Procédures légères
Thérapie Génique par surexpression de la phosphodiestérase de type 3 chez le rat pour traiter l’insuffisance cardiaque induite par l’hypertension artérielle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Certains rats reçoivent un implant sous-cutané sous anesthésie pour faire monter leur pression artérielle, d'autres des injections, et tous passent des échocardiographies successives sous anesthésie générale de vingt minutes. 160 rats vont être utilisés, 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 40 un niveau léger. Le projet vise à tester si une thérapie génique augmentant l'expression d'une enzyme dans le cœur protège de l'insuffisance cardiaque liée à l'hypertension. Le porteur écrit que le produit injecté devrait soulager les rats traités, tout en surveillant chez les animaux hypertendus l'apparition d'une ascite, d'un œdème pulmonaire, d'une dyspnée et d'une prostration. L'insuffisance cardiaque étant irréversible, indique-t-il, tous les rats sont tués en fin de procédure pour le prélèvement de leurs organes.
Objectifs
L’hypertension artérielle (HTA) est un problème de santé public majeur dont la prévalence est estimée à environ 30% soit 12.7 millions d’adultes en France. La pression artérielle continuellement élevée augmente le travail du cœur afin de maintenir un débit normal. À terme, cette évolution se traduit par une hypertrophie cardiaque et peut progressivement mener à l’insuffisance cardiaque (IC) chronique. Ceci correspond à l’incapacité du coeur à pomper suffisamment le sang pour répondre aux besoins de l’organisme. Un dysfonctionnement du myocarde entraine des conséquences dramatiques qui affectent non seulement le coeur mais également les tissus périphériques et notamment les fonctions pulmonaires, rénales, hépatiques et musculaires. Notre hypothèse générale est que l’augmentation de l’activité des phosphodiestérases dans le coeur pourrait protéger contre la progression de la maladie. Nous avons déjà testé notre hypothèse dans des cultures primaires et validé notre hypothèse générale dans des modèles physiopathologiques mimant d’autres causes de de l'insuffisance cardiaque. L’utilisation d’animaux est indispensable pour l’évaluation de la fonction cardiovasculaire et ne peut être remplacée par des cultures cellulaires (les cellules cardiaques ne se divisent pas). De plus l’évaluation de la fonction cardiaque est à réaliser sur l’animal entier adulte afin de s’approcher le plus possible de la pathologie humaine.
Bénéfices attendus
L’objectif du projet est de tester qu’une thérapie génique permettant l'augmentation de l'expression d'une enzyme, la phosphodiestérase de type 3 (PDE3A) dans le coeur, améliorerait l'activité cardiaque des patients atteints d’hypertension artérielle et éviterait que leur pathologie amène à l’insuffisance cardiaque. Notre stratégie thérapeutique pourrait ainsi constituer une alternative prometteuse ou un complément aux traitements actuels de l'insuffisance cardiaque induite par l’hypertension artérielle.
Procédures
Certains rats subissent des injections sous anesthésie. Cette intervention dure 10 minutes. Certains rats reçoivent un implant sous-cutané sous anesthésie, procédure qui dure 10 minutes. - La mesure de la pression artérielle est réalisée sur animal vigile et l’évaluation de la fonction cardiaque de tous les rats est réalisée sous anesthésie générale pendant 20 minutes par échocardiographies successives (n=160). Pendant des échographies sous anesthésie générale, les animaux subissent une injection.
Impact sur les animaux
Les injections ne provoquent qu'une nuisance légère et transitoire, c'est pour cela qu'elles sont réalisées sous anesthésie pour limiter le stress, après avoir appliqué un gel de lidocaïne au point d'injection pour limiter la douleur. L'injection du produit à visée thérapeutique devrait limiter la progression de l’insuffisance cardiaque et soulager les animaux ainsi traités. Les chirurgies réalisées entraineront des douleurs modérées et transitoires. L’hypertension et l’éventuelle insuffisance cardiaque qui vont ensuite s’installer dans le groupe soumis à traitement pour élever la pression artérielle va s’accompagner des signes cliniques de ces pathologies. Ainsi, l'apparition d’une ascite et un oedème pulmonaire, qui provoquent asthénie, une dyspnée, perte de poids et une prostration sera surveillée.
Devenir
L’insuffisance cardiaque est une pathologie irréversible, les animaux sont donc euthanasiés en fin de procédure. L’ensemble des animaux sera euthanasié pour prélèvements d’organes, ce qui est nécessaire pour permettre l’évaluation du potentiel thérapeutique de la thérapie génique que nous testons.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle cellulaire permettant de récapituler le phénotype d’une cellule cardiaque adulte. Les tests cellulaires ne peuvent donc être réalisés que sur des cellules fraichement isolées de coeurs. De plus, dans l’hypertension artérielle et l’insuffisance cardiaque, le corps met en place des régulations physiologiques impliquant le système neuro-hormonal. Ces régulations neuro-hormonales ne peuvent pas être reproduites in vitro ce qui rend indispensable l’expérimentation dans un modèle préclinique intégré.
Réduction
(i) une planification minutieuse basée sur un calcul de puissance et l’expertise de l’équipe ont permis l'estimation de la taille d'échantillon optimale. Ceci a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et de conserver une puissance statistique suffisante pour observer un effet de 40% obtenu sur la diminution de la fonction cardiaque (ii) les fonctions cardiovasculaires sont étudiées par des méthodes non invasives permettant de limiter le nombre d’animaux, (iii) afin de minimiser encore le nombre d’animaux utilisés, en fin d’expérimentation les tissus prélevés sont partagés entre les domaines explorés.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer qu’ils ne subissent aucun stress. Afin d’améliorer leurs conditions d’hébergement de l’enrichissement sera ajouté dans leurs cages. Les rats sont mis en cage et observés tous les jours. Les cages sont changées 2 fois par semaine afin de minimiser une éventuelle infection. L’injection d’aav9 dans la veine caudale est réalisée à l’occasion de la première ou la deuxième échographie évitant un stress et une anesthésie à l’animal. L’hypertension artérielle sera induite en respectant au maximum les procédures de bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Toutes les mesures sont prises pour mettre en place la qualité de l’hébergement requis et la mise en place de procédures adaptées pour limiter la souffrance animale en accord avec la législation en vigueur et respecter l’application de la règle des « 3R ». Un suivi rigoureux des animaux engagés dans les procédures est mis en place. Des points limites ont été scrupuleusement déterminés et sont soigneusement évalués quotidiennement. Si ces points limites sont atteints, les animaux sont sacrifiés pour limiter leur souffrance et leurs organes sont prélevés.
Choix des espèces
Le rat est choisi car c’est un mammifère qui constitue un modèle courant et classique pour l'étude de la fonction cardiovasculaire y compris dans un contexte pathologique. Il est un modèle de choix car il offre la possibilité d’induire l’insuffisance cardiaque par des procédures chirurgicales. Des rats de 7 semaines (250g ) adultes ont été choisis comme modèles car les maladies cardiovasculaires chez l'humain et l'hypertension en particulier touche essentiellement des adultes.
Formations sur les gestes techniques chez le rat et la souris
- Formation professionnelle
Rats : 160
Ponctions de sang au sinus rétro-orbital, administrations par voies intraveineuse, intranasale, orale, vaginale et oculaire, puis mise à mort par dislocation cervicale : ce sont les gestes que des personnes en formation apprennent sur 160 souris et 160 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Un même animal peut subir jusqu'à trois gestes différents par jour, cinq jours de suite. Le porteur affirme que ces formations visent à limiter l'inconfort et l'anxiété des animaux non-humains pendant l'expérimentation, tout en reconnaissant qu'un geste réalisé par une personne peu expérimentée peut provoquer stress, inconfort et douleur locale. Ces séances sont des formations internes à une entreprise, initiales ou continues, adossées aux études de pharmacocinétique exigées par la réglementation du médicament.
Objectifs
Ce projet a pour but de décrire les formations du personnel avec des rats et souris, notamment les gestes techniques nécessaires pour faire des études pharmacocinétiques et les études mécanistiques de devenir du médicament dans l’organisme qui répondent aux exigences règlementaires. Les formations peuvent inclure : - la bonne contention - l’anesthésie d’un animal - les prélèvements de sang au sinus rétro-orbital, des organes ou des fluides chez le rat et la souris - l’administration par voie intraveineuse, intramusculaire, intranasale, per os, sous-cutanée, intra-vaginale, topique, intra-auriculaire et oculaire (topique) - la mise à mort d’un animal (dislocation cervicale). La formation est adaptée à la personne et à la fonction exercée. Pour une formation initiale dans l’entreprise, l’acquisition des notions théoriques et des gestes et techniques devant être réalisées seront évalués et, selon le degré de maitrise, seront validés ou nécessiteront une formation complémentaire. Pour la formation continue, les personnes concernées se forment uniquement aux nouveaux gestes nécessaires pour leur travail. Toute formation est faite en présence d’un formateur expérimenté qui maitrise la technique en question. La formation pour chaque geste est terminée quand le formateur juge que la technique est maitrisée.
Bénéfices attendus
Ces formations permettent aux expérimentateurs d’acquérir des gestes techniques parfaitement maîtrisés. Ceux-ci visent à limiter au maximum l’inconfort et l’anxiété de l’animal pendant l’expérimentation. De plus, la qualité des résultats expérimentaux obtenus pour le développement de médicaments à usage humain sera améliorée par la maîtrise de ces gestes et permettra de ne pas réaliser ces expérimentations sur un plus grand nombre d’animaux que nécessaire (réduction du nombre d’animaux utilisés).
Procédures
Le même animal sera utilisé pour plusieurs gestes si possible, par exemples, plusieurs types d'administration et prélèvement du sang. La durée des interventions sera comprise entre quelques secondes (par exemple pour les intraveineuse, Orales, Intrapéritoneale, Sous cutanée, occulaire et intra-auriculaire) et une minute (administration rectale, vaginale). La durée d’un prélevement rétro-orbital sera d’environ 10 secondes. Un maximum de 3 gestes (différents) par jour, par animal et sur un maximum de 5 jours ne sera pas dépassé. Administration par différentes voies, prélèvement du sang, mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie, prélèvement d’organes après mise à mort.
Impact sur les animaux
Les gestes ou actions expérimentales effectuées par une personne peu expérimentée peuvent générer du stress, un inconfort ou une douleur locale.
Devenir
Les mêmes animaux utilisés pour la formation de l’administration peuvent être également utilisés pour les formations de prélèvement. Dans la mesure de possible, les animaux sont utilisés pour collecter des organes ou du plasma nécessaire aux méthodes de dosages de bioanalyses) à la fin de l’ensemble des procédures.
Remplacement
La formation pour l’administration et le prélèvement ne peux pas être fait avec un autre modèle. La réglementation pour le développement de nouveau médicament exige les tests chez les rongeurs. Afin de pouvoir répondre à cette demande, une formation aux gestes techniques est obligatoire pour les études de pharmacocinétique.
Réduction
Avant l’utilisation des animaux, une formation théorique sera dispensée sur la bonne manipulation et la contention afin de réduire le stress et l’inconfort de l’animal. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les gestes sont montrés dans un premier temps pendant des études pharmacocinétiques liés à un autre projet autorisé (phase d’observation). La formation pratique sera ensuite faite sur les animaux. Aucun animal n’est spécifiquement commandé pour la formation.
Raffinement
La personne à former reçoit d’abord une formation théorique et une formation à la manipulation et contention de l’animal sans geste de prélèvement ou d’administration. Quand le formateur juge que la personne maitrise ces techniques, les autres formations peuvent commencer. L’animal sera anesthésié si la procédure le nécessite. De plus, lors de l’hébergement des animaux, l’enrichissement du milieu comprend l’utilisation de maisonnettes et boules de coton pour les souris, de tubes en carton et blocs de bois pour les rats. L’hébergement est réalisé en groupe stable.
Choix des espèces
Rat ou souris pour les essais règlementaires de pharmacocinétique nécessaires au développement de nouveaux médicaments à usage humain. Les animaux utilisés ont entre 6 et 12 semaines conformément à la règlementation.
Maintenance et reparation de la myéline centrale: role d’ADAM10
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 402 souris vont être utilisées dans des procédures allant de la souffrance légère à sévère, toutes tuées au plus tard deux mois après la chirurgie pour prélever leurs tissus. Chacune subit un prélèvement à la queue entre le septième et le dixième jour de vie, un traitement pharmacologique, des tests de mémorisation et de locomotion de dix minutes, et pour une partie d'entre elles une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie destinée à provoquer une lésion de la myéline. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des maladies démyélinisantes. Le porteur chiffre le lot expérimental entre 1 152 et 2 304 souris, sans expliquer d'où viennent les 5 402 déclarées.
Objectifs
La myéline est une substance qui entoure le prolongement des neurones et qui est responsable de la conduction nerveuse et donc de la transmission des commandes initiées par le système nerveux. La myéline est produite par des cellules appelées oligodendrocytes, localisés dans le cerveau et la moelle épinière. La perte de myéline ou d’oligodendrocytes peut survenir dans le cas de pathologies appelées maladies démyélinisantes (telle que la sclérose en plaques) ou lors de traumatismes (par ex. accidents de la route), et peuvent mener à de lourds handicaps. La formation de la myéline (myélinisation) et sa réparation (remyélinisation) sont des processus complexes qui font intervenir de nombreux mécanismes dans les oligodendrocytes. Le but de ce projet est de comprendre l’implication d’une protéine particulière en recherchant (1) son rôle dans la maintenance des gaines autour des prolongements neuronaux et (2) son rôle dans la réparation de la myéline chez la souris en mimant une lésion par perte myélinique. Ce projet s’appuie sur des études précédentes montrant que l’activation de ce type de molécule est capable de protéger la myéline. Pour étudier l’implication de cette protéine uniquement dans les oligodendrocytes, nous caractériserons les individus d’un point de vue macroscopique (locomotion, cognition) mais aussi microscopique (état des tissus, organes, cellules). Le projet proposé nous permettra de mieux comprendre le rôle de notre protéine dans ces maladies démyélinisantes et son potentiel régénératif. Ce projet permettra d’ouvrir la voie à de nouvelles pistes thérapeutique pour les maladies démyélinisantes, pour lesquelles il n’existe actuellement pas de traitements efficaces chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Par ce projet, nous espérons faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des maladies démyélinisantes.
Procédures
- Un prélèvement à la queue sera réalisé à l’âge de P7-10 sur l’ensemble des souris afin de vérifier leur génotype (lien de leur parenté). - Les souris seront traitées par un composé pharmacologique afin de pouvoir étudier notre protéine d’intérêt dans le processus de réparation du système neveux. - Les souris réaliseront des expériences de comportement afin de vérifier leur capacités cognitives et motrices (mémorisation, locomotion). Ces expériences sont non-invasives et non douloureuses. Elles se feront sur animal vigile et dureront chacune maximum 10 min. - Une chirurgie sera réalisée sur des souris sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 20 min. L’ensemble des animaux sera mis à mort, 2 mois maximum après la chirurgie afin de récupérer les tissus d’intérêt pour les analyser.
Impact sur les animaux
- Stress de contention dû à la préhension de l’animal lors du traitement - Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie – Troubles moteurs suite à la chirurgie (de la nourriture humide sera placée dans la cage pour éviter les déplacements de l’animal).
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue des expérimentations de chaque procédure afin de prélever les tissus d’intérêt.
Remplacement
Le modèle animal que nous utilisons permet de mimer certains aspects des pathologies que nous étudions (telle que la sclérose en plaques), et pour lesquelles il n’existe pas de traitement. Ce modèle est donc nécessaire pour mieux comprendre ces maladies. Les processus de myélinisation et de réparation de la myéline impliqués dans les maladies démyélinisantes que nous étudions induisent des processus biologiques et physiologiques complexes qui nécessitent l’intervention de multiples acteurs cellulaires. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet. Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer l’inflammation et la démyélinisation, ainsi que la récupération fonctionnelle de l’animal.
Réduction
Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux pour atteindre la puissance statistique suffisante nécessaire à l’interprétation des résultats. Ce nombre a été évalué́ à partir d’études précédentes (les expériences histologiques et biochimiques nécessitent au moins 6 animaux et les expériences comportementales en nécessitent au moins 10). Ces précautions permettent de limiter les variations inter-individuelles et d’aboutir à des conclusions rigoureuses. Les animaux issus des études comportementales seront ensuite utilisés pour les études des tissus prélevés, nous évitant ainsi d’avoir recours à de nouveaux lots de souris dédiés à cette analyse. De plus, plusieurs tissus d’intérêt seront prélevés sur chaque souris, permettant encore de réduire le nombre d’animal utilisé. Dans le cas où nos premiers résultats ne montreraient pas d’effet d’OLA10 dans la réparation de la myéline, la procédure serait abandonnée. Nous envisageons donc de commencer par des expériences pilotes avec un nombre réduit de souris. Si les résultats sont concluants, les données seront complétées et approfondies en utilisant la totalité des groupes expérimentaux prévus. Ainsi, le lot expérimental serait constitué d’un minimum de 1152 souris, et d’un maximum de 2304. Les animaux contrôles utilisés dans nos procédures sont indispensables pour établir des comparaisons fiables et tirer des conclusions précises. Ces animaux nous permettront de contrôler les variables externes, d’éliminer les biais et de mesurer les effets de nos traitements en les comparant aux groupes expérimentaux. Ils renforcent ainsi la validité de nos conclusions.
Raffinement
Un suivi particulier du bien-être des animaux soumis à la chirurgie sera mis en place et une prise en charge de la douleur sera utilisée si nécessaire. Les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique post-chirurgical et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà̀ du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité́, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisément d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères qui partagent de nombreuses similitudes biologiques avec l’Homme, en particulier au niveau génétique et neurologique. Elles constituent des modèles de choix pour (1) étudier les mécanismes des pathologies neurologiques humaines et (2) explorer des traitements potentiels de manière pertinente pour ces maladies. Les souris sont des organismes modèle bien établis en recherche biomédicale, et offrent une capacité élevée de reproduction et de cohérence dans les résultats expérimentaux, permettant des interprétations fiables et de tirer des conclusions robustes. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de notre molécule d’intérêt et l’état de la myéline (affectée dans la pathologie étudiée) sont très bien adaptées chez la souris. Les animaux sont utilisés à l’âge d’au moins 7 semaines car il est connu que le processus de myélinisation est terminé à cet âge, ce qui nous permet d’étudier la maintenance de la myéline une fois les gaines achevées autour des prolongements de neurones. De plus, la perte de myéline survient principalement chez le jeune adulte, que ce soit lors de maladies démyélinisantes telle que la sclérose en plaques, ou lors de traumatismes mécaniques type accident de la voie publique. L’âge choisi pour notre modèle permettra donc de mimer au mieux les lésions médullaires survenant chez l’Homme et d’en étudier le processus de réparation. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de ce modèle animal, et ce à l’âge choisi.
Criblage des inhibiteurs intrinsèques aux lymphocytes T dans un microenvironnement tumoral et/ou allogénique
- Recherche appliquée
- Cancers
Deux à cinq injections sous anesthésie et une irradiation de dix minutes : 983 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour analyse post-mortem de leurs organes. Chacune porte une tumeur. Le projet cherche à identifier les molécules qui freinent les lymphocytes T dans un environnement tumoral, pour renforcer les thérapies cellulaires anticancéreuses. Les effets subis tiennent en trois fragments de phrase, effets liés aux tumeurs, aux injections et aux irradiations avec risque de maladie du greffon contre l'hôte, et aucun chiffre ne vient étayer l'effectif de 983 animaux.
Objectifs
Les lymphocytes T (ou cellules T) sont des acteurs clés de l'immunité contre le cancer. Le transfert de lymphocytes T dirigés contre les tumeurs représente une nouvelle thérapie majeure, permettant à la fois d’éradiquer directement la tumeur mais aussi de constituer une protection sur le long terme contre les rechutes. Cependant, leur prolifération (persistance et taux) peut être altérée dans un environnement immunosuppresseur, tel que le site tumoral lui-même ou par le système immunitaire de l’individu receveur. Nous proposons ici d’identifier de manière non biaisée et systématique les inhibiteurs spécifiques de ces cellules T dans ces environnements immunosuppresseurs dans le but de potentialiser de nouvelles générations de thérapies cellulaires. Nous cherchons à identifier des inhibiteurs de l’infiltration tumorale de cellules T mémoires pour améliorer l’efficacité des thérapies anti-tumorales. De plus, nous explorons la résistance des cellules T à la destruction par le système immunitaire du receveur dans le but de générer des thérapies cellulaires universelles à partir de donneurs sains de lymphocytes T.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal de ce projet est l'identification de nouvelles cibles therapeutiques optimisant l'efficacité des thérapies cellulaires T. Ce projet va aussi permettre de répondre à des questions fondamentales pour mieux comprendre et comparer le comportement des cellules T CD4 et CD8 in vivo. Au final, les résultats attendus pourraient permettre d'améliorer la prise en charge de certains cancers humains.
Procédures
Deux à cinq injections (5 minutes) sur animaux anesthésiés. Irradiations (10 minutes): une par animal, pour certains animaux.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à la présence de tumeurs (une par animal). Effets liés à des injections. Effets liés aux irradiations (risque de maladie du greffon contre l'hôte).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour faire des analyses post-mortem sur les organes d'intérêt.
Remplacement
Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement immunosuppresseur auquel est soumis le système immunitaire in vivo. En effet, le système immunitaire est très compartimenté entre les organes lymphoïdes et les tissus avec une régulation des flux de cellules et des signaux (cytokines, chimiokines) très précise entre ces différents compartiments. De plus, l’utilisation d’un mode de sélection puissant in vivo nous permet d’identifier les inhibiteurs majeurs et non-redondants des cellules T, avec une relevance clinique immédiate.
Réduction
Nous pratiquerons le minimum d'expériences permettant à la fois d'être certain de la reproductibilité des phénomènes observés en assurant la puissance statistique nécessaire en tenant compte de la variabilité expérimentale du modèle employé. Nous allons effectuer des tests statistiques pour analyser la croissance tumorale et le suivi des souris.
Raffinement
Le milieu sera enrichi afin de réduire le stress des animaux. Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. Les souris sont anesthésiées pour les injections et l'imagerie. Les animaux seront suivis quotidiennement afin d’assurer leur bien-être et pour suivre les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des points-limites ont été établis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins et de la disponibilité de souches congéniques et transgéniques parfaitement définies. Nous utiliserons des souris adultes car elles possèdent un système immunitaire mature.
Etude de l’impact d’une exposition fœto-maternelle au chlordécone sur le système nerveux nigro-strié de la souris et lien avec les syndromes Parkinsoniens – EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Seize heures sans nourriture avant un test d'olfaction de dix minutes : 96 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance légère, toutes tuées par perfusion intracardiaque pour prélever leur système nerveux central. Quarante-huit subissent trois tests comportementaux nommés, motricité fine, olfaction, anxiété et motricité générale, le premier répété jusqu'à six fois. Les quarante-huit autres partent vers un second établissement pour une heure d'imagerie cérébrale sous anesthésie, dont six minutes de stimulation visuelle et trente-cinq minutes de stimulation pharmacologique. Le projet cherche à savoir si le chlordécone, insecticide interdit dans les années 90 mais toujours présent aux Antilles, favorise les syndromes parkinsoniens, le porteur écartant les organoïdes qu'il juge "prometteurs mais pas encore développés au laboratoire".
Objectifs
Le chlordécone est un insecticide organochloré utilisé aux Antilles pour lutter contre le charançon noir, un insecte ravageant les bananeraies. Compte tenu notamment de sa neurotoxicité à des doses élevées cet insecticide a été interdit dans les années 90. Malheureusement, cet insecticide est très persistant et a contaminé durablement l’environnement, les animaux et la population Antillaise. Pour l’heure les effets neurologiques éventuels d’une exposition à long terme sont mal connus. Toutefois, plusieurs éléments suggérant un effet délétère existent, notamment sur le neuro-développement chez les jeunes garçons nés de mères exposées. De plus, l’heptachlore, un autre insecticide organochloré à l’origine d’une contamination environnementale et humaine à Hawaï a un effet délétère chez la souris dans les régions du cerveau atteintes lors de la maladie de Parkinson et a été associé à des lésions cérébrales chez l’homme. L’objectif scientifique du projet est l’étude de l’effet sur la viabilité et la physiologie des neurones du système nerveux central chez des souris après une exposition au chlordécone par voie alimentaire chez la souris adulte d’une part et d’autre part après une exposition au chlordécone au cours de la période foeto-maternelle. Il s’agit d’un projet multisite qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La finalité de ces approches est d’évaluer un lien potentiel entre une exposition au chlordécone et le déclenchement ou l’accélération de la maladie de Parkinson et de documenter les évènements physiopathologiques associés à ce mode d’exposition.
Procédures
Dans l’établissement utilisateur 2 : l’Imagerie cérébrale est réalisée une fois sur 48 animaux : elle est réalisée sous anestésie générale. La procédure complète dure environ 1 heure et comprends 6 minutes de stimulation visuelle et 35 minutes de stimulation pharmacologique via une injection intra-péritonélae. Dans l’établissement utilisateur 1 : les 48 autres animaux sont soumis à trois tests comportementaux : le premier test mesurant la motricité fine dure 10 minutes et est répété 6 fois (3 habituations et 3 tests) ou 2 fois (1 habituation et 1 test) selon le groupe d’étude, le second test évaluant les capacités d’olfaction dure 10 minutes (après une privation de nourriture de 16 heures) et est répété 2 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude et le dernier test mesurant l’anxiété et la motricité générale dure 15 minutes et est répété 3 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude.
Impact sur les animaux
Une procédure expérimentale similaire a déjà été mise en oeuvre au laboratoire sur une durée de 4 mois mais à l’aide d’une exposition par injection intrapéritonéale et aucun signe de souffrance n’a été détecté, pas de perte de poids ni de décès chez les souris mâles exposées. Les modalités d’exposition sont présumées ne pas induir d’effets indésirables. L’ensemble des interventions sont susceptibles d’engendrer des nuisances de classes légères aux animaux : -Les tests comportementaux peuvent potentiellement induir un stress pour les animaux -Les perfusions intra-cardiaque représentent un risque de souffrance lors de l’injection des produits anésthésiants -Le transport des animaux vers le second etablissement utilisateur peut induir un stress -L’anesthésie, la contention et la stimulation chimique lors de la réalisation de l’imagerie cérébrale peuvent induir à la fois un stress de l’animal et de la souffrance
Devenir
L'objectif de ce projet est l'étude de l'effet neurotoxique du chlordécone, pour ce faire il est nécessaire d'euthanasier les animaux afin de disposer du système nerveux central.
Remplacement
A ce jour, le remplacement complet de ce modèle d’étude n’est pas envisageable. Il existe des modèles d’étude utilisant des lignées de cellules neuronales mais ces derniers ne permettent pas d’étudier l’effet d’une exposition sur les interconnexions neurales ou l’impact sur les cellules gliales. Des travaux plus récent proposent l’utilisation d’organoïdes, ces approches sont prometteuses mais pas encore dévelopées au laboratoire.
Réduction
Le nombre de souris est réduit jusqu’au nombre d’animaux minimal permettant d’attendre des résultats statistiquement significatifs dans les différentes approches proposées.
Raffinement
Conformément aux exigences de raffinement, les expérimentations ont été optimisées afin de réduire la douleur au minimum, les animaux sont suivis quotidiennement et hébergés dans un environnement enrichi. En début de procédure, à la réception des animaux au laboratoire, un temps d’acclimatation d’environ 2 semaines est respecter. Un temps d’acclimatation est également respecté lors du transfert des animaux dans le second établissement utilisateur. Pour les animaux soumis aux tests comportementaux une étape d’habituation est également prévue. De plus, le personnel est attentif à la planification de ces tests afin de ne pas soliciter plus de 3 fois les animaux dans la même semaine. Cette alimentation supplémentée en Chlordécone n’a jamais été utilisée dans notre laboratoire en conséquence la quantité de nourriture ingérée par cage chaque semaine sera monitorée en plus du suivi du poids des animaux afin d’identifier le plus tôt possible un défaut d’appétence des croquettes
Choix des espèces
Les souris utilisées sont des souris conventionnelles C57Bl/6, cette lignée de souris est fréquemment utilisée dans les études du système dopaminergique. En effet, la physiologie de cette population neuronale est proche de celle de l’espèce humaine et la taille de sa population autorise des dénombrements précis. Par ailleurs cette lignée a déjà été utilisée dans notre laboratoire, nous pourrons ainsi comparer les résultats obtenus avec nos premiers résultats après deux et quatre mois d’exposition par injection intra-péritonéale. Le projet prévoit d’utiliser des souris adultes à l’âge de 2 mois au début du protocole d’exposition, ceci nous permettra de comparer les résultats de cette voie d'exposition avec notre projet précédent dans lequel les souris avaient subi une exposition similaire mais par voie intrapéritonéale. Le deuxième groupe d'animaux est constitué de souris exposées tout au long de la période de gestation et maintenues soit jusqu’à la fin de la période de sevrage soit jusqu'à l'âge de 2 mois. Cette partie du projet permettra d'obtenir des données quant à l'effet d'une exposition au chlordécone au cours de cette période du dévellopement.
Etude de la mitophagie dans un modèle murin de SLA/DFT
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Baguées à l'oreille et biopsiées à la queue dès le plus jeune âge, 1 122 souris porteuses d'une mutation de sclérose latérale amyotrophique avec démence frontotemporale sont ensuite laissées vieillir sans autre intervention, dans des procédures allant de la souffrance légère à sévère. Leur prise de poids décroche dès trois mois. Entre dix et quatorze mois apparaissent la perte de poids, la baisse de mobilité et les tremblements, jusqu'au stade que le porteur retient comme final. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes, le seuil déclenchant la mise à mort étant une perte de poids supérieure à 15 % ou l'incapacité à se retourner sur soi en moins de quinze secondes.
Objectifs
La maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique) et la démence frontotemporale sont des maladies neurodégénératives conduisant à la mort des motoneurones (= neurones situés dans la moelle épinière, innervant et commandant les fibres musculaires). Ces deux pathologies présentent un spectre clinique commun, 50% des patients atteints de sclérose latérale amyotrophique développent une démence frontotemporale, 15% des patients atteints de démence frontotemporale présentent des signes de sclérose latérale amyotrophique. Précédemment, une mutation sur le gène d'une protéine de la mitochondrie (= petit organite qui a un rôle essentiel dans les processus énergétiques cellulaires) a été identifiée chez des patients souffrant d'une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale. Parmi tous les facteurs impliqués dans le processus conduisant à la sclérose latérale amyotrophique, un dysfonctionnement des mitochondries a toujours été envisagé comme un acteur majeur de cette pathologie. Mais, l'identification d'une mutation dans un gène codant pour une protéine de la mitochondrie fut la 1ère preuve génétique démontrant le rôle primaire des mitochondries dans des atteintes du motoneurone. L'objectif général de notre projet de recherche est de comprendre comment la mutation de ce gène codant pour une protéine de la mitochondrie conduit à la mort des motoneurones. Pour cela, nous devons caractériser la séquence des évènements reliant l'atteinte des mitochondries à la mort des motoneurones. L'étude du modèle murin présentant une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale suggérait une implication du processus de mitophagie (processus de mort permettant l'élimination des mitochondries anormales) dans différents organes. Ces souris ont été croisées avec des souris permettant de quantifier la mitophagie (la mitophagie est visualisée sous forme de points rouges en microscopie). Nous avons ainsi pu observer une augmentation de la mitophagie dans différents organes chez ces souris comparées à leurs souris contrôles. La poursuite de ce projet aura pour objectifs de 1/ caractériser le rôle de la mitophagie dans l'atteinte du motoneurone et 2/ établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans la séquence des évènements conduisant à la mort des motoneurones.
Bénéfices attendus
Actuellement, la maladie de Charcot et la démence frontotemporale ne présentent pas d'option thérapeutique, il est donc important de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail permettra de déterminer si le ciblage du processus de mitophagie peut être une piste thérapeutique intéressante dans le traitement des atteintes du motoneurone associées à un dysfonctionnement mitochondrial.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, l'identification des animaux nécessitera la pose d'une bague à l'oreille et d'une biopsie au niveau de la queue ou de l'oreille. Pour les procédures 1 et 2, les animaux seront élevés dans le cadre d’un protocole de vieillissement et ne seront soumis à aucune autre intervention avant la mise à mort des animaux. Pour la procédure 3 (240 animaux), les animaux seront également élevés dans le cadre d’un protocole de vieillissement. Au moment de la mise à mort des animaux, une injection intrapéritonéale d'une solution analgésique sera effectuée, suivie 15 minutes plus tard d'une deuxième injection intrapéritonéale d'une solution anesthésique. Deux injections en intrapéritonéales seront donc réalisées pendant la durée de vie de la souris.
Impact sur les animaux
Les souris présentant une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale présenteront un phénotype dommageable conduisant à la mort des animaux. Les animaux présenteront : - une prise de poids diminée par rapport aux souris contrôles dès l'âge de 3 mois, - une diminution du poids et/ou une diminution de la mobilité des animaux et/ou la présence de tremblements à un stade plus avancé de la vie de l'animal (autour de 10 à 14 mois). L'identification des animaux (pose d'une bague et biopsie) entrainera une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Les animaux étudiés présentent un phénotype de maladie neurodégénérative (sclérose latérale amyotrophique et démence frontotemporale) nécessitant la mise à mort des animaux afin de prélever les organes pour les analyser.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des expériences in vitro ont été réalisées précédemment sur des cellules en culture à partir de fibroblastes primaires issus des patients porteurs de la mutation d'intérêt et à partir de motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites exprimant la mutation d'intérêt. Des expériences sur les motoneurones continueront à être menées. Néanmoins, bien que ces modèles cellulaires issus des patients présentent un potentiel important pour rempacer et réduire l'utilisation de l'animal, ils ne permettent pas de reproduire les interactions physiologiques et les mécanismes physiopathologiques intégrés à l'ensemble de l'organisme. La sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant une pathologie touchant plusieurs organes, seul un modèle animal permettra d'étudier les conséquences multiples du processus de mitophagie dans les différents organes et surtout d'établir une cinétique (à des âges différents) permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones.
Réduction
Dans un but de réduction, nous utiliserons des modèles cellulaires (notamment des motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites) pour étudier le rôle de la mitophagie dans la mort des motoneurones. Ces expériences nous permettront de répondre à certaines questions scientifiques et ainsi de diminuer le nombre d'animaux utilisés. Des statistiques prédictives ont également été réalisées dans le but d'utiliser le minimum d'animaux nécessaires à ce projet. Afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs, nous aurons besoin de 15 animaux par expérience et par génotype.
Raffinement
Dans un but de raffinement, un suivi hebdomadaire du poids sera réalisé et une fiche de score sera utilisée pour assurer un suivi optimal de chaque animal. Cette fiche de score a été établit en lien avec le phénotype attendu de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale et a été précédemment utilisée pour le suivi de ces souris. Les animaux seront observés hebdomadairement, ce qui permettra d'identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Le phénotype de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant associé à une perte de poids, les animaux seront pesés une fois par semaine. Lorsqu'une perte de poids sera observée, une surveillance accrue de l'animal sera réalisée (2 fois par semaine ou tous les jours suivant le pourcentage de perte de poids), de l'eau et de la nourriture gélifiée seront également ajoutés dans la cage. Lors de cette surveillance hebdomadaire, une attention particulière sera portée sur la mobilité (affaiblissement des membres inférieurs ou tremblements) et sur le comportement des animaux. L'environnement de l'animal sera enrichi par ajout d'un igloo en papier mâché et de carrés de ouate ou de tissu compressé (pour permettre à l'animal de se faire un nid à l'abri de la lumière), ainsi que de batonnets en bois (pour permettre à l'animal de ronger) dans chaque cage.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) présente des similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, permettant dans la mesure du possible d'extrapoler les résultats et d'en tirer des conclusions valables pour l'homme. De plus, elle présente un cycle de vie court et un cycle de reproduction avec une natalité importante. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour réaliser les analyses protéique, génomique et histologique nécessaires au déroulé de ce projet de recherche. De plus, les modèles murins utilisés sont des modèles spécifiques déjà établis et caractérisés (modèle de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale et modèle permettant de quantifier la mitophagie in vivo). Aucun autre modèle ne peut donc être utilisé. Les animaux seront utilisés à 4 stades de développement : - stade correspondant à l'atteinte finale de la maladie (= soit perte de poids supérieure à 15% par rapport à la pesée précédent la 1ère diminution de poids, soit un affaiblissement partiel de l'extension des pattes ou tremblements, associé à une incapacité pour la souris de se retourner sur elle-même lorsqu'elle est sur le flanc en moins de 15 secondes) - stade d'apparition des 1ers signes cliniques = 3 mois de vie - stade intermédiaire = 6 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones) - stade intermédiaire = 9 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones)
Effet de l’exercice physique sur la neurodégénérescence chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsie de la queue sur tous les souriceaux, six à huit injections intrapéritonéales, deux injections sous-cutanées, une à deux chirurgies intracrâniennes de quarante minutes à une heure trente, et la coupe des moustaches pendant les périodes d'enregistrement : 1 656 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Une partie l'est plus tôt, faute de porter le génotype recherché. Le projet cherche à comprendre comment l'activité neuronale et l'exercice physique, volontaire ou avec apprentissage moteur, favorisent la production de myéline. Sur la réduction, le porteur écrit limiter le nombre d'animaux "au strict minimum" sans donner de calcul, et l'effectif de 1 656 ne reçoit aucune justification chiffrée.
Objectifs
La myéline est une substance isolante qui entoure les prolongements des neurones du cerveau. Dans certaines maladies, la myéline peut être attaquée et détruite par les cellules du système immunitaire. A terme, les prolongements des neurones dénudés de myéline finissent par mourir. Cependant, bien que la capacité régénérative du cerveau soit limitée, une régénération de la myéline est possible dans certaines maladies comme la sclérose en plaques. Malheureusement, cette régénération est incomplète. Le but de ce projet est de déterminer comment l'activité neuronale et l’exercice physique favorisent la production de myéline quand celle-ci est diminuée dans le cerveau. Nous étudierons la capacité à produire de la myéline en réponse à une augmentation de l'activité neuronale et à un type d'entrainement physique qu'il soit simple (exercice volontaire) ou complexe (apprentissage moteur) sur des modèles présentant une baisse de myéline.
Bénéfices attendus
A terme, l’identification des mécanismes biologiques sous-tendant une meilleure production de la myéline peut être très important pour développer des thérapies non-invasives dans des maladies comma la sclérose en plaques.
Procédures
Tous les souriceaux sont soumis à une biopsie caudale afin d'effectuer un génotypage. Nous prévoyons sur un premier groupe d'animaux un traitement alimentaire spécifique, 6 injections intrapéritonéales, 2 injections sous-cutanées et deux chirurgies. Celles-ci durent entre 40 min et 1h30. Ces animaux seront imagés lors d'un exercice physique simple, un exercice impliquant un apprentissage moteur ou en contrôle. Leurs moustaches seront coupées pendant la période d'enregistrement. Un autre groupe de souris recevra le même traitement alimentaire et seront injectées 8 fois. Dans un troisième groupe d'animaux, nous prévoyons le même traitement alimentaire spécifique, 6 injections intrapéritonéales, 2 injections sous-cutanées et une chirurgie. Leur moustachese seront coupées pendant la période d'enregistrement lors d'un exercice physique simple, un exercice impliquant un apprentissage moteur ou en contrôle. Enfin, les animaux restants recevront 7 injections intrapéritonéales, 2 injections sous-cutanées et deux chirurgies.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales et sous-cutanées (nuisance légère), la coupe des vibrisses (nuisance légère), les anesthésies (nuisance légère) et les chirurgies intracrâniennes (nuissances modérées) vont induire un stress et une possible douleur. Les nouveaux-nés subiront un stress léger lié à la contention et une douleur légère liée à la biopsie de la queue.
Devenir
Certains animaux sont mise à mort car ils sont sans génotype d’intérêt pour le projet. Tous les autres animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de pouvoir collecter leur cerveau.
Remplacement
Notre compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies telles que la sclérose en plaques sera toujours insuffisante si ces mécanismes ne sont pas induits et analysés dans leur milieu naturel complexe. En étudiant les différentes composantes de façon isolée, de nombreux effets émergents de l'activité neuronale et des interactions cellulaires seront obligatoirement négligées. L’utilisation de l’animal est donc primordiale pour obtenir des résultats qui puissent avoir un véritable impact dans le développement de nouvelles thérapies chez l’homme. Les souris sont le seul modèle permettant d'étudier l'effet du comportement animal sur la myéline en temps réel.
Réduction
Une réduction du nombre d’animaux sera réalisée en limitant ce nombre au strict minimum nécessaire pour obtenir un résultat scientifiquement fiable. Les expériences seront arrêtées si des analyses intermédiaires permettent d’atteindre la significativité statistique. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés, pour comparaisons multiples ou données suivies selon les cas.
Raffinement
Lors des actes chirurgicaux, les animaux sont anesthésiés et reçoivent des analgésiques en pré- et post-opératoires par voie locale et sous-cutanée. Après l’opération, un apport de fluide est effectué pour réhydrater l’animal, puis celui-ci est placé dans une enceinte chauffée jusqu’à son réveil complet. De la nourriture est placée dans la cage d’hébergement afin de faciliter la récupération; la surveillance des animaux est renforcée afin d’éviter toute souffrance; les animaux sont observés régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites est utilisée. Tout signe de douleur est soulagé avec des analgésiques.
Choix des espèces
Les expériences seront réalisées chez des souris génétiquement modifiées. La souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Une autre raison pour utiliser la souris est la possibilité de manipuler de types précis de cellules chez des animaux transgéniques. Pour le génotypage et les biopsies, les souriceaux ont entre 5 et 10 jours, âge a quel il est possible de tatouer les coussinets des phalanges. L'expérimentation est menée sur des animaux adultes entre 2 à 5 mois ce qui nous permet de faire nos protocoles et traitements.
Évaluation d’approches thérapeutiques dans un modèle murin humanisé de la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, leur diaphragme et leur cœur, 1 880 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses de la mutation humaine de la dystrophie myotonique de type 1, activée par un antibiotique ajouté à la nourriture, elles reçoivent une à quatre injections intraveineuses sous anesthésie, deux prélèvements sanguins, des mesures de force d'agrippement, une échographie cardiaque et un électrocardiogramme. Une chirurgie de quinze minutes sous anesthésie profonde sert à mesurer la force musculaire, la mise à mort suivant immédiatement, avant tout réveil. Le porteur affirme que les souris ne montrent aucun signe de douleur même après plusieurs mois d'induction du phénotype, et renvoie le bénéfice attendu, un médicament, à un éventuel passage ultérieur en essai clinique.
Objectifs
La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est une des maladies neuromusculaires les plus fréquentes chez l’adulte. Cette maladie est caractérisée par de multiples symptômes parmi lesquels des atteintes musculaires (faiblesse et fonte musculaire, problème de relaxation), cardiaques (trouble du rythme) et neurologiques, particulièrement invalidantes. Actuellement il n’existe pas de traitement pour cette maladie mais de nombreuses approches thérapeutiques sont évaluées en laboratoire et en essais cliniques chez l’homme. L’utilisation de modèles animaux qui reproduisent des symptômes moléculaires et fonctionnels de la maladie est cruciale pour ces études. Un nouveau modèle murin de la DM1 qui exprime la mutation humaine et reproduit les symptômes musculaires a été caractérisé. Ce modèle qui combine les qualités des deux modèles précédemment les plus utilisés va devenir une nouvelle référence pour les études préclinique de composés thérapeutiques pour cette maladie. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’utiliser ce modèle pour évaluer plusieurs nouvelles approches thérapeutiques innovantes développées par le laboratoire. L'objectif à long terme reste d'identifier un composé thérapeutique capable d'aller en essai clinique chez l’homme et à terme devenir un médicament.
Bénéfices attendus
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la maladie musculaire la plus fréquente chez l’adulte (1 personne sur 8000 en moyenne au niveau mondial) et est très invalidante. Il n’y a encore aucun médicament pour cette maladie. L’attente des patients pour un traitement ciblé est donc très forte. L’objectif principal de ce projet est la validation de composés thérapeutiques innovants, développés dans notre laboratoire, qui permettraient une amélioration des symptômes spécifiques à la maladie dans le modèle murin, pour ensuite passer à des essais chez l’homme et avoir un médicament spécifique. Les composés évalués dans ce projet pourraient à terme bénéficier, en théorie, à tous les patients atteints de DM1. Par ailleurs, ce projet va également permettre de valider ce nouveau modèle murin comme modèle de référence pour l’évaluation d’approches thérapeutiques qui profitera ainsi à toute la communauté scientifique DM1 et donc accélérer le développement et à la validation d’autres médicaments pour la maladie.
Procédures
Les animaux feront l'objet d'injections en intraveineuse, sous anesthésie. Il y aura, selon les procédures, entre 1 et 4 injections espacées de 2 semaines. Chaque injection prend moins de 2 min par souris. Les souris feront également l'objet de prélèvements sanguins. Cette intervention de moins de 5 min se fera deux fois, un début et en fin de procédure avant l’euthanasie des animaux. Une partie des animaux fera l'objet d'évaluations fonctionnelles non-invasives (mesure de force d’agrippement, échographie cardiaque, électrocardiogramme, mesure de respiration). Enfin, les animaux feront l'objet d'une procédure de mesure de force nécessitant une intervention chirurgicale d’environs 15 min sous analgésie et anesthésie profonde. Cette mesure sera immédiatement suivie par l'euthanasie des animaux avant leur réveil.
Impact sur les animaux
En présence d’inducteur dans la nourriture, les souris vont développer un phénotype, très similaire à celui des patients atteints de Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1), caractérisé par de la myotonie (défaut momentané de relaxation musculaire après une contraction) et de la faiblesse musculaire provoquant une baisse générale d’activité. Cependant nos études montrent que les souris ne montrent pas de problème à se déplacer ou à se nourrir. De plus les souris ne montrent pas de signe de douleur même après plusieurs mois d’induction. Donc les nuisances ou effets indésirables qu’elles pourraient expérimenter seront surtout liés à ce phénotype DM1, que nous cherchons à obtenir, similaire à celui des patients et aux procédures dont elles feront l’objet (pour l’identification à l’animalerie d’élevage ou les procédures du projet). A cause des actes dont elles feront l’objet, les souris pourraient ressentir une gêne au point d’injection/prélèvement, et une détresse légère lors des manipulations (comme la mesure du poids chaque semaine à partir du début du protocole ou la contention pour les injections). Les animaux pourraient également subir un stress thermique dû à l’anesthésie ainsi qu’éventuellement une petite hémorragie temporaire suite au prélèvement sanguin. Concernant les effets indésirables dus au traitement, des versions similaires aux composés qui seront évalués dans cette étude ont déjà tété injectées dans des modèles murins d’autres pathologies musculaires et n’ont pas montré de signes évidents d’effets secondaires délétères.
Devenir
Tous les animaux qui entreront dans ce projet (soit un maximum de 1880 souris) seront euthanasiés à la fin de la procédure à laquelle ils seront associés. En effet, dans le cadre de l'évaluation d'approches thérapeutiques comme celles décrites dans ce projet, nous devons vérifier la correction des symptômes moléculaires au niveau des organes atteints. Dans le cas du modèle murin de la maladie que nous étudions (Dystrophie myotonique de type 1), nous devons vérifier l'efficacité de notre traitement au niveau des muscles, du diaphragme et du cœur, ce qui rend strictement nécessaire l’euthanasie en fin de procédure afin de prélever ces organes. Ces marqueurs moléculaires sont très spécifiques à la maladie et corrèlent très bien avec l'état de sévérité et donc également avec l'efficacité du traitement. Ces études d'efficacité seront complétées par l'analyses de marqueurs sanguins pour déceler une éventuelle toxicité.
Remplacement
Dans un objectif de REMPLACEMENT, une sélection in vitro des composés thérapeutiques dans des modèles cellulaires de la maladie (Dystrophie Myotonique de Type 1 ou DM1) sera effectuée avant toute utilisation dans un organisme vivant. Cependant les modèles in vitro de cellules musculaires restent imparfaits puisqu’ils ne reproduisent pas le contexte tissulaire adulte de la fibre musculaire qui est une cellule hautement spécialisée et différenciée. L’évaluation in vivo de l’efficacité des différents composés thérapeutique nécessite d’avoir recours à des modèles de souris transgéniques qui expriment la mutation humaine DM1 et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et surtout physiologique. Ainsi, seuls les composés montrant une forte efficacité sans effet délétère seront injectés dans un premier temps en intramusculaire puis par voie intraveineuse dans les souris DM1.
Réduction
Afin de REDUIRE et d’optimiser le nombre d’animaux, le protocole d’étude a été développé avec une réduction du nombre d’animaux utilisés dans la mesure où tous les animaux issus des croisements (sans distinction de sexe) seront utilisés. Les souris n’ayant pas les symptômes d’intérêt seront utilisées comme contrôles négatifs dans les différentes expériences. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles (études fonctionnelles et analyses moléculaires sur plusieurs organes comme les muscles et le cœur). Enfin ce projet se déroulera en plusieurs étapes. Ainsi la réussite de la première étape détermine la poursuite, la mise en place et l’utilisation des animaux prévus dans la seconde étape, et ainsi de suite. Nos études précédentes, ainsi que l’utilisation d’un logiciel de statistiques, nous ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés et assurer la distribution normale de nos données. Ensuite les groupes seront comparés grâce à des tests statistiques appropriés. Pour ce projet, un maximum de 1880 animaux sera utilisé.
Raffinement
Finalement, dans le but RAFFINER le protocole et, en conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour /nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès illimité à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements suivants : carré de lanière kraft, rouleau en carton, bâtonnet en bois ou abri en carton. Si un animal se retrouve isolé (seul mâle d’une portée, animal arrivé seul d’un fournisseur, agression entre congénères, dernier animal dans la cage...), il bénéficiera de deux enrichissements et il sera vérifié par la structure chargée du bien-être animal (SBEA) pour valider ses conditions d’hébergement. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites (spécifiques à chaque protocole mis en place) ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement. Des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur ainsi qu’une de perte de poids importante seront considérés comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduiront à l’euthanasie des animaux concernés. Par ailleurs au cours des différentes procédures, tout acte le nécessitant sera accompagné d’une anesthésie et d’un traitement préventif de la douleur. De plus, une surveillance accrue des animaux sera effectuée pendant une à deux heures après chaque acte.
Choix des espèces
L’efficacité d’une approche thérapeutique pour la Dystrophie Myotonique de Type 1 (DM1) doit être validée sur un modèle animal de cette pathologie. A ce jour, des modèles murins, drosophile et poisson-zèbres ont été décrits pour la maladie. Cependant seuls les modèles murins montrent des symptômes robustes (physiologiques et moléculaires) similaires à ce qui est observé chez les patients. L’étude des différents modèles murins a permis la compréhension de plusieurs symptômes observés chez les patients. Dans ce contexte, le modèle murin DM1, utilisé pour ce projet, présente un énorme avantage : il a la mutation humaine qui ne s’active qu’après l’ajout d’un inducteur (ici un antibiotique : la doxycycline) dans la nourriture. Les souris ne présentent donc pas de symptômes pendant les périodes d’élevage. Quand on active la mutation, à l'âge adulte, les souris développent un phénotype similaire à ce qui est observé chez les patients DM1 : caractérisé par de la myotonie (défaut momentané de relaxation musculaire après une contraction et qui donne son nom à la maladie), de la faiblesse musculaire et de forts défauts moléculaires dans plusieurs organes. Aucune mortalité n’est observée. Pour le projet, les souris seront utilisées à l’âge adulte, quand tous les organes, et surtout les muscles, sont bien développés et que la croissance est terminée.
Intérêt d’associer activité physique et antipsychotique (aripiprazole) dans un modèle murin de schizophrénie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour mesurer si l'exercice physique améliore la tolérance d'un antipsychotique, 214 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Un groupe reçoit une injection quotidienne de phencyclidine pendant quatorze jours, censée reproduire des symptômes de schizophrénie, puis de l'aripiprazole dans l'eau de boisson, deux séances d'imagerie sous anesthésie générale et un mois de tests comportementaux. Parmi eux, l'inhibition du réflexe de sursaut place chaque souris une trentaine de minutes dans un dispositif qui lui inflige trente sursauts mesurés. 118 souris pourront être réutilisées dans d'autres protocoles, les 96 autres étant tuées par perfusion-fixation pour prélever leurs tissus.
Objectifs
La schizophrénie est une pathologie psychiatrique fréquente (1% de la population), qui regroupe des troubles multiples, liés à la pathologie elle-même, au style de vie des patients mais aussi aux traitements et au caractère chronique de leur prise. Hormis les troubles directement liés à la pathologie, le style de vie des patients fait souvent empirer la situation (sédentarité, hygiène négligée, troubles du sommeil, mauvaise alimentation…). S’ajoutent à cela les effets indésirables et inévitables des traitements, qui sont généralement des traitements à vie. De façon très intéressante, la plupart de ces problèmes peuvent être en partie contrebalancés par l’activité physique, reconnue pour être un moyen non-pharmacologique très puissant pour améliorer la santé, non seulement physique mais aussi mentale. De plus en plus d’études révèlent que l’activité physique stimule les fonctions cérébrales en augmentant notamment le nombre de cellules gliales, de neurones, de synapses, et de dendrites, et de vaisseaux sanguins. De tels effets sont associés à une amélioration de la cognition et à une augmentation de la résistance au stress, aussi bien chez l’homme que chez l’animal. L’objectif de ce projet est d’une part, d’approfondir dans des modèles murins de schizophrénie l’impact d’un protocole d’entraînement physique sur l’efficacité et la tolérance d’un traitement chronique par l’aripiprazole (antipsychotique le plus prescrit en France) et d’autre part d’appréhender les mécanismes neurobiologiques sous-jacents à ces modulations physiologiques. Il s’organise en 2 parties. La première vise à développer un système innovant de suivi de l’activité physique volontaire chez des souris ne nécessitant pas d’isoler les animaux. Il sera d’abord testé chez des souris saines puis chez un modèle animal de schizophrénie (délétion du gène de la sérine racémase), connu pour son hyperactivité. La seconde partie est dédiée au traitement chronique, soit par l’aripiprazole, soit par l’entraînement physique ou les deux, d’un modèle animal de schizophrénie induit par l’administration subchronique de phencyclidine.
Bénéfices attendus
Ce projet préclinique s’inscrit en parallèle d’un essai clinique visant à démontrer les effets bénéfiques de l’activité physique adaptée chez les patients souffrant de schizophrénie. Les données recueillies chez l’animal permettront d’apporter des arguments scientifiques supplémentaires sur les bienfaits de l’activité physique sur le cerveau et sur la prévention des effets secondaires des antipsychotiques. La réalisation de ce programme permettra d’affiner la connaissance des mécanismes d’une part, sous tendant les effets bénéfiques de l’activité physique sur les altérations comportementales, anatomiques, électrophysiologiques et neurobiologiques en lien avec la schizophrénie et d’autre part, d’approfondir les mécanismes d’action synergique entre une telle activité physique et un traitement pharmacologique dans ce contexte. Il permettra enfin de développer de nouveaux outils pour le suivi d’activité physique (roues), avec des applications potentielles dans d’autres pathologies.
Procédures
Dans la première partie du projet, les animaux seront soumis à un suivi d’activité dans les roues durant 3 semaines. Dans la seconde partie du projet, les animaux seront soumis à environ 3 mois de suivi, avec 3 semaines d’induction du modèle, 7 semaines de traitements et 1 mois de tests comportementaux. Le modèle consiste en l’injection sous cutanée (durée : 1 minute) quotidienne d’un psychotrope durant 14 jours consécutifs. Le traitement consiste en l’administration d’un antipsychotique dans l’eau de boisson avec ou sans activité physique (roue). Pendant cette période, 2 sessions d’imagerie d’une heure maximum seront réalisées (anesthésie générale). Des séries de tests comportementaux seront ensuite réalisés, dont une majorité directement dans la cage d’hébergement (Intelllicage). L’inhibition du réflexe de sursaut sera évaluée en une seule session d’une durée d’environ 25 min pour chaque souris. La sociabilité de l’animal sera évaluée lors d’une session de 10 minutes. Enfin, une partie des souris seront mises à mort par la méthode de perfusion/fixation qui dure environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Pour les 2 parties du projet, l’utilisation d’isoflurane par voie inhalée pour l’anesthésie est à prendre en considération par son effet relativement désagréable durant quelques instants au niveau des muqueuses, et par la perte de connaissance qu’il induit. Pour la seconde partie du projet, s’ajoutent les nuisances liées au modèle animal et aux évaluations. Pour le modèle "PCP", outre les aspects stressants des injections quotidiennes de phencyclidine (PCP) (durée d’injection : environ 1 minute), ces administrations induisent des modifications comportementales qui miment certains symptômes rencontrés dans la schizophrénie (hyperlocomotion, troubles sociaux, troubles de mémoire, etc.) et qui sont la base du modèle de cette pathologie. Il ne s’agit pas à proprement parler de douleur mais d’une certaine déstabilisation du fonctionnement du cerveau qui peut induire une certaine angoisse. Le traitement antipsychotique n’a pas d’effet aigu notable et l’imagerie est réalisée sous anesthésie générale (1 heure maximum par session). Enfin, un certain niveau de stress sera possiblement lié aux tests comportementaux qui seront réalisés. Les évaluations comportementales en Intellicage sont en majorité des tests d’activité spontanée qui ne sont pas décrits pour induire un stress marqué. Seuls les tests d’impulsivité et la limitation temporelle de l’accès à l’eau peuvent induire un certain stress mais pas de douleur. Pour les autres tests, celui de l’inhibition du réflexe de sursaut peut aussi générer un stress. En effet, les animaux sont placés pour une durée d’environ 30 minutes dans le dispositif et les sons diffusés entraînent des sursauts qui sont mesurés (30 essais).
Devenir
Les animaux de la première partie du projet pourront tous être réutilisés, de même que les 10 « souris stimulus » utilisées dans le test de sociabilité de la seconde partie du projet. Les autres animaux de la seconde partie du projet seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’échantillons biologiques.
Remplacement
Dans la mesure où le projet présenté ici concerne une pathologie psychiatrique très complexe mettant en jeu de multiples facteurs liés au fonctionnement du cerveau, facteurs qui ne sont pas tous connus, ni maitrisés, il y a absolue nécessité de réaliser des études comportementales (in vivo). Par ailleurs, les aspects comportementaux qui seront étudiés et qui miment les symptômes très invalidants que vivent les patients, ne peuvent à l’heure actuelle pas être modélisés d’une autre manière.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste en fonction du niveau d’effet attendu en imagerie (réduction du volume de certaines structures cérébrales de 10% par exemple) et pour les études comportementales, pour obtenir une puissance statistique suffisante. Les données seront comparées par des tests non-paramétriques et/ou paramétriques en fonction de leur distribution. La première partie du projet contiendra des mâles et des femelles, afin d’évaluer les différences d’activité entre les sexes mais pour la seconde partie du projet, un seul sexe sera testé (mâles) afin de limiter le nombre de groupes d’animaux. Il est indéniable qu’une comparaison mâle / femelle serait idéale, cependant, cette étude est une preuve de concept et la pathologie cible, la schizophrénie, connue pour présenter des symptômes plus graves chez les patients masculins. Le suivi longitudinal par imagerie IRM permettra aussi de réduire le recours aux méthodes ex vivo.
Raffinement
Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux seront stabulés dans des cages contenant un igloo en papier mâché et des lamelles de papier kraft afin d’assurer un enrichissement, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). Ils seront laissés au repos sans intervention (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) durant 1 semaine (habituation au cycle inversé jour / nuit), puis seront manipulés régulièrement durant la durée totale du projet afin de les habituer au contact humain. L’accès à une roue constitue aussi un enrichissement par rapport aux cages standards, en augmentant l’espace disponible pour les animaux et en permettant de faire de l’activité physique. Le traitement à l’aripiprazole sera administré dans l’eau de boisson, ce qui réduit le stress des animaux par rapport à un traitement par gavage. L’utilisation du système Intellicage permettra de réaliser des tests directement dans la cage d’hébergement en groupe, ce qui réduit le stress des animaux par rapport aux méthodes standards (isolation des animaux pour un suivi individuelle des performances). Enfin, l’utilisation d’anesthésique volatil et d’analgésique sera effectuée pour l’implantation des puces, l’imagerie et la mise à mort.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris (Mus musculus). Il s’agit comme le rat, d’un animal sur lequel ont été mis au point des modèles de schizophrénie très utiles à la recherche des dysfonctionnements cérébraux liés à cette pathologie. La souris est une espèce plus facile que le rat à maintenir, en termes de coût et de place. Son comportement est bien connu et détaillé dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (mémoire à court et à long terme, sociabilité, exercice physique, réflexe de sursaut, activité spontanée). Par ailleurs, la sérine racémase ainsi que les cibles pharmacologiques des traitements sont présentes chez l’homme et la souris (récepteurs NMDA pour la PCP et récepteurs dopaminergiques et sérotoninergiques pour l’aripiprazole) et sont caractérisées par une activité fonctionnelle similaires dans les 2 espèces. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), à un âge auquel les grands systèmes physiologiques sont matures. Cela correspond à l’âge d’apparition de la pathologie chez les patients.
Etude des structures lymphoïdes tertiaires dans un modèle spontané d’inflammation du côlon
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Pour savoir si des agrégats de cellules immunitaires aggravent l'inflammation du côlon et préparent un cancer colorectal, 499 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, 354 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 145 dans des procédures déclarées légères. Toutes sont tuées pour des analyses post-mortem. Leurs mutations déclenchent une entérocolite dès trois semaines d'âge, avec perte de poids et saignements dans les selles et par le rectum, et le suivi se poursuit jusqu'à seize semaines. Le porteur souligne qu'aucun geste technique n'est pratiqué dans cette première phase, et prévoit, si les souris résistent à la colite, de leur administrer un produit inflammatoire dans l'eau de boisson à doses progressivement augmentées.
Objectifs
De nombreux organes, notamment le côlon, sont peuplés d’une accumulation de cellules immunitaires, prêtes à initier une réponse immunitaire rapide et ciblée en cas d’infection: ce sont les organes lymphoïdes secondaires. Ces structures apparaissent durant les premiers stades de développement embryonnaire et deviennent complètement matures après la naissance. Dans un contexte inflammatoire chronique, les cellules du système immunitaire se réorganisent pour former des agrégats dans le tissu inflammé : ce sont les structures lymphoïdes tertiaires (SLT). Ces nouveaux organes lymphoïdes reproduisent la structure et la fonction des organes lymphoïdes secondaires classiquement observés dans les tissus. Or dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) comme la maladie de Crohn, la présence et la densité de ces structures n’est pas systématiquement corrélée avec un pronostic favorable. En effet, il a récemment été démontré que les lymphocytes B, cellules immunitaires majoritaires des SLT, peuvent faire obstacle à la réparation de la muqueuse intestinale en contexte inflammatoire. Notre projet vise à caractériser les structures lymphoïdes tertiaires (SLT) dans l’inflammation du côlon et en particulier, de déterminer si ces SLT participent activement à la progression de l’inflammation colique dans les MICI et, par la suite, dans le cancer colorectal.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre à court terme d’étudier la formation et le rôle des structures lymphoïdes tertiaires dans l’inflammation du côlon. Il va ainsi permettre d’améliorer les connaissances sur les interactions entre les cellules immunitaires et les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale en contexte inflammatoire chronique. A long terme, il pourrait permettre de mieux comprendre le rôle des SLT dans l’inflammation colique pré-cancéreuse et de mettre en évidence un nouveau mécanisme de cancérogenèse dans le côlon. Ceci pourrait participer à l’élaboration de nouveaux traitements des MICI ainsi que du cancer colorectal.
Procédures
Dans une première procédure, nous allons évaluer la cinétique d’apparition spontanée de l’inflammation du côlon dans des souris génétiquement modifiées en fonction de leur fonds génétique d’origine. Trois lots d’animaux seront comparés et suivis régulièrement de 4 à 16 semaines d’âge jusqu’à apparition d’une colite. Aucun geste technique ne sera réalisé sur les animaux. Néanmoins, les mutations étudiées entraineront l’inflammation du côlon à partir de l’âge de 3 semaines. Si les animaux utilisés dans cette première procédure ne présentent pas de signes de colite au bout de 16 semaines d’âge, nous réaliserons une deuxième procédure où les animaux seront traités avec un traitement inflammatoire dans l’eau de boisson, de 3 à 14 jours maximum. Les doses seront progressivement augmentées en cas de résistance avérée à l’apparition de la colite.
Impact sur les animaux
Les animaux d’intérêts peuvent présenter les premiers signes d’entérocolite spontanée dès 3 semaines d’âge (perte de poids, saignements dans les selles et rectaux). Le poids des animaux sera mesuré régulièrement tout au long de la procédure. Les selles seront vérifiées régulièrement. L’administration d’un traitement inflammatoire dans l’eau de boisson (DSS) peut engendrer une déshydratation et une inflammation de l’ensemble du tractus intestinal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Il est nécessaire de réaliser les expériences sur des animaux afin de modéliser (i) le développement des structures lymphoïdes tertiaires dans l’inflammation colique et (ii) les interactions entre les différentes populations immunitaires et les cellules épithéliales adjacentes. Les expériences in vitro ne sont pas adaptées pour étudier les comportements immunitaires dans l’inflammation du côlon (interactions cellulaires multiples et complexes).
Réduction
Nous réaliserons des expériences-pilote afin de déterminer avec un nombre minimal d’animaux, les conditions optimales d’apparition de la colite spontanée et des SLT dans notre modèle murin. La deuxième procédure (traitement DSS) sera réalisée uniquement en cas de résultats négatifs issus de la procédure 1, c’est-à-dire dans le cas où les souris d’intérêts sur différents fonds génétique présentent une résistance à l’apparition d’une colite spontanée en conditions d’hébergement conventionnel. Tous les tissus murins collectés lors des expériences-pilote seront utilisés pour analyse immunologique. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Comme recommandé dans la littérature, les animaux sont suivis attentivement afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être. Une grille de score adaptée est mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal sera mis à mort. En cas de perte de poids ou de déshydratation, du gel nutritif sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire qui peuvent être causés par la colite. En cas de déshydratation sévère, une réhydratation par injection de solutés en voie intra-péritonéale sera réalisée. De plus, l’inflammation du côlon peut être suivie par une méthode non invasive : la mesure du taux d’une protéine spécifique dans les selles.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en fait un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 3 et 16 semaines, selon le temps d’apparition de la colite.
Formation de gestes techniques pour concepteur et ou applicateur
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Former des personnels aux gestes techniques, sans produire aucune connaissance : 450 souris vont être utilisées à cette seule fin, 300 dans des procédures menées sous anesthésie sans aucun réveil et 150 dans des procédures déclarées de souffrance légère. Toutes sont tuées, avec prélèvement de sang ou de tissus. Chaque animal subit soit deux gestes espacés de sept à quinze jours, un gavage de trente secondes et une injection de dix secondes par exemple, soit un seul geste sous sédation. Le porteur indique que ces souris proviennent de lots "non utiles" de son animalerie et "devaient être mises à mort pour réduction d'élevage", et ne justifie l'effectif de 450 que par la validation du geste après une ou deux manipulations par apprenant.
Objectifs
Ce projet a un seul but éducatif: former les personnels aux gestes techniques dans une démarche de bien-être animal optimisé à son maximum lors des futures procédures. Aucun animal ne sera acheté ou né pour ce projet. Tous les animaux utilisés viendront de notre animalerie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont essentiellement en terme de maitrise de gestes en utilsant des animaux qui devaient être mis à mort pour réduction d'élevage
Procédures
chaque animal utilisé ne subira qu'une procédure: - soit 2 gestes non invasifs sur 2 temps bien distincts (1 gavage 30 sec et 1 injection 10 sec à 7 -15 js d'intervalle par ex) - soit un seul geste sous sédation ou anesthésie
Impact sur les animaux
Tous les animaux subiront une contention et un geste technique. Selon le geste la gravité sera classée légère ou sans réveil. Aucun geste ne sera sévère. Dans la première procédure classée légère, l'animal ne pourra subir que 2 gestes au maximum mais pas simultanement. Ex: Gavage et injection - entre 7 et 15js d'écart entre 2 gestes. Nuisances attendues: stress à la contention, douleur légère lors de l'injection oudu prélèvement
Devenir
entrainement à des gestes techniques. Mise à mort pour prélèvements sanguins ou tissulaires.
Remplacement
Cette formation est un support complémentaire à la formation théorique reçue préalablement à l'autorisation de travailler avec des animaux à des fins scientifiques.
Réduction
Les animaux utilisés viendront exclusivement de lots "non utiles" des élevages présents dans l'animalerie. Les gestes seront montrés aux personnels par une personne habilitée et formée. Le formateur validera le geste après 1 ou 2 manipulations, le nombre d'animaux utilisés sera réduit à son maximum selon les personnels
Raffinement
Tous les animaux seront issus d'élevage présents dans notre animalerie. Ils seront hébergés en fratrie comme à leur habitude. Si dans le lot "non utile", un animal montre un signe quelconque de souffrance, il ne sera pas utilisé pour un "test" et sera mise à mort éthiquement selon les méthodes réglementaires par une personne habilitée. L'application des points limites précités sera strictement surveillée.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle de la souris car il est le plus utilisé en expérimentation animale, et les élevages de souris représentent 90% de notre animalerie tous les animaux surnuméraires pourront être utilisés à partir du sevrage
Effets de l’exposition précoce à la musique sur le développement des comportements sociaux chez la caille japonaise
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Exposées pendant quinze jours à de la musique ou à du bruit rose, trois fois quarante-deux minutes par vingt-quatre heures, 96 cailles japonaises subissent des procédures déclarées de souffrance légère. Toutes sont gardées vivantes pour des études ultérieures, le porteur estimant que la procédure ne porte pas atteinte à leur intégrité. L'objet du projet est d'éprouver une hypothèse sur les origines évolutives de la musicalité, en comparant une espèce aux capacités d'apprentissage vocal limitées à des espèces qui imitent les sons. Cinq tests comportementaux sont annoncés, deux en présence de congénères et trois en isolement, dont un mesure l'immobilité tonique, les autres n'étant pas nommés.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans une étude visant à explorer les origines et fonctions évolutives de la musicalité ainsi que les liens entre musique et comportements sociaux. Il existe une théorie selon laquelle la musicalité serait apparue au cours de l’évolution parce qu’elle renforcerait les liens sociaux et la cohésion du groupe. Plusieurs études ont en effet révélé que les activités musicales conjointes favorisent la prosocialité chez les enfants. De plus, écouter de la musique favorise les interactions sociales positives à la fois chez les enfants d’âge préscolaire et chez les oiseaux. Ainsi, la musicalité pourrait avoir émergé au moins deux fois au cours de l’évolution, chez les humains et chez les oiseaux, avec des fonctions adaptatives similaires. Cependant, d’importantes questions demeurent concernant (i) le rôle de facilitation que les capacités d’apprentissage vocal ont pu jouer dans l’évolution de la musicalité, et (ii) les circonstances dans lesquelles la musique influence le comportement social. Dans ce contexte, notre présent projet a pour objectif d'analyser, chez la caille japonaise, l’effet de l’exposition précoce à la musique sur le développement des comportements sociaux. Notre modèle présentant des capacités d'apprentissage vocal limitées, notre étude permettrait ainsi d'affirmer ou d'infirmer le lien entre apprentissage vocal et musicalité.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de l’étude visant à explorer les origines et fonctions évolutives de la musicalité, ainsi que les liens entre musique et comportements sociaux, le projet permettra d’évaluer le rôle de l’exposition précoce à la musique sur le développement des comportements sociaux chez la caille. La comparaison de ces résultats obtenus chez la caille japonaise avec ceux obtenus chez d’autres espèces animales ayant des capacités d’apprentissage vocal plus ou moins développées permettra de déterminer si la musique a ou non des effets plus prononcés sur les interactions sociales chez les espèces ayant les capacités les plus devéloppées. La caille japonaise étant un animal domestique utilisé dans des élevages en captivité, le projet pourrait aussi ouvrir des pistes pour développer l’utilisation de la musique pour favoriser le bien-être et les interactions sociales positives chez les animaux en captivité.
Procédures
Lors de la phase d’exposition à la musique/bruit rose, les individus seront soumis pendant 15 jours à trois stimulations sonores par 24h (42 min*3 = 126 min/24h), d’une intensité d’environ 55 décibels et de fréquences allant de 50 à 20 000 Hz. Les animaux seront soumis à 5 tests comportementaux afin d’évaluer l’effet de la musique sur leurs traits de comportement. Deux tests en présence de congénères d’une durée de 8 et 20 minutes. Trois tests en isolement d’une durée de 3, 4 et 6 minutes. Ainsi, la durée totale de test par individu est de 41 minutes. Les tests sont séparés au minimum de 24h afin de ménager des temps de récupération aux oiseaux.
Impact sur les animaux
Les traitements musicaux sont succeptibles de déranger les animaux. Cependant, nos études précédentes n’ont pas montré un tel dérangement et les stimuli sonores seront diffusés dans l’environnement habituel des oiseaux, à un volume sonore limité et contrôlé à l’aide d’un sonomètre (maximum 55 décibels au niveau de la cage). Le déplacement et l’isolement des oiseaux lors des tests ainsi que leurs expériences lors des tests (environnement nouveau, manipulation pour l’immobilité tonique) sont également susceptibles de les perturber. Cependant ces tests seront de courtes durées (10 minutes maximum) et les animaux seront manipulés par des personnes expérimentées.
Devenir
La procédure n'impliquant pas d'effets portant à l'intégrité des individus, les oiseaux seront tous gardés en vie pour des études ultérieures.
Remplacement
Le projet consiste à observer le comportement d’animaux vivants libres de leurs mouvements et de leurs réactions, ce qui, par essence, exclut tout remplacement par des modèles autres que ces animaux.
Réduction
La taille de chaque traitement (N=32) tient compte de potentielles différentes de réponses comportementales des individus selon leur sexe. La caille japonaise présentant un sexe ratio généralement équilibré, un effet sexe pourra ainsi être testé (16 individus par sexe et par traitement) statistiquement, tout en tenant compte de la forte variabilité interindividuelle inhérente à l’expression comportementale.
Raffinement
Les oiseaux seront hébergés en groupe sociaux dans des cages aménagées de substrat (litière en copeaux de bois) permettant l’expression de bains de poussière. Les cailleteaux étant incapables de réguler leur température pendant les 11 premiers jours de vie, les cages seront équipées de chaufferettes pendant toute cette période. Un suivi de la localisation des cailleteaux sous et autour de la chaufferette permettra de moduler la température en fonction de leur besoin (la chaufferette pouvant être abaissée ou remontée pour adapter la température au sol). La manipulation des oiseaux sera limitée, de courte durée et réalisées par des personnes expérimentées. Les animaux seront soignés et observés tous les jours par un personnel expérimenté. La détection de tout changement de comportement conduira à isoler l'individu afin de l’observer de plus près et de le soigner si nécessaire, l’objectif étant de pouvoir le remettre dès que possible dans ses conditions de vie habituelles.
Choix des espèces
L’un des objectif du projet consiste à comparer l’influence de la musique sur les comportements sociaux chez différentes espèces ayant des capacités d’apprentissage vocal variables. Celles-ci sont connues pour être importantes ches les oscines et les psittacidés. De plus, plusieurs espèces de psittacidés, sont connues pour leur sensibilité à la musique. Au contraire, les capacités musicales semblent plus limitées d’après la littérature chez les gallinacés, dont font partie les cailles. Les cailles étant connues pour avoir des capacités d’apprentissage vocal limitées, nous nous attendons donc à observer chez elles un effet moins important de la musique que chez les espèces capables d’apprentissage vocal par imitation (comme les espèces étudiées par les partenaires du projet). Comparer ces différentes espèces permettra de tester l’hypothèse de l’apprentissage vocal comme prérequis à l’évolution de la musicalité et de mieux comprendre l’évolution de ce trait au cours de l’histoire du vivant. Les oiseaux seront utilisés à différents stades de leur développement depuis le jour de leur éclosion jusqu’à leur maturité sexuelle. Ce suivi permettra de mettre en évidence l’impact de nos traitements sur différentes caractéristiques comportementales qui sont exprimées à différents moments de la vie de l’oiseau.