Procédures légères

Le protocole d'administration dépend des molécules confiées par les clients du laboratoire. 2 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements immunologiques et histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à 162 administrations de composés et d'allergènes, jusqu'à deux fois par jour, et subir jusqu'à douze prélèvements sanguins sur animal vigile. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace l'"animal entier", et précise que ses clients s'engagent à recourir au modèle animal faute d'autre solution connue d'eux.

Objectifs

L’asthme allergique est un type d’asthme qui est déclenché ou aggravé par des allergies. L’exposition à des allergènes, comme le pollen, les squames d'animaux, les moisissures, ou à des irritants peut augmenter les symptômes et provoquer une crise d’asthme chez les personnes souffrant d’asthme allergique. 300 millions de personnes sont atteintes d’asthme allergique à travers le monde et 80 % des asthmes sont d’origine allergique. L’asthme touche environ 4 millions de personnes en France et est associé à plus de 60 000 hospitalisations et à près de 900 décès par an. L’asthme est un syndrome inflammatoire chronique de la muqueuse bronchique dans lequel de nombreuses cellules jouent un rôle dans un processus en cascade. Chez des individus prédisposés, cette inflammation cause des épisodes récurrents de sifflements, essoufflements (dyspnée), oppression thoracique et toux, particulièrement la nuit et/ou au petit matin. Ces symptômes accompagnent habituellement une limitation du flux aérien qui est, au moins en partie, réversible (soit spontanément, soit par action thérapeutique). L’inflammation est également la cause associée d’une augmentation de la réactivité des voies aériennes à une diversité de stimuli. L’asthme ne se guérit pas, il persiste toute la vie même si des phases de rémission peuvent durer plusieurs années. Pour limiter les crises, il est fondamental d’éliminer les facteurs déclenchants de son environnement. Chez les patients atteints d’asthme modéré à sévère, le contrôle de la maladie repose sur un traitement de fond (corticostéroïdes inhalés ou des anti-leucotriènes qui peuvent être associés à un ou deux bronchodilatateurs de longue durée d’action) à prendre quotidiennement et un traitement de crise (bronchodilatateurs d’action rapide parfois associés à des corticostéroïdes inhalés, qui permettent quant à eux de limiter l’intensité des symptômes). En cas d’asthme léger, un traitement de crise peut être prescrit seul. Ce projet est un renouvellement, qui vise à étudier de nouveaux traitements contre le remodelage pulmonaire responsable des symptômes de la maladie dans un modèle d’asthme allergique induit par administration d’acariens (HDM : House Dust Mite), ovalbumine (OVA), papaïne (protéase à cystéine fragilisant la barrière épithéliale), pollen de bouleau (BPE : Birch Pollen Extract) ou cytokines (molécules permettant aux cellules du système immunitaire de communiquer entre elles) impliquées dans la réponse asthmatique chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces dernières années, des innovations thérapeutiques majeures ont été réalisées grâce à la compréhension des mécanismes biologiques de l’asthme allergique, et cinq médicaments de thérapie ciblée sont aujourd’hui commercialisés. Ils permettent d’améliorer la prise en charge des patients les plus sévèrement atteints, non contrôlés par les traitements conventionnels. Cependant, les traitements actuels ne font que contrôler les manifestations de l’asthme : ils ne permettent pas de le guérir. Pour cela, le processus de remodelage bronchique devrait être inversé afin que le tissu des bronches revienne à la normale. Les investigations actuelles visent donc à identifier les différentes voies biologiques à l’origine du remodelage, pour pouvoir ensuite proposer des traitements ciblés. Le but est ici d'étudier ces pistes thérapeutiques. Dans notre projet précédent, nous avons pu identifier 12 molécules qui ont eu un effet bénéfique sur les animaux traités à savoir une diminution de l’inflammation et/ou une amélioration de la fonction pulmonaire. Nous espérons dans ce nouveau projet pouvoir identifier de nouvelles molécules prometteuses.

Procédures

Prélèvements de sang : maximum 12 prélèvements (1 fois par semaine maximum, 30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/souris). Administrations de composés + allergènes : maximum 162 administrations (2x/semaine à 2x/jour selon la voie d’administration; 30 secondes/souris).

Impact sur les animaux

Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie. La douleur pourra générer une perte de poids. L’administration de traitement par injections répétées (1 à 2x /j pour les sous-cutanés, ou 2x/semaine pour les i.v.) pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Pour les traitements en gavage (1 à 2x /j), aucune douleur n'est attendue mis à part un léger stress (quelques secondes) lié à la contention des animaux. Le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire la maladie (douleurs inflammatoires). Sur les études réalisées lors de la DAP précédente, 98.7% de animaux étaient en gravité réelle légère, 0.7% en gravité modéré et 0.6% en sévère.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.

Remplacement

Nous proposons dans ce projet de mettre en place un modèle d’asthme allergique chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies dans le cadre d’une monothérapie ou d’une combinaison thérapeutique. Ces nouvelles thérapies sont en premier lieu testées et validées sur des lignées cellulaires afin de sélectionner les doses à appliquer in vivo pour l'étude d'efficacité. Cependant, les méthodes substitutives à l’expérimentation animale ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament, tests nécessaires avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires. Nos clients s'engagent à ce que la toxicité des composés ainsi que du véhicule fourni soit validée in vitro sur des modèles pertinents avant leur passage en étude in vivo. Ils s’engagent également à recourir au modèle animal car il n’existe pas à leur connaissance d’autre modèle à même d’évaluer l’efficacité de leur molécule.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire (10 souris/groupe) pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 2 variables.

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré et des croquettes humides seront ajoutés dans les cages. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Dans le cas d'une analyse de la capacité pulmonaire, la pléthysmographie sera effectuée sous anesthésie générale avec administration d'un analgésique et anesthésique local. La température corporelle sera maintenue constante entre 37 et 38°C par un tapis chauffant. Dans la précédente DAP clôturée, 0.7% d’animaux ont été en gravité modéré et 0.6% en sévère sur la totalité des études réalisées. Nous avons choisi ici de raffiner la grille de scoring en ajoutant de la buprénorphine (en plus de l’ajout de croquettes humides dans la cage) dès qu’un animal se situera en surveillance renforcée. Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec des enrichissements que nous ferons varier au cours de l’étude : cylindres de coton, des frisures kraft ainsi que des dômes/tunnels et objet de rongeage en bois dès leur arrivée. Cela permettra de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - Nos modèles d'études ont été développés sur les souches de souris dont les génomes possèdent 99% de similitude avec le génome humain, et ne présentent aucun gène manquant ou supplémentaire pouvant modifier l’intensité de la réponse immunitaire attendue. - La souris est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettent la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. - Le modèle d’asthme allergique est très bien décrit dans la littérature chez la souris et mis en place depuis plusieurs années au laboratoire. Les animaux sont utilisés au stade adulte (7 semaines minimum) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature

Les souris naissent dans l'élevage du projet, subissent une biopsie de la queue dès l'âge de dix jours pour établir leur génotype, et celles qui portent le mauvais génotype ou qui sont des femelles sont tuées sans avoir servi. 31 200 souris vont être utilisées au total, 26 880 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 4 320 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever le foie et le tissu adipeux. Les animaux retenus reçoivent jusqu'à 72 injections, des gavages, un régime gras, occidental ou cétogène pendant une à vingt-quatre semaines, deux mises à jeun et une semaine seuls en cage métabolique. Le porteur annonce trente souris par groupe expérimental, sans expliquer comment ce chiffre conduit à 31 200 animaux.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche fondamentale est de décrypter le rôle d'une molécule du métabolisme dans les maladies métaboliques à l’aide d’un modèle de souris dans lequel le gène étudié est invalidé spécifiquement dans un certain type de cellules immunitaires.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche apportera des connaissances fondamentales nécessaires au développement de thérapies ciblées sur ldes celulles immunitaires du foie et du tissu adipeux. Des médicaments pourraient être developpés pour inhiber/activer spécifiquement les voies métaboliques liées à une molécule du métabolisme et spécifiques de ces ceulles immunitaires.

Procédures

Les souris seront soumises à des interventions non chirurgicales sur animaux vigiles, incluant une biopsie de l’extrémité de la queue pour génotypage réalisée à l’âge de 10 jours (1 × ~5 s), des microcoupures de la queue pour prélèvements sanguins (jusqu’à 3 × ~5 s), une mise sous régime particulier (qui peut aller de 1 à 24 semaines) des injections (~10 s, jusqu’à 72 maximum, des gavages oraux (~10 s, jusqu’à 2 administrations par animal, ainsi que des périodes de mise à jeun de 6 h ou 12 h (selon le test) (2 mises à jeun maximum par animal espacés de 2 semaines).

Impact sur les animaux

Régimes riches (HFD, WD) : prise de poids progressive et diminution modérée de l’activité. Régime cétogène (KD) : perte de poids transitoire en phase initiale. Isolement en cage métabolique : stress modéré lié à l’isolement et au changement d’environnement pendant une semaine. Injection intrapéritonéale (IP) : douleur légère liée à la piqûre. Microcoupure à la queue : douleur modérée au moment du geste. Mise à jeun : gêne liée à la privation alimentaire. Gavage : stress lié à la contention et à l’administration. Biopsie de l’extrémité de la queue à 10 jours pour génotypage : douleur modérée lors de la réalisation.

Devenir

Les animaux non utilisés (femelles et/ou de mauvais génotype) sont mis a mort. Des animaux femelles et males avec le bon génotype sont gardés en vie pour la reproduction puis mis à mort en fin d'accouplement. L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour récupérer les tissus d'intérêt, notamment le foie pour analyse ultérieures.

Remplacement

Les méthodes alternatives comme les cultures cellulaires ou les modèles informatiques ne permettent pas de reproduire toute la complexité du fonctionnement d’un organisme vivant. En particulier, elles ne permettent pas d’étudier correctement les interactions entre les organes ni les effets des régimes alimentaires ou des traitements sur l’ensemble du corps. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire pour comprendre le rôle des cellules immunitaires dans le foie et le tissu adipeux dans des conditions proches de la réalité. Ces études permettront d’identifier des mécanismes importants pour la santé et pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Plusieurs tissus sont prélevés après la mise à mort afin d’obtenir un maximum d’informations à partir de chaque animal. Le nombre de souris par groupe (n=30) a été déterminé à partir de données scientifiques et de calculs statistiques.

Raffinement

Les points limites définis dans le projet seront strictement appliqués afin de limiter au maximum la douleur et la souffrance. Les injections seront réalisées avec des aiguilles fines en alternant les sites, et le gavage avec une sonde souple pour réduire les risques. Une grille de suivi adaptée sera utilisée si nécessaire. Les manipulations seront effectuées par du personnel formé

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité. Les gènes impliqués dans cette condition jusqu'à présent identifiés chez l'Homme sont conservés chez la souris. De plus de nombreux outils sont disponibles sur le modèle souris. A 10 jours, toutes les souris jeunes seront biopsiés afin d'attribuer le bon génotype. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront entre 8 et 10 semaines au début de la procédure (qui correspond à l'âge optimal pour débuter un régime).

Pour comprendre pourquoi l'obésité abîme davantage les mâles que les femelles, ce projet cible des cellules immunitaires du cerveau, les microglies de l'hypothalamus. 2 952 souris vont être utilisées, 2 880 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 72 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie du crâne d'une à une heure et demie avec injection d'un gène dans le cerveau, parfois la pose d'une fibre optique, trois à quatre semaines de récupération, puis une semaine de tests de récompense et d'évitement à raison de deux heures par jour, certaines recevant une injection abdominale dont l'effet dure six heures. Le porteur annonce l'arrêt immédiat de l'expérience si l'état d'un animal se dégrade, sans indiquer les seuils qui déclenchent cette décision.

Objectifs

Le but du projet est de comprendre comment certaines cellules du système nerveux, nommées « microglies » influent sur les troubles métaboliques liés à l’obésité, tout en prenant compte l’impact du sexe dans ce fonctionnement. Nous nous intéresserons plus particulièrement à un type spécifique de neurones situés dans l’hypothalamus. Le projet se déroule en deux grandes étapes : 1) caractériser quelles cellules de cette structure qui s’activent lors de la prise de nourriture grasse, 2) étudier leur rôle dans différents schémas de nourrissage.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre pourquoi l’obésité n’entraîne pas les mêmes complications chez les mâles et les femelles. En comparant des mâles plus vulnérables et des femelles plus résistantes aux troubles métaboliques, nous cherchons à identifier les mécanismes biologiques qui expliquent ces différences. Nous étudions en particulier le rôle de certaines cellules du cerveau appelées microglies, qui participent aux réactions inflammatoires. Mieux comprendre leur fonctionnement dans l’obésité est une étape essentielle avant d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de traitements plus ciblés et mieux adaptés aux différences entre les sexes, afin d’améliorer la prise en charge des patients souffrant de complications liées à l’obésité.

Procédures

Les souris seront soumises à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale, au cours de laquelle une injection sera réalisée dans le cerveau afin d’introduire un gène permettant d’étudier l’activité de certains neurones. Selon les cas, un dispositif optique très fin pourra également être implanté pour observer ou contrôler cette activité. L’intervention dure environ une à une heure et demie et se déroule avec une prise en charge de la douleur avant et après l’opération. Une période de récupération de trois à quatre semaines est ensuite prévue. Après cette phase de récupération, les souris participeront à des tests comportementaux pendant une durée maximale d’une semaine, à raison de deux heures par jour au maximum. Ces tests permettront d’évaluer des apprentissages liés au plaisir (récompense) ou à l’évitement (réactions face à une situation désagréable). Pour certaines souris, une injection dans l’abdomen sera réalisée environ 30 minutes avant les tests afin de moduler temporairement l’activité de certains neurones, en les activant ou en les inhibant. Cette injection est très rapide et ses effets durent 6 heures. Au total, la durée complète du protocole pour chaque animal est estimée à environ cinq semaines, comprenant la chirurgie, la période de récupération, les tests comportementaux et les injections.

Impact sur les animaux

Les interventions chirurgicales réalisées chez les souris peuvent entraîner des effets indésirables temporaires. Après l’opération, les animaux peuvent ressentir une douleur ou un inconfort liés aux petites ouvertures pratiquées au niveau du crâne et aux points de suture. Ces effets peuvent s’accompagner d’une inflammation locale (rougeur, sensibilité), d’un risque limité d’irritation ou d’infection, ainsi que d’une baisse temporaire de l’activité ou du poids. Ces signes sont généralement modérés et disparaissent en quelques jours. L’utilisation de certaines souris génétiquement modifiées nécessite l’administration d’un antibiotique qui peut provoquer de légers troubles digestifs passagers. Enfin, certaines étapes de l’étude impliquent un isolement temporaire des souris pendant plusieurs semaines. Cet isolement, bien que nécessaire pour le bon déroulement de l’expérience, peut représenter une source de stress pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Quand cela sera necessaire, nous récupèrerons les cerveaux pour des analyses post mortem afin de récupérer les données d’intérêt et de s’assurer de la validité des chirurgies.

Remplacement

La réalisation de ce projet repose sur l’utilisation de souris génétiquement modifiées, permettant d’identifier précisément certaines populations de neurones activées à un moment précis (pendant la prise alimentaire). Ce modèle offre la possibilité d’évaluer comment des modifications ciblées dans certaines régions du cerveau influencent le comportement de prise alimentaire. À ce jour, la souris reste l’organisme le plus adapté pour combiner ces approches génétiques avec des analyses comportementales et fonctionnelles.

Réduction

Les effectifs d’animaux ont été ramenés au minimum, permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique dédié d’après des données préliminaires disponibles au sein de l’équipe, afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires. Les souris passées en comportement appétitif seront également utilisées pour le comportement aversif, réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Après chaque intervention chirurgicale, l’état des animaux sera surveillé attentivement pendant au moins deux jours. Un suivi quotidien permettra de vérifier leur comportement général, leur niveau de confort, l’aspect de la zone opérée et l’évolution de leur poids. Si des signes de souffrance ou une dégradation de leur état sont observés, l’expérience sera immédiatement interrompue et des mesures adaptées seront mises en place. Avant les tests comportementaux, les animaux seront manipulés régulièrement afin de les habituer à la présence des expérimentateurs et de réduire leur stress. Leur état de santé sera suivi tout au long du projet. Lorsque les souris seront hébergées individuellement, des aménagements supplémentaires (matériaux de nidification et dispositifs permettant de se cacher ou se reposer) seront fournis afin d’améliorer leur confort, tout en maintenant un contact visuel et olfactif avec les congénères. Pendant les interventions chirurgicales intracérébrales, les paramètres physiologiques seront surveillés en continu. La température corporelle sera maintenue à l’aide d’un dispositif adapté, un gel ophtalmique lubrifiant stérile sera appliqué dès l’induction de l’anesthésie afin de prévenir toute dessiccation cornéenne, et une hydratation adaptée sera assurée. Des mesures analgésiques et anti-inflammatoires seront systématiquement administrées avant et après l’intervention afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort.

Choix des espèces

Les souris fournissent des excellents modèles pour l'étude des réseaux neuronaux, au cœur de notre projet. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical, et son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Ce modèle est parfaitement maîtrisé pour ce type d’expérimentation, tant sur le plan des techniques utilisées que sur celui des conditions d’hébergement et de bien-être animal. Il est admis qu’à 12 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures concernant la chirurgie prévue dans le projet. Les souris ne seront plus utilisées au-delà de 11 mois, afin de limiter l’apparition de facteurs liés au vieillissement pouvant interférer avec les analyses.

Quatre mois d'administration nasale trois fois par semaine, trois séances d'IRM sous sédation de deux heures et demie, deux tests d'anxiété par semaine dont une suspension par la queue, puis un mois seule en cage pour installer un état dépressif : 320 souris modèles de la maladie d'Alzheimer et de la trisomie 21 vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 64 d'entre elles et modéré pour 256. Le porteur présente cet isolement d'un mois comme le meilleur compromis pour éviter des "souffrances psychologiques inutiles", alors qu'il sert à produire la détresse même que le projet veut mesurer. Il indique aussi que chaque sédation peut abaisser les défenses immunitaires des souris, tout en qualifiant l'IRM de non invasive et indolore. Les souris utilisées pour caler le protocole d'imagerie pourront être réutilisées dans d'autres procédures ou dans des projets d'enseignement, les autres étant tuées pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Plusieurs études scientifiques montrent l’importance de la neuroinflammation, c’est-à-dire l’inflammation du cerveau, dans l’aggravation des lésions cérébrales au cours de la maladie d’Alzheimer et l’intérêt de développer une approche thérapeutique la ciblant. Récemment, une nouvelle approche thérapeutique a été testée : il s’agit d’administrer un présentant des propriétés favorisant la prolifération des certains types cellulaires du cerveau et la protection des neurones. Il a été démontré que ce peptide favorisait la mémoire spatiale et l’activation de cellules qui combattent l’inflammation neuronale. Sur la base de cet effet bénéfique, nous souhaitons tester son potentiel thérapeutique pour la maladie d'Alzheimer (MA). Pour cela, nous utiliserons des souris modèles pour la MA, mais aussi pour la Trisomie 21 humaine, une pathologie associée à un risque très élevé de développer une maladie d'Alzheimer en vieillissant. La dépression est également étroitement liée à la MA et à la Trisomie 21, et est donc présente chez de nombreux patients. L'hypothèse que nous faisons ici est que, en traitant l'inflammation et, indirectement, la MA, nous obtiendrons des bénéfices également au niveau de la dépression. Les souris seront traitées avec la molécule à différents stades pour comparer les effets du traitement : avant l’apparition des symptômes de la pathologie neurodégénérative et à un stade plus avancé. Des tests comportementaux et des acquisitions d’IRM fonctionnelles seront corrélés aux informations déjà obtenues sur l’impact sur les mécanismes neuro-inflammatoires. Les tests comportementaux fournissent des informations sur certaines fonctions cérébrales, comme la mémoire spatiale. Grâce à l'IRMf, en revanche, on peut mesurer de manière non invasive à la fois le niveau d'inflammation du cerveau - et la qualité des connexions entre les régions cérébrales paramètre utilisé pour suivre certains troubles cognitifs.

Bénéfices attendus

Cette recherche doit permettre de déterminer si la molécule testée a des effets bénéfiques, en particulier anti-inflammatoires, sur la survenue et la progression de la maladie d’Alzheimer. Si les résultats sont positifs, alors d’autres études pourront être conduites jusqu’en clinique de ce candidat-médicament pour les patients atteints de maladies neurodégénératives, comme la MA et la trisomie 21.L’induction de la dépression par l’isolement social pourrait entraîner un déficit de toilettage chez l’animal, accompagné d’une perte transitoire de poids.

Procédures

Les interventions auxquelles les souris sont soumises sont les suivantes : - un traitement prolongé de 4 mois avec la molécule en question par voie nasale de la durée de quelques seconds, trois fois par semaine en vigile. - Trois séances d'imagerie de 2,5 heures maximum par résonance magnétique sous sédation pour mesurer le niveau de connectivité cérébrale. - Enfin, des tests comportementaux d'une durée maximale de 15 minutes, deux fois par semaine avec un jour de repos entre les deux, compléteront les informations obtenues par imagerie afin d’évaluer le niveau d’anxiété des animaux. Les deux tests employés visent à déterminer quel comportement un animal privilégie : celui provoqué par sa motivation naturelle ou celui influencé par un niveau d’anxiété élevé. Ainsi, un de tests vise à comparer le temps passé dans des couloirs fermés à celui passé dans des couloirs ouverts (moindre si l’animal est plus stressé). Le test de suspension vise à comparer le temps passé à essayer de se libérer à celui passé immobile (plus élevé lorsque l’animal est stressé). - À la fin de la période de traitement, les souris seront hébergées pendant un mois dans des cages individuelles afin de produire un état favorisant la dépression. - La coupe de la queue pour le génotypage est un peu douloureuse.

Impact sur les animaux

L’administration de la molécule peut éventuellement générer un stress léger lié à la manipulation de l’animal par un opérateur. Les séances d'IRM seront espacées d'au moins un mois et nécessiteront une sédation légère, mais chaque sédation peut baisser les défenses immunitaires et fragiliser les souris. La pose du cathéter sous-cutané, nécessaire pour maintenir la sédation lors de certaines sessions d'IRM, pourrait être gênante Le stress pour l'animal, induit par les tests comportementaux. L'hébergement individuel temporaire des souris dans des cages individuelles induira un état de dépression.

Devenir

Une partie des souris vont servir à optimiser un protocole d’IRM fonctionnelle. Elles n’auront pas eu d’injection de la molécule candidate. A l’issue de cette procédure, elles pourront être réutilisées dans une autre procédure ou dans le cadre de projets à des fins d'enseignement. Pour une autre partie, en revanche, il sera nécessaire d’euthanasier les animaux pour récupérer leur cerveau pour des études ultérieures ex vivo, indispensables pour s’assurer de la validité des résultats obtenus par IRM fonctionnelle.

Remplacement

Ce projet de recherche vise à valider in vivo les effets thérapeutiques d’une molécule sur la maladie d’Alzheimer. Il n’existe aujourd’hui aucune méthode alternative (modèle ex vivo ou computationnel) permettant de modéliser la complexité des mécanismes moléculaires, cellulaires, physiologiques inhérent à ce projet. L'utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques et tester de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Le recours à l’IRM permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce protocole : c’est un outil puissant capable d’explorer de manière non invasive de multiples paramètres en une seule séance et adapté au suivi au cours du temps. Nous avons effectué des analyses statistiques basées sur des données précédemment acquises nous permettant de constituer des groupes avec un nombre d’animaux le plus petit possible et garantissant une validité statistique de nos résultats. De plus, l'un des protocoles expérimentaux décrits ici prévoit l'optimisation du protocole utilisé pour anesthésier les souris pendant un scan IRMf, et les souris issues de ce protocole pourront être réutilisées à des fins pédagogiques. Enfin, nous procéderons à une vérification minutieuse et continue des articles scientifiques publiés, afin d'éviter toute répétition inutile des protocoles expérimentaux.

Raffinement

Les IRM, non invasives et indolores, seront réalisées sous anesthésie par un opérateur qualifié. L'anesthésie pourra être réalisée sous forme gazeuse ou injectable (anesthésique ou sédatif administré par cathéter sous-cutané, selon les besoins expérimentaux). Chaque session IRM ne dépassera pas 2,5 heures. La fréquence respiratoire des animaux sera surveillée en continu tout au long de l'examen afin de détecter tout effet indésirable. Lors des séances d’IRM, la tête des animaux sera immobilisée à l’aide d’un dispositif de maintien adapté, afin d’éviter les mouvements pendant l’enregistrement des images. Pour limiter tout inconfort, une anesthésie locale sera appliquée aux oreilles avant la mise en place du dispositif. Les animaux seront maintenus au chaud grâce à un tapis chauffant adapté, afin de prévenir toute hypothermie pendant la procédure. L’hébergement individuel nécessaire pour induire un état dépressif a été réduit à un seul mois. Des études précédentes ont montré que ce délai d'un mois est le meilleur compromis entre l'efficacité, en termes de dépression, et la brièveté, pour éviter des souffrances psychologiques inutiles. Nous avons établi une liste détaillée des points limites, avec des interventions spécifiques à mettre en œuvre pour assurer un contrôle continu du bien-être animal et une réponse rapide à d'éventuels effets secondaires des traitements et expériences prévus.

Choix des espèces

Les souris représentent la quasi-totalité des modèles connus pour la maladie d'Alzheimer et la trisomie 21. De plus, la quantité et la qualité des études des connexions entre différentes régions cérébrales déjà menées sur la souris ont permis non seulement d'optimiser les protocoles d'acquisition et d'analyse des données, mais aussi d'établir des comparaisons directes avec la connectivité du cerveau humain, qui ont montré un haut niveau de similitude. Enfin, la souris permet de suivre l'évolution de la pathologie en l'espace de quelques mois. L'âge des souris à utiliser est déterminé implicitement par les phases par rapport auxquelles nous voulons étudier les effets bénéfiques de la molécule sur la maladie d'Alzheimer.

Trois chirurgies du crâne d'une heure chacune, puis une vingtaine de sessions d'enregistrement de trente minutes avec un microscope miniature fixé sur la tête : 660 souris vont être utilisées, 140 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 520 dans des procédures d'un niveau modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur décrit des dommages osseux et tissulaires, des douleurs, des pertes de poids et une mobilité réduite, et fait porter en permanence aux animaux un faux appareil du même poids pour les y habituer. Pendant les 80 sessions de recherche de nourriture, les souris sont soumises à une restriction alimentaire. Le porteur teste aussi une lignée Shank comme modèle d'autisme, dont il annonce surveiller l'apparition de stéréotypies, et qu'il désigne comme une "lignée dommageable".

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment le cerveau utilise les informations sensorielles pour guider le comportement et les mouvements. Dans une première partie, nous observerons l’activité du cerveau chez des souris se déplaçant librement grâce à de petits microscopes miniatures. Nous cherchons à comprendre comment le cerveau permet à l’animal de s’orienter dans l’espace et de choisir les informations sensorielles les plus utiles (par exemple des odeurs, des repères visuels ou des sons) pour trouver une récompense. Pour cela, nous ferons varier ces indices sensoriels afin d’étudier comment le cerveau s’adapte lorsque les informations changent. Dans une seconde partie, nous étudierons une autre région du cerveau impliquée dans la coordination des mouvements. Cette région permet notamment d’ajuster les gestes en temps réel lors des déplacements. Nous mesurerons l’activité de différents neurones pendant que les souris réalisent des tâches motrices, afin de mieux comprendre comment le cerveau coordonne les mouvements de manière précise. L’ensemble de ce projet contribuera à améliorer notre compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans l’orientation et le contrôle des mouvements.

Bénéfices attendus

Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles qui permettent au cerveau de s'orienter dans l'environnement et d'effectuer des tâches motrices complexes. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment le cerveau est capable d’orienter et d’orchestrer le mouvement dans des conditions physiologiques. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures concernées est nécessaire pour permettre un traitement des pathologies neurologiques liées à des dysfonctionnements moteurs et à des déficits d'orientation. Un modèle murin autistique est également testé dans le cadre d'une tâche locomotrice.

Procédures

Approche 1 : Étude de l’activité cérébrale pour comprendre le rôle du système de direction de la tête dans la navigation spatiale : 23 interventions :: Les souris seront soumises à 3 interventions chirurgicales pour permettre la mesure optique de l'activité neuronale. Ces interventions chirurgicales durent 1 heure. Les souris participeront ensuite à environ 20 sessions de tests comportementaux pendant lesquelles leurs mouvements et l'activité cérébrale seront mesurés. Chacun de ces enregistrements dure de 30 minutes, avec un maximum de deux par jour. Approche 2 : Enregistrement simultané de l’activité cérébrale pour explorer comment le cerveau contrôle les mouvements : 23 interventions :: Les souris seront soumises à 3 interventions chirurgicales pour permettre la mesure optique de l'activité neuronale. Ces interventions chirurgicales durent 1 heure. Les souris participeront ensuite à environ 20 sessions de tests comportementaux pendant lesquelles leurs mouvements et l'activité cérébrale seront mesurés. Chacun de ces enregistrements dure de 30 minutes, avec un maximum de deux par jour. Approche 3 : Tâche de localisation de récompense basée sur des indices sensoriels variables : 80 sessions de recherche de nourriture:: Les souris sont soumises à une tâche de recherche de nourriture consistant à chercher des récompenses alimentaires. La tâche est effectuée jusqu'à 4 fois par jour pendant une période pouvant aller jusqu'à quatre semaines. Afin de motiver les animaux à rechercher des récompenses alimentaires pendant la tâche de navigation spatiale, leur alimentation est restreinte et leur poids est étroitement surveillé (Approche 1 and 3).

Impact sur les animaux

Les chirurgies invasives prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. La durée typique de récupération après une opération est 2 jours, période pendant laquelle les animaux sont traités avec des médicaments. Porter le miniscope sur la tête peut induire un stress chez l'animal et réduire sa mobilité. Afin qu'il s'habitue au dispositif, l'animal portera en permanence un mini-scope factice du même poids.

Devenir

Tous les animaux (n = 660) seront mis à mort ; parmi eux, 520 seront utilisés pour des analyses histologiques du cerveau après le protocole expérimental impliquant l’imagerie in vivo.

Remplacement

L'intégration des informations sensorimotrices pendant la navigation spatiale libre implique de multiples régions et réseaux cérébraux. Afin de comprendre le rôle des neurones dans le comportement moteur et l'orientation, il est donc primordial de réaliser des expériences sur animal vivant et libre de ses movements afin de conserver la structure et l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents. : Il s’agit d’un projet de neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, cette étude d'activité neuronale in vivo est réalisée avec des implants chroniques. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour de nombreuses sessions (4-8 semaines) d'enregistrement. De plus, cette étude prévoit d’enregistrer un grand nombre de neurones depuis un seul animal, grâce à l'imagerie calcique de la population. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour de nombreuses sessions d'enregistrement. De plus, l'utilisation de souris des deux sexes permet de réduire davantage le nombre d'animaux produits pour cette étude. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible.

Raffinement

Tous les animaux de cette étude seront gardés dans des cages dans l'animalerie avec leurs congénères. Les cages seront enrichies de roues de course et des rouleaux pour se cacher. Les souris seront maintenues avec eau et nourriture ad libitum, sauf pendant la tâche de recherche de nourriture au cours de laquelle les souris sont soumises à une restriction alimentaire. Leur état général et en particulier le poids sera surveillé de façon quotidienne pendant toute la durée du protocole. Pour éviter toute souffrance, tout signe de douleur, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques et anti-inflammatoires. Une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. La surveillance régulière de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale en cas de signes d’anxiété ou de souffrance définis dans l’échelle d’évaluation. Un raffinement renforcé sera mis en place pour la lignée dommageable (Shank), incluant un enrichissement environnemental adapté (matériel de nidification, structures d’exploration), une manipulation non aversive (tunnel), et une gestion sociale optimisée avec des groupes stables. Un suivi clinique régulier permettra de détecter précocement l’apparition de stéréotypies ou de troubles du comportement, fréquents dans ce modèle.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative. En combinant souris transgénique et injections virales nous serons en mesure de mesurer l’impact fonctionnel d’une population neuronale spécifique. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge où leur activité motrice est arrivée à son niveau mature (>P30) et pendant les deux mois qui suivent. À cet âge, la locomotion est entièrement développée et les structures cérébrales impliquées dans la locomotion et l'orientation sont matures.

Les souris de ce projet développent spontanément un lupus vers six mois, avec des auto-anticorps qui se déposent dans leurs reins et une évolution vers la défaillance rénale sur un an. 1 544 d'entre elles vont être utilisées, 1 124 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 420 dans des procédures d'un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles reçoivent des injections à jours fixes pendant six mois, subissent des prélèvements de sang et des séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse, et près d'un tiers développe une inflammation de la peau aux points d'injection ou de prélèvement. Le porteur qualifie ces procédures d'"indolores" et parle d'un "léger inconfort", alors que la maladie qu'il laisse s'installer conduit ces souris à l'insuffisance rénale.

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but d’étudier en détail les changements et adaptations de certaines cellules issues de différents organes pendant l'évolution d’une maladie auto-immune, le lupus érythémateux systémique (LES), et lors de son traitement par immunothérapie. Le LES est une maladie grave où le système immunitaire, permet pour des raisons encore méconnus le développement des anticorps dirigés contre des protéines de l’organisme par des cellules immunitaires appelées lymphocytes B, des « autoanticorps ». Ceux-ci se déposent principalement dans les reins et la peau et peuvent causer des inflammations de la peau et/ou des atteintes rénales. Malgré les traitements existants, de nombreux patients ne répondent pas bien à ces médicaments, et d’autres développement une résistance au traitement après un certain temps, rendant le traitement inefficace. Aujourd’hui, il est encore impossible de prédire quels patients vont développer des complications graves. Et nous commençons seulement à comprendre pourquoi certains traitements cessent de fonctionner. Notre objectif est de répondre à ces questions et de décrypter les mécanismes de la maladie en observant par des méthodes de pointes les caractéristiques des lymphocytes B évolue au fil du temps, et comment elles réagissent réagit aux traitements. Nous anticipons que ce projet permettra d’identifier des marqueurs précoces de la maladie et des échecs thérapeutiques, permettant une prise en charge plus rapide et mieux adaptée.

Bénéfices attendus

Ce projet va conduire à une meilleure compréhension de l’évolution des différentes populations des cellules immunitaires dans le lupus érythémateux systémique (LES) et des effets des immunothérapies sur ces populations. À terme, cette recherche pourrait permettre de : - développer des traitements plus efficaces notamment pour les patients qui ne répondent pas aux médicaments actuels. - réduire les effets secondaires en ciblant plus précisément les cellules responsables de la maladie. - mieux prédire l’évolution de la maladie grâce à des marqueurs biologiques Ainsi, ce projet devrait sur le long terme contribuer à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes en limitant les poussées inflammatoires et les dommages aux organes.

Procédures

Dans toutes les procédures : L’évaluation de souris implique : - Une observation des animaux sans intervention (2 minutes) - Placement de l’animal (2-3 secondes) dans une boite en plastique jusqu’à la miction. - Transfert de l’animal dans une boite d’anesthésie gazeuse (2-3 secondes) - Pesée de l’animal anesthésié (3 secondes) - Prélèvement de sang sur animal anesthésié (15 secondes). - Dans le cadre de la deuxième procédure, les animaux déjà anesthésiés pour l’évaluation de routine vont en plus recevoir des injections à jours 0,14,28 ensuite tous les 28 jours pendant 6 mois (durée de quelques secondes à chaque fois). Expérience impliquant l’imagerie sur animal vivant : - Transfert de l’animal dans une boite pour l’anesthésie (2-3 secondes) - Injection (quelques secondes) - Installation de l’animal dans l’appareil d’imagerie (5-10 secondes avec maintien de l’anesthésie) - Prise d’image 5-10 minutes

Impact sur les animaux

S’agissant d’un modèle spontané de lupus érythémateux systémique (LES), les souris vont développer progressivement la pathologie autour de l’âge de 6 mois. Dans la suite, la maladie touchera essentiellement les reins. La pathologie se développe sur un an cumulant dans une défaillance rénale. Autre que l’implication rénale, une inflammation spontanée de la peau peut se développer dans une partie (30%) de ces souris, surtout au niveau des sites d’injections ou de prélèvements. Celle-ci va être traitée par des analgésiques locaux selon les conseils des vétérinaires. Les manipulations liées à des procédures sont des très courtes durées et induisent qu’un léger inconfort chez les souris. Plus précisément sont prévues des prélèvements de sang sur animal anesthésié (15 secondes) et dans le cadre de la deuxième procédure, des injections sur des animaux déjà anesthésiés (durée de quelques secondes). L’anesthésie peut provoquer quelques secondes d’angoisse aux moments de l’endormissement et du réveil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes vitaux et pourront donc être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

La pathologie et les thérapies qui vont être étudiées ici résultent de réactions systémiques et impliquent des conséquences au niveau de différents tissus et organes. Ces processus sont complexes, reposant sur les singularités du système immunitaire et des tissus touchés par des dépôts de complexes immuns, processus qui ne peuvent pas être reproduits in vitro. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinent.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé avec l’objectif de réduire ce nombre autant que possible tout en minimisant le « bruit de fond » inhérent à la recherche biologique in vivo. Ce nombre inclut le nombre nécessaire de contrôles et la nécessité de reproduire les résultats. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental.

Raffinement

Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Cela se traduit par : Un suivi rigoureux tout au long de la vie de l’animal : Les animaux seront évalués régulièrement et avec une fréquence croissante selon leur âge pour des signes évoquant un lupus érythémateux systémique (LES) : Lors de ces évaluations nous observons les souris pour les postures et comportements qui pourraient traduire de la douleur, du stress ou de l’inconfort. Nous utiliserons une grille d’évaluation standardisée pour détecter précocement tout signe de détresse et nous mettrons en place des actions pour minimiser toute forme de souffrance pour l’animal. Nous mesurons leurs poids, et suivons différents paramètres dans le sang et l’urine. Cela nous permet d’établir des points limites précis (nécessitant la mise à mort de l’animal) pour chaque procédure, limitant ainsi au maximum une souffrance inutile des animaux. Des procédures indolores : - Les manipulations sont limitées au strict minimum avec le but de minimiser l’angoisse et le stress ressenti par l’animal. Les animaux seront anesthésiés pour les prélèvements sanguins.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Même si le système immunitaire des souris n’est pas identique à celui des humains, ces animaux constituent des modèles fiables et largement utilisés pour étudier des maladies complexes comme celle étudiée ici. Leur utilisation permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et l’induction de la résistance aux traitements. Dans ce projet, nous utiliserons uniquement des souris adultes, âgées de 4 à 12 mois. Ce choix est motivé par le fait que la maladie étudiée se développe naturellement avec l’âge chez les souris, comme chez les humains. Les premiers signes immunologiques, l’apparition d’auto-anticorps, n’apparaissent qu’à partir de 4-6 mois. Utiliser des animaux plus jeunes ne permettrait pas d’étudier la maladie, car elle n’est pas encore déclarée. Les mécanismes immunitaires que nous voulons observer ne sont pleinement actifs qu’à l’âge adulte. Les organes cibles (reins) ne présentent des lésions qu’à un stade avancé de la maladie, soit vers 8 à 12 mois. Finalement, les résistances aux traitements se développent avec le temps, qui nécessite un suivi de souris sur plusieurs mois.