mises en place pour réduire au maximum le stress de l'animal : une poignée de sciure de leur cage d’hébergement contenant une odeur familière et celle des congénères versée dans leur cage individuelle, ou encore la mise en place de séparateurs de cage pour garder un contact visuel, auditif et odorant avec un autre congénère. L'isolement est ponctuel et ne dure pas plus de 1-2h. La mise sous restriction alimentaire, nécessaires au bon fonctionnement des expériences mesurant l’aspect motivationnel lors de tests en conditionnement opérant seront réduites au maximum, et un suivi tout particulier sera effectué sur l’évolution du poids des souris. Hormis ces deux cas de figure, tout au long de leur hébergement, les souris recevront de l’eau et de la nourriture ad libitum, et seront changées régulièrement (1 fois par semaine) afin de conserver un environnement de vie propre et confortable. Elles seront également observées minutieusement de manière quotidienne par un personnel qualifié. Au cours de ces observations, si un animal présente des blessures, il sera immédiatement soigné et recevra un suivi renforcé (surveillé deux fois par jour). Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être (perte de poids de plus de 15%, poils hérissés, prostration…), la mise en place de mesures appropriées sera effectuée en fonction des besoins de l’animal. Il sera si besoin isolé de sa cage et les soins nécessaires lui seront administrés. Si, suite aux soins effectués, l’animal ne montre aucune amélioration significative dans les 48h suivant sa prise en charge, il sera mis à mort. De plus, si des signes d’agressivités sont présents dans une cage collective, l’agresseur est identifié et isolé du reste du groupe.

Choix des espèces

Le modèle de rongeur permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. Le comportement du vivant en réaction à l’anxiété, aux fonctions cognitives, sociales ou décisionnelles sera particulièrement exploité dans notre étude, d’autant plus que les tests comportementaux utilisés font appel à des comportements innés chez les rongeurs. La souris a tout particulièrement été choisie car les effets du régime utilisé dans la seconde partie de notre étude sont bien caractérisés chez cette espèce. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (8 semaines). Ils seront livrés au sein de l’animalerie par un établissement agréé dès l’âge de 3 semaines (après le sevrage). Puis hébergés en collectivité (par 4 ou 6), le temps d’atteindre leur âge adulte. Ils débuteront ensuite les premiers tests comportementaux à l’âge de 8 semaines (adulte). Puis ils seront utilisés pour une durée totale de 6 mois.

252 souris seront tuées parce qu'elles n'auront pas le bon profil génétique ou parce qu'elles auront servi de reproductrices, 88 autres étant gardées vivantes pour une expérimentation déjà autorisée. 340 souris vont donc être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit un prélèvement d'une touffe de poils, ou l'ablation d'un millimètre de queue si la première technique ne donne pas de résultat. Le porteur décrit un élevage destiné à produire des souris immunodéficientes, et affirme que l'étude du composé anticancéreux visé exige de travailler sur un "organisme entier".

Objectifs

Dans ce projet, nous souhaiterions produire des souris génétiquement altérées à phénotype dommageable (immunodéficience). Il s’agit d’un projet où la génération et l’élevage des souris servirait pour l’expérimentation (qui a déjà fait l’objet d’une autorisation). A terme, ce projet permettrait de comprendre l’action d’un composé encapsulé immunostimulant et son effet antitumoral. Le rôle du système immunitaire dans l'évolution des cancers est indéniable. Ces dernières années, des avancées significatives ont été réalisées dans le traitement des patients grâce à de nouvelles immunothérapies qui modulent le système immunitaire. Une molécule présente dans les bactéries a été identifiée comme particulièrement efficace pour stimuler le système immunitaire. Cependant, en dépit de ses bienfaits, sa toxicité a empêché son utilisation clinique. La détoxification de ce composé et son encapsulation a permis réduire sa toxicité pour permettre son injection intraveineuse. Il a été décrit que le composé immunostimulant encapsulé activait deux voies différentes pour stimuler l’immunité, ayant différentes finalités lorsqu’elles sont activées. Ainsi, nous voulons mettre en évidence l’efficacité du composé encapsulé - seul ou en combinaison avec un anticorps thérapeutique utilisé en clinique, lorsque l’une de ces voies est génétiquement altérées chez des souris préalablement implantées avec des cellules tumorales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de gérer au mieux l’élevage de souris génétiquement altérées à phénotype dommageable, et de sélectionner les souris de bon génotype pour l’expérimentation. Le schéma de croisement permet de générer un minimum de souris non-utilisables, tout en réduisant les nuisances par la mise au point d’une technique d'identification très peu invasive pour l'animal.

Procédures

Prélèvement d'une petite touffe de poils à l'aide d'une pince - 1 fois par animal, durée < 1min Dans le cas où nous ne parvenons pas à obtenir des résultats par cette technique, nous serons contraints de prélever un petit bout de la queue (1 mm) - 1 fois par animal, durée : < 1min

Impact sur les animaux

- risque d'infections bactériennes et virales. - Douleur légère de courte durée si biopsie de queue

Devenir

88 souris gardées en vie pour les expérimentations : animaux ayant le bon profil génétique (44 souris femelles pour chaque lignée). 252 souris mises à mort : souris n'ayant pas le bon profil génétique, et couples reproducteurs.

Remplacement

La sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion du composé dans le système sanguin et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire activées par le composé, sa migration dans l'organisme, son recrutement et son effet seul sur la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles

Réduction

Afin de produire le minimum de souris nécessaire, nous envisageons de former au plus vite des couples avec le bon profil. Ainsi, tous les individus naissants de ces couples seront utiles pour la suite de notre étude. La congélation de sperme des animaux ayant le bon profil sera réalisé afin de pouvoir faire naitre des souris avec le profil d'intérêt (permet de s’affranchir de nouveaux croisements, ainsi que de l’import des animaux en provenance des États-Unis.)

Raffinement

L’EU possède un statut sanitaire strict permettant de réduire les contaminations dont sont sensibles ces souris immunodéficientes. Les animaux sont hébergés en cages ventilées, manipulées stérilement, afin de limiter tout risque d’infection. Une double paire de gant ainsi que des manchettes seront utilisées, et changées entre chaque lignée manipulée pour éviter la transmission de germes. Les éléments de raffinements, l’alimentation et la litière sont décontaminées par voie gazeuse (peroxyde d’hydrogène) avant entrée en zone. L’eau, distribuée via des poches à usage unique, est filtrée et passée aux UV. Le personnel à l’habitude de travailler avec des Animaux Génétiquement Altérés (immunodéficients et des animaux transgéniques), un suivi journalier des animaux est effectué et le moindre changement/problème est automatiquement signalé au chercheur par l’équipe. L’état général, le comportement (activité, isolement…) les critères physiques (poils hérissés, dos voussé (signe de douleur chez la souris) …), ou le moindre signe de douleur sera évalué et annoté sur une fiche de suivi pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. La technique utilisant le prélèvement de poils plutôt qu'un petit bout de queue, moins invasive, sera mise en place au laboratoire. La mise en place des couples reproducteurs ayant le profil d'intérêt va permettre de s’affranchir des naissances inutiles. Si nécessaire, la biopsie de la queue sera réalisée précocement, à l’âge de 7-12 jours, avant l’ossification de la queue, ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. En cas d’apparition d’une inflammation au niveau de la zone de biopsie ou d’automutilation de la queue, la plaie sera traitée selon la procédure décrite par la vétérinaire désignée jusqu’à cicatrisation. La congélation de sperme sera réalisée sur les animaux ayant le profil attendu afin de s’affranchir des nouveaux croisements ainsi que de l’import des animaux en provenance des États-Unis si nécessité d'une nouvelle utilisation de cette lignée.

Choix des espèces

Les souris sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs et permettent de constituer des groupes d’effectifs compatibles avec des résultats statistiquement significatif. Les souris génétiquement modifiées choisies sont des lignées stables, commercialisées et bien décrites dans de nombreuses publications scientifiques. Elles ont été choisies pour leurs caractéristiques particulière dans les réponses immunitaires. Les animaux seront croisés à maturité sexuelle, soit à 6 semaines d’âge. Pour les expérimentations, les animaux auront entre 5 à 10 semaines d’âge, en fonction des croisements obtenus et le temps mis en œuvre pour obtenir toutes les souris nécessaires. Cette tranche d’âge permet aux souris d’avoir un système immunitaire mature tout en ayant une prise tumorale optimale.