Procédures légères

Tuées d'abord pour n'avoir pas le bon génotype, tuées ensuite à la fin de chaque procédure pour que leurs organes soient prélevés, 1 920 souris vont être utilisées, 1 440 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 480 au niveau modéré. Le bout de leur queue est coupé aux ciseaux pour le génotypage, une partie d'entre elles est rendue obèse et diabétique par trois mois de régime gras et sucré, et sept prélèvements de sang sont faits à la queue. Certaines sont opérées quarante-cinq minutes pour la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire, puis soumises à un test de deux heures avec quinze mesures de glycémie et huit prises de sang, d'autres isolées cinq jours en cage de mesure, d'autres perfusées au paraformaldéhyde par le cœur. Le porteur justifie ses effectifs par des lots de douze souris par condition, sans expliquer comment ces lots conduisent à 1 920 animaux.

Objectifs

L'obésité entraîne une inflammation au niveau du cerveau qui perturbe son fonctionnement et modifie le comportement alimentaire des patients obèses. Ainsi ils sont moins sensibles à la satiété et ont tendance à manger plus qu'ils ne devraient. Nous étudions une protéine anti-oxydante qui agit au niveau de l'hypothalamus (une zone précise du cerveau, qui régule le comportement alimentaire) mais aussi sur d'autres organes comme le pancréas ou le foie . Cette protéine a la particularité de protéger contre l'inflammation due à l'obésité. Pour étudier cette protéine nous utiliserons un modèle animal, la souris, elle sera génétiquement modifiée et ne produira plus cette protéine anti-oxydante au niveau de l'hypothalamus. Les animaux seront nourris avec un régime alimentaire gras et sucré, afin de les rendre obèses et diabétiques, puis ils passeront plusieurs tests durant lesquels nous mesurerons la quantité de nourriture qu'ils mangent et leur activité physique. Enfin nous mettrons à mort les animaux pour prélever leurs organes et les étudier.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre la mise au point d'un nouveau traitement contre l'obésité et le diabète de type 2, qui connaissent une progression significative depuis 30 ans de sorte que la pandémie actuellement observée au niveau mondial constitue un réel enjeu de santé publique.

Procédures

Le bout de la queue des animaux sera coupé (de 2 ou 3 mm) une seule fois, afin de réaliser un génotypage. Une partie des souris sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 3 mois, ainsi ces animaux deviendront obèses et diabétiques. Des prélévements de sang seront effectués à partir de la queue des animaux qui resteront libres de leurs mouvements (7 prélèvements par animal, chacun des prélévements prendra moins d'une minute). Certains animaux seront opérés pour placer un cathéter dans la veine jugulaire. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale durera 45 minutes. Après 1 semaine de repos ces animaux suivrons un autre test : ils seront libres de leurs mouvements et porteront un collier. Pendant 2 heures nous mesurerons leur glycémie 15 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 8 fois). Il n’y aura qu’un seul test de ce type pour ces animaux. Une partie des animaux seront placés dans une cage individuelle qui mesurera en temps réel leurs déplacements, leur prise de nourriture et d'eau. Ils seront également scannés pour évaluer leur quantité de muscles et de graisses.

Impact sur les animaux

#1. Régime hypercalorique : Après 3 mois de régime hypercalorique les animaux ont un surpoids et présentent les premiers signes d'apparition du diabète de type 2, ces nuisances sont modérées. #2. Test de tolérance au glucose et à l'insuline : Le gavage, l’injection intra-péritonéale et les prélèvements sanguins peuvent stresser les animaux (nuisances légères). La queue des animaux sera coupée au ciseau, cela entraine une douleur considérée comme légère. #3. Pose d’un cathéter dans la veine jugulaire : Plusieurs effets indésirables sont possibles. Des souris peuvent mal supporter l'anesthésie. La chirurgie peut entrainer des douleurs modérées et des problèmes de récupération modérés. #4. Analyse de calorimétrie indirecte : les animaux seront individualisés pendant 5 jours, cela entrainera un stress et une possible perte de poids (nuisance modérée). #5. Mesure du renouvellement du glucose : le risque principal est de créer une hypoglycémie lors du test, si les niveaux de perfusion d’insuline et de glucose ne sont pas optimaux. Cet effet indésirable sera considéré comme modéré. #6. Perfusion intra-cardiaque de paraformaldéhyde ET #7. Prélèvement de sang intra-cardiaque : Des souris peuvent mal supporter l'anesthésie (effet indésirable modéré).

Devenir

Les animaux de génotype non adéquat pour les expériences ou le maintient de la lignée seront mis à mort. Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car nous avons besoin de prélever leurs organes pour les analyser ultérieurement.

Remplacement

Afin de comprendre, de façon globale, le rôle de la SELENOT dans le contrôle de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2, nous utilisons une lignée de souris transgéniques obtenue par le système Cre-Lox, afin de pouvoir inhiber l'expression de la Sélénoprotéine T, de façon sélective, au niveau des neurones POMC de l'hypothalamus.

Réduction

En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les processus physiologiques étudiés seront analysés sur des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. De plus, les procédures n’impliquant pas d’effet néfaste à long terme, pourront être menées successivement sur les mêmes animaux intercalées avec des périodes de repos de 7 jours au cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués.

Raffinement

L’ensemble des actes pouvant entraîner une douleur (tatouage, génotypage, actes chirurgicaux) sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale selon la méthode la plus adaptée) afin d’en minimiser l’impact au maximum. De plus, les animaux recevront un traitement analgésique avant l'acte qui peut être poursuivi après l'acte si nécessaire pour prévenir la douleur. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par la mesure des prises de nourriture et de boisson, et le suivi du poids de chaque animal. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance.

Choix des espèces

Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, le rôle physiologique de notre protéine d'intérêt dans le contrôle de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité, associée au diabète de type 2; et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme.

Les neuf rates gestantes sont tuées au sevrage de leurs petits, à 21 jours, et les ratons en surnombre, au-delà de dix par portée, sont placés dans d'autres portées ou tués. Au total, 111 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et tous ceux nés dans l'étude sont tués à leur tour, seuls 12 rats adultes utilisés pour un test de sociabilité étant gardés en vie pour d'autres projets ou une retraite. Les mères reçoivent par gavage, chaque jour pendant 42 jours de gestation et de lactation, un retardateur de flamme ou une huile neutre, et au 12e jour de gestation une injection de VPA, le médicament de référence, ou d'eau stérile. Les 90 jeunes passent quatre tests comportementaux, sensibilité sensorielle, activité et anxiété, interactions sociales et comportements répétitifs, pour vérifier qu'ils présentent le "phénotype autistique recherché", puis une partie d'entre eux passe des séances d'imagerie cérébrale sous anesthésie. Le porteur qualifie d'"essentielle" l'expérimentation sur des animaux non-humains pour reproduire la complexité des troubles du spectre autistique.

Objectifs

Les Troubles du Spectre Autistique se caractérisent par des difficultés de communication et des comportements répétitifs. La génétique n'explique que 25 % des cas, ce qui suggère que des facteurs environnementaux, comme les polluants chimiques, jouent un rôle important. Les retardateurs de flamme sont identifiées comme substances préoccupantes en raison de leurs effets toxiques pour le cerveau. Des recherches précédentes ont montré que l'exposition à ce polluant pendant la gestation et la lactation provoque des comportements autistiques et des altérations cérébrales chez les jeunes rats, comparables à ceux observés dans un modèle autistique médicamenteux de référence. Ces dommages comprennent une inflammation du cerveau et des changements dans la façon dont les cellules nerveuses communiquent entre elles, observés après la mort des animaux. Pour étudier plus en détail ces effets, ce projet validera une technique d'imagerie chez des jeunes rats exposés à ce polluant. Deux traceurs seront utilisés pour mesurer l'activité métabolique du cerveau et son inflammation afin de mieux comprendre les mécanismes cérébraux associés à ces troubles. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Pour la première fois, ce projet utilisera l'imagerie cérébrale pour étudier comment le métabolisme et l'inflammation du cerveau sont affectés par un polluant chimique de l'environnement, en lien avec les Troubles du Spectre Autistique. Il aidera à définir et valider les paramètres de la méthode d’imagerie (comme l’anesthésie et la durée du protocole d’imagerie) pour voir, à l’échelle du cerveau entier, où et comment les dommages se produisent et à établir un lien potentiel entre ces dommages.

Procédures

Femelles gestantes : Administration unique par gavage avec le polluant ou le véhicule (huile neutre) quotidiennement pendant 42 jours, couvrant les périodes de gestation et de lactation, injection avec le médicament de référence ou le véhicule (eau stérile) une seule fois au 12ème jour de gestation et suivi régulier du poids. Jeunes rats : suivi régulier du poids et tests comportementaux après sevrage. Chaque jeune rat passera 4 tests comportementaux (sensibilité sensorielle, niveaux d’activité et d’anxiété, interactions sociales, comportements répétitifs) pour sélectionner ceux qui présentent des signes d’autisme, en vue des études d’imagerie. Imagerie cérébrale : À partir de 60 jours, certains rats passeront des séances d'imagerie cérébrale (4 fois en tout sur 2 semaines) sous anesthésie (6 fois), pour mesurer l’activité métabolique cérébrale et pour détecter l’inflammation. La durée de chaque session (1 à 2 h) sera définie pendant cette phase de mise au point.

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables attendus sont les suivants : Pour les femelles gestantes : Pour les femelles gestantes : - La piqure d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale de VPA entraine un stress physique mineur et une douleur légère de courte durée (1 fois). - L’administration du polluant par gavage (42 fois) entraine un stress physique mineur de courte durée. Pour les descendants : - L’existence d’un phénotype comportemental de type autistique entraine notamment un risque d’anxiété accru. - La réalisation des tests comportementaux (4) entraine un stress physique mineur de courte de durée.

Devenir

Neuf femelles gestantes seront réparties en trois groupes. Elles seront maintenues en vie jusqu'au sevrage de leurs petits à 21 jours, puis euthanasiées. Le sang et les tissus seront utilisés notamment pour l’analyse des hormones. En cas de portées trop importantes (supérieures à 10 ratons), la portée sera réduite par placement des ratons surnuméraires dans d’autres portées plus faibles ou euthanasie. Dans ce cas, les tissus seront prélevés pour des analyses. L’ensemble des ratons (10 par portée soit 90) réaliseront 4 tests comportementaux afin de s’assurer qu’ils présentent le phénotype autistique recherché et de pouvoir en sélectionner pour les études in vivo par imagerie (dix-huit mâles et femelles maximum). A l’âge adulte, l’imagerie sera réalisée sur 3 rats par groupe et par sexe. Si nécessité de renforcer les résultats, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté à chaque groupe pour augmenter la taille de l’échantillon. L’ensemble des rats nés dans cette étude sera euthanasié pour des analyses en histologie et biologie moléculaire ou des ajustements de techniques en vue de la phase 2 du protocole qui fera l’objet d’une future demande d’autorisation. Enfin les 12 rats (6 femelles et 6 mâles) ayant participé aux tests de sociabilité seront maintenus en vie et pourront être réaffectés à d’autres projets ou placés en retraite.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est essentielle pour reproduire la complexité des Troubles du Spectre Autistique observés chez l'Homme. Les modèles autistiques utilisés dans ce projet, reconnus et validés chez les rongeurs, permettent de créer des troubles comportementaux et cérébraux similaires à ceux de l'Homme. Ils permettront d’utiliser l'imagerie cérébrale pour étudier les effets d'un polluant et comprendre le lien avec le développement de l’autisme. Cette imagerie nécessite l'étude de l'activité cérébrale d'animaux vivants.

Réduction

Chaque portée sera considérée comme une unité statistique. Dans chaque portée, un raton mâle et un raton femelle seront sélectionnés pour réaliser des analyses par imagerie in vivo. Comme il y a peu de données sur l'utilisation des deux radiotraceurs de l’étude, cette première phase vise à tester la faisabilité de l'imagerie sur un échantillon de 3 ratons par groupe et par sexe, pour 3 groupes. Si besoin, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté pour augmenter la taille de l'échantillon. Ainsi, cette phase exploratoire inclura un total de 9 rates gestantes, 90 jeunes et 12 autres rats adultes pour un test de sociabilité. Au total, 111 animaux seront impliqués dans cette étude, avec un minimum de 9 rats mâles et 9 rats femelles (jusqu'à un maximum de 18 de chaque sexe) utilisés en imagerie.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans l’EU1 dans des conditions standards, respectant les réglementations en vigueur. Les femelles gestantes et allaitantes seront hébergées avec leurs petits jusqu'à 21 jours après la naissance. Ensuite, les jeunes rats resteront ensemble sans leur mère entre 21 et 28 jours pour maintenir leurs liens sociaux. À 28 jours, les rats seront séparés par sexe et placés par deux dans des cages ventilées, avec des buchettes de bois et de la frisure de papier Kraft pour enrichir leur environnement. Les tests comportementaux seront effectués durant la nuit, période d'activité naturelle des rats. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être, et manipulés par le même personnel entraîné pour réduire le stress. À 50 jours, les rats seront transportés dans des cages prévues à cet effet vers l'animalerie de la plateforme d'imagerie EU2, avec des conditions similaires à leur habitat précédent (cycle lumineux, nourriture, enrichissements environnementaux) pour minimiser les perturbations. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale, en suivant des protocoles rigoureux adaptés à chaque animal. Les radiotraceurs seront injectés par du personnel qualifié, avec des doses précises. Pendant l’imagerie, l'anesthésie sera surveillée en temps réel pour assurer la sécurité des animaux. Après la procédure, les rats seront surveillés attentivement dans un environnement calme pour une récupération rapide et sans complications.

Choix des espèces

Les modèles de Troubles du Spectre Autistique médicamenteux ou après exposition des mères au polluant ont été développés et sont reconnus chez le rat dont le comportement social est proche de celui des humains, ce qui en fait un bon choix pour étudier ces troubles. Les femelles adultes utilisées pour la reproduction auront entre 12 et 13 semaines, comme dans les études précédentes, pour assurer la comparabilité des résultats. Les petits seront étudiés de la naissance jusqu'à 80 jours pour suivre leur croissance, évaluer leur comportement (entre 36 et 43 jours) et analyser les modifications métaboliques et inflammatoires par imagerie (entre 60 et 80 jours). Cette période permettra de définir les protocoles d'imagerie.

Un casque est implanté sur le crâne de certaines souris sous anesthésie, avec une lentille ou un cache-œil porté ensuite de façon prolongée, et jusqu'à treize anesthésies gazeuses en trois semaines s'enchaînent pour nettoyer les lentilles et passer les scanners. 330 souris vont être utilisées ainsi, 210 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 120 au niveau modéré, toutes tuées à l'issue parce que, génétiquement modifiées, elles ne peuvent être ni réutilisées ni mises à la reproduction. L'objet déclaré est de comprendre le rôle d'un gène associé à la forte myopie, dans un modèle où la myopie est provoquée artificiellement. Le porteur annonce des tests comportementaux au cours desquels des animaux sont placés une heure sur une plateforme, sans préciser lesquels, et signale par ailleurs un risque d'arrêt cardiaque sous anesthésie et une cataracte temporaire possible.

Objectifs

La cécité nocturne congénitale stationnaire (CNCS) est un groupe de pathologies rétiniennes d'origine génétique. La plupart des personnes atteintes ont une acuité visuelle basse, associée à des difficultés d’orientation en condition de faible luminosité. De nombreux patients présentent également d’autres anomalies oculaires telles qu’une forte myopie. Dans des études précédentes, des gènes responsables de l'apparition de la CNCS ont été identifiés. De plus les modèles animaux mimant la CNCS ont été très étudiés et d’autres gènes altérés ont été découverts dans toutes les différentes formes de CNCS. Le rôle précis de ces gènes dans la rétine et leur impact sur la CNCS et la myopie sont encore mal connus. Nous allons, au cours de ce projet, étudier l'un de ces gènes qui a notamment été associé à la forte myopie. Pour se faire, nous allons utiliser un modèle de souris génétiquement modifié dans lequel ledit gène a été inactivé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet incluront une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires menant à la myopie et à la Cécité Nocturne Congénitale Stationnaire (CNCS). La myopie étant l’affection oculaire handicapante la plus courante actuellement et avec une incidence en constante augmentation (les prédictions nous disent que la moitié de la population mondiale sera myope d’ici 2050, et 10 pourcent sera atteint d’une forte myopie). La CNCS est une maladie visuelle handicapante provoquant des symptômes variés pour laquelle aucun traitement n’existe à ce jour. Une meilleure compréhension des mécanismes induisant ces pathologies permettrait de proposer des traitements plus précoces, plus efficaces et moins invasifs que ceux déjà existant.

Procédures

Pour induire et étudier la myopie, une technique chirurgicale, effectuée sous anesthésie et analgésie, se résumant par l’implantation d’un casque sur le crâne de certains animaux est nécessaire. Pour mesurer la myopie : contention manuelle régulière et répétée de certains animaux: une fois par animal et par semaine pendant 6 semaines au total, 10 minutes par animal maximum à chaque fois. Anesthésies gazeuses répétées: Une anesthésie le jour de la chirurgie (durant 45 minutes maximum) + 3 anesthésies maximum par semaine pour le nettoyage des lentilles et des yeux des animaux (10 minutes maximum/animal) + Anesthésies le jour des scanners (3 fois, 15 minutes par animal maximum) soit 13 anesthésies maximum sur 3 semaines. Anesthésie par injection le jour de l’électrorétinographie (une fois/animal, pendant une heure). Modification de l’environnement lumineux de certains animaux : abaissement de la luminosité pendant 4h à un niveau dit « de lumière basse). Les animaux seront répartis en 3 groupes distincts : le premier groupe se verra induire et mesurée la myopie, le deuxième groupe se verra analysé par électrorétinographie, le troisième groupe verra son environnement lumineux changé.

Impact sur les animaux

Certains des animaux seront soumis à des chirurgies : Les techniques chirurgicales peuvent mener à des pertes de poids, des infections, douleurs post-opératoire, perte de sang. Ces mêmes animaux subiront des anesthésies gazeuses répétées pouvant causer un risque léger d’hypothermie, d’insuffisance respiratoire et arrêt cardiaque. Port du cadre à lunette: qu’il s’agisse du cache-oeil ou d’une lentille, le port prolongé de l’appareil peut induire une gêne et un assèchement oculaire. Certains animaux seront placés en hébergement individuel, ce qui peut entraîner des détresses sociales. Durant les tests comportementaux, certains animaux seront placés sur une plateforme durant une heure. L’arrivée dans un milieu inconnu peut stresser l’animal. Une partie des animaux seront utilisés dans le cadre de différents tests fonctionnels afin de caractériser le modèle qui implique soit une immobilisation manuelle pouvant induire un stress soit une anesthésie par injection d’anesthésiques pouvant induire un stress thermique ou des risques cardio-respiratoires. L’un de ces tests peut entrainer une cataracte temporaire. Enfin, certains animaux seront placés en illumination contrôlée sont dans une ambiance lumineuse différente de celle de leur hébergement. L’enrichissement sera réduit pendant cette procédure, ce qui peut induire un stress.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés à la fin des expériences car il s'agit d'animaux OGM et que nous ne pourrons les réutiliser pour des accouplements ou d'autres projets. L'euthanasie sera effectuée selon la méthode réglementaire. Les yeux des animaux seront ensuite prélevés pour études histologiques et de biologie moléculaire.

Remplacement

L’induction et l’étude de la myopie ainsi que la caractérisation phénotypique nécessite un œil complet, en 3D, avec sa rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, crystallin, iris, humeur aqueuse). Aucune méthode alternative ne permet d’obtenir un oeil en 3D.

Réduction

Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour le projet en nous basant sur les données de la littérature scientifique. Aucune étude n’a montré d’influence claire du sexe sur la Cécité Nocturne Congénitale Stationnaire et la myopie. Nous allons utiliser les animaux mâles et femelles indistinctement. Nous utiliserons comme témoins des animaux contrôles non modifiés, possédant donc le gène étudié sur leurs 2 chromosomes. Nous comparerons aussi les résultats avec des animaux contrôles dits « hétérozygotes » possédant le gène étudié sur un seul de leur chromosome, afin de renseigner le potentiel impact de la perte du gène sur un chromosome. Le nombre d’animaux indiqué dans chaque procédure a été estimé sur la base d’expériences similaires effectuées dans notre équipe et en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe), des contraintes techniques (Taux de réussite des expériences), des contraintes de contrôles. Nombre total d’animaux nécessaires: 330 animaux

Raffinement

Les animaux utilisés naîtront et seront hébergés en animalerie extérieure jusqu’à expérimentation. Ils seront alors hébergés dans notre animalerie où ils observeront une période d’acclimatation de 5 jours avant toute manipulation. Pour les accouplements, les parents seront placé un mâle avec deux femelles. Les nouveaux-nés seront sevré à 21 jours après la naissance. Les animaux adultes seront placés à 5 au maximum par cage (hors accouplement), possèderont une maison et des morceaux de cellulose ainsi que des morceaux de bois. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les paramètres environnementaux contrôlés des animaleries seront conformes aux normes réglementaires. De l’hydrogel nutritif sera mis à disposition si nécessaire. Seul le personnel qualifié en zootechnie sera habilité à gérer l’hébergement des animaux. Seul le personnel compétent dans la manipulation des animaux sera autorisé à manipuler les animaux. Seul du personnel formé aux techniques chirurgicales du petit animal sera autorisé à procéder aux techniques chirurgicales. Le personnel de zootechnie change les cages chaque semaine et sera en charge de la surveillance de la santé des animaux. Une communication rapide entre les chercheurs et les membres de la zootechnie est assurée par la proximité géographique entre l’animalerie et le laboratoire et permettra une prise de décision rapide en cas de problème de santé des animaux. Les procédures nécessitant une anesthésie et/ou l’application d’analgésiques seront effectuées par du personnel habilité. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien être des animaux. Les informations concernant les animaux seront mutualisées sur un site web commun. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs permettant de limiter toute douleur inutile aux animaux ont été mis en place

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle souris car nous avons besoin d’un modèle génétique particulier qui n’existe que dans cette espèce. Certaines expériences visent à étudier le développement naturel de l'oeil. Le développement de l'oeil se mesure par réfractométrie. Les mesures de réfractométrie ne commencent à être fiables qu’à partir de 3 semaines d’âge, lorsque l’animal est sevré. Avant cela, l’oeil est trop petit. En général, le développement de l'oeil des souris se termine autour de 6 semaines d’âge. Pour nous assurer d’avoir dépassé la période critique du développement, nous poursuivrons la mesure du développement jusqu’à 9 semaines d’âge. Certaines expériences nécessitent d'induire la myopie. L’induction de la myopie est plus efficace si elle débute entre 3 et 4 semaines d'âge car l’oeil y est encore en phase de croissance critique. Certaines expériences consistent en la mesure post-mortem des taux de dopamine rétiniens. Pour éviter tout impact de la croissance de l'animal sur la mesure de Dopamine, nous effectuerons l’expérience à l’âge adulte. Dans un souci de cohérence, nous nous fixons sur 80 jours après la naissance car il s’agit de l’âge auquel nous avons fait des analyses similaires lors de projets précédents. Certaines expériences consistent en la caractérisation phenotypique (ie les symptômes)des animaux, nous travaillerons sur des animaux sur 2 stades adultes différents (6 semaines, 6 mois) pour documenter un possible phénotype progressif.

21 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour sept d'entre eux et modéré pour les quatorze autres. Ces quatorze reçoivent trois injections d'un candidat vaccin contre Klebsiella pneumoniae et jusqu'à six prises de sang, maintenus éveillés cinq minutes par prélèvement dans une cage de contention. Le porteur attend de la nouvelle formulation une production d'anticorps supérieure, l'objectif à terme étant de vacciner des populations à risque faute d'antibiotiques efficaces. Les quatorze sont tués au bout de soixante-dix jours, la mise à mort étant justifiée par le volume de sang à prélever, tandis que les sept lapins écartés après la phase de sélection restent disponibles pour d'autres études.

Objectifs

S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont également résistantes à ces antibiotiques de dernière ligne. Des alternative aux antibiotiques, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin à usage humain, basé sur des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées (bactéries inoffensives dont tous les facteurs de virulence ont été retirés) et génétiquement modifiées pour exprimer des protéines de surface de Klebsiella pneumoniae, a déjà montré une protection significative dans un modèle d’infection à Klebsiella pneumoniae chez la souris. Une précédente étude a également testé la production d’anticorps chez le lapin en réponse à différente fréquences d’administration de ce candidat vaccin associé à un adjuvant (produit utilisé pour améliorer l’efficacité des vaccins). L’objectif est de poursuivre l’étude de ce vaccin chez le lapin en étudiant cette fois une nouvelle formulation (proportions de vaccin et d’adjuvant différentes des études précédentes) dans le but de déterminer quelle formulation est capable d’entrainer la plus grande production d’anticorps spécifiques.

Bénéfices attendus

La nouvelle formulation du vaccin devrait entrainer une meilleur réponse immunitaire. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.

Procédures

Les animaux vont être soumis à différentes interventions : - 3 injections sur animal vigile 3 secondes par injection - 1 à 6 prélèvements sanguins sur animal vigile 5 minutes de maintien en cage de contention par prélèvement - 1 anesthésie générale suivie d’un prélèvement sanguin terminal (2 minutes) qui se terminera par une injection d’un euthanasiant (3 secondes) pour assurer la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - 3 injections Le candidat vaccin a déjà été testés chez la souris et le lapin et n’a montré aucun signe de toxicité. Nous n’attendons donc aucune toxicité lors de l’administration de cette nouvelle formulation. - 1 à 6 prélèvements sanguins sur animal vigile en cage de contention Les animaux seront familiarisés à la cage de contention au cours de 3 séances d’habituation réalisées avant le début de l’expérience. - 1 anesthésie générale suivie d’un prélèvement sanguin terminal qui se terminera par une injection d’un euthanasiant pour assurer la mise à mort. Le prélèvement sanguin terminal étant réalisée sous anesthésie générale, il ne sera associé à aucune douleur particulière.

Devenir

A l’issue de la phase 1 (sélection) , 7 animaux sur 21 seront exclus de l’étude. Ils n’auront subit qu’un prélèvement d’1 à 2 mL de sang à l’oreille (douleur légère) et pourront donc être réutilisés pour des études ultérieures. Les 14 animaux de la phase 2 (immunisation) seront mis à mort à l’issue des 70 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance. Leur mise à mort est justifiée par la nécessité de récupérer suffisamment d’anticorps pour les analyses complémentaires ce qui implique le prélèvement d’une grande quantité de sang.

Remplacement

La production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour l’étude de la production d’anticorps suite à une vaccination.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. La sélection des animaux durant la première phase du projet permettra de réduire le nombre d’animaux qui participeront à la phase d’immunisation. Ainsi un tiers des animaux du projet subiront uniquement un prélèvement sanguin.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la phase d’immunisation. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations des traitements et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. L’administration des traitements n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude, supportés par une grille de score de douleur, ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance. Les injections et prélèvements seront réalisés sur animaux vigiles et ne nécessiteront pas d’anesthésie ou d’analgésie particulière (comme chez l’homme). Seul le prélèvement terminal nécessitant un grand volume de sang sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le lapin est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. En effet sa taille moyenne implique un volume sanguin important et donc un plus grand potentiel de récupération d’anticorps que pour la souris par exemple. Également, l’efficacité du candidat vaccin sera ultérieurement testé dans un modèle d’infection chez le lapin. Des lapins mâles et femelles de 3-4 mois seront utilisés de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante.

Pour trouver un moyen de limiter les pertes économiques que la coccidiose fait subir à l'aviculture, plus de 1,5 milliard d'euros par an dans le monde selon le porteur, 60 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue. Quarante subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, vingt un niveau modéré. Chaque animal reçoit deux administrations orales sous contention, l'une d'un microbiote, l'autre du parasite Eimeria tenella. La dose de parasite est calibrée pour rester en dessous du point limite, défini par la perte de poids, les plumes ébouriffées, la prostration, les yeux mi-clos et la diarrhée, et les poulets de chair retenus sont de type conventionnel pour rester au plus près des conditions des élevages industriels.

Objectifs

Les coccidioses représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture conduisant à d'importantes pertes économiques (>1,5 milliards d’euros/an dans le monde). Ces maladies sont provoquées par des parasites, Eimeria. La prophylaxie repose sur l’utilisation d’anticoccidiens et sur la vaccination. Le coût élevé des vaccins, l’apparition de résistances aux anticoccidiens et la demande des consommateurs pour limiter l’utilisation des anticoccidiens et des antibiotiques nécessitent le développement de nouveaux moyens de lutte plus naturels. Dans cet objectif, notre ambition est d'utiliser la modulation du microbiote pour atténuer la sévérité de la pathologie liée à l'infection par Eimeria. Comme nous l’avons décrit précédemment, nos résultats mettent en évidence un rôle du microbiote et/ou ses métabolites sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella incluant le développement du parasite E. tenella et sur la réponse inflammatoire associée à l’infection. La nature des bactéries et/ou leur métabolites impliqués dans cet effet restent encore à déterminer. Dans ce projet, nous comparerons des microbiotes présentant une complexité et une diversité plus ou moins forte (microbiote de jeune, d’adulte, enrichi en bactéries probiotiques dès l’éclosion) sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella. Nous évaluerons l'effet de ces différentes compositions microbiennes caecales sur le développement des parasites, la formation de lésions et la réponse inflammatoire. Ensuite, les corrélations entre la composition du microbiote, des métabolites caecaux et des paramètres d'infection seront déterminées pour détecter les taxons et les métabolites qui peuvent être enrichis ou appauvris dans le cas d'infections plus ou moins sévères. Ce projet fournira des indications pour le développement d'un microbiote limitant les conséquences négatives de l'infection.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, le bénéfice attendu est que les animaux supplémentés résistent mieux à l’infection (effet anticoccidien) et présentent par conséquent de meilleures performances zootechniques, moins de lésions, moins d’inflammation, moins développement parasitaire. Si la supplémentation du microbiote ne présente pas d’effet, les animaux supplémentés présenteront des charges parasitaires et des paramètres lésionnels similaires à ceux du groupe contrôle.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux administrations orales : une de microbiote et une du parasite Eimeria. De plus, la contention peut engendrer du stress pour les animaux. Chaque intervention dure environ 30 secondes à 1 minute.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite, le point limite se définissant par la perte de poids, les plumes ébourriffées, prostration, yeux mi-clos, diarrhées. Une perte de poids pourra être observée chez les animaux infectés non supplémentés sans atteindre le point limite ni des signes cliniques sévères. De plus, la contention peut engendrer du stress pour les animaux.

Devenir

A la fin de l'expérimentation, l'euthanasie des animaux est prévue pour des prélévements des caeca et mesures de différents paramètres (parasitaire, inflammatoire, microbiote, métabolites)

Remplacement

L’étude de l’influence du microbiote sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella nécessitent des expérimentations in vivo pour lesquelles des analyses des paramètres zootechniques, parasitaires, inflammatoires, biochimiques, et du microbiote intestinal seront réalisées.

Réduction

Les effectifs sont basés sur les études du laboratoire et de la littérature portant sur les scores lésionnels lors de supplémentations et pour lesquelles il faut en moyenne 20 animaux / groupe avec trois groupes pour avoir une différence significative. Ces effectifs sont suffisants pour les analyses microbiotes.

Raffinement

Hébergement : Les poulets disposeront d’un enrichissement social et comportemental (dans les box : petites rondelles en inox suspendues ou du bolduc suspendues ce qui permet aux animaux de piquer dedans et des perchoirs qui apporte un enrichissement qui fait partie du comportement naturel). Limitation des nuisances sur le bien-être animal : Evaluation de l’état de santé des animaux deux fois par jour par le personnel de la plateforme expérimentale. Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite, le point limite se définissant par la perte de poids, les plumes ébourriffées, prostration, yeux mi-clos, diarrhées.

Choix des espèces

Le poulet est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria. Des poulets de chair mâles et femelles de type conventionnel seront utilisés dans l’étude pour être dans les conditions les plus proches de celles des élevages industriels, et auront un statut sanitaire exempt d'organismes pathogènes spécifiés. L'éclosion constituant une fenêtre unique pour l'implantation de bactéries et l'amélioration précoce des fonctions intestinales, l'implantation de bactéries pour améliorer précocement les fonctionnalités de l'intestin sera réalisée juste après l’éclosion (1er jour d’âge). Une coccidiose expérimentale sera ensuite induite à environ 2 semaines d’âge afin de reproduire expérimentalement la fenêtre d’infection de la coccidiose aviaire.