Procédures légères

Un bruit de sèche-cheveux de quinze secondes répété cinq fois sert à provoquer un stress émotionnel chez des souris porteuses d'un capteur cardiaque implanté sous la peau. 90 souris vont être utilisées, 50 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 40 d'un niveau léger, toutes tuées pour prélever leur cœur. Après quarante minutes d'anesthésie pour l'implantation et une semaine de repos, elles enchaînent cinq protocoles de stress, dont un exercice physique d'une demi-heure et trois injections intrapéritonéales sur animal conscient, l'inconfort lié aux sutures étant annoncé pour quatre semaines. Le porteur retient la souris parce que son cœur compte quatre cavités comme celui de l'être humain et parce que les arythmies apparaissent entre quatre et six mois chez les lignées génétiquement modifiées reproduisant cette maladie cardiaque héréditaire.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Parmi elles, les troubles du rythme sont une cause importante de mort subite. Ces troubles du rythme adviennent lors de conditions pathologiques telles que l’insuffisance cardiaque ou suite à des maladies génétiques par mutation d’une protéine impliquée dans le rythme cardiaque. Lors d’un stress aigu, les catécholamines naturellement produites par l’organisme entrainent une accélération du rythme cardiaque et une augmentation du débit de sang. Dans certaines maladies génétiques comme la CPVT (tachycardie ventriculaire polymorphe catécholergique), des mutations altèrent cette réponse au stress, causant des défaillances cardiaques allant parfois jusqu’à la mort subite. Dans les cellules cardiaques, le calcium constitue un élément essentiel à la régulation de la fréquence cardiaque. La CPVT est causée par une mutation d’un canal cardiaque pour le calcium, RYR2. L’objectif du projet est d’étudier les mécanismes impliqués dans les arythmies cardiaques en situation de stress sur des modèles de souris génétiquement modifiées qui miment cette maladie. Nous étudierons ainsi la réponse au stress de ces souris. Les souris mâles et femelles seront étudiées distinctement dans ce projet afin de déceler des différences potentielles basées sur le sexe.

Bénéfices attendus

Par ce projet, nous espérons mieux comprendre les mécanismes de régulation du canal au calcium RYR2 en réponse à un stress dans un contexte physiologique mais aussi dans un contexte pathologique. A court terme, il s’agit de mieux comprendre les mécanismes de cette maladie et à moyen terme, cela pourrait permettre de développer RYR2 comme une nouvelle cible thérapeutique. En effet, environ un tiers des patients atteints de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholergique ne sont pas correctement pris en charge par les traitements actuels.

Procédures

Afin d'enregistrer le rythme cardiaque, les animaux sont placés sous anesthésie générale pendant environ 40 minutes pour permettre l’implantation sous-cutanée d’un capteur électrocardiogramme. Les animaux reçoivent une analgésie pré- et post-opératoire. Après implantation de ces capteurs les animaux ont une période de repos d’une semaine. On évaluera ensuite la réponse au stress par l'enregistrement du rythme cardiaque, lors de 5 protocoles successifs. La réponse au stress sera provoquée par un exercice physique (environ 30 minutes), puis des injections intrapéritonéales de substances pharmacologiques (3 protocoles différents donc 3 injections différentes ; durée d’effet moins d’une heure) sur animal conscient et par des épisodes de nuisances sonores de courte durée (bruit de sèche-cheveux, 15 secondes, répétées 5 fois). D’autres animaux seront étudiés par échocardiographie, sous anesthésie générale. C’est une technique d’étude non invasive, qui dure environ 30 minutes.

Impact sur les animaux

Afin d'enregistrer le rythme cardiaque, les animaux sont sujets à une implantation sous cutanée de capteurs. Cela peut entrainer une douleur dues aux sutures ainsi qu'un inconfort de l'animal. La durée de cette nuisance est de 4 semaines (1 semaine de repos après implantation et 1 semaine de protocole expérimental puis échelonnement des euthanasies). Les protocoles expérimentaux pendant l'enregistrement du rythme cardiaque induisent un stress chez l'animal qui est nécessaire à l’expérience (stress pharmacologique par injection intrapéritonéale unique, stress émotionnel par nuisance sonore de courte durée).

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de collecter le cœur. Cela nous permettra d’étudier l’expression et l’activité de notre protéine mutée d’intérêt. Ces études permettront une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans notre domaine d’étude.

Remplacement

Au vu du niveau de complexité et de la spécialisation des cellules cardiaques, aucun système d’étude in vitro ne permet actuellement d’analyser la fonction et le dysfonctionnement cardiaque. Ainsi le recours à des modèles animaux reste impératif. Le cœur est un organe complexe, composé anatomiquement de plusieurs compartiments et physiologiquement de plusieurs tissus spécialisés. De plus, notre étude porte sur la réponse du cœur (et ses défauts) en fonction du stress, en conditions physiologique et pathologique, il est donc indispensable d’étudier le cœur intégré à l’organisme ; les modélisations par ordinateur ne sont pas suffisantes pour mimer une telle complexité. Il est donc nécessaire pour l’évaluation de la fonction cardiaque d’utiliser un mammifère entier adulte afin de s’approcher le plus possible des mécanismes physiopathologiques humains. La souris est un bon modèle car les gènes étudiés sont conservés.

Réduction

Une planification à l’aide de logiciels de statistiques nous a permis de déterminer le nombre d’animaux minimum nécessaires pour obtenir des résultats fiables, pour chaque objectif du projet. De plus, au sein d'une procédure expérimentale, les lots de souris sont soumis à diverses techniques d’études afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et maximiser le recueil de données sur les mêmes animaux. Afin d’utiliser au mieux les animaux à notre disposition issus des croisements de lignées, mâles et femelles seront étudiés. En fin d’expérimentation, les animaux seront euthanasiés et des expériences de biologie moléculaire et des études sur tissus ou cellules isolés seront effectuées afin d’optimiser les ressources à notre disposition et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux élevés au sein de l’animalerie seront pris en charge et observés de leur naissance à leur euthanasie. Les cages des animaux seront enrichies et les animaux seront suivis par un personnel spécifiquement formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles, dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Les interventions chirurgicales se font sous anesthésie générale et les animaux reçoivent une analgésie pré- et post-opératoire. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne et de pesées régulières en fonction des procédures. Une grille de score a été définie, évaluant les paramètres suivants : apparence, comportement naturel, hydratation, signes cliniques et comportement provoqué. Des points limites, en fonction du score obtenu selon cette grille, ont été décidés, menant à l’administration d’analgésie supplémentaire ou à l’euthanasie.

Choix des espèces

La souris constitue un bon modèle cardiovasculaire car c’est un rongeur possédant un cœur à 4 cavités et une physiologie semblable à l’être humain. De ce fait, cette espèce est la plus couramment utilisée comme modèle d'étude de la fonction cardiovasculaire. De plus, il a été démontré que nos protéines d’intérêt retrouvées chez l’être humain ont des fonctions similaires chez la souris. Ainsi, ces animaux représentent un bon modèle sur le plan physiologique et génétique. Des souris adultes âgées de plus de 4 mois seront utilisées car les maladies cardiaques se déclarent essentiellement à l’âge adulte et il a été montré que dans les modèles CPVT de souris, les arythmies surviennent majoritairement entre 4 et 6 mois.

Le poids et les symptômes de la salmonellose sont relevés chaque soir, une grille de score fixant le seuil au-delà duquel les souris sont mises à mort. 1 281 souris vont être utilisées, 1 221 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 60 d'un niveau modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour prélever leurs tissus. Elles sont infectées par voie orale et suivies quinze jours, avec des gavages jusqu'à cinq fois par semaine, une chirurgie de moins de cinq minutes, une injection de toxine pouvant provoquer une diarrhée et un prélèvement sanguin. Le porteur présente l'étude des cellules immunitaires des plaques de Peyer comme une piste vaccinale ou thérapeutique, et indique que ce projet pourrait produire le modèle de culture in vitro qui manque aujourd'hui pour les étudier.

Objectifs

Les plaques de Peyer sont des organes immunitaires se trouvant dans l'intestin grêle et responsables de l'initiation de la réponse immunitaire intestinale. Il existe une population de cellules immunitaires particulière dans les plaques de Peyer de plusieurs espèces dont la souris et l'homme qui sont très importantes pour la capture des agents pathogènes se trouvant dans la lumière intestinale. Cependant, leur origine, les facteurs nécessaires à leur survie et leurs fonctions dans l'initiation de la réponse immunitaire in vivo restent peu caractérisées. Nos objectifs visent à (i) identifier les précurseurs de ces cellules immunitaires dans le sang et la moelle osseuse ; (ii) caractériser les facteurs nécessaires à leur recrutement, leur survie et leur différentiation dans les plaques de Peyer ainsi que les cellules produisant ces facteurs dans leur microenvironnement ; (iii) étudier leurs fonctions in vivo grâce à des inhibiteurs et modèles de souris génétiquement modifiées ciblant spécifiquement ces précurseurs et facteurs. Ce projet fournira donc des données scientifiques essentielles sur les cellules immunitaires de plaques de Peyer et leur rôle dans l'initiation de la réponse immunitaire intestinale, ce qui devrait permettre d'influer sur ces réponses et proposer de nouvelles pistes d'investigation à visée vaccinale ou thérapeutique.

Bénéfices attendus

En fournissant des outils et des données scientifiques essentielles sur les cellules immunitaires de plaques de Peyer et leur rôle dans l'initiation de la réponse immunitaire intestinale, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes d'investigation pour promouvoir ou réguler ces réponses immunitaires dans un but vaccinal ou thérapeutique. Il pourrait également permettre d'établir un premier modèle de culture in vitro des cellules immunitaires de plaques de Peyer concernées afin de réduire l'utilisation des animaux jusqu'à présent indispensable à leur étude.

Procédures

1/ Injection de substances une seule fois/animal en moins d'une minute sur animal anesthésié légérement. 2/Administration de substances une à cinq fois par semaine pendant une semaine sur animal vigile. 3/ Chirurgie pratiquée en une seule fois en moins de 5 minutes sur animal anesthésié profondément. 4/ Gavages sur souris vigiles réalisés en moins d'une minute une à 5 fois par semaine pendant 2 semaines maximum. 5/ Prélèvement sanguin pratiqué une seule fois sur souris vigile en moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins et les administrations de substances peuvent entrainer des douleurs légéres de courte durée. La toxine injectée est susceptible d'engendrer une diarhée de courte durée (

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure et les tissus d'intérêt prélevés en vue d'analyses.

Remplacement

Aucun modèle de différentiation in vitro des cellules immunitaires de plaques de Peyer concernées n'existe actuellement. Il est donc impossible de les étudier sans avoir recours à l'expérimentation animale. Par contre, ce projet est susceptible de générer un tel modèle en identifiant les précurseurs et facteurs requis à la différentiation des cellules immunitaires de plaques de Peyer.

Réduction

Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de tests et donc de souris utilisées. Le nombre estimé de souris nécessaires à ce projet (1281) a été calculé afin d’obtenir une puissance statistique d'au moins 80% avec une erreur de première espèce de 5%.

Raffinement

Afin de limiter leur stress, les souris seront acclimatées à leur nouvel environnement pendant une semaine avant toute expérimentation. Elles seront hébergées par 5 dans des cages de 530 cm² avec la nourriture et l’eau fournies à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nous essaierons autant que possible de remplacer le gavage par une administration des molécules en solution appétente (lait sucré) à la micropipette après période d'habituation. Lors des expériences d’infection par les salmonelles sur les animaux vaccinés, le poids et l’apparition des symptômes de la salmonellose seront suivis quotidiennement en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. Une grille de score dédiée définissant les points limites sera appliquée. De la nourriture en pâte sera aussi fournie directement dans la cage pour aider à l'alimentation des animaux affaiblis. Suivant les cas des mesures complémentaires seront prises en concertation avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle idéal pour étudier les cellules immunitaires de plaques de Peyer puisque c'est le modèle dans lequel elles ont été le mieux caractérisées. Il permet aussi d'étudier les réponses immunitaires spécifiques d'antigènes modèles utilisés dans le cadre de ce projet et d'analyser précisément les populations immunitaires et leur état d'activation grâce au grand nombre d'anticorps disponibles sur le marché pour cette espèce. Enfin, son infection orale par Salmonella Typhimurium est connue pour mimer une infection systémique par les salmonelles chez l’homme et est donc idéale pour tester l’efficacité vaccinale dans un modèle préclinique. Afin de limiter les variations expérimentales qui seraient dues à des différences d'âge et de poids, des souris adultes âgées de 7 à 12 semaines et pesant entre 20 et 30g seront utilisées.

Comparer un régime riche en graisses donné en continu ou par alternance de deux semaines : 2 080 souris vont être utilisées pendant vingt semaines de régime gras, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Les nouveau-nés subissent une biopsie de la queue pour génotypage, puis les animaux reçoivent jusqu'à quatre injections intrapéritonéales, un gavage et jusqu'à dix prélèvements sanguins à la veine de la queue, le dernier se faisant en rétro-orbitaire sous anesthésie. Pendant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, chaque souris est isolée dans sa propre cage. Le porteur annonce des points limites lors de ces tests, avec apport de glucose ou d'insuline si les seuils sont atteints, et un enrichissement par bâtonnets de bois pour éviter que les dents ne poussent anormalement faute d'aliment dur.

Objectifs

L’obésité est en augmentation croissante dans les pays industrialisés et les pays en voie de développement et contribue à l’augmentation des pathologies cardiovasculaires qui se situent au premier rang des causes de mortalité dans le monde. De ce fait, l’étude des mécanismes impliqués dans le développement de cette pathologie constitue un enjeu majeur de santé publique. Notre projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans l’obésité, et plus particulièrement d’étudier les effets induits par un régime induisant l’obésité donné de manière discontinue en comparaison avec ce même régime donné de manière continue. Nous étudierons en particulier les effets de ces 2 régimes sur la modulation de la réponse inflammatoire. Seule l’expérimentation in vivo, qui mime de façon fidèle la complexité de la réponse inflammatoire dans un contexte d’obésité nous permettra de mettre en lumière des acteurs clés impliqués dans la pathogenèse de cette maladie. Pour cela, nous évaluerons différents paramètres métaboliques et immunologiques chez des souris soumises à un régime riche en acides gras. Pour induire l’obésité, nous allons utiliser un modèle d’obésité chez des souris contrôle et des modèles génétiquement modifiés (mâles et femelles, nombre total de souris : 2080 sur une durée de 5 ans). Ce modèle murin est une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de cette maladie. En effet, actuellement il n'y a pas de systèmes in vitro qui reproduisent, imitent ou permettent la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’obésité chronique. Ce projet comporte 2 procédures : (A) une qui consiste en la mise des animaux sous régime riche en matières grasses soit de manière continue ou discontinue (en alternant le régime gras et standard toutes les 2 semaines) pendant une durée maximale de 20 semaines de régime gras pour les 2 groupes de souris. Cette durée de régime gras de 20 semaines permet le développement de l’obésité. Pour évaluer les paramètres métaboliques des tests de tolérance à l’insuline et au glucose seront effectués. Ces tests consistent en l’administration d’insuline par voie intrapéritonéale ou de glucose par voie orale, des prélèvements de sang seront ensuite réalisés sur souris vigile à différents temps pour doser le taux de glycémie. Il y a également un prélèvement sanguin à effectuer avant la mise à mort des animaux. (B) une seconde pour l'élevage des animaux.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront de comprendre, in vivo, le rôle de l'inflammation mise en jeu dans les différents types cellulaires et tissulaires et son implication dans l'obésité. Cela permettra de définir de nouvelles approches thérapeutiques ciblant la réponse immuno-inflammatoire pour le traitement des patients présentant des maladies métaboliques telle que l'obésité.

Procédures

Des animaux seront utilisés pour la génération de colonies d'animaux. Les nouveaux-nés auront une biopsie caudale. Les animaux auront jusqu'à 4 injections intrapéritonéales sur toute la durée de la procédure (durée inférieure à 30 secondes par injection) . Les animaux vigiles auront un gavage (durée inférieure à 30 secondes) au cours de la procédure. Des prélèvements sanguins auront lieu sur animaux anesthésiés (une seule fois avec une durée inférieure à 30 secondes) ou vigiles à la veine de la queue (jusqu'à 10 prélèvements de moins de 30 secondes).

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l’expérimentation : 1- inconfort lié à la préhension et contention des animaux, lié au gavage, 2 - potentielle douleur au point d'injection en intrapéritonéale et au prélèvement sanguin terminal en rétro-orbitaire, 3 - stress lié à l'anesthésie, à l'individualisation des animaux durant les tests métaboliques et aux prélèvements de sang à la queue.

Devenir

A l'issue des différents gestes techniques, tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure dans le but de prélever les différents organes ou tissus d'intérêt. Ceci nous permettra d'étudier les populations cellulaires d'intérêt à l'aide de différentes expériences, afin de répondre aux différentes questions posées dans le cadre de ce projet.

Remplacement

Actuellement il n'existe pas de système in vitro qui reproduise, imite ou permette la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’obésité. Les modèles in vivo sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l’obésité. L’expérimentation in vivo est également le seul modèle permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans une même pathologie.

Réduction

Selon le principe de réduction décrit au 2° de l'article R. 214-105 du code rural et de la pêche maritime, et à partir des données de la littérature et de notre expérience sur le sujet (résultats analysés avec des tests statistiques adaptés), nous avons déterminé un nombre minimun de souris par groupes expérimentaux pour avoir assez de matériel et garantir une analyse statistique fiable. Nous visons toujours à maximiser l'information qui peut être récupérée à partir d'un seul animal. Les accouplements (en trio) seront optimisés (choix des génotypes) pour permettre l'obtention des groupes d'animaux nécessaire à la réalisation des expériences dans les conditions définies ci-dessus.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Le suivi quotidien de tous les animaux par le personnel qualifié (zootechniciens et expérimentateurs) et la mise en place de points limites adaptés permettront d'identifier et de limiter toute souffrance et douleur. Il y aura un enrichissement complémentaire dans certains cas : maisonnettes si des comportements de domination sont observés ; bâtonnets de bois pour les cages sous régime riche en gras (aliment mou) pour éviter la pousse ou abrasion dentaire anormale. Lors des procédures expérimentales, les nuisances seront réduites au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Pour la procédure des tests métaboliques de tolérance à l'insuline et au glucose, les souris seront individualisées pour limiter les interactions avec les congénères, la glycémie sera suivie en cinétique et l'apport de glucose ou l'insuline sera réalisé si nécessaire en fonction des points limites définis. Ensuite, les animaux retourneront avec leurs congénères, dans la cage d’hébergement d'origine pour limiter le stress lié au changement de cage. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs ou par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Un suivi hebdomadaire du poids des animaux sera réalisé par les expérimentateurs.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude de l'obésité avec notamment le développement du syndrome métabolique dans un laps de temps raisonnable. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées génétiquement modifiées que nous souhaitons étudier. En effet, la souris est l'espèce dont la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. L’utilisation des souris permet ainsi d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés, qui nous permettront d’appréhender le rôle spécifique d’un type cellulaire, d’un facteur ou encore d’une voie de signalisation dans l’obésité. Grace à ces modèles murins, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Les souris seront utilisées au stade adulte, à partir de 8 semaines. Le développement de l’obésité est corrélé à l’âge, c’est pour cela que nous utiliserons des souris adultes. Au stade nouveaux-nés, les animaux seront marqués par bagage et une biopsie caudale sera réalisée afin de génotyper et ainsi sélectionner les animaux génétiquement modifiés pouvant rentrer dans la procédure.

5 192 rates et 3 410 souris gestantes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pendant le dernier tiers de leur gestation. Chacune subit une intervention chirurgicale, pose d'une pompe osmotique sous la peau, ligature des artères utérines ou ablation d'un rein, puis dix-huit heures en cage de recueil d'urine, une mesure quotidienne de pression artérielle pendant douze jours et jusqu'à vingt et un jours d'injections sous-cutanées. La prééclampsie est ainsi provoquée pour tester deux pistes de traitement, un antagoniste d'un récepteur de la vasopressine et un agoniste du récepteur de l'apeline. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" de mener cette étude sur un "organisme entier" faute de modèle in vitro de prééclampsie, après avoir pourtant sélectionné ces molécules in vitro.

Objectifs

La prééclampsie est une maladie qui survient pendant la grossesse et qui provoque une hypertension artérielle chez la mère. Les complications pouvant être graves pour la mère et le fœtus, la prééclampsie peut nécessiter le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Les femmes ayant souffert de prééclampsie et les adultes nés prématurément ont un risque augmenté de maladies cardiovasculaires. Il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie. Des études cliniques ont mis en évidence une augmentation (avant même le diagnostic) de la vasopressine (ou AVP) et une diminution de l’apeline circulant dans le sang des mères atteintes de prééclampsie, suggérant fortement que l'AVP et l'apeline jouent un rôle dans le développement de la maladie. De plus, des études chez le rongeur suggèrent un rôle spécifique d’un récepteur, le V2R, dans la maladie et montrent que l'administration préventive d'apeline améliore les symptômes liés à la prééclampsie. Le premier objectif sera donc de comprendre le rôle de l'AVP et de l'apeline dans la physiopathologie de la prééclampsie chez le rongeur. Pour cela, i) nous évaluerons le rôle de chacun des récepteurs de l'AVP dans la prééclampsie en comparant le modèle préexistant par infusion d'AVP (qui active les trois récepteurs de l'AVP) à un nouveau modèle par infusion de dDAVP (qui a une affinité très élevée pour le V2R), et ii) nous étudierons le rôle du récepteur de l'apeline dans la prééclampsie en utilisant l'antagoniste MM 54, et nous décrirons le rôle de chaque ligand endogène du récepteur de l'apeline. Le second objectif sera d'évaluer le potentiel impact thérapeutique d’un antagoniste du V2R ou/et d’un agoniste du récepteur de l'apeline chez le rongeur atteint de prééclampsie. Pour ce faire, nous utiliserons des peptides qui ne traversent pas la barrière placentaire, c’est-à-dire sans risque pour le fœtus, et qui présentent une haute affinité et une sélectivité absolue pour le V2R ou le récepteur de l'apeline.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la prééclampsie qui demeure, à ce jour, incertaine. En particulier, ce projet va clarifier le rôle des récepteurs de la vasopressine et l’apeline dans la prééclampsie. Malheureusement, il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie, ce qui nécessite le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Ce projet va donc chercher à développer une stratégie thérapeutique contre la prééclampsie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule intervention chirurgicale qui consistera soit en une intervention courte de 5-10 minutes de pose d’une pompe osmotique sous-cutanée soit en une intervention plus longue de 20 minutes de ligature des artères utérines ou d’ablation d’un rein. Les animaux seront également soumis à un seul prélèvement urinaire qui aura lieu durant 18 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines. Les animaux seront aussi soumis à un enregistrement de la pression artérielle par une méthode non-invasive (une fois par jour pendant 30 minutes maximum) durant une période de 12 jours consécutifs. Enfin les animaux seront soumis soit à des injections sous-cutanées répétées (une fois par jour) s’étalant sur 4 à 21 jours maximum, soit à une seule injection intraveineuse.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables relatifs aux chirurgies (implantation d’une pompe osmotique sous-cutanée ou ligature des artères utérines ou ablation d’un rein) sont potentiellement une douleur relative à la chirurgie, une infection et/ou une mauvaise cicatrisation au niveau du site chirurgical. Ces effets débuteront lors de la chirurgie, soit 7 jours après la livraison des rongeurs, et ne devront pas s’étendre au-delà de 72h après la chirurgie. Pour éviter ces effets indésirables la zone sera désinfectée abondamment avec de la Vétidine, un analgésique local injectable sera appliqué au niveau du site chirurgical (Lidocaïne/Laocaïne) et un antidouleur global à action diffuse par voie sous-cutanée (Buprénorphine) sera injecté. Cependant, si une infection est décelée et perdure au-delà de 72h, l’animal sera exclu de l’étude et pris en charge par le vétérinaire de l’installation. Les effets indésirables relatifs au geste quotidien d’injections sous-cutanées sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection et un stress lié à la contention des animaux. Ces effets débuteront 7 jours après la livraison des rongeurs jusqu’au dernier tiers de leur gestation. Pour éviter ces effets indésirables i) une pommade analgésique local sera appliquée, au préalable, sur le site d’injection, ii) la localisation du site d’injection variera quotidiennement et iii) les injections seront faites dans une pièce au calme sans passage. Les effets indésirables liés aux molécules administrées (inhibiteur de nitrique oxyde synthase, antagoniste du récepteur de l’apeline, AVP, dDAVP, antagoniste du récepteur de l’AVP, agoniste du récepteur de l’apeline) sont décrits dans la littérature et dans nos précédentes études « preuve de concept » et de « toxicité ». Les doses sélectionnées dans ce projet ont été choisies afin de ne pas induire d’effets indésirables chez les animaux.

Devenir

Les rates seront mises à mort durant le dernier tiers de leur gestation à la fin de chacune des procédures expérimentales. Les souris seront mises à mort durant le dernier tiers de leur gestation à la fin de chacune des procédures expérimentales.

Remplacement

Nous avons étudié in vitro des molécules d’intérêts pour traiter la prééclampsie (antagonistes du récepteur de l’AVP de type 2 et agonistes du récepteur de l’apeline) afin de sélectionner le plus petit nombre possible de molécules à tester in vivo. Il est indispensable de mener cette étude in vivo au niveau d’un organisme entier car il n’existe pas de modèle in vitro de prééclampsie et car cette étude s’inscrit dans le cadre d’une phase préclinique d’un nouveau traitement d’une pathologie chez l'Homme.

Réduction

Le projet s’intéresse au développement de la préécleampsie dont le paramètre caractéristique est la pression artérielle. Or, la pression artérielle est un paramètre très variable. De ce fait, le nombre minimum d’animaux par groupe calculé afin d’obtenir la puissance statistique nécessaire s’élève à 8 rates ou 15 souris par condition différentes, les difficultés de mesures étant plus importantes chez la souris. Une des procédures expérimentales a pour but de mesurer la capacité des molécules d’intérêt à passer la barrière materno-fœtale et donc de sélectionner les molécules non-toxiques pour l’embryon, c’est-à-dire celles ne franchissant pas cette barrière. Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par type d’analyse pour cette procédure. Pour réduire le nombre d’animaux, les doses de molécules thérapeutiques qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro et in vivo antérieures afin d’être réduites à leur stricte minimum. De plus, nous allons essentiellement réaliser notre étude sur des modèles déjà publiés et bien décrits dans la littérature de prééclampsie, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la mise au point de modèles. Enfin, si une des doses de molécule étudiée parait adéquate, toutes les doses indiquées ne seront pas nécessairement testées afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi pendant 7 jours. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées sera effectuée. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux administrations sous-cutanées quotidiennes, une pommade analgésique sera appliquée localement sur le site d’injection, la localisation du site d’injection variera quotidiennement et les injections seront réalisées dans une pièce au calme sans passage. Afin de diminuer la douleur occasionnée par les chirurgies, une analgésie locale injectable par voie sous-cutanée (laocaïne) sera utilisée accompagnée par un analgésique global à action diffuse par voie sous-cutanée (buprénorphine). Pendant toute chirurgie, les animaux seront placés sur une plaque chauffante à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés avec du sérum physiologique. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre en groupe dans un milieu enrichi et étroitement surveillés. Pour réduire ou supprimer la douleur relative aux enregistrements de pression artérielle, nous utiliserons une méthode non-invasive qui consiste à mesurer la pression artérielle et le rythme cardiaque des rongeurs à l’aide d’un brassard placé au niveau de la queue des rongeurs. Cette méthode non-invasive est toutefois légèrement stressante pour l’animal. Pour réduire ou supprimer le stress relatif à cette méthode nous entrainerons donc les animaux quotidiennement entre le treizième jour et le vingtième jour de gestation pendant un temps n’excédant pas 30 minutes par jour. Enfin, bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, de souffrance et d’angoisse associées à l’administration des composés, une étroite surveillance quotidienne des animaux sera réalisée à l’aide d’une grille de scoring associée.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces pertinentes pour l’étude de la prééclampsie car plusieurs modèles préexistants ont déjà été publiés et sont largement décrits. De plus, nous avons déjà étudié chez le rat et la souris dans des études « preuve de concept » et dans des études de « toxicité » les molécules d’intérêts que nous souhaitons utiliser pour traiter la prééclampsie. Les animaux utilisés seront des rates et souris gestantes. Les rates seront commandées et livrées supposées gestantes au deuxième jour de gestation. Les rates seront ensuite utilisées 7 jours après leur livraison, soit entre le neuvième jour et le vingtième jour de gestation, c’est-à-dire jusqu’au dernier tiers de leur gestation. Les souris seront commandées et livrées non-gestantes. L’accouplement se fera sur place à l’animalerie. Les souris seront ensuite utilisées 7 jours après leur livraison soit de la semaine précédant leur accouplement jusqu’au dix-neuvième jour de gestation, c’est-à-dire jusqu’au dernier tiers de leur gestation.

Pour tester la tolérance et l'efficacité de cinq molécules destinées à des maladies rares de la cornée, 2 400 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à différents délais pour prélever leurs tissus oculaires. Les lésions de la cornée sont provoquées sous anesthésie générale et locale, ou par exposition aux rayons ultraviolets B, puis suivies d'examens répétés de l'œil jusqu'au seizième jour et d'injections sous la conjonctive. Les collyres sont instillés dans les deux yeux sur animal vigile, maintenu de force. La douleur est mesurée par un test de retrait de la patte sous pression, et le porteur reconnaît qu'après l'induction des modèles les rats sont susceptibles de souffrir et de développer une infection de la surface oculaire avec rougeurs et sécrétions.

Objectifs

Le défaut de cicatrisation de la cornée est le dénominateur commun de nombreuses maladies oculaires rares, ce qui représente un problème médical critique et un domaine où les besoins médicaux sont largement insatisfaits. Dans des maladies rares de la cornée, une inflammation, la croissance de nouveaux vaisseaux, une innervation défectueuse et un œdème conduisent à une perte de la transparence entraînant une baisse de la vision et la cécité. A ce jour, les traitements disponibles sont peu efficaces et provoquent des effets indésirables. Les objectifs dans ce projet de recherche sont d’investiguer et de proposer de nouvelles alternatives pour le traitement de maladies affectant la surface oculaire. Ainsi, la tolérance et l’efficacité de composés nouveaux et déjà existants seront évaluées dans des modèles expérimentaux animaux afin de comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies ainsi que les mécanismes d'action des traitements proposés.

Bénéfices attendus

Ce projet consiste en des tests précliniques de toxicité et d’efficacité en utilisant des modèles expérimentaux animaux pertinents qui doivent être réalisés au préalable pour évaluer la sécurité et l'efficacité de ces médicaments avant d’aller chez l’homme. Les maladies oculaires, de manière générale, ont tendance à provoquer de nombreux effets délétères chez les patients touchés, en plus du risque de cécité permanente. Cependant, parmi le vaste groupe de maladies pouvant affecter l'œil, il en existe certaines qui sont considérées comme rares et qui, malgré leur gravité, ne sont généralement pas une priorité en termes de recherche et de développement, précisément en raison de leur faible incidence et prévalence dans la population en général. En Europe, environ 30 millions de personnes souffrent de cécité et de déficience visuelle. Il est estimé qu’il y a environ 500 000 patients qui souffrent de maladies rares de la surface oculaire, ce qui représente environ 1.7 pour cent de la population totale atteinte de déficiences visuelles et de cécité eu Europe. Parmi ces maladies rares, la néovascularisation cornéenne conduisant au rejet de greffe et à la cécité représente une prévalence de 1 à 10 cas pour 50 000 personnes. Le déficit en cellules souches limbiques, une autre maladie rare de la surface oculaire dans laquelle les patients présentent une altération de la cicatrisation épithéliale cornéenne et des ulcères cornéens chroniques pouvant mener à des perforations cornéennes, représente une prévalence de 1 cas pour 8 000 personnes en Europe. Dans ce contexte, les études précliniques revêtent d’une importance primordiale pour filtrer et proposer des schémas thérapeutiques qui pourront être transposés aux patients, tout en garantissant la sécurité des doses proposées avec le moins d'effets indésirables possible. Tous les médicaments suggérés présentent des données préliminaires montrant des effets remarquables dans la restauration de la physiologie cellulaire, immunitaire, avasculaire, neuronale et environnementale de signalisation dans la cornée dans le contexte de maladies rares, depuis les modèles animaux jusqu'aux essais cliniques. Les résultats attendus dans ce projet sont susceptibles de constituer une avancée majeure pour les patients qui souffrent depuis trop longtemps de maladies débilitantes et progressives sans avoir accès à un traitement adéquat et abordable.

Procédures

L’induction des modèles pathologiques dure entre 10 à 15 minutes. Les lésions cornéennes sont réalisées après anesthésie générale et locale. Un analgésique est également administré 30 minutes avant la réalisation de l’acte. Suivant le modèle utilisé, l’analgésique est administré pendant 3 à 5 jours après l’induction de la lésion cornéenne. L’évaluation de la douleur est réalisée par un test comportemental en appliquant une pression sur la patte et en mesurant la réponse de retrait ainsi qu’en observant les signes comportementaux. Les collyres sont administrés à l’aide d’un flacon contenant un compte-gouttes dans les deux yeux. L’administration des gouttes est réalisée sur animal vigile par contention physique. Les injections sous-conjonctivales se réalisent sous microscope opératoire après anesthésie générale. L’acte ne dure que quelques secondes. Les examens in vivo afin d’évaluer la morphologie et la transparence cornéennes sont réalisés après anesthésie générale et durent entre 5 à 10 minutes chacun. Pour l’évaluation de la toxicité des gouttes, des examens in vivo sont réalisés le premier jour puis 7 jours après sur l’ensemble des animaux. Pour l’évaluation de la toxicité du traitement administré en sous-conjonctival, les examens in vivo sont réalisés le premier jour puis 4 jours après sur l’ensemble des animaux. Dans le modèle expérimental de cicatrisation cornéenne, les examens in vivo sont réalisés à avant l’induction du modèle puis après 6h, 24h, 48h et 72h sur l’ensemble des groupes expérimentaux. Dans le modèle expérimental de dommages cornéennes induites par l’exposition au rayonnement ultraviolet B (UVB), les examens in vivo sont réalisés avant l’induction du modèle puis 3, 5, 7, 10, 14 et 16 jours après sur l’ensemble des animaux. Un examen d’angiographie in vivo pour la visualisation des néovaisseaux cornéens est réalisé une seule fois au 14ème jour. Dans le modèle expérimental d’insuffisance limbique, les examens in vivo sont réalisés le premier jour puis 3, 7 et 14 jours après sur l’ensemble des animaux.

Impact sur les animaux

Les traitements évalués dans ce projet ne contiennent que des excipients connus et approuvés pour un usage oculaire et des études antérieures ont montré que ces excipients n’entraînent pas ou très peu d’effets indésirables. Les doses sont faibles étant donné que les formulations sont administrées localement. La quantité de produit qui traverse les barrières oculaires et se retrouve dans le sang est négligeable. La préhension des animaux vigiles et l’administration topique des formulations en contention physique peuvent entraîner un stress. Avant l’induction des modèles expérimentaux, les animaux sont anesthésiés par voie générale en intrapéritonéal. L’injection peut entraîner une douleur lors de la piqure et l’anesthésie peut mener à des problèmes respiratoires, dépression ou encore d’hypothermie. Après l’induction des modèles expérimentaux, les animaux sont susceptibles de ressentir une douleur. Une infection de la surface oculaire comprenant des rougeurs et des sécrétions peut également survenir après l’induction des modèles.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés à différents délais pour le prélèvement de tissus oculaires afin de mieux analyser les effets des traitements à l’issue de toutes les procédures.

Remplacement

Avant de passer chez l’homme, il est impératif d’évaluer la toxicité des molécules dans des modèles pertinents qui se rapprochent le plus possible des mécanismes complexes chez l’homme. Les rongeurs restent l’une des espèces la plus utilisée pour l’évaluation de la tolérance des médicaments dans le domaine de l’ophtalmologie. Des modèles expérimentaux animaux seront également utilisés afin d’étudier les mécanismes physiopathologiques visibles uniquement à l’échelle de l’animal. Travailler sur l’animal entier est devenu une nécessité pour étudier les mécanismes physiopathologiques intégrés, les lignées cellulaires ne pouvant pas reproduire les mécanismes complexes d’adaptation d’un organisme. Toutes les études plus spécifiques sur les mécanismes plus délimités seront effectuées avec des cultures cellulaires. Dans cette étude, il est impératif de passer par l’animal avant de procéder à des tests cliniques chez l’homme.

Réduction

Au total, 2400 rats seront utilisés dans ce projet qui englobe l’évaluation de la toxicité et de l’efficacité de 5 molécules à potentiel thérapeutique pour des maladies rares de la surface oculaire. Une étude de la littérature ainsi qu’une estimation grâce à un test de puissance ont été réalisées pour s’assurer de la faisabilité du projet ainsi que pour estimer le nombre d’animaux nécessaires. Cela permettra également de mettre en évidence des différences statistiques entre les résultats de nos différents groupes. Les analyses in vivo dans le temps chez le même animal permettront de diminuer le nombre d’animaux euthanasiés.

Raffinement

Une semaine d’acclimatation est mise en place avant toute manipulation des animaux. Ceci leur permet de récupérer de leur transport et de s’habituer aux nouvelles conditions de vie. Les rats seront hébergés en portoirs ventilés en pression positive avec enrichissement du milieu tunnels en carton ou en plastique et ou maison en plastique au sol ou accrochée à la grille afin que ces derniers soient dans un environnement qui leur soit le plus adapté possible. La stabulation sera conventionnelle et les animaux recevront un régime alimentaire normal. Ils seront suivis quotidiennement pendant les périodes d’évaluation, ainsi que pendant les phases de repos afin de s’assurer de leur bien-être et de pouvoir apporter rapidement des soins le cas échéant. Les animaux sont anesthésiés par voie générale et locale lors de l’induction des modèles expérimentaux. Afin d’éviter l’hypothermie pendant l’anesthésie, les animaux sont placés sur tapis chauffant. Les procédures utilisées dans le projet pouvant entraîner une souffrance modérée pour les animaux, des mesures de prévention et des points limites précoces ont été mis en place afin de réduire ou éviter la douleur. Les animaux seront pesés avant l’induction des modèles expérimentaux puis pendant toute la durée des procédures.

Choix des espèces

Les rongeurs dont les rats sont l’une des espèces les plus choisies car il s’agit d’un modèle établi pour le développement de différentes pathologies dont des maladies oculaires humaines de la surface oculaire. Par ailleurs, il existe de nombreux outils d’analyse en ophtalmologie qui ont été développés notamment pour la réalisation d’examens fonctionnels in vivo. Par rapport à la souris, le rat est plus facile à manipuler pour l’induction des modèles expérimentaux. La taille de l’œil du rat est plus importante que celle de la souris, ce qui permet une meilleure manipulation, un meilleur contrôle et reproductibilité lors de l’induction des modèles et facilite la réalisation des imageries in vivo. Des rats jeunes adultes entre 6 à 8 semaines et entre 10 à 12 semaines seront utilisés dans ce projet. L’âge choisi est en accord avec ce qui est fait dans la littérature pour ces types d’expériences et de modèles expérimentaux. Il s’agit de modèles de pathologies survenant à l’âge adulte.