Procédures légères
Etude de l’implication des neurones sensoriels dans le cancer du côlon et immunité
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Laparotomie pour injecter des produits dans la paroi intestinale ou directement dans des adénomes, injections entre les vertèbres, dépôt de cellules tumorales dans le rectum, biopsie de queue : 458 souris subissent ces gestes, dont 252 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées à l'issue. Le porteur indique que les tumeurs intestinales peuvent provoquer douleur et prolapsus rectal, et que les chirurgies peuvent entraîner des délabrements. L'objet déclaré est de comprendre le rôle des neurones sensoriels dans la croissance des tumeurs du côlon, une étape amont dont les retombées thérapeutiques restent à l'état d'hypothèse. Une grille de score doit repérer les 16 % d'animaux susceptibles de perdre du poids et de développer une anémie, sans que le RNT dise d'où vient cette proportion.
Objectifs
Les tumeurs solides sont souvent infiltrées par des fibres nerveuses, qui peuvent participer dans l'initiation et/ou la progression tumorale. Par exemple, dans les cancer de la peau, les cellules cancéreuses interagissent avec les terminaisons nerveuses sensorielles en produisant des neuropeptides, qui influencent la croissance tumorale par divers mécanismes incluant le contrôle de l'activité des cellules immunitaires infiltrées. Par ailleurs, l'absence des fibres nerveuses sensorielles dans des modèles animaux de colites exacerbe l'inflammation et la pathologie, et l'inflammation chronique intestinale est établie comme un facteur de risque du cancer colorectal. Néanmoins, le rôle des neurones sensoriels reste à identifier précisément dans le cadre du cancer colorectal, et des intéractions entre ces neurones et les cellules immunitaires restent à examiner dans le cadre de cette pathologie. Nous avons donc proposé d'étudier le rôle des neurones sensoriels dans la croissance tumorale et la surveillance immunitaire au cours du cancer colorectal. La présente saisine couvre donc des aspects initiaux de notre projet, incluant la création de modèles animaux de carcinogénèse intestinale et de co-cultures cellulaires in vitro.
Bénéfices attendus
Sur le plan fondamental, le rôle du systeme nerveux sensoriel dans la croissance tumorale intestinale sera comprise chez la souris. Sur le plan translationnel, les résultats permettront d'envisager d'utiliser l'activité nerveuse, pour modifier la croissance tumorale au cours du cancer colorectal. Parmi les hypothèses, l'identification des neuropeptides sécrétés par les neurones sensoriels pourraient suggérer des traitements afin d'agir sur le système immunitaire, sur les tumeurs, ou potentialiser des traitements déjà connus.
Procédures
Nous réaliserons les gestes suivants: Traitement pour l'induction des tumeurs intestinales : durée 3 minutes incluant la prise en main (1x/jour pendant 5 jours). Injections inter-vertebrales: durée 10 minutes par souris ; Injections dans le parois intestinale ou dans des adénomes intestinaux: durée 30 minutes comprenant la laparotomie (1/souris) ; Injections de cellules tumorales dans le rectum : durée 20-25 minutes incluant le positionnement sur le masque d'anesthésie (1/souris). Biopsie de queue à 14j pour génotypage: durée 30sec/souris (1/souris)
Impact sur les animaux
Le modèle animal que nous utiliserons développent des tumeurs dans l'intestin qui peuvent provoquer de l'inconfort et/ou de la douleur lorqu'elles sont trop nombreuses et/ou trop grosses, voire induire un prolapsus rectal. De même, l'implantation dans le rectum de cellules tumorales de stade plus avancé peut provoquer de la douleur dûe à la croissance de la tumeur, voire un prolapsus rectal. Les chirurgies nécessaires à la réalisation des injections intra-tumorales ou dans la paroi intestinale ou intrathécales, peuvent induire des délabrements et/ou des douleurs post-chirurgicales. Les différents traitements en i.p. peuvent générer un stress et une douleur légère transitoire. Les biopsies de queues pour le génotypage peuvent générer une douleur légère de courte durée.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort
Remplacement
Les expériences in vitro ont permis d'identifier des intéractions de terminaisons nerveuses avec des cellules tumorales et/ou immunitaires, et nous exploitons ces données. Nous reprendrons cette approche pour une partie de notre projet, ce qui limitera le nombre d'animaux requis et le caractère invasif de certaines experiences in vivo (susceptibles de générer des informations équivalentes). Des analyses de bases de données publiques in silico permettront de sélectionner des candidats moléculaires. Néanmoins, certaines observations ne peuvent être réalisées en dehors du contexte de l'animal, telles que les études des intéractions multicellulaires, de la morphologie des structures. Enfin, le contrôle sélectif des neurones sensoriels in vitro requiert au préalable la manipulation génétique des neurones sensoriels matures, in vivo, afin d'obtenir des phénotypes les plus fidèles à la physiologie.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser pour chaque obejctif a été rigoureusement calculé pour réduire un maximum le nombre d'animaux tout en gardant une puissance statistique adaptée qui permettra de conclure sur les résultats. Pour ce projet nous pouvons utiliser les mâles et les femelles.
Raffinement
Les souris seront hébergées avec un enrichissement (frizottis, rouleaux de coton, lambeaux de papier, abri en carton ou en plastique rouge) qui sera modifié qualitativement après chaque change. Afin de lutter contre l'isolement de mâles, notre première mesure est de conserver un frère pour compagnie. Quand cela n'est pas possible (un mâle sans frère), notre animalerie propose un hébergement avec une femelle de compagnie n'étant plus en âge de mettre bas. Pour la chirurgie abdominale, les animaux seront habitués au chirurgien pendant quelques jours avant la chirurgie et des conditions d'asepties seront rigoureusement appliquées pour éviter la perte d'animaux dûe à des infections post-chirurgicales et pour éviter d'utiliser plus d'animaux afin d'obtenir un résultat significatif. Les prises en charge avant les chirurgies sont une analgésie locale, une analgésie générale et un traitement anti-inflammatoire. Après la chirurgie abdominale, les animaux recevront pendant 5j consécutifs d'un anti-inflammatoire et un analgésique contre la douleur. Une grille de score sera également utilisée. Le raffinement spécifique au phénotype dommageable consiste à étudier les animaux avant qu'ils développent les signes d 'inconfort. De plus, une grille de score sera utilisée pour identifier les 16% d'animaux qui pourraient développer des signes de mal être tels que perte de poids et anémie et ces animaux seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Les souris présentent plusieurs avantages pour l'étude. Certaines lignées récapituleront la tumorigenèse précoce observée chez l'homme et seront utilisées lorsque les tumeurs sont développées (120-150j). Le contrôle de la génétique de la souris permet d'identifier des types cellulaires précis (dans cette saisine les neurones sensoriels) et ainsi de limiter le nombre d'animaux utilisés. Elles seront utilisées à l'âge adulte, entre 7 et 15 semaines afin que l'intestin soit mature totalement.
Génotypage de poissons zèbres, sans phénotype dommageable, pour l’étude de mécanismes impliqués dans un type de mémoire , l’habituation.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
8 000 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. À deux mois, chaque poisson est anesthésié à la tricaïne par balnéation, puis une extrémité de sa nageoire caudale est coupée sur une surface inférieure à 0,25 mm², en moins de deux minutes. L'objectif déclaré est de repérer les poissons hétérozygotes pour organiser les croisements, les expériences sur la mémoire portant ensuite sur des larves de moins de cinq jours, hors du champ réglementaire. Seuls les hétérozygotes sont gardés vivants pour la reproduction, tous les autres génotypes sont tués, et tout poisson présentant un trouble de la flottabilité, une immobilité, une scoliose ou, pour les femelles, un ventre rempli d'œufs est tué immédiatement.
Objectifs
Le projet est une caractérisation génétique de 8 lignées de poissons âgés de 2 mois, génétiquement modifiés. Ces poissons seront ensuite élevés puis croisés entre eux afin d'obtenir des larves âgées de moins de 5 jous, non soumis à l'expérimenation animale, pour les études afin de comprendre comment les animaux apprennent et forment des souvenirs. S'il est clair que les souvenirs se forment grâce à la plasticité des réseaux neuronaux, de nombreuses questions restent ouvertes. Par exemple, dans un circuit neuronal complexe de vertébrés, lesquels et combien de neurones sont soumis à la plasticité ? Quels sont les mécanismes moléculaires impliqués dans cette plasticité ? Pour répondre à cette question des poissons zèbres sont utilisées car leur cerveau est relativement simple (~100 000 neurones), petit (0,25 mm3) et l'activité de tous les neurones peut être mesurée de façon indépendante. Lorsqu'il est stimulé par un flash de lumière ou un bruit, le poisson zèbre réagit par un sursaut. En cas d'éclairs ou de bruits répétés, cette réponse diminue, formant un type de mémoire à long terme connu sous le nom d’habituation. Afin d'étudier cette habituation, nous disposons de 8 lignées de poisson zèbre portant des mutations, non dommageables, sur différentes protéines. Ces poissons seront croisés entre eux pour étudier le comportement de leur descendance, âgèe de moins de 5 jours et donc non soumise à l'expérimentation animale. L'étude du comportement des poissons correspondra à l'étude de leur habituation suite à l'extinction de la lumière.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique des lignées pour optimisation de la gestion des élevages est nécessaire car l'étude de l'habituation chez le poisson zèbre âgé de moins de 5 jours, nécessite d'avoir tous les génotypes possibles analysés en simultanée dans la même expérience. Par exemple pour un simple mutation, en croisant deux poisson +/-, nous aurons des larves âgées de moins de 5 jours ayant les généotypes +/+;+/- et -/-. Le fait de garder, après génotypage, les parents sous forme +/- est le seul moyen, le plus rationnel, d'avoir les larves âgées de moins de 5 jours avec les 3 génotypes voulus.
Procédures
Les poissons agès de 2 mois, seront génotypés par prélèvement d 'une partie infime de leur nageoire caudale afin de ne garder que les individus hétérozygotes. Le génotypage sera fait par balnéation et anesthésie du poisson à la Tricaine; un bout de la nageoire caudale sera coupée . Le temps total de la procédure sera le plus court possible (moins de 2 min). Les poissons seront placés rapidement dans un bac de réveil rempli d'eau avant d'être transféré dans son aquarium. Cette procédure concerne tous les poissons de cette demande mais seuls le nombre de poissons nécessaires à obtenir les effectifs souhaités subiront le génotypage, les autres ne seront pas génotypés dés lors que les effectifs voulus sont atteints. Les chiffre donnés sont donc des maximums et le prélèvement sera le seul geste invasif faits sur les animaux et une seule fois dans leur vie.
Impact sur les animaux
Le génotypage des poissons se fera par découpe d'une extrémité de la nageoire caudale d'une surface inférieure à 0.25 mm2 sous anesthésie dans un délai très court. Les nuisances ou effets indésirables, extrêment rares avec ce protocole établi et utilisé en routine, seront visibles au moment de l'endormissement, du réveil (trop long ou visualisé par une nage inhabituelle), des lésions suite à la biopsie ou de la non repousse, dans des cas exceptionneles, de la nageoire (qui doit être totale au bout de 15 jours). Tout phénotype inhabituel entrainera la mise à mort immédiate du poisson.
Devenir
Les poissons une fois génotypés seront divisés en deux catégories. Les poissons hétérozygotes seront maintenus en vie pour être mis en croisement afin de faire des expériences d'habituation sur leurs descendants âgès de moins de 5 jours (non sousmis à une demande) et pour être mis en croisement pour obtenir la génération suivante. Les poissons ayant tous les autres génotypes possibles seront mis à mort car nous souhaitons maintenir les lignées sous forme hétérozygote. En effet, ce n'est que par croisement de poissons hétérozygotes entre eux que nosu obtiendrons des larves (non soumis à une dap) ayant tous les génotypes souhaités.
Remplacement
Au niveau du génotypage aucun remplacement n'est possible pour la biopsie de la nageoire caudale. L'étude de la mémoire et du comportement ne peut se faire que sur un cerveau entier, dans des animaux vivants. Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés. En tant que vertébrés, le cerveau et le génome du poisson zèbre partagent des homologies majeures avec les mammifères et les humains. Travailler sur un modèle vertébré est essentiel pour nos projets visant à découvrir les mécanismes conservés de plasticité et leur pertinence potentielle pour la fonction psychiatrique humaine et le dysfonctionnement du cerveau dans les maladies neurologiques. Nous utilisons des lignées transgéniques connues pour être impliquées dans l'habituation afin de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu et mieux caractériser l'action de certaines molécules impliquées dans les défauts de mémoire. Aucun modèle cellulaire in vitro ne peut se substituer à cette étude.
Réduction
Nous faisons une nouvelle génération que les 8 à 10 mois (au lieu de tous les 6 mois) ce qui permet sur 5 ans de diminuer le nombre de générations. Un nombre minium de 20 individus est élevé pour maintenir la lignée et obtenir des alevins. Ce chiffre permet d'avoir suffisament de mâles et femelles pour les accouplements. Seul le nombre de poissons nécessaires à obtenir les effectifs souhaités subiront le génotypage, les autres ne seront pas génotypés dés lors que les effectifs voulus sont atteints. Les chiffres donnés sont donc des maxima. Nous ne gardons que les poissons hétérozygotes (au lieu de garder des +/+ et -/-) car en le croisant entre eux nous obtenons tous les génotypes voulus pour vos expériences sur des larves de moins de 5 jours. Les études sur la mémoire se font sur des larves âgées de moins de 5 jours, non soumises à une DAP. Les poissons possèdent deux ou trois mutations, nous permettant ainsi de ne pas maintenir des lignées avec une seule mutation. Les lignées non utilisées dans le futur seront cryoconservées.
Raffinement
Tout poisson, quel de soit sont stade de développement, qui présente un comportement anormal, ou un signe de mal être a ou un des points limites tels que problème de flottabilité, immobilité, mouvements anormaux, scoliose, siphose, femelle avec ventre rempli d'oeufs, sera mis à mort immédiatement. Les poissons sont maintenus dans les aquariums en nombre suffisant pour leur permettre de se déplacer en banc. Une fois par jour des artémias vivants leur sont donnés afin de maintenir leur activité de prédation. Le prélèvement pour le génotypage sera le seul geste invasif fait sur les animaux et une seule fois dans leur vie. Lors du processus de génotypage, les poissons sont maintenus par deux par bac de 700 ml un minimum de temps ne dépassant pas 48h. Durant ces 48h, les poissons sont maintenus deux par deux dans les bacs avec un séparateur entre les deux afin de pouvori les identifier suite au génotypage.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un animal modèle facile à élever (animal petit, robuste, possédant d'excellentes capacités de reproduction). De plus, 70% des gènes du poisson zèbre ont un équivalent chez l'homme. Enfin, ce génome s'est montré facilement manipulable, ce qui a conduit à la création de milliers de mutants dont ceux utilisés dans ce projet. Les études comportementales associées à des approches d’imagerie sur l’organisme entier, à une résolution pouvant atteindre l’échelle cellulaire (poisson optiquement transparent jusqu'à 4 semaines) fait du poisson zèbre un modèle pertinent. Ces approches d'étude de comportement à haut débit et l'imagerie sur animal entier, ne sont absolument pas applicables en routine sur d'autres modèles vertébrés ce qui fait du poisson zèbre comme modèle vertébré un modèle idéal. Du plus il s'agit d'un modèle dont le cerveau est relativement simple comparativement à d'autres modèles et il est donc plus facile d'obtenir des résultats interprétables Les lignées sont déjà établies. Les génotypages des adultes pour chaque génération se feront au stade 2 mois. A ce stade les poissons sont assez grands pour que le génotypage de la nageoire caudale se fasse sans séquelle, celle-ci étant assez développée
Étude de la variabilité génétique et phénotypique au sein d’une colonie de ouistitis d’élevage.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Issus de deux colonies d'élevage que les établissements font grandir pour atteindre l'effectif visé, 150 ouistitis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun n'étant tué et tous réintroduits dans leur groupe. Chaque animal est mis à jeun, capturé à la main, au filet ou par conditionnement à entrer dans une boîte, puis anesthésié pour une heure environ de prélèvements et de mesures. Les expérimentateurs lui prélèvent un millilitre de sang, une biopsie cutanée refermée par un point de suture et une quarantaine de poils, avant des examens ophtalmologiques avec collyre, blépharostat maintenant chaque œil ouvert et pose de lentilles. Le porteur écrit que "le principe de réduction est donc difficilement applicable dans ce contexte", l'objectif étant de caractériser toute la colonie, et l'expansion de celle-ci sur cinq ans doit fournir les 150 individus.
Objectifs
Ce projet est un projet transversal réalisé dans deux EU qui hébergent chacun une colonie de ouistiti qui leur est propre. Les résultats seront mis en commun et analysés de façon globale. Ce projet a pour objectif d'étudier la variabilité génétique et phénotypique au sein de ces colonies. Cette variabilité au sein d’une espèce est un élément clé pour sa survie en milieu naturel. En captivité, les possibilités d’accouplement au sein d’une colonie sont limitées et le brassage avec des individus non apparentés (et donc suffisamment éloignés du point de vue génétique) n'est pas toujours possible. Au fils des années, des effets négatifs sur la fertilité et la santé (e.g. susceptibilité accrue aux infections) peuvent apparaitre et différentes études ont mis en évidence l'apparition de déficits chez des animaux hébergés en captivité. De même les conditions d’élevage peuvent influer sur la variabilité phénotypique (taille, poids, acuité visuelle..). Étudier la variabilité génétique et phénotypique au sein de colonies d'élevage est donc important pour mieux caractériser et contrôler génétiquement la diversité dans ces populations, raffiner la gestion et le bien-être des animaux et améliorer les études scientifiques futures. Pour atteindre les objectifs de ce projet, des prélèvements de sang et de poils ainsi que des biopsies cutanées seront effectuées chez tous les individus. En parallèle, des examens ophtalmologiques non-invasifs en imagerie multimodale permettant d'évaluer les caractéristiques anatomo-fonctionnelles de la rétine (mesure de la forme de l'oeil, de l'épaisseur de la choroïde, de la correction optique, du diamètre de la pupille, etc.) seront également réalisés.
Bénéfices attendus
Les données collectées dans le cadre de ce projet contribueront à caractériser la diversité génétique et phénotypique au sein de nos colonies de ouistitis. D'autre part, elles pourraient contribuer à affiner l'arbre décisionnel permettant de sélectionner les animaux qui seront mis en contact à des fins de reproduction. Enfin, la caractérisation phénotypique et fonctionnelle de l'oeil pourrait permettre la mise en place de mesures de raffinement complémentaires pour améliorer l’environnement des animaux.
Procédures
Conditionnement à la capture et à l’entrée volontaire dans une boite de capture. Mise à jeun des animaux (retrait de la nourriture et de l’eau respectivement 2h et 1h avant la capture et l’anesthésie). Capture des animaux (à la main/filet ou par entrée volontaire dans une boite de capture) et transport des animaux de leur espace d’hébergement vers la pièce d’anesthésie (au sein du même bâtiment). Anesthésie des animaux (protocole d’anesthésie gazeuse ou anesthésie fixe avec un relai en anesthésie gazeuse). Sous anesthésie, réalisation de différents prélèvements : un échantillon de sang total (environ 1 ml par animal), une biopsie cutanée de quelques millimètres de surface avec mise en place d’un point de suture (un échantillon par animal), et un prélèvement de poils (une quarantaine par animal). [Durée total de la phase de prélèvement des échantillons : environ 30 minutes]. Réalisation de mesures ophtalmologiques (dans le cadre de la même anesthésie que celle décrite précédemment lorsque ce sera possible) : application d’un collyre permettant une anesthésie locale de la cornée, mise en place d’un blépharostat pour maintenir chaque œil ouvert, application d’un collyre dans chaque œil pour induire une dilatation de la pupille, mise en place d’une lentille non corrigée sur chaque œil pour prévenir tout dessèchement de l’œil, puis réalisation d’une série de mesures non invasives sans contact direct avec les yeux. [Durée total de la phase de tests ophtalmologiques : environ 30-40 minutes]. Fin de l’anesthésie avec maintien de l’animal sur tapis chauffant et sous surveillance jusqu’au réveil. Retour de l’animal dans la zone de stabulation en boite de capture et ré-introduction de l’animal dans son groupe sous surveillance le jour de la session et le jour suivant.
Impact sur les animaux
Stress potentiel durant la phase de conditionnement et lié à la capture des animaux et à leur transport de la zone de stabulation vers la pièce de prélèvements/tests. Inconfort lié à l’anesthésie mise en place pour effectuer les prélèvements et les tests ophtalmologiques, complications potentielles au niveau local des suites de la biopsie cutanée (inflammation, infections), conséquences du prélèvement sanguin (hématome localisé), de la pause et du retrait du blepharostat utilisé pour maintenir les paupières ouvertes lors des examens ophtalmologiques, inconfort associée à l'instillation de collyre et à la pose de lentilles non corrigées sur la cornée au cours de l'anesthésie, stress potentiel lié au retour de l'animal dans le groupe.
Devenir
Le projet ne prévoit pas de mise à mort et tous les animaux seront maintenus en vie. A l'issue du projet les animaux seront ré-introduits dans leur groupe.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthodes in vitro permettant d’étudier les comportements sociaux et les effets de médicaments neurologiques/psychiatriques sur ces fonctions.
Réduction
Il s'agit ici de caractériser d'un point de vue phénotypique et génétique l'ensemble de notre colonie de ouistitis. Le principe de réduction est donc difficilement applicable dans ce contexte. La colonie de ouistitis actuellement hébergées compte une centaine d'individus. L'expansion de cette colonie, durant la durée d'autorisation du projet de 5 ans, permettra de produire un nombre d'animaux compatible avec l'objectif d’échantillonnage fixé à 150 individus
Raffinement
Captures et manipulations représentent des stress importants. Les captures seront effectuées par les personnes régulièrement en contact avec les animaux (personnel de zootechnie ou en charge du suivi de la colonie). Si d'autres personnes devaient effectuer des captures, des visites seront préalablement organisées pour que les animaux s'y habituent. Deux protocoles pourront être utilisés pour la capture selon la tolérance des animaux au contact humain et le type d'hébergement dont ils seront issus : capture à la main/filet ou conditionnement à entrer dans une boite de transport. La seconde option sera privilégiée dès que possible et fera l’objet de séances d’habituation (entraînement à entrer dans la boite avec récompense (gomme arabique)). S’ils sont capturés à la main/filet, de la gomme arabique leur sera proposée immédiatement après capture lors de l'entrainement. Durant les transports un tissu opaque sera placé sur la boite pour limiter le stress. Si possible, les collectes d’échantillons et les mesures ophtalmologiques seront réalisées dans le cadre d’une anesthésie unique. Le protocole d'anesthésie utilisé permet de raccourcir les phases d’endormissement et de réveil et évite le stress associé à la contention et à l’administration. Pour ce faire, nous utiliserons une boite de capture spécifique, de faible volume et ajourée, qui sera placée dans une boite d’induction thermostatée. Une fois l’anesthésie induite, l’animal sera maintenu au masque sous anesthésie gazeuse pendant toute l’intervention. Lors des mesures ophtalmologiques, les animaux seront placés sur un coussin de contention. La réalisation des biopsies s’effectuera sous anesthésie avec analgésie locale préalable. Un petit échantillon de peau sera collecté et un traitement analgésique et anti-inflammatoire sera administré. La plaie, d’éventuelles irritations des yeux seront suivies jusqu’à la cicatrisation. Les interactions sociales seront monitorées attentivement dans les heures et les jours suivants l’intervention pour s’assurer qu’aucun conflit ne survienne ; dans le cas contraire une surveillance accrue sera mise en place.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs ont largement montré leurs limites quant à la modélisation des troubles psychiatriques. Le ouistiti, en raison de ses caractéristiques comportementales et sociales et de la présence de variations génétiques identifiées chez l’Homme en lien avec les pathologies psychiatriques, est un modèle de choix. Tous les individus de notre colonie de plus de 1 an seront étudiés. Cette limite d'âge a été fixée car, bien que dès la naissance les yeux aient quasiment atteints leur taille définitive chez tous les primates, au niveau fonctionnel (au niveau des aires visuelles supérieures notamment) il faut dépasser un an pour que les neurones figent la vision binoculaire, après ce laps de temps on peux considérer le système visuel comme entièrement développé.
L’Evaluation de nouveaux médicaments pour la neuroinflammation oculaire en utilisant les modèles murins
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rats : 796
Deux injections dans le vitré des deux yeux, des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant 14 jours et un examen à la lampe à fente chaque jour à partir du huitième : 796 rats et 720 souris vont être utilisés, tous tués à des moments échelonnés du protocole. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 316 animaux et modéré pour 1 200, avec une uvéite auto-immune déclenchée par immunisation, des dégénérescences rétiniennes provoquées par agents chimiques et une néovascularisation choroïdienne induite au laser. Le porteur annonce détresse, fièvre et perte de poids au pic inflammatoire, une baisse de vision dans tous les modèles, des hémorragies intraoculaires possibles et des lésions de la cornée en cas d'anesthésie prolongée. Il indique n'utiliser les rats que pour l'évaluation thérapeutique parce que leurs yeux sont plus grands, ce qui permet d'injecter une dose précise et de récupérer assez de matériel, argument qu'il présente comme une réduction du nombre d'animaux tués.
Objectifs
Les maladies rétiniennes inflammatoires sont les causes principales de cécité dans les pays industrialisés. Les traitements anti-inflammatoires actuels, tels que les glucocorticoïdes, peuvent entraîner de graves effets secondaires. Il n’existe pas non plus de traitement pour la neuroprotection. Dans ce projet, nous évaluerons le potentiel thérapeutique de deux molécules candidates : une nouvelle molécule anti-inflammatoire prometteuse et un médicament existant que nous voulons repositionner dans l’œil. Les objectifs du projet sont : 1) d’évaluer les effets thérapeutiques de ces deux molécules en utilisant des modèles expérimentaux d’inflammation oculaire et de neurodégénérescence rétinienne de rat, et 2) d’étudier les mécanismes moléculaires en utilisant des modèles murins transgéniques.
Bénéfices attendus
Une des deux molécules à tester est un nouveau type de médicament anti-inflammatoire, qui a un grand potentiel dans le traitement des maladies oculaires inflammatoires cécitantes chez l’homme. L’autre molécule est un médicament déjà sur le marché aux propriétés pharmaceutiques connues, Il peut être repositionné pour traiter les maladies oculaires grâce à leurs effets anti-inflammatoires. Les résultats de ce projet serviront à déterminer les pathologies pour lesquelles ces traitements seront bénéfiques et à identifier les mécanismes d’action. Ils permettront également de comparer les voies d’administration afin de développer des traitements ciblés optimisés pour les patients souffrant de diverses inflammations oculaires. Ce projet contribuera à approfondir nos connaissances sur la pathogenèse de la neuro-inflammation oculaire et à promouvoir la santé publique à long terme en fournissant de nouveaux traitements fondés sur des preuves.
Procédures
L’induction des modèles pathologiques prend entre 5 à 10 minutes. Les expériences sont réalisées sous anesthésie générale et locale sur tous les animaux. Un analgésique est administré pendant 3 jours après l’induction de l’uvéite autoimmune expérimentale (EAU). Dans cette procédure, l’administration systémique des médicaments est réalisée par injection intrapéritonéale (IP) une fois par jour pendant 14 jours sur les animaux éveillés. Pour tous les modèles pathologiques, l’administration intraoculaire des médicaments est effectuée par injection intravitréenne (IVT) dans les 2 yeux sous anesthésie générale et locale. Cet acte dure quelques secondes. Pour le modèle EAU, deux IVT sont effectuées aux jours 7 et 15 après l’immunisation. Pour les modèles de dégénérescence rétinienne induits par des agents chimiques, une seule IVT est réalisée au jour 0. Tous les animaux sont suivis par des examens morphologiques et fonctionnels. L’observation de l’uvéite avec une lampe à fente, qui prend environ 1 minute, est réalisée quotidiennement à partir du jour 8 jusqu’à la fin de la procédure EAU, sur les animaux éveillés. De différents examens in vivo permettant d’évaluer la morphologique et la fonction de la rétine sont réalisés sous anesthésie générale et locale et durent entre 10 à 30 minutes. L’examen de la morphologie de la rétine est effectué aux jours 7, 15 et 24 après l’immunisation dans le modèle EAU chez le rat ; avant, puis aux jours 3, 7 et 14 après l’injection des agents chimiques dans les modèles de dégénérescence rétinienne chez le rat ; tous les 3 et 4 jours dans le modèle EAU chez la souris ; et avant et 10 jours après le traitement au laser dans le modèle de néovascularisation choroïdienne (CNV) chez la souris. L’examen de la fonction de la rétine est réalisé au jour 15 dans le modèle EAU chez le rat ; au jour 3 ou jours 7 et 14 dans les modèle de dégénérescence rétinienne, et au jour 21 dans le modèle EAU chez la souris. L’angiographie permettant de visualiser des néovaisseaux est effectuée une seule fois dans le modèle CNV. Enfin, un prélèvement sanguin est réalisé au jour 15 après l’immunisation chez les rats traités systématiquement dans le modèle EAU. Cet acte dure une dizaine de secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux incluent : 1) Pendant la manipulation, notamment lors des examens des yeux, les animaux peuvent éprouver du stress. 2) L’anesthésie présente des risques tels que l’hypothermie, la détresse respiratoire et, dans des cas extrêmes, le décès. 3) Dans le cadre du modèle d’uvéite autoimmune expérimentale, les animaux sont susceptibles de souffrir de détresse, de fièvre et de perte de poids pendant la phase de pic inflammatoire. 4) Tous les modèles étudiés pourraient entraîner une baisse de vision. 5) Des complications spécifiques, comme une hémorragie intraoculaire, peuvent survenir lors des injections intravitréennes et des traitements au laser. 6) Enfin, la prolongation de l’anesthésie ou une protection insuffisante de la cornée peuvent causer des lésions cornéennes.
Devenir
Tous les animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à des moments différents, selon les besoins spécifiques des questions scientifiques posées. Les tissus oculaires seront ensuite prélevés pour réaliser des analyses histologique, immunohistochimique, ainsi que des études cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Ce projet concerne 1) d’une part l’évaluation des effets thérapeutiques de deux catégories de médicaments, 2) d’autre part l’identification des mécanismes moléculaire et la cascade de signalisation impliquée dans la régulation du système immunitaire locale et systémique, de la barrière hémato-rétinienne et la neuroprotection. Face à la complexité des systèmes étudiés, aucun système accessible pour le moment in vitro ou ex vivo ne reproduit totalement le modèle intégré dont nous avons besoin. Le but principal reste le transfert des techniques mises en œuvre vers l’évaluation thérapeutique des traitements chez l’homme.
Réduction
Les examens morphologiques et fonctionnels in vivo assurent un suivi du même animal et permettent une réduction du nombre d’animaux euthanasiés. Les mécanismes d’action des médicaments seront évalués secondairement dans des modèles où les traitements sont bénéfiques. Les souris transgéniques sont partagées entre plusieurs équipes qui travaillent sur d’autres sujets de recherche et sur d’autres organes. Le nombre total d’animaux établi pour ce projet est de 1516 grâce à un calcul de puissance. Il sera également nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les procédures utilisées dans le projet pouvant entraîner une souffrance modérée pour les animaux, des mesures de prévention et des points limites précoces sont mis en place pour réduire ou éviter la douleur. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale et locale. Une analgésie sera administrée avant les interventions potentiellement douloureuses et sera renouvelée pendant 3 jours. Afin d'éviter l'hypothermie pendant l'anesthésie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Pour protéger la cornée du dessèchement et éviter les lésions cornéennes consécutives, des gouttes de larmes artificielles sont instillés jusqu’au réveil de l’animal. Des points limites précoces sont définis en amont et seront contrôlés tout au long du projet, impliquant des actions pouvant aller jusqu’à l’euthanasie en cas de souffrance trop importante. Le chercheur observe les différents signes permettant d'évaluer une souffrance animale avérée : le comportement, l'activité locomotrice, qualité du poil, la prise alimentaire et la perte de poids. Pour assurer de bonnes conditions de stabulation pour les animaux, les conditions d’hébergements (température, hygrométrie) sont contrôlées conformément aux exigences réglementaires de l’espèce. La litière, l’abreuvement et la nourriture sont changés une fois par semaine et vérifiés quotidiennement. Le milieu est enrichi pour les souris : coton de nidification, tunnels et niches, maison en plastique accrochée à la grille ; et pour les rats : tunnels en cartons ou plastique et/ou maison en plastique au sol. Des recherches régulières dans la littérature et la participation à la formation continue de l’expérimentation animale permettront d’apprendre et mettre en œuvre de nouvelles techniques de raffinement.
Choix des espèces
Les espèces rat et souris ont été choisies car il s'agit des modèles établis pour le développement de différentes pathologies dont des maladies oculaires humaines. Seuls les rats sont utilisés pour tester les effets thérapeutiques des médicaments, car leurs yeux sont plus grands, et une dose précise de médicament peut facilement être injectée dans l’œil. De plus, nous pouvons récupérer suffisamment de matériel pour effectuer les analyses, ce qui réduit le nombre d’animaux euthanasiés. Les souris transgéniques sont utilisées pour étudier les mécanismes, car le génome de souris est similaire à celui de l’homme, et la fonction des gènes dans les maladies humaines peut être analysée à l’aide de ces modèles murins. Dans le cas d’animaux achetés, les rats et souris auront 5-7 semaines à leur livraison, une phase d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée avant que les animaux ne rentrent dans le protocole. Dans le cas où nous élevons les animaux au sein de notre propre établissement, les animaux auront 6-8 semaines. L'âge choisi est en accord avec ce qui est fait dans la littérature pour ce type de modèles expérimentaux. Il s'agit de modèles de pathologie survenant à l'âge adulte.
Identification et genotypage des souris en élevage
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
690 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, au sein d'un élevage de lignées modélisant des malformations cardiaques congénitales. Chaque animal est saisi par la queue une dizaine de secondes, le temps d'une biopsie caudale de cinq secondes destinée à vérifier la transmission du gène modifié. Le porteur indique que ces souris sont maintenues en vie pour une utilisation continue dans d'autres autorisations de projet, l'élevage servant à produire les cohortes des expériences suivantes. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe "aucune alternative" et que le recours à l'animal est "incontournable", cellules in vitro et organoïdes ne rendant pas compte du développement du cœur.
Objectifs
Elevage de souris à des fins de recherches sur les pathologies cardiaques congénitales ( malformations du coeur à la naissance) Nous élevons des souris qui modélisent des pathologies cardiaques congénitales telles que la cardiomyopathie dilatée (dilatation du ventricule gauche ) ou le Syndrome de Cornelia de Lange, une maladie du développement affectant la formation et la fonction de nombreux organes. Ces deux souris modèles nous ont permis de mettre en évidence des pistes thérapeutiques pharmacologiques (identification de médicament utilisés pour la cancérologie) qui feront l' objet de projets cliniques dans un futur proche. Ces souris plus généralement nous permettent également de mieux comprendre la formation du coeur et de chercher l 'origine des malformations qui sont susceptibles de se produire.
Bénéfices attendus
un génotypage (c'est à dire la vérification de la transmission du gène modifié dans le modèle de souris à partir des parents) adéquat très important pour la rigueur de nos recherches
Procédures
les souris seront soumises à une légèrepréhension par la queue pendant 10 secondes pour la biopsie de queue qusi ne dure que 5 secondes ce qui pourrait événtuellement entraîner une légère et courte douleur
Impact sur les animaux
les gestes sont très rapides et n'apportent à la souris qu'une gêne à la préhension
Devenir
Ces souris sont élévées pour une recherche continue sur les malformations cardiaques congénitales apparaissant de novo ou associéees à des maladies rares. Les souris sont maintenus en vie, pour une utilisation continue dans des DAP d'expérimentation. Dans seulement les 5 dernières années, nous avons pu mettte en évidence deux cibles médicamenteuses grace à l utilistion de ces souris. Ceci a permis en collaboration avec nos collègues cliniciens le design actuel de deux essais cliniques chez des patients.
Remplacement
Ce projet sera conduit dans le strict respect de la regle des 3R. L’étude des pathologies cardiaques congénitales nécessite de recourir a l’animal car il n’existe aucune alternative. Il n’est pas possible d’obtenir ces informations par des cellules in vitro ou des organoides qui ne peuvent rendre compte fidèlement du développement, de la maturation et du fonctionnement du coeur
Réduction
Le recours a l’animal etant incontournable, nous avons reduit le nombre d’animaux au minimum pour le strict maintien de la colonie pour chaque allèle
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid, cartons à ronger)
Choix des espèces
3.4.3. Justifiez la pertinence des espèces animales choisies La souris peut être facilement modifiée génétiquement. Nos modèles murins récapitulent parfaitement le phenotype des patients. Elle est un bon modèle de biologie du développement, un avantage pour les pathologies cardiaques congénitales
Impact de l’interaction entre le microbiome respiratoire et le glycome sur la sensibilité des bovins aux infections
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Des veaux de 15 à 30 jours sont retenus parce que l'immunité transmise par le colostrum commence alors à décliner, ce qui les rend plus vulnérables à l'infection qu'on va leur inoculer. Ils sont 28, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, l'autre d'un niveau modéré. Chacun subit huit prises de sang, huit sessions d'écouvillonnage nasal profond à trois écouvillons par narine, huit écouvillonnages rectaux et huit lavages broncho-alvéolaires, quatorze d'entre eux recevant en plus une co-infection virale et bactérienne par masque puis huit administrations d'antibiotique. Tous sont tués par injection à la fin du projet, pour des analyses post mortem sur leurs organes.
Objectifs
Le complexe respiratoire bovin revêt une importance capitale, tant en France que sur le plan international, en raison de son impact sur la santé et le bien-être des animaux, ainsi que des pertes économiques significatives qu’il entraîne. Les principaux agents pathogènes de cette affection sont des bactéries et des virus qui agissent de concert de façon synergique. Chez les animaux en bonne santé, le mucus des voies respiratoires forme une barrière protectrice, composée de mucines et d’un écosystème microbien diversifié, qui joue un rôle crucial dans la prévention de l’invasion pathogène et dans la facilitation de leur élimination. Ces pathogènes exploitent souvent les glycanes présents sur les cellules eucaryotes et les mucines (le « glycome ») pour infecter l’hôte. Alors que chez l’homme, des études indiquent un rôle essentiel du complexe microbiote-glycome respiratoire dans la modulation de la colonisation par les agents pathogènes, les données relatives aux animaux restent encore limitées. Dans ce cadre, l’objectif principal de notre projet est d’explorer les interactions régulatrices entre le microbiome et le glycome des voies respiratoires chez les veaux, et leur réponse à une infection polymicrobienne ainsi qu’à un traitement antibiotique précoce. De manière plus spécifique, ce projet vise à : (1) caractériser les variations temporelles du microbiote et du glycome des mucines respiratoires, (2) identifier les profils de glycome et microbiens post-infection qui sont indicatifs de processus moléculaires liés à l’adhésion et la réplication virales, à la réponse immunitaire, à la guérison ou à la résilience, (3) décrire la dynamique du résistome microbien, et (4) confirmer la corrélation entre les profils de glycanes et le tropisme viral.
Bénéfices attendus
Notre projet se distingue par trois innovations majeures. Tout d’abord, il vise à identifier des biomarqueurs microbiens et glycomiques qui sont associés à la réaction, la récupération ou la résilience face aux infections respiratoires et à l’administration d’antibiotiques. Ces biomarqueurs viendront compléter les stratégies conventionnelles telles que la vaccination, les mesures de biosécurité, une nutrition et une hygiène adéquates, le contrôle des vecteurs et les soins vétérinaires réguliers. Ensuite, nous évaluerons les biomarqueurs glycomiques tant in vitro qu’ex vivo, notamment en testant la capacité des virus à se lier aux glycanes et leur potentiel de transmission entre espèces, une donnée actuellement inexistante pour les pathogènes affectant le bétail. Enfin, l’analyse comportementale et l’utilisation de capteurs pour le suivi du bien-être animal pourraient mener à l’identification de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce des maladies. Au-delà de ces avancées, les biomarqueurs glycomiques et microbiens issus d’animaux résistants pourraient conduire au développement de glycanes à effet prébiotique et à la création de consortiums microbiens synthétiques (SynComs), qui seront expérimentés en tant que probiotiques de nouvelle génération.
Procédures
1/ co-infection expérimentale par voie nasale, à l'aide d'un masque : n = 14 veaux, une seule fois, durée : 8 à 12 minutes ; 2/ administration d'un antibiotique (tilmicosine) par voie orale : n = 14 veaux, 2 fois par jour pendant 4 jours soit 8 administrations au total, durée : 2 minutes maximum par administration ; 3/ prises de sang : n = 28 veaux, 8 prélèvements sanguins/veau, durée : 2 minutes maximum/prélèvement, 4/ écouvillonnages nasaux profonds : n = 28 veaux, 8 sessions/ veau avec, pour chaque session, 3 écouvillons dans chaque narine, durée : 3 minutes maximum/session ; 5/ écouvillonages rectaux : n = 28 veaux, 8 prélevements/veau, avec 2 écouvillons par veau, durée : 15 secondes//prélèvement ; 6/ lavages broncho-alvéolaires : n = 28 veaux, 8 prélèvements/veaux, durée : entre 5 et 10 minutes par prélèvement (en fonction de la acilité d’introduction de la sonde dans la trachée).
Impact sur les animaux
La co-infection IDV/BCoV/Mycoplasma bovis, peut provoquer des effets indésirables potentiels sur la santé et le bien-être des veaux : 1/ signes cliniques de maladie respiratoire : toux, écoulement nasal, augmentation de la fréquence respiratoire, difficultés à respirer, hyperthermie, baisse de l'apport alimentaire. 2/ Perte de poids : les veaux peuvent connaître une perte de poids en raison de la combinaison d'une diminution de l'apport alimentaire et des dépenses énergétiques liées à la lutte contre l'infection. 3/ Déshydratation : la fièvre et l'augmentation du rythme respiratoire peuvent contribuer à la déshydratation chez les veaux infectés. 4/ infections bactériennes secondaires (bronchopneumonie alvéolaire) consécutives à un affaiblissement du système immunitaire et aggravant les troubles respiratoires initiaux. 5/ Stress : la manipulation/contention et la collecte d'échantillons peuvent induire du stress chez les veaux. 6/ Changements comportementaux : les veaux infectés peuvent présenter des changements de comportement, tels qu'une activité réduite et des interactions sociales diminuées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par injection à la fin du projet., afin de réaliser des analyses post mortem sur leurs organes, dont les résultats viendront compléter les données obtenues de leur vivant.
Remplacement
Il n'existe pas de système in vitro capable de simuler fidèlement l’interaction complexe entre les pathogènes respiratoires, le microbiote et les mucines respiratoires. Les cultures in vitro ne permettent pas de reproduire les conditions nécessaires pour l’étude des virus, des mycoplasmes et de l’ensemble des microorganismes et mucines du système respiratoire.
Réduction
Un effectif de 7 veaux par lots expérimentaux assure la faisabilité de l’étude tout en permettant d’obtenir des données statistiques robustes pour observer un effet potentiel. Cette stratégie s’appuie sur les données d’une étude précédente, dans laquelle un modèle de coinfection IDV-M. bovis avait été utilisé sur de jeunes veaux. Malgré une variabilité individuelle notable dans la réponse clinique, un effectif de 5 animaux avait suffi à démontrer des différences significatives par rapport à des veaux témoins non infectés. Une ANOVA à un facteur a été utilisée pour comparer les moyennes des aires individuelles sous les scores cliniques quotidiens (ACS). Lorsque l’effet du facteur “traitement” était significatif, un test de Newman-Keuls a été utilisé pour comparer les effets des traitements à chaque point de temps. Un test t (test de Mann-Whitney) a également été effectué pour ces paramètres.De plus, les données virologiques et bactériologiques s'étaient révélées relativement homogènes entre les individus, offrant une corrélation directe avec la pathogénicité dans l’appareil respiratoire profond. Par sécurité, nous avons choisi d'inclure 2 veaux supplémentaires par lot afin de pallier d'éventuelles exclusions d'individus pour des raisons sanitaires (infections intercurrentes) ou éthiques (atteinte des points limites).
Raffinement
Les veaux seront logés dans un bâtiment divisé en quatre aires paillées, chacune accueillant 7 animaux et mesurant 60 m². L’environnement sera enrichi avec des jouets robustes et flexibles de différentes matières et couleurs, ainsi qu'avec des bidons et des cônes de chantier pour stimuler leur curiosité. Avant le début de la procédure expérimentale, ils bénéficieront d'une période d'acclimatation à leur nouvel environnement de 14 jours. Si l'un des veaux manifeste des signes de détresse ou d’inconfort lors de l'inoculation intranasale, la nébulisation sera immédiatement interrompue et l’animal sera réconforté puis surveillé jusqu'à récupération complète. Lors de la procédure, les prélèvements seront effectués par des personnes préalablement formées. A chaque point d'étape, les 3 types de prélèvement (prise de sang, écouvillons nasaux, écouvillons rectaux, lavages broncho-alvéolaires) seront réalisés à la suite, de manière à attraper et à contenir une seule fois les animaux. Les prises de sang seront effectuées en alternance à la veine jugulaire droite et à la veine jugulaire gauche, de manière à minimiser les risques de phlébite. Lors des lavages broncho-alvéolaires (LBA), un anesthésique local (lidocaïne) sera pulvérisé sur la muqueuse nasale (Xylocaine spray 10%, 50mL), 2 minutes avant introduction de la sonde dans le naseau et l'extrémité de celle-ci sera enduite d'une pommade anesthésique composée de lidocaïne et prilocaïne, agissant par diffsion et induisant una anesthesie de quelques millimètres (EMLA). Les animaux présentant des symptômes respiratoires marqués à sévères seront exemptés de LBA. Suite à l'infection expérimentale, le comportement et le bien-être des animaux seront évalués quotidiennement. Une surveillance sanitaire rigoureuse sera également assurée par un personnel qualifié : un vétérinaire évaluera l’état clinique de chaque animal deux fois par jour, mesurant la température rectale, la fréquence cardiaque et respiratoire, et notant tout comportement anormal tel que le refus de s’alimenter, l’agressivité, le retrait social ou l’abattement.
Choix des espèces
Le projet visant à étudier l'impact de l'interaction entre le microbiome respiratoire et le glycome sur la sensibilité des bovins aux infections, il est nécessaire d'utiliser un modèle bovin. Des veaux âgés de 15 à 30 jours seront sélectionnés pour notre étude. Ils seront infectés entre 30 et 45 jours, ce qui correspond à la période critique où les bronchopneumonies infectieuses se manifestent fréquemment dans les élevages bovins sous des conditions naturelles. L’âge de 22-30 jours est particulièrement significatif car il marque le début de la diminution de l’immunité maternelle colostrale, rendant les veaux plus susceptibles aux infections et donc un moment idéal pour étudier la réponse immunitaire face aux agents pathogènes. Cette fenêtre temporelle est donc stratégique pour reproduire les conditions d’apparition des maladies respiratoires et pour évaluer l’efficacité des interventions thérapeutiques.
Étude de la variabilité génétique et phénotypique au sein d’une colonie de ouistitis d’élevage.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Issus de deux colonies d'élevage internes, 50 ouistitis de plus d'un an vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, puis réintroduits dans leur groupe sans mise à mort prévue. Chacun est mis à jeun, capturé à la main, au filet ou par entrée conditionnée dans une boîte, puis anesthésié pour un prélèvement d'environ un millilitre de sang, une biopsie cutanée suturée et le prélèvement d'une quarantaine de poils. Suivent trente à quarante minutes d'examens oculaires, paupières maintenues ouvertes par un blépharostat, pupilles dilatées au collyre et lentilles posées sur chaque œil. La colonie compte aujourd'hui une trentaine d'individus, et le porteur indique que son expansion sur cinq ans permettra "de produire un nombre d'animaux compatible avec l'objectif d'échantillonnage fixé à 50".
Objectifs
Ce projet est un projet transversal réalisé dans deux EU qui hébergent chacun une colonie de ouistiti qui leur est propre. Les résultats seront mis en commun et analysés de façon globale. Ce projet a pour objectif d'étudier la variabilité génétique et phénotypique au sein de ces colonies. Cette variabilité au sein d’une espèce est un élément clé pour sa survie en milieu naturel. En captivité, les possibilités d’accouplement au sein d’une colonie sont limitées et le brassage avec des individus non apparentés (et donc suffisamment éloignés du point de vue génétique) n'est pas toujours possible. Au fils des années, des effets négatifs sur la fertilité et la santé (e.g. susceptibilité accrue aux infections) peuvent apparaitre et différentes études ont mis en évidence l'apparition de déficits chez des animaux hébergés en captivité. De même les conditions d’élevage peuvent influer sur la variabilité phénotypique (taille, poids, acuité visuelle..). Étudier la variabilité génétique et phénotypique au sein de colonies d'élevage est donc important pour mieux caractériser et contrôler génétiquement la diversité dans ces populations, raffiner la gestion et le bien-être des animaux et améliorer les études scientifiques futures. Pour atteindre les objectifs de ce projet, des prélèvements de sang et de poils ainsi que des biopsies cutanées seront effectuées chez tous les individus. En parallèle, des examens ophtalmologiques non-invasifs en imagerie multimodale permettant d'évaluer les caractéristiques anatomo-fonctionnelles de la rétine (mesure de la forme de l'oeil, de l'épaisseur de la choroïde, de la correction optique, du diamètre de la pupille, etc.) seront également réalisés.
Bénéfices attendus
Les données collectées dans le cadre de ce projet contribueront à caractériser la diversité génétique et phénotypique au sein de nos colonies de ouistitis. D'autre part, elles pourraient contribuer à affiner l'arbre décisionnel permettant de sélectionner les animaux qui seront mis en contact à des fins de reproduction. Enfin, la caractérisation phénotypique et fonctionnelle de l'oeil pourrait permettre la mise en place de mesures de raffinement complémentaires pour améliorer l’environnement des animaux.
Procédures
Conditionnement à la capture et à l’entrée volontaire dans une boite de capture. Mise à jeun des animaux (retrait de la nourriture et de l’eau respectivement 2h et 1h avant la capture et l’anesthésie). Capture des animaux (à la main/filet ou par entrée volontaire dans une boite de capture) et transport des animaux de leur espace d’hébergement vers la pièce d’anesthésie (au sein du même bâtiment). Anesthésie des animaux (protocole d’anesthésie gazeuse ou anesthésie fixe avec un relai en anesthésie gazeuse). Sous anesthésie, réalisation de différents prélèvements : un échantillon de sang total (environ 1 ml par animal), une biopsie cutanée de quelques millimètres de surface avec mise en place d’un point de suture (un échantillon par animal), et un prélèvement de poils (une quarantaine par animal). [Durée total de la phase de prélèvement des échantillons : environ 30 minutes]. Réalisation de mesures ophtalmologiques (dans le cadre de la même anesthésie que celle décrite précédemment lorsque ce sera possible) : application d’un collyre permettant une anesthésie locale de la cornée, mise en place d’un blépharostat pour maintenir chaque œil ouvert, application d’un collyre dans chaque œil pour induire une dilatation de la pupille, mise en place d’une lentille non corrigée sur chaque œil pour prévenir tout dessèchement de l’œil, puis réalisation d’une série de mesures non invasives sans contact direct avec les yeux. [Durée total de la phase de tests ophtalmologiques : environ 30-40 minutes]. Fin de l’anesthésie avec maintien de l’animal sur tapis chauffant et sous surveillance jusqu’au réveil. Retour de l’animal dans la zone de stabulation en boite de capture et ré-introduction de l’animal dans son groupe sous surveillance le jour de la session et le jour suivant.
Impact sur les animaux
Stress potentiel durant la phase de conditionnement et lié à la capture des animaux et à leur transport de la zone de stabulation vers la pièce de prélèvements/tests. Inconfort lié à l’anesthésie mise en place pour effectuer les prélèvements et les tests ophtalmologiques, complications potentielles au niveau local des suites de la biopsie cutanée (inflammation, infections), conséquences du prélèvement sanguin (hématome localisé), de la pause et du retrait du blepharostat utilisé pour maintenir les paupières ouvertes lors des examens ophtalmologiques, inconfort associée à l'instillation de collyre et à la pose de lentilles non corrigées sur la cornée au cours de l'anesthésie, stress potentiel lié au retour de l'animal dans le groupe.
Devenir
Le projet ne prévoit pas de mise à mort et tous les animaux seront maintenus en vie. A l'issue du projet les animaux seront ré-introduits dans leur groupe.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthodes in vitro permettant d’étudier les comportements sociaux et les effets de médicaments neurologiques/psychiatriques sur ces fonctions.
Réduction
Il s'agit ici de caractériser d'un point de vue phénotypique et génétique l'ensemble de notre colonie de ouistitis. Le principe de réduction est donc difficilement applicable dans ce contexte. La colonie de ouistitis actuellement hébergées compte une trentaine d'individus. L'expansion de cette colonie, durant la durée d'autorisation du projet de 5 ans, permettra de produire un nombre d'animaux compatible avec l'objectif d’échantillonnage fixé à 50 individus
Raffinement
Captures et manipulations représentent des stress importants. Les captures seront effectuées par les personnes régulièrement en contact avec les animaux (personnel de zootechnie ou en charge du suivi de la colonie). Si d'autres personnes devaient effectuer des captures, des visites seront préalablement organisées pour que les animaux s'y habituent. Deux protocoles pourront être utilisés pour la capture selon la tolérance des animaux au contact humain et le type d'hébergement dont ils seront issus : capture à la main/filet ou conditionnement à entrer dans une boite de transport. La seconde option sera privilégiée dès que possible et fera l’objet de séances d’habituation (entraînement à entrer dans la boite avec récompense (gomme arabique)). S’ils sont capturés à la main/filet, de la gomme arabique leur sera proposée immédiatement après capture lors de l'entrainement. Durant les transports un tissu opaque sera placé sur la boite pour limiter le stress. Si possible, les collectes d’échantillons et les mesures ophtalmologiques seront réalisées dans le cadre d’une anesthésie unique. Le protocole d'anesthésie utilisé permet de raccourcir les phases d’endormissement et de réveil et évite le stress associé à la contention et à l’administration. Pour ce faire, nous utiliserons une boite de capture spécifique, de faible volume et ajourée, qui sera placée dans une boite d’induction thermostatée. Une fois l’anesthésie induite, l’animal sera maintenu au masque sous anesthésie gazeuse pendant toute l’intervention. Lors des mesures ophtalmologiques, les animaux seront placés sur un coussin de contention. La réalisation des biopsies s’effectuera sous anesthésie avec analgésie locale préalable. Un petit échantillon de peau sera collecté et un traitement analgésique et anti-inflammatoire sera administré. La plaie, d’éventuelles irritations des yeux seront suivies jusqu’à la cicatrisation. Les interactions sociales seront monitorées attentivement dans les heures et les jours suivants l’intervention pour s’assurer qu’aucun conflit ne survienne ; dans le cas contraire une surveillance accrue sera mise en place.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs ont largement montré leurs limites quant à la modélisation des troubles psychiatriques. Le ouistiti, en raison de ses caractéristiques comportementales et sociales et de la présence de variations génétiques identifiées chez l’Homme en lien avec les pathologies psychiatriques, est un modèle de choix. Tous les individus de notre colonie de plus de 1 an seront étudiés. Cette limite d'âge a été fixée car, bien que dès la naissance les yeux aient quasiment atteints leur taille définitive chez tous les primates, au niveau fonctionnel (au niveau des aires visuelles supérieures notamment) il faut dépasser un an pour que les neurones figent la vision binoculaire, après ce laps de temps on peux considérer le système visuel comme entièrement développé.
Un complément en acides gras furanique peut-il prévenir ou ralentir la fonte musculaire observée dans le cadre de pathologies cancéreuses? EU2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Une greffe de cellules cancéreuses dans le pancréas, puis une cachexie qu'il faut laisser s'installer pour l'étudier : c'est ce que subissent les 220 souris du volet EU2/2 de ce protocole, 60 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 120 modéré et 40 sévère. Elles reçoivent le lipide testé par sonde de gavage, huilée pour faciliter l'introduction, et passent en RMN tous les deux jours. Le porteur ramène pourtant les nuisances attendues au stress des manipulations et à une irritation de l'œsophage, quand la fonte musculaire induite est l'objet même de l'étude. Toutes sont tuées en fin de procédure, muscles, sang, organes et tumeurs prélevés pour analyse.
Objectifs
Des études précliniques indiquent qu’un lipide spécifique augmente la masse musculaire. Ce lipide appartient à une famille de lipides synthétisés par des plantes et des bactéries, présents dans le poisson, les produits laitiers et les fruits et légumes. Nos études sur des cellules musculaires montrent que ces lipides stimulent la synthèse des protéines. De plus, nous avons mis en évidence, que l’ajout de ce lipide dans l’alimentation est suffisant pour induire une augmentation de la masse musculaire chez des souris normales ou chez des souris obèses. Ces résultats soulignent que ce lipide pourrait avoir des effets bénéfiques en prévenant ou en ralentissant le développement de fonte musculaire lors de cancers. L'objectif principal de ce projet de recherche est d'étudier si une supplémentation avec ce lipide est capable de contrer ou de ralentir l'apparition de la fonte musculaire dans 2 modèles animaux de cancers touchant le colon et le pancréas. Ce projet fait appel à l'expertise de deux établissements : le premier pour la l'induction des tumeurs chez les animaux, le second pour leur analyse métabolique et musculaire.
Bénéfices attendus
La preuve de concept que ce lipide peut diminuer la fonte musculaire dans le cadre de cancers chez l'animal est une étape indispensable avant d’envisager des essais cliniques chez l’Homme. En cas de résultats positifs, ces lipides seront destinés à devenir un complément ou additif alimentaire en santé humaine.
Procédures
Dans l'établissement EU 1/2 la moitié des animaux subiront une administration sous-cutanée unique (30 secondes, animaux vigiles), l'autre moitié subira une procédure chirurgicale (15 min, sur animaux anesthésiés avec injection préalable d'analgésique). Ensuite les animaux seront transportés (moins de 15 minutes en voiture) dans l'établissement EU 2/2 pour y être analysés comme décrit ci-dessous. Les lipides seront administrés par voie orale 5 jours sur 7 pendant 2 à 3 semaines selon les lots d’animaux. L'administration orale prend moins d'1 minute par souris. Une pesée des animaux et une mesure de la composition corporelle seront réalisées tous les 2 jours à l'aide d'un appareil RMN (Résonnance magnétique) qui permet d’obtenir le taux de masse maigre (muscle), de masse grasse et d'eau dans le corps de la souris. Ces mesures prennent 2 minutes par souris et sont réalisées sur des animaux vigiles pendant la durée des procédures (1 semaine, 3 semaines ou 4 à 5 semaines).
Impact sur les animaux
La nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera principalement liée à la greffe, au développement de tumeurs et à l’induction de la fonte musculaire (cachexie). Les animaux pourront ressentir du stress et avoir une irritation de l’œsophage liée à l’administration orale (5j/7, de 1 à 3 semaines selon les lots), et du stress lors des mesures du poids des animaux et de la mesure de la composition corporelle (tous les deux jours pendant 3 semaines).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure. Les muscles, le sang, les organes et les tumeurs seront prélevés pour plus d'analyses.
Remplacement
Notre projet porte sur le syndrome de cachexie qui se définit comme une perte accélérée de muscle et de gras, provoquée par une diminution des apports nutritionnels, des changements énergétiques et métaboliques. Préalablement aux études que nous proposons, nous avons démontré in vitro que les acides gras furaniques (FuFAs) avaient un effet non seulement sur des cellules musculaires saines en culture mais aussi sur organisme entier (souris saines ou obèses), en impactant la régulation du métabolisme. Afin d’envisager l’utilisation chez l’Homme des FuFAs en tant que complément ou additif alimentaire pour prévenir ou ralentir le développement de la sarcopénie, nous souhaitons à présent étudier ces molécules dans un modèle murin de cachexie cancéreuse. En effet, ce syndrome ne peut être étudié et de nouvelles thérapies évaluées que dans le contexte d’un organisme suffisamment complexe, tel que celui du rongeur en première intention.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel pour calculer le nombre d'animaux minimal néccessaire pour avoir des résultats statistiques fiables. Notre projet sera réalisé en 3 étapes. Si la première étape n'est pas concluante, nous ne réaliserons pas les deux autres. Le nombre d'animaux utilisé sera donc uniquement de 80 au lieu des 220 prévus.
Raffinement
Pour l'implantation des cellules cancéreuses dans le pancréas, les animaux seront anesthésiés et sous analgésique pendant et après la chirurgie. Pour le transport de courte durée (inférieure à 15 minutes), les animaux seront placés au dernier moment, en groupes, dans des boites de transport avec litière, nourriture, enrichissement de la cage d'origine. La boite sera ensuite placée dans un suremballage afin de limiter le mouvement pendant le transport. Les véhicules utilisés seront climatisés ou chauffés en fonction de la température extérieure. Dès leur arrivée dans l'EU 273 les souris seront mises en cages traditionnelles. Elles seront hébergées par 2 jusqu'à la fin de l’étude dans des cages avec une roue d’activité leur permettant d'avoir une activité spontanée, avec pour enrichissement des copeaux et un tunnel en plexiglass rouge. Le tunnel sert à la fois au déplacement des animaux et à l’habituation pour le test de composition corporelle. Pour l’administration orale, la sonde de gavage sera enduite d’huile végétale pour faciliter l’introduction. Nous utiliserons une grille de suivi de l'état de santé des animaux et appliquerons les décisions définies préalablement pour soulager la souffrance des animaux. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les modèles de greffe de cellules cancéreuses sur souris que nous avons choisi sont couramment utilisés pour induire une perte de poids et fonte musculaire (cachéxie) similaire à celle observée dans le cadre des cancers du colon ou pancréas. Ce sont donc de bons modèles pour tester les nouvelles thérapies. Les souris étudiées seront des souris jeunes adultes de 10 semaines ayant atteint un poids suffisant, qui permet d'observer une phase de cachéxie sans atteindre les points limites de perte de poids trop rapidement. Elles seront suivies entre 4 et 6 semaines.
Un complément en acides gras furanique peut-il prévenir ou ralentir la fonte musculaire observée dans le cadre de pathologies cancéreuses? EU1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Un gavage cinq jours sur sept pendant deux à trois semaines, une pesée et un passage en RMN tous les deux jours : 220 souris porteuses de tumeurs du côlon ou du pancréas vont être utilisées, 60 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 120 modéré et 40 sévère. Toutes sont tuées, muscles, sang, organes et tumeurs prélevés. Il s'agit de tester si un acide gras furanique ralentit la fonte musculaire provoquée par le cancer, le porteur présentant cette preuve de concept chez la souris comme une étape "indispensable" avant des essais chez l'être humain. Le choix du modèle repose sur des greffes de cellules cancéreuses réputées induire une cachexie comparable à celle des patients, chez des souris de dix semaines suivies quatre à six semaines.
Objectifs
Des études précliniques indiquent qu’un lipide spécifique augmente la masse musculaire. Ce lipide appartient à une famille de lipides synthétisés par des plantes et des bactéries, présents dans le poisson, les produits laitiers et les fruits et légumes. Nos études sur des cellules musculaires montrent que ces lipides stimulent la synthèse des protéines. De plus, nous avons mis en évidence, que l’ajout de ce lipide dans l’alimentation est suffisant pour induire une augmentation de la masse musculaire chez des souris normales ou chez des souris obèses. Ces résultats soulignent que ce lipide pourrait avoir des effets bénéfiques en prévenant ou en ralentissant le développement de fonte musculaire lors de cancers. L'objectif principal de ce projet de recherche est d'étudier si une supplémentation avec ce lipide est capable de contrer ou de ralentir l'apparition de la fonte musculaire dans 2 modèles animaux de cancers touchant le colon et le pancréas. Ce projet fait appel à l'expertise de deux établissements : le premier pour l'induction des tumeurs chez les animaux, le second pour leur analyse métabolique et musculaire.
Bénéfices attendus
La preuve de concept que ce lipide peut diminuer la fonte musculaire dans le cadre de cancers chez l'animal est une étape indispensable avant d’envisager des essais cliniques chez l’Homme. En cas de résultats positifs, ces lipides seront destinés à devenir un complément ou additif alimentaire en santé humaine.
Procédures
Dans l'établissement EU 1/2 la moitié des animaux subiront une administration sous-cutanée unique (30 secondes, animaux vigiles), l'autre moitié subira une procédure chirurgicale (15 min, sur animaux anesthésiés avec injection préalable d'analgésique). Ensuite les animaux seront transportés (moins de 15 minutes en voiture) dans l'établissement EU 2/2 pour y être analysés comme décrit ci-dessous. Les lipides seront administrés par voie orale 5 jours sur 7 pendant 2 à 3 semaines selon les lots d’animaux. L'administration orale prend moins d'1 minute par souris. Une pesée des animaux et une mesure de la composition corporelle seront réalisées tous les 2 jours à l'aide d'un appareil RMN (Résonnance magnétique) qui permet d’obtenir le taux de masse maigre (muscle), de masse grasse et d'eau dans le corps de la souris. Ces mesures prennent 2 minutes par souris et sont réalisées sur des animaux vigiles pendant la durée des procédures (1 semaine, 3 semaines ou 4 à 5 semaines).
Impact sur les animaux
La nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera principalement liée à la greffe, au développement de tumeurs et à l’induction de la fonte musculaire (cachexie). Les animaux pourront ressentir du stress et avoir une irritation de l’œsophage liée à l’administration orale (5j/7, de 1 à 3 semaines selon les lots), et du stress lors des mesures du poids des animaux et de la mesure de la composition corporelle (tous les deux jours pendant 3 semaines).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure. Les muscles, le sang, les organes et les tumeurs seront prélevés pour plus d'analyses.
Remplacement
Notre projet porte sur le syndrome de cachexie qui se définit comme une perte accélérée de muscle et de gras, provoquée par une diminution des apports nutritionnels, des changements énergétiques et métaboliques. Préalablement aux études que nous proposons, nous avons démontré in vitro que les acides gras furaniques (FuFAs) avaient un effet non seulement sur des cellules musculaires saines en culture mais aussi sur organisme entier (souris saines ou obèses), en impactant la régulation du métabolisme. Afin d’envisager l’utilisation chez l’Homme des FuFAs en tant que complément ou additif alimentaire pour prévenir ou ralentir le développement de la sarcopénie, nous souhaitons à présent étudier ces molécules dans un modèle murin de cachexie cancéreuse. En effet, ce syndrome ne peut être étudié et de nouvelles thérapies évaluées que dans le contexte d’un organisme suffisamment complexe, tel que celui du rongeur en première intention.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel pour calculer le nombre d'animaux minimal néccessaire pour avoir des résultats statistiques fiables. Notre projet sera réalisé en 3 étapes. Si la première étape n'est pas concluante, nous ne réaliserons pas les deux autres. Le nombre d'animaux utilisé sera donc uniquement de 80 au lieu des 220 prévus.
Raffinement
Pour l'implantation des cellules cancéreuses dans le pancréas, les animaux seront anesthésiés et sous analgésique pendant et après la chirurgie. Pour le transport de courte durée (inférieure à 15 minutes), les animaux seront placés au dernier moment, en groupes, dans des boites de transport avec litière, nourriture, enrichissement de la cage d'origine. La boite sera ensuite placée dans un suremballage afin de limiter le mouvement pendant le transport. Les véhicules utilisés seront climatisés ou chauffés en fonction de la température extérieure. Dès leur arrivée, les souris seront mises en cage traditionnelle. Elles seront hébergées par 2 jusqu'à la fin de l’étude dans des cages avec une roue d’activité leur permettant d'avoir une activité spontanée, avec pour enrichissement des copeaux et un tunnel en plexiglass rouge. Le tunnel sert à la fois au déplacement des animaux et à l’habituation pour le test de composition corporelle. Pour l’administration orale, la sonde de gavage sera enduite d’huile végétale pour faciliter l’introduction. Nous utiliserons une grille de suivi de l'état de santé des animaux et appliquerons les décisions définies préalablement pour soulager la souffrance des animaux. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les modèles de greffe de cellules cancéreuses sur souris que nous avons choisi sont couramment utilisés pour induire une perte de poids et fonte musculaire (cachéxie) similaire à celle observée dans le cadre des cancers du colon ou pancréas. Ce sont donc de bons modèles pour tester les nouvelles thérapies. Les souris étudiées seront des souris jeunes adultes de 10 semaines ayant atteint un poids suffisant, qui permet d'observer une phase de cachéxie sans atteindre les points limites de perte de poids trop rapidement. Elles seront suivies entre 4 et 6 semaines.
Caractérisation d’un nouveau modèle murin de cardiomyopathie arythmogène d’origine génétique EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tués parce que leur génotype les exclut du projet ou parce qu'ils sont produits en surnombre, les reproducteurs et les hétérozygotes excédentaires rejoignent les animaux mis à mort après la procédure chirurgicale finale, cœur prélevé. 640 souris au maximum sont concernées, 310 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 330 d'un niveau modéré. Elles subissent une biopsie de génotypage, un transfert vers un second établissement, jusqu'à quatre électrocardiogrammes et quatre échocardiographies, trois stimulations transœsophagiennes sous anesthésie, puis une stimulation intracardiaque terminale de 40 minutes sans réveil. Le porteur justifie le recours à la souris par le fait que la mutation d'intérêt a été introduite chez cette espèce et que son système cardiovasculaire est proche de celui de l'être humain.
Objectifs
Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs. Le projet s’insère dans un contexte de recherche qui a pour but de comprendre les mécanismes à l’origine de pathologies cardiovasculaires afin de pouvoir envisager de nouveaux traitements. Pour cela l’effet de diverses substances ou de protéines mutantes introduites chez des souris normales est étudié et leurs conséquences physiologiques chez l’animal sont mesurées. Ces expériences nécessitent un suivi phénotypique. L’objectif du projet est la caractérisation fonctionnelle d’une mutation humaine homozygote dans un gène qui vient d'être découvert comme responsable d'une nouvelle forme de cardiomyopathie arythmogène récessive associant des troubles du rythme atriaux et ventriculaires, pouvant conduire à des syncopes et à une mort subite. Le but de ce projet est donc de comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans les régulations auxquelles participe cette protéine. Ces connaissances seront facilitées en utilisant un modèle in vivo qui garantit la présence des molécules partenaires dans un contexte physiologique.
Bénéfices attendus
L'étude de ce modèle murin nous permettra de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie liée à des troubles du rythme cardiaque atrial et ventriculaire, et de déterminer si les souris développent ou non une cardiopathie associée. A plus long terme, des stratégies thérapeutiques pourront être testées sur ce modèle car ces arythmies peuvent être mortelles chez l'Homme et nous ne disposons pas de traitements efficaces. Du point de vue de l’incidence, c’est certainement une maladie rare, en particulier en Europe où il y a peu de familles consanguines. Quand les résultats de nos recherches seront publiés, d’autres études viendront conforter et compléter nos premiers résultats. Il est probable que des mutations fondatrices existent dans certaines régions du monde, transmises de génération en génération et que seuls les patients homozygotes par descendance soient atteints avec une incidence locale plus élevée et un réel besoin de traitements pour prévenir le développement d'arythmies ventriculaires possiblement léthales.
Procédures
Une biopsie sera réalisée pour génotypage (animal vigile, 1 fois, 1 minute, EU1). Les animaux seront transférés de l’établissement d’élevage vers l’établissement secondaire où seront effectuées les différentes explorations (EU2). Les enregistrements électrocardiographiques avec le système Tunnel sont effectués sur animal vigiles qui sont juste placés dans un tunnel, avec chaque patte positionnée sur une plaque, ce qui permet l’enregistrement de l’électrocardiogramme (4 fois au maximum, 5 min, EU2). L’échocardiographie est enregistrée sur animal anesthésié très légèrement afin de juste les maintenir immobiles. C’est une procédure non invasive et non douloureuse. Les animaux se réveillent juste après l’arrêt de l’anesthésie (4 fois au maximum, 30 min, EU2). Les animaux seront également soumis à une stimulation transoesophagienne pour mettre en évidence et analyser une éventuelle susceptibilité à déclencher une fibrillation atriale (sous anesthésie et analgésie, 3 fois au maximum, 30 min, EU2). Le protocole de stimulation intracardiaque ne sera fait qu’une seule fois (acte unique, sous anesthésie et analgésie, durée 40 min, EU2), car c’est une procédure terminale, sans réveil, avant euthanasie. Les souris subissent cette procédure chirurgicale afin d’évaluer la susceptibilité des modèles murins aux arythmies ventriculaires.
Impact sur les animaux
Les nuisances découlant des procédures sont 1) l’utilisation de lignées transgéniques qui nécessite l’identification génétique des souris réalisée par une biopsie, ce qui peut être une cause de stress et de douleur légère de courte durée, 2) ce projet consiste à phénotyper une nouvelle lignée murine, le phénotype dommageable des animaux pourrait entrainer des troubles du rythme cardiaque pouvant provoquer le décès dans les cas les plus graves, 3) le stress lié au transport des animaux de l'animalerie d'élevage à l'animalerie d'expérimentation, 4) le stress lié aux diverses manipulations pour les administrations ou durant le suivi, 5) douleur légère de courte durée au point d'injection, 6) lors de certains actes sous anesthésie gazeuse, une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire.
Devenir
Tous les reproducteurs en fin de période de reproduction ou exclus du fait de leur génotype ne pouvant être inclus dans le projet, ainsi que les hétérozygotes générés en surplus seront euthanasiés. Tous les animaux transférés pour l'expérimentation seront euthanasiés à la fin de la procédure chirurgicale et les cœurs seront prélevés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Les maladies cardiaques d’origine génétique sont difficiles à modéliser dans des systèmes ex vivo ou en culture cellulaire. Les cardiomyocytes sont des cellules qui n’existent pas en lignées. Nous disposons de protocoles d’établissement de cardiomyocytes issus d’iPS (des cellules pluripotentes capables de donner tous les types cellulaires de l’organisme) et utilisons également ce modèle, mais ils présentent des inconvénients comme une immaturité, une variabilité liée des différenciations plus ou moins complètes, et la présence de plusieurs types cellulaires. Ces cellules ne permettent pas de remplacer le recours aux animaux en particulier pour les analyses physiopathologiques nécessitant l’intégration de signaux neuro-humoraux et mécaniques comme pour les pathologies cardiaques.
Réduction
640 animaux au maximum seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Une étude pilote sera effectuée afin de définir précisément les âges optimaux pour réaliser les analyses. A la fin des études expérimentales, des organes seront prélevés sur tous les animaux afin de maximiser les informations analysables. Un isolement et une étude des cardiomyocytes isolés seront également réalisés. Ce modèle cellulaire ex vivo permettra de tester l’effet de composés pharmacologiques pour tenter de corriger des anomalies à l’origine des dysfonctionnements cardiaques, plutôt que de tester directement in vivo l’effet de ces composés afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. En élevage, une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Le transport entre les deux EU est réalisé sans changement de cage pour limiter le stress des animaux. Les cages sont délicatement placées dans un sac kraft et sur un chariot. Le transfert est réalisé par un tunnel sous terrain sans passage par l'extérieur. La durée du trajet est de 5 minutes. Le projet a également été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie...) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris pour les raisons générales suivantes : 1) la mutation d'intérêt a été introduite chez cette espèce 2) le développement et la physiologie sont bien connus. 3) le fonctionnement du système cardiovasculaire est proche de celui de l’Homme (échocardiographie, ECG). 4) de nombreux modèles physiopathologiques sont disponibles et caractérisés. Les animaux seront utilisés entre 7 et 14 jours de vie pour réaliser une biopsie, entre 2 et 6 mois pour la reproduction et entre 15 jours et 8 mois de vie pour le suivi (poids, fonction cardiaque)
Formation et maintien des compétences aux procédures et techniques d’administration et de prélèvement chez la souris
- Formation professionnelle
Pour entraîner techniciens, étudiants et chercheurs aux gestes de prélèvement et d'administration, 6 170 souris vont être utilisées sur cinq ans, 5 270 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 900 d'un niveau modéré. Toutes sont tuées une fois les trois gestes réglementaires atteints, le porteur estimant que leur hétérogénéité d'âge, de lignée et de sexe rend toute réutilisation impossible. Ces souris proviennent pour l'essentiel d'autres projets, et chacune subit prélèvements sanguins par différentes voies, gavages ou injections, avec une semaine de repos entre deux gestes. Le test de tolérance à l'insuline peut provoquer une hypoglycémie surveillée plusieurs heures, corrigée par une injection de glucose si la glycémie descend sous un seuil fixé.
Objectifs
La règlementation en vigueur concernant la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (Décret n° 2013-118 du 1er février 2013) et relative à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques (Arrêté du 1er février 2013), requiert que le personnel soit compétent. A ces fins, les techniciens de notre institut suivent les formations théoriques obligatoires. En complément de l’aspect théorique, nous devons assurer la compétence des nouveaux arrivants ainsi que le maintien des compétences du personnel avec une formation « pratique » d’administration et de prélèvements sanguins, techniques que nous maitrisons et pratiquons en routine dans nos animaleries. Cette formation continue permet ainsi aux techniciens, étudiants et chercheurs de mener les projets de l’institut dans les meilleures conditions pour les animaux. L’ensemble de nos projets se déroulant sur des animaux vivants, il est impossible de proposer ces formations autrement qu’en utilisant la souris pour modèle. Afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées, les animaux servant à cette formation proviendront seront des animaux de réforme. La règlementation imposant un maximum de 3 procédures par animal, le nombre d’animaux nécessaire pour une année de formation sera de 1234, donc sur l’ensemble du projet (5 ans) 6170 souris. Les procédures sont réalisées sous la supervision d’un tuteur, les animaux sont surveillés durant toute la durée de la formation. Toute procédure potentiellement stressante ou douloureuse sera réalisée sous anesthésie générale avec couverture analgésique afin de préserver au maximum le bien-être animal. Par ailleurs, les animaux seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bon été général.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mettre en place et maintenir les compétences du personnel réalisant les gestes techniques sur animaux, employés durant les protocoles expérimentaux dans notre établissement. Le bénéfice est lié à la parfaite réalisation de tous les projets réalisés sur notre plateforme afin de garantir un raffinement de nos procédure avec des gestes réalisés avec le minimum de stress pour l'animal et une réduction potentielle du nombre d'animaux utilisés dans les autres projets, en lien avec une plus faible variabilité dans les gestes.
Procédures
Les animaux seront soumis à un maximum de trois gestes : des prélevements sanguins réalisés par différentes voies, des gavages ou des injections seront pratiqués. Ces gestes durent quelques minutes et n'affectent pas le bien-être des animaux plus d'une heure. Certaines procédures peuvent durer plus longtemps, tels que le test de sensibilité qui peut affecter l'état des animaux durant plusieurs heures du fait d'une possible hypoglycémie.
Impact sur les animaux
Parmi les nuisances attendues, des contentions pour les prélevements sanguins ou les gavages seront pratiquées. Le test de sensibilité à l'insuline qui peut entraîner une hypoglycémie passagère, qui sera surveillée durant plusieurs heures afin de s'assurer que les animaux se portent bien suite à cette procédure. Pour réduire l'inconfort des animaux, ceux-ci auront une semaine de repos entre chacune des procédures et un maximum de trois procédures par animal sera pratiqué. Cela nous semble un bon compromis entre réduction et raffinement.
Devenir
Une fois que les animaux ont subi 3 gestes de formation, ils seront mis à mort. Les animaux utilisés sont d'âge, de lignée et de sexe différents. Cette hétérogénéité rend leur réutilisation impossible. En effet, ces animaux rendraient les potentiels groupes expérimentaux dans lesquels ils seraient ajoutés non homogènes. De plus, on ne peut écarter totalement l’hypothèse que les procédures déjà subies par ces animaux n'induiraient pas un biais pour un autre projet.
Remplacement
L’ensemble de nos projets se déroulant sur animaux vivants, il ne nous est pas possible de réaliser des formations apportant une compétence complète autrement que chez la souris. En effet, il existe des souris factices sur lesquelles on peut s’entrainer aux différents prélèvements et administrations. Parmi les gestes pouvant être pratiqués sur ces modèles: Manipulation et contention, les prélèvements sanguins, l'administration intraveineuse et l'administration orale. Néanmoins, ces modèles sont parfaits pour les personnes devant apprendre le geste dans les premières étapes, mais cela ne permet pas de finaliser la compétence sur animaux vivants qui est requise pour effectuer de manière efficace les expériences. L'absence de pelage, de tonus musculaire et de contraction sont en effet des élements facilitant l'apprentissage mais en décalage avec la réalité expérimentale. Pour les personnes n'ayant jamais manipulé d'animaux, c'est une première étape qui sera mise en place autant que possible pour éviter l'utilisation d'animaux pour apprendre la méthodologie de chaque geste avant une formation aboutie pour devenir compétent
Réduction
Nous avons établis les effectifs nécessaires pour la réalisation de ce projet, selon le nombre de personnels à former durant une année. Ainsi, cela inclut la formation des étudiants, des chercheurs qui arrivent dans notre animalerie, mais aussi le maintien des compétences pour le personnel. Les effectifs indiqués sont à considérer comme des maximum théoriques qui ne seront vraisemblablement jamais atteints. Nous souhaitons pouvoir assurer une formation efficace de toutes les personnes amenées à travailler sur des animaux, mais tous les efforts seront entrepris pour réduire autant que possible le nombre d'animaux employés. Dans le cadre de formation ou de maintien de compétences, aucun résultat scientifique n’est attendu ainsi aucune approche statistique n’est utilisée.
Raffinement
Tous les gestes techniques enseignés sont d’abord expliqués et font l’objet d’une démonstration par le tuteur/formateur. Le personnel réalise ensuite toujours ces formations sous la surveillance de ce tuteur qui est compétent et dont la présence permet de s’assurer du respect de l’animal et d’éviter au maximum toute souffrance ou stress. L’état général des animaux utilisés est toujours surveillé durant la réalisation du geste technique et dans les heures et/ou jours qui suivent. Les sites d’injections sont surveillés, si une inflammation ou des signes de douleur sont détectés, l’animal serait pris en charge. Les procédures les plus stressantes et susceptibles de provoquer une douleur sont faites sous anesthésie générale avec couverture analgésique adéquate, comme la prise de sang au sinus infra-orbitaire ou l’installation intra-nasale. Pour le gavage, si une détresse respiratoire (signe d’une fausse route) est observée au moment de la réalisation du geste, le tuteur prendra en charge immédiatement l’animal. Dans le cas du test de tolérance à l’insuline, si le taux de glycémie descend sous une certaine valeur, l’animal recevra immédiatement une injection de glucose et sera placé sur plaque chauffante.
Choix des espèces
Notre institut travaille actuellement quasi en exclusivité avec la souris pour ses projets. Il est donc logique que la formation du personnel se fasse sur la même espèce. Les animaux seront adultes car pour la majorité issus d’autres projets d’une part et d’autre part parce que les projets de notre institut se font sur adulte et le personnel doit donc se former à ce stade.
Étude des propriétés nucléaire dans la physiologie du muscle squelettique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris utilisées portent une invalidation génétique conditionnelle d'un gène musculaire, activée par cinq administrations orales de tamoxifène. Elles sont 420, dont 84 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 168 modéré et 168 sévère, toutes tuées à l'issue. 168 reçoivent une injection de cardiotoxine qui détruit le muscle de la patte, et toutes passent une épreuve de course d'environ une heure trente d'endurance ainsi qu'une mesure de force par électrostimulation sous anesthésie. Le cumul de l'électrostimulation et de la course peut induire un stress et de la douleur, reconnaît le porteur, et la mise à mort sert à prélever les muscles pour des analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.
Objectifs
Près de la moitié de la masse du corps humain est composé de muscles striés squelettiques. Ceux-ci sont composés de milliers de cellules géantes (les fibres musculaires), pouvant atteindre des 10aines de centimètre de long. Nos travaux ont montré que l’intégrité fonctionnelle des fibres musculaires est contrôlée par le positionnement des noyaux le long de la fibre. Les travaux de notre équipe ont permis l’identification d’une protéine impliquée dans le positionnement des noyaux dans les fibres musculaires formées in vitro. Notre étude cherchera à quantifier l’impact de l’absence de cette protéine dans les fibres musculaires sur (1) la fonctionnalité musculaire et (2) au cours de la régénération musculaire chez des souris jeunes et âgées grâce à un modèle de souris invalidé pour notre gène d’intérêt spécifiquement dans les fibres musculaires. A terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels la mécano-transduction nucléaire contrôle la physiologie du tissu musculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise la compréhension du contrôle de la fonctionnalité du muscle squelettique dependant d'une protéine nucléaire, qui conditionne les performances musculaires. Les résultats qui découleront de ce projet nous permettront de comprendre le rôle de notre protéine d'interêt dans le tissu musculaire mais également lors de la régénération musculaire. A terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels le noyau contrôle la physiologie du tissu musculaire et d’identifier ainsi une nouvelle cible thérapeutique dans les maladies musculaires associées.
Procédures
- une injection intramusculaire dans le muscle releveur de la patte sera réalisée sur certains animaux (168/420). Elle dure moins de 5 secondes et sera réalisée sur animaux anesthésiés. Deux injections d’analgésique (anti-douleur) seront également réalisées avant et après la lésion musculaire. - administration par voie oral de souris avec un mélange d'huile de maïs contenant du tamoxifène ; il dure moins de 20 secondes et est répété 5 fois (108/420). - Épreuves de course, 1 fois dans leur vie. L’habituation dure de 10 min à 15 min au fil des 4 jours ; la mesure de la vitesse maximale aérobie environ 30 min, l’endurance environ 1h30 (toutes les souris). - Mesure de force musculaire par stimulation musculaire sous anesthésie générale, 1 fois dans leur vie : chaque intervention durera au maximum 30 minutes. Deux injections d’analgésique (anti-douleur) seront également réalisées avant et après mesure de force (toutes les souris).
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé n’ont pas montré de problèmes détectables sur le comportement, l’activité et ou la prise de poids des souris. L’administration de tamoxifène dans les souris par voie oral pourra causer une douleur légère et brève aux animaux. Aucune faiblesse musculaire, reflétée par des problèmes de locomotion ou activité ne sont observables suite à cette procédure. L’injection de cardiotoxine dans le Tibialis Anterior entraine la destruction du tissu musculaire. Suite à cette injection, le processus de régénération musculaire va se mettre en place instantanément après la blessure et entrainer une régénération complète du muscle en moins de 7 jours. L’injection étant localisée sur un seul des muscles composant la patte, les conséquences fonctionnelles sur la locomotion de la souris sont limitées et ne sont présentes que pendant les premières 24h. En effet, après le réveil, les souris circulent normalement dans la cage. Certaines présentent parfois une rétractation des pattes traitées, qui disparaît en quelques heures, sans modification de la mobilité ni signe de souffrance. Dans tous les cas elles accèdent à la nourriture et à la boisson sans difficulté apparente. Les animaux sont surveillés quotidiennement. En cas de toute anomalie visible locale (gonflement anormal de la patte, infection au niveau du point d’injection, non utilisation de la patte, hémorragie visible) ou générale (prostration de l'animal, démangeaison, lésion, poil hirsute etc..), de mobilité réduite ou d'inconfort visible, l'animal est mis à mort. Des nuisances modérées sont attendues du fait d’un cumul d’actes (électrostimulation et course sur tapis) qui peuvent induire un stress et de la douleur chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.
Remplacement
Des études in vitro à partir de cellules primaires murines permettant la formation de myotubes et de myofibres ont été réalisées en présence ou en absence de notre protéine d'interêt. Cette méthode nous a permis de mettre en évidence ses premiers rôles dans la formation des fibres et l’homéostasie musculaire. Il est désormais nécessaire d’utiliser un nouveau modèle murin in vivo afin de confirmer nos résultats précédents. En effet, l’homéostasie musculaire regroupe plusieurs mécanismes complexes d’interaction entre différents acteurs que nous ne pouvons reproduire dans notre système de culture de cellules primaires in vitro précédemment utilisé. De plus, la régénération musculaire repose sur un ensemble d’interactions complexes entre les tissus lésés, le système immunitaire et vasculaire ainsi que sur la coordination efficace de nombreux types cellulaires.
Réduction
Grâce à nos connaissances accumulées sur les tests d’effort chez les souris et les études ex vivo réalisées, nous pourrons optimiser le nombre de lots et le nombre d’animaux par lot pour les réduire autant que possible, tout en gardant des effectifs permettant d’atteindre une pertinence statistique. La taille de l’échantillon (7 souris pour chaque analyse et 12 pour les tests fonctionnel (course, force) a été déterminée par des outils d' analyses statistiques. Pour la mesure de force, nous utilisons un dispositif expérimental utilisable in vivo qui permet de réaliser des protocoles de mesure de force musculaire de manière longitudinale sur les mêmes animaux sur l’ensemble du protocole (force, course, force). Cette innovation réduit également la variabilité expérimentale inter-animale.
Raffinement
Avant le début de chacune des procédures, les animaux suivront une période d’acclimatation à leur environnement d’au moins 1 semaine, nécessaire à l’adaptation de leur comportement et à la réduction du stress. La procédure 2 consiste en une injection intramusculaire simple. C’est la procédure la moins invasive et douloureuse pour étudier la régénération musculaire, ne nécessitant aucune chirurgie. Un analgésique sera administré aux animaux avant le début de cette procédure et l’injection de cardiotoxine sera réalisée sous anesthésie dans le but de réduire au maximum un état de stress et de souffrance chez les animaux. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition : coton et cabanes. Comme la locomotion des animaux sera limitée pendant les premières 24h, des croquettes mouillées seront ajoutées au sein des cages pour leur permettre une alimentation et hydratation constante. De l’eau en gel sera également ajoutée au sein des cages. L’analgésie sera poursuivie les jours suivants autant que de besoin. Une analgésie avant et après le test de mesure de force musculaire sera également effectuée. Enfin, pour chaque procédure, des points limites ont éte établis, prenant en compte des critères refletant la souffrance des animaux et permettant ainsi de mettre fin précocément à la procédure.
Choix des espèces
La composition et le fonctionnement du tissu musculaire murin est proche de celui de l’être humain, faisant du modèle murin un modèle pertinent pour l’analyse de gènes impliqués dans l’homéostasie cellulaire. De plus, les modèles transgéniques proposés dans cette étude sont conditionnels et l’un d’eux est inductible, permettant la délétion de notre gène d’intérêt dans un type cellulaire spécifique et à un moment voulu. Des souris jeunes, âgées de 8 à 12 semaines (2 mois) et de 12 mois seront utilisées. Entre 8 et 12 semaines, les souris ont fini leur croissance et atteignent l’âge adulte dit « mature », ce qui permet d’observer la régénération et les performances physiques dans un contexte de muscle squelettique adulte jeune. Un deuxième temps à 12 mois est utilisé car nos données montrent qu’après 12 mois, une nouvelle voie de signalisation contrôle le fonctionnement musculaire en lien avec le postionnement nucléaire.