Procédures légères

Nées de lignées transgéniques entretenues pour alimenter d'autres projets, 50 764 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées de souffrance légère. Entre le septième et le douzième jour de vie, chacune est tatouée aux phalanges ou aux coussinets et subit l'ablation de l'extrémité de la queue pour le génotypage, les deux gestes enchaînés sous contention et sans anesthésie. Le porteur présente le tatouage comme un moyen "de ne pas mutiler les animaux" et retient la biopsie caudale notamment parce qu'elle évite l'anesthésie. 40 000 de ces souris passeront dans d'autres autorisations de projet, les autres sont tuées selon leur génotype, dès le sevrage si aucune utilisation n'est possible, plus tard si elles servent à l'élevage et deviennent trop âgées ou "mauvais reproducteurs".

Objectifs

L'objectif de cette demande est d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Ces animaux sont identifiés par marquage et caractérisés à l’aide d'une biopsie (prélèvement de tissus). Cette demande d'autorisation de projet pour l'identification des animaux et le prélèvement de tissus se justifie par la nécessité de sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres demandes de projet) ; sélectionner les animaux d'entretien des élevages ; sélectionner les animaux pour : • le maintien des compétences, • les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo.

Bénéfices attendus

La biopsie est une étape nécessaire pour déterminer quels sont les animaux dont le profil ADN est pertinent pour mener à bien les expérimentations, dans le but de trouver des thérapies innovantes qui puissent être transposées en recherche clinique. L’identification par tatouage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.

Procédures

Les animaux de cette DAP seront soumis à deux gestes techniques invasifs qui sont réalisés ensembles: 1/ l'identification par tatouage digital: 1 fois, durée de quelques secondes 2/ biopsie de queue: 1 fois, durée de quelques secondes

Impact sur les animaux

La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets - la biopsie de queue, qui consiste en un prélèvement de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress.

Devenir

A l'issue de cette unique procédure, le devenir des animaux est différent selon leur génotype: a/- ils sont prévus pour expérimentation, formation ou maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP): utilisation continue b/- ils sont sélectionnés pour entretien des colonies, puis mis à mort lorsque trop âgés ou mauvais reproducteurs c/- ils sont utilisés ex vivo, donc mis à mort avant utilisation d/- ils sont mis à mort dès sevrage si aucune utilisation possible au vu de leur génotype e/- ils sont mis à mort à tout moment si atteinte d'un point limite.

Remplacement

Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que l'étude de phénomènes physiologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. A ce jour, les prélèvements salivaires et pileux pour génotypage ne sont pas suffisamment fiables. Il n’existe donc pas d’autres méthodes aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue.

Réduction

A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’EU établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’EU. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.

Raffinement

Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté à jour de ses formations et qui ont un bon regard sur les points limites découlants de ces gestes. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel adapté en respectant les conditions d’asepsie établies dans l’établissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Ces cages sont enrichies avec des palets de Woodwool qui permettent au souris de nidifier et de se cacher. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère.

Choix des espèces

Au sein de notre EU les équipes de recherche utilisent le modèle souris pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de modéliser. Les animaux sont identifiés et prélevés entre 7 et 12 de manière à cibler l'orientation des animaux avant sevrage.

Améliorer l'image nutritionnelle des matières grasses laitières, et par là encourager leur consommation : 18 hamsters dorés vont être utilisés dans ce but, dans des procédures déclarées de souffrance légère, puis proposés à l'adoption ou inclus dans un autre protocole. Chacun jeûne douze heures avant d'être gavé à l'huile par sonde, une fois par semaine pendant trois semaines. Sous anesthésie gazeuse, jusqu'à 10 % de leur volume sanguin leur est prélevé chaque semaine, en six ponctions étalées sur six heures lors du premier cycle, trois lors du second. Le porteur revendique une réduction de plus de moitié des effectifs grâce à cette réutilisation des mêmes individus, et annonce comme bénéfice une meilleure qualité nutritionnelle des produits laitiers, qui "encouragerait davantage leur consommation".

Objectifs

L’ingestion d’un repas riche en graisse provoque une augmentation excessive des lipides dans le sang. Cette augmentation du taux de lipides dans le sang est connue comme étant un facteur de risque de développer des maladies cardiovasculaires. Dans cette étude, nous allons vérifier si le remplacement d’une partie des lipides alimentaires par des acides gras qui ont une structure particulière (dits acides gras à chaînes courte et moyenne) entraînerait une moindre augmentation du taux de lipides après un repas et serait donc favorable à une meilleure santé cardiovasculaire. Nous prévoyons donc d’administrer ces lipides laitiers par voie orale à des hamsters, d’analyser les différents taux de lipides dans le sang pendant les 6h qui suivent l’administration et de comparer les résultats avec ceux obtenus après l’administration chez ce même groupe de hamsters de lipides laitiers standard ou de l’huile de palme (acides gras connus pour leur effet délétère). Ces expériences seront réalisées sur deux lots d'animaux et les expérimentations sur chaque lot sont appelées par la suite cycle 1 d'expérimentation et cycle 2 d'expérimentation.

Bénéfices attendus

Il est attendu une diminution des taux de lipides dans le sang après l’ingestion des lipides laitiers riches en acides gras à chaînes moyennes et courtes comparé aux lipides laitiers standard ou encore à l’huile de palme. Trois paramètres seront étudiés : l’évolution du taux de lipides pendant 6 heures après l’administration, taux cholestérol estérifié dans les HDL (bon cholestérol) et les LDL (mauvais cholestérol) et la mesure d’activité d’un transporteur de lipide (CETP). Les produits laitiers sont une source importante de protéines et de calcium, et leur consommation fait partie intégrante des habitudes alimentaires en France. La modification de leurs lipides pour les rendre moins susceptibles d’induire des maladies cardiovasculaires constituerait une amélioration significative de leur qualité nutritionnelle, et encouragerait davantage leur consommation.

Procédures

- Mise à jeun (12h) avant chaque gavage à l'huile à l'aide d'une sonde souple. - Gavages une fois par semaine pendant 3 semaines. - Prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse :

Impact sur les animaux

Gavage => nuisances en lien = stress de courte durée lié à la contention. Prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés => nuisances en lien = stress lié à l'anesthésie

Devenir

Les animaux peuvent être inclus dans la mesure du possible dans un autre protocole. Autrement, ils seront proposés à l'adoption (placement).

Remplacement

La lipémie postprandiale est le résultat de plusieurs processus physiologiques impliquant la digestion, l'absorption, l'hydrolyse et la captation tissulaire. Son évaluation exige donc une expérimentation in vivo. Il n'existe aucune méthode alternative (in silico ou in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques impliqués dans la réponse postprandiale.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés dans cette étude, nous avons prévu la réutilisation des animaux, dans chacun des 2 cycles, avec des périodes de wash-out de minimum une semaine. En effet dans notre étude nous avons trois groupes correspondant chacun à une fraction lipidique. En théorie, il aurait fallu 54 animaux, au total, pour avoir 9 animaux/groupe/cycle d'expérience, alors que nous prévoyons seulement 18 hamsters pour la totalité de l'étude, soit une réduction de plus de 50%.

Raffinement

L'hébergement respecte les recommandations en vigueur chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (mise à disposition de carrés de coton, des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). Un suivi régulier des animaux est assuré par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). Les protocoles expérimentaux pour chaque procédure sont optimisés afin d’obtenir le maximum d’informations et des résultats fiables. Les procédures utilisées étant de sévérité légère, nous utilisons des points limites adaptés qui consistent essentiellement à surveiller le poids des animaux, un animal ayant perdu du poids ne sera pas utilisé après la période de wash-out. Les points limites retenus pour la procédure expérimentale de ce projet seront déterminés lors du suivi quotidien des animaux. Une mauvaise hygiène, un repliement sur soi, une diminution de l’activité, une diminution de la prise alimentaire (boisson et nourriture), une perte de poids (>10%) représentent des critères d’observation traduisant la présence d’une souffrance. En cas de souffrance, l’animal est mis en observation pour d’éventuels soins. Si la souffrance, pour des raisons inconnues, persiste, l’animal est euthanasié.

Choix des espèces

Le hamster syrien doré est un animal qui présente de nombreuses similitudes en ce qui concerne le métabolisme des lipides. Il présente une gestion de l'absorption des lipides ainsi qu'une répartition de cholestérol présence du bon et du mauvais cholestérol) similaires à ce qu'on retrouve chez l'homme. Nous avons fait le choix d'utiliser des hamsters adultes (âgés de plus de 8 semaines, environ 100g) ce qui nous permet de réaliser les différents prélèvements dans de bonnes conditions.

30 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées de souffrance légère, toutes tuées à l'issue pour la récolte de leurs tissus. Chacune subit deux à six frottis vaginaux sous anesthésie gazeuse, puis une ponction cardiaque terminale d'environ une minute. L'objet du projet est de mesurer le taux d'œstrogènes dans le sang de souris porteuses d'une modification génétique, pour comprendre le rôle d'une protéine de la peau qui ne se manifeste que chez les femelles. Le porteur indique que les expériences in vitro ont déjà donné des résultats concluants sur le rôle de cette protéine, et juge malgré cela le recours au modèle animal "indispensable" pour le confirmer dans un organisme plus intégré.

Objectifs

L'objectif du projet est de mieux comprendre le rôle d'un protéine régulatrice impliquée dans la physiologie de la peau. Pour cela, un modèle de souris spécifique a été développé, ce qui permet l'étude du rôle de la protéine au sein de la peau. Des résultats préliminaires obtenus sur ce modèle, ont montré son implication dans le développement des vaisseaux sanguins ainsi que dans le métabolisme des lipides, mais cela uniquement chez les souris femelles. Ce rôle sexe-dépendant pourrait être expliqué par les hormones sexuelles, notamment les oestrogènes qui sont des hormones importantes chez les femelles. De plus, un article récent a montré l'expression de la protéine d'intérêt dans l'hypophyse, petite glande située sous le cerveau qui contrôle la sécrétion d'hormones responsables de la production d'oestrogènes. Pour cela, le taux d’œstrogènes dans le sang sera exploré dans le modèle d'intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances sur le contrôle de la production d'oestrogènes chez la souris. L’apport de connaissances fondamentales est un prérequis pour comprendre la physiopathologie des maladies vasculaires et permettre le développement de thérapies à plus long terme.

Procédures

Entre 2 et 6 frottis vaginaux seront réalisés, geste qui dure une 15aine de secondes par souris. La ponction cardiaque en prélèvement terminal sera réalisé sur souris anesthésiées 1 fois et durera environ 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

Le frottis vaginal réalisé pour vérifier le stade hormonal dans lequel les souris sont peut causer un léger stress momentané chez l’animal et sera donc réalisé sous anésthésie gazeuse au début pour diminuer ces effets.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour la récolte des tissus.

Remplacement

Les expérimentations in vitro on déjà été réalisées et ont donné des résultats concluants quant au rôle de la protéine dans la peau. Il est nécéssaire aujourd'hui de confirmer son rôle dans un modèle plus intégré comme la souris. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable.

Réduction

Dans la procédure, le nombre d’animaux a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée au moins trois fois par semaine grâcfe à des points limites précoces et prédictifs qui ont été définis.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation des différents organes qui nous intéressent très semblable à l'Homme et les différentes étapes du cycle hormonal sont conservées. Les souris utilisées dans ce projet seront âgées de 6-20 semaines pour rester cohérent avec les expériences déjà réalisées sur ce projet.

Un taux de prise de greffe de 2 % pour la prostate, 9 % pour le rein, 18 % pour la vessie : 27 500 souris nude vont être utilisées dans des procédures déclarées de souffrance légère, toutes tuées à l'issue, pour établir et entretenir des tumeurs humaines greffées sous leur peau. Chacune reçoit un fragment de tumeur prélevé sur un patient au cours d'une intervention de cinq minutes sous anesthésie, puis le volume tumoral est mesuré au pied à coulisse chaque semaine. Le porteur écrit qu'aucune nuisance particulière n'a été rapportée dans ce type d'expérimentation et que la greffe ne génère pas de douleurs particulières, tout en indiquant que la mise à mort finale sert aussi à "soulager les douleurs éventuelles". Les souris choisies ont cinq à six semaines pour que leur système immunitaire soit encore immature, condition de la prise de greffe, et les lignées tumorales ainsi entretenues seront proposées à des laboratoires publics et privés.

Objectifs

Actuellement, les cancers sont la 2ème cause de mortalité dans le monde avec 19,3 millions de cas pas an/monde, et 10 millions de décès en 2020 an/monde. Dans ce projet, nous nous intéressons à plusieurs cancers, dont la majorité fait partie des cancers qui intéressent plus particulièrement notre laboratoire, à savoir ceux du poumon, du foie, du pancréas, du rein, de la vessie et de la prostate et le mélanome (6,3 millions de cas par an/monde, 3,9 millions de décès par an/monde). Ces cancers sont des pathologies pour lesquelles de nouvelles options thérapeutiques doivent être impérativement développées. La réalisation d'études précliniques nécessite l'utilisation de modèles animaux reproduisant fidèlement les caractéristiques des tumeurs humaines et notamment l’hétérogénéité entre les individus et au sein même de la tumeur. La validation préclinique d'un nouveau traitement passe donc par l'utilisation d'un vaste panel de modèles porteurs de tumeurs aux caractéristiques moléculaires variables. Or, jusqu'à présent, les modèles d'étude en oncologie se basent sur les lignées cancéreuses clonales en culture qui, d'une part ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ et d'autre part, ne permettent pas de reproduire le microenvironnement tumoral dont le rôle dans le développement tumoral et la réponse aux traitements n'est plus à démontrer. Ainsi, les modèles animaux s'avèrent indispensables pour cette problématique préclinique. L'approche par xénogreffe chez la souris nude de tumeurs humaines obtenues au moment de la chirurgie, apparaît comme le modèle expérimental prédictif de la réalité clinique le mieux adapté aux études en oncologie, et ce sont ces modèles que nous nous proposons de développer dans ce projet.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à développer des modèles précliniques pertinents pour les tests thérapeutiques de molécules nouvelles ou en repositionnement. Ces modèles pourront être utilisés en interne au sein de notre Unité, ou en externe pour le public ou le privé. Les retombées de notre projet ont donc des implications potentielles très importantes pour la clinique, et permettront ainsi d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement de ces cancers. Du fait que les patients deviennent généralement résistants aux thérapies anti-tumorales classiques, il y a un besoin urgent de découvrir, de développer et valoriser de nouvelles alternatives thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients notamment aux stades avancés. Ils permettront également d’appréhender les mécanismes de résistance aux thérapies, qui sont souvent un frein au développement de thérapies efficaces, et qui sont en grande partie dues à l’hétérogénéité tumorale, que les autres modèles, cités plus haut, ne peuvent pas reproduire.

Procédures

Les animaux recevront un implant tumoral sous-cutané au cours d’une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. L'expérimentation durera 5 minutes. Le volume tumoral sera suivi par mesure hebdomadaire à l’aide d’un pied à coulisse électronique.

Impact sur les animaux

Comme il s’agit de greffer des petits morceaux de tissus tumoraux, il est possible qu’il y ait une douleur au site d’incision, et une infection au point de suture. Une inflammation au site d’injection est aussi possible. Par ailleurs, la xénogreffe étant située en haut du dos, elle n’engendre aucune gêne de déplacement des animaux et ne génère pas non plus de douleurs particulières ; Les modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX, pour Patient-Derived tumor Xenografts) existent depuis quelques décennies, pour virtuellement tous les cancers, et ils sont développés par de nombreux laboratoires publics comme privés, en France, en Europe et à travers le monde, sans que des nuisances particulières aient pu être reportées. Aucun impact sur le comportement n’a été non plus répertorié dans ce type d’expérimentations.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expérimentations afin de collecter un maximum de tissus afin de procéder à des analyses complémentaires et soulager les douleurs éventuelles.

Remplacement

Le cancer se caractérise par une grande variabilité cytogénétique entre les individus et hétérogénéité au sein même de la tumeur. La réalisation d'études précliniques fiables nécessite l'utilisation de modèles reproduisant fidèlement ces caractéristiques des tumeurs humaines. Or, les modèles d'étude se basant sur les lignées cancéreuses clonales ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. De même, pour les systèmes de culture 3D en cours de développement qui ne permettent pas encore d’obtenir des résultats projetables à l’homme. Par conséquent, aucune méthode de remplacement pertinente n'existe à ce jour. Il est donc indispensable d’utiliser le modèle de xénogreffe de tumeur de patients, seul capable de reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine.

Réduction

Les taux de prise de xénogreffe en primo-implantation pour chaque type tumoral (indiqué chapitre 3.3.2.2 sont : Poumon, 29% ; Foie, 38% ; Pancréas, >50% ; Rein, 9% ; Vessie, 18% ; Prostate, 2% : Mélanome, 27%, pouvant légèrement différer suivant les sources bibliographiques et les caractéristiques des tumeurs utilisées). Notre volonté est de pouvoir disposer et proposer entre 30 et 40 modèles PDX par type de cancer. Un large panel est nécessaire pour tenir compte de l’hétérogénéité tumorale, qui est très important dans les réponses disparates aux thérapies existants, en repositionnement et très probablement aux thérapies émergentes à venir. Par conséquent, nous estimons devoir récupérer environ 50 tumeurs par an pour chaque cancer, soit un total d'environ 350 tumeurs (environ 1750 tumeurs sur 5 ans). Il s’agit donc d’un nombre minimal d'animaux nous permettant d'une part d'optimiser la prise de greffe et d'autre part d'obtenir assez de matériel à la fois pour le maintien du modèle et les analyses/expériences éventuelles ultérieures. Par ailleurs, étant limité par la quantité de matériel biologique, le prélèvement initial (issu du patient) sera greffé au maximum sur 10 souris (entre 2 et 10 souris). Pour l'entretien du modèle, du passage 2 au passage 10 ; 5 souris par passage et par modèle sont suffisantes pour atteindre l'objectif du projet. En conclusion, 27500 animaux seront requis pour la durée du projet. Nous avons ainsi réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les différentes étapes du projet. Le but étant d’établir des modèles stables, aucune analyse statistique n’est nécessaire à cette étape. Ces modèles serviront aux tests thérapeutiques par des laboratoires publique et/ou privées ainsi que par notre laboratoire.

Raffinement

Le raffinement sera assuré par un enrichissement des cages pour le confort des animaux (des bâtons à ronger pour limiter les querelles ; des carrés de coton pour une nidification ; des igloos, permettant le jeu et le repos). Les souris seront nourries et hébergées en groupe ; elles ne seront séparées qu'en cas de comportement agressif avec induction de plaies. Nous diminuerons la douleur et l'angoisse liées à la xénogreffe en opérant sous anesthésie générale, avec une anesthésie locale au site d’implantation, et en appliquant une analgésie péri- et post-opératoire. Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la xénogreffe et pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. De plus, nous avons établi des points limite qui mettront fin à l’expérimentation en cas de souffrance et d’inconfort des animaux.

Choix des espèces

Les pathologies cancéreuses en général se caractérisent par une grande variabilité cytogénétique (variation de l’ADN des cellules tumorales) entre les individus et sont généralement hétérogènes au sein même de la tumeur. Or, jusqu'à présent, les modèles d'étude en oncologie se basent sur les lignées cancéreuses clonales qui ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. Par ailleurs, les modèles expérimentaux in vitro ne prennent pas en compte le rôle du microenvironnement dans le développement tumoral. Ainsi, malgré le développement de cultures 3D dont la mise en place reste difficile, les modèles animaux s'avèrent donc indispensables pour la recherche translationnelle en oncologie. Le modèle expérimental décrit dans ce projet nécessite l'utilisation d'animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d'un tissu étranger. Les greffes seront réalisées sur des souris jeunes âgées de 5 à 6 semaines afin d’avoir un système immunitaire encore très peu mature, permettant d’assurer une prise de greffe optimale.

Rendus obèses et diabétiques par un régime riche en matières grasses avant même le début de toute expérience, 10 000 souris et 5 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le protocole tient à peu de chose, une pesée pour tous et un ou deux prélèvements sanguins pour moins d'un pour cent d'entre eux, le reste étant les signes cliniques que l'alimentation installe. Le porteur décrit un service, ces 15 000 rongeurs étant produits en fonction des "besoins stricts de chaque scientifique" et expédiés à qui les commande. Ceux qui ne partent pas sont tués, un animal "non standard" ne pouvant pas passer d'un projet à un autre si les spécifications diffèrent.

Objectifs

Dans le but d’étudier certaines maladies, il peut être nécessaire d’induire une modification de métabolisme et/ou de paramètres physiologiques en modifiant le régime alimentaire des animaux. Par exemple, une alimentation riche en matières grasses a été liée à un grand nombre de maladies, dont l'obésité, les maladies métaboliques et inflammatoires. Ce projet vise à produire des modèles animaux pathologiques avec des modifications physiologiques induites par l’alimentation dans le but de répondre aux attentes des chercheurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont le développement pour la communauté scientifique d’un modèle diabétique/d’obésité permettant de mieux comprendre et étudier ces phénomènes pathologiques qui touchent à la fois l’humain et l’animal, et de chercher des traitements à ces maladies et leurs comorbidités.

Procédures

Microprélèvements (moins de 1% des animaux, durée du geste : environ 1 minute), prise de sang (moins de 1% des animaux, durée du geste : environ 2min), pesée (100% des animaux, durée du geste : environ 30 secondes par souris et 1 minute par rat). Un animal subira 1 seule pesée et au maximum deux prélevements sanguins pendant l’étude.

Impact sur les animaux

Signes cliniques associés à l’obésité et au phénotype diabétique, stress et douleur associés aux prélèvements sanguins, stress associé à la pesée, stress associé à la contention.

Devenir

Les animaux sont mis à mort car il s’agit d’animaux non standards, suivant un protocole de nourissage et de prise de poids spécifiques aux attentes des scientifiques. On ne peut pas réutiliser les animaux d’un projet pour un autre projet à moins que les spécifications soient identiques ou les animaux sont expédiés chez le scientifique.

Remplacement

Ces modèles pathologiques sont issus de mécanismes complexes avec des processus de régulation impliquant l’ensemble de l’organisme. Ils permettent d’observer les conséquences des pathologies dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques et qui ne peuvent être remplacés par aucune méthode alternative.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et à prendre les deux sexes. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle, ce nombre étant basé sur les taux de réussite connus et attendus des modèles. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal afin d’adapter les traitements et de diminuer la morbidité et mortalité éventuelle.

Raffinement

Les animaux ont accès à de l’enrichissement dans leurs cages (mouchoirs et frisure de carton). Les animaux sont manipulés avec des méthodes à faible stress (manipulation par le corps). Afin de limiter le stress lors des prises de sang, dès que possible, les microprélèvements sont favorisés au lieu de prise de sang. Des points limites spécifiques et précoces ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces très utilisées en recherche. Ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables. Ce sont les espèces qui permettent à la communauté scientifique de réaliser un certain nombre d'études en recherche et développement grâce aux données historiques et à leur connaissance de ces modèles animaux. Stade adulte compte tenu que l’aliment est donné aux animaux après sevrage (généralement à 6 semaines), comme le demande le modèle pathologique.

630 souris Swiss vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une injection et un prélèvement de sang sous anesthésie générale, en moins d'une minute, puis reste sous surveillance vingt-quatre heures avant d'être tuée pour le dosage du produit dans ses organes. Trois formulations d'un antidote contre les neurotoxiques organophosphorés sont comparées, l'enjeu déclaré étant d'équiper l'armée, la protection civile et les centres antipoison contre une menace chimique que le porteur relie au contexte géopolitique. Il écrit que la molécule a déjà montré in vitro sa capacité à franchir la barrière hématoencéphalique, et que le passage à l'animal reste "incontournable à ce stade".

Objectifs

Au vu du contexte géopolitique actuel ainsi que des récents évènements rapportant l’utilisation malveillante d’armes chimiques contre des populations civiles, le risque d’attaque chimique est une menace de plus en plus présente. Les armes chimiques telles que le sarin, le tabun, le VX, et le Novitchok sont des composés neurotoxiques organophosphorés. Ces types de composés ne sont pas seulement utilisés en tant qu’armes chimiques mais également comme pesticides dans l’agriculture dans les pays émergents où ces produits ne sont pas encore interdits. Les composés organophosphorés sont des toxiques mortels agissant au niveau du système nerveux central. Les antidotes actuellement sur le marché font face à des inconvénients majeurs avec notamment une efficacité thérapeutique très limitée et un faible spectre d’action. Pour ces raisons, de nouveaux antidotes ont été développés. La molécule JDS364, brevetée en 2017, se démarque particulièrement : elle fait preuve d’une forte capacité à bloquer l’action des composés organophosphorés sur des modèles cellulaires. Elle a également une meilleure capacité à franchir la barrière hématoencéphalique (BHE) par rapport aux antidotes sur le marché (résultats in vitro). Cependant, le développement de cet antidote fait face à quelques limitations. Des problèmes de solubilité dans le plasma sanguin des souris ont été démontrés ce qui empêche la molécule d’atteindre le système nerveux central. Afin de faire face à cette problématique, une solution envisagée est de réaliser des formulations par encapsulation de l’antidote pour augmenter la solubilité et la stabilité de la molécule JDS364. L’objectif de cette étude est donc de réaliser la pharmacocinétique et la biodistribution des trois formulations de cet antidote sur un modèle murin sain, suivant différentes modalités d’administration adaptées aux différents cas de figure (champ de bataille, attaque terroriste, agriculteur intoxiqué,…) . Les données recueillies serviront à mettre en place ultérieurement des études d’efficacité in vivo sur un modèle murin intoxiqué par une neurotoxine, études qui seront réalisées par une équipe partenaire.

Bénéfices attendus

Les composés neurotoxiques organophosphorés sont les éléments essentiels de l'arsenal chimique militaire moderne et leur utilisation possible au cours d'un conflit ou d'actes terroristes pose le difficile problème de la prise en charge collective de ce type d'intoxication. Des exemples récents d’utilisation d’armes chimiques dans l’actualité ne manquent pas. Ils sont également utilisés à large échelle comme insecticides dans les pays emergents où ces produits ne sont pas encore interdits et sont responsables d’une mortalité élevée par intoxication aiguë. Les antidotes actuellement sur le marché font face à des inconvénients majeurs avec notamment une efficacité thérapeutique très limitée et un faible spectre d’action. Le développement de nouveaux antidotes efficaces est donc une priorité pour équiper l’armée, la protection civile et les centres antipoisons des hôpitaux contre cette menace chimique.

Procédures

Chaque souris subira une injection et un prélèvement de sang sous anesthésie générale dont la durée n’excèdera pas une minute.

Impact sur les animaux

La dose injectée étant sans effet toxique ou néfaste ne devrait pas produire d’effets indésirables. Les souris peuvent subir un inconfort modéré et transitoire pendant et après l’injection des formulations, notamment l’injection intramusculaire. Un léger stress peut être induit au moment de l’anesthésie à l’isoflurane.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les organes pour des dosages de la molécule JDS364.

Remplacement

La barrière hématoencéphalique est un système très complexe de par sa composition, son organisation et son fonctionnement. Elle n’a pas la même perméabilité pour toutes les molécules. Les modèles précliniques actuels ne reproduisent pas complètement cette complexité et ont une pertinence physiologique limitée. L’antidote de cette étude, le JDS364, a déjà montré une forte capacité à bloquer l’action des molécules organophosphorées et une meilleure capacité à franchir la BHE lors d’études in vitro. La prochaine étape est maintenant de tester cet antidote sur un animal afin de vérifier qu’en conditions physiologiques complexes, le passage de la BHE est toujours effectif. Le passage à l’animal est donc incontournable à ce stade de notre étude.

Réduction

Le nombre de formulations testés in vivo dans ce projet a été limité à trois (les trois plus prometteuses) pour réduire le nombre d’animaux. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été déterminé par une approche statistique qui permet de définir le juste nombre d’animaux à inclure dans l'étude afin de pouvoir exploiter les résultats de façon fiable.

Raffinement

Les administrations et prélèvements de sang s’effectueront sous anesthésie générale à l’isoflurane afin de réduire au maximum la douleur et le stress que pourraient subir les animaux lors des gestes techniques. Les produits injectés seront à température ambiante et l’aiguille sera changée entre chaque animal afin de réduire l’inconfort du à l’injection. Les souris seront surveillées pendant toute la durée de la procédure qui dure 24h. Une surveillance particulière sera mise en place après l’administration jusqu’au réveil complet des souris. Des points limites adaptés seront strictement appliqués en cas de souffrance avérée déterminée à partir de signes cliniques précis.Les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi de tubes en cartons et de matériaux de nidification (type sizzle nest ou cocon) afin de favoriser les comportements naturels tels que l’activité et la fabrication d’un nid pour se mettre à l’abri.

Choix des espèces

La procédure se fera sur souris Swiss afin de pouvoir comparer la pharmacocinétique et la biodistribution de nos formulations de JDS364 avec d’autres antidotes testés sur cette espèce. La procédure se fera sur des souris Swiss adulte de 8-12 semaines, la cible clinique étant majoritairement une population adulte.

Produits en permanence sur le site d'un éleveur et vendus à la communauté scientifique, 10 000 rats ZDF vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont obèses et diabétiques par construction, l'accouplement retenu étant consanguin, frère-sœur, entre mâles obèses et femelles non obèses, les femelles obèses ne produisant pas de lait. Ceux qui ne partent pas chez un chercheur sont tués, le porteur indiquant qu'ils portent un phénotype dommageable et ne peuvent pas être proposés à l'adoption. Les procédures se limitent à des microprélèvements sanguins jusqu'à deux fois par semaine, quatre prises de sang et une pesée hebdomadaire, auxquels s'ajoutent les signes cliniques de l'obésité et du diabète. Le porteur affirme qu'aucun modèle "alternatif inerte systémique complet" n'existe encore pour remplacer l'animal vivant.

Objectifs

Le projet a pour but de développer et fournir à la communauté scientifique des modèles animaux avec une modification du métabolisme et/ou physiologique induite par la modification du régime alimentaire (aliment riche en matière grasse). Le modèle est un modèle de rat diabétique et obèse nourri avec une alimentation spécifique, produit de façon permanente sur le site.

Bénéfices attendus

Mise à disposition pour la communauté scientifique d’un modèle diabétique/d’obésité permettant de mieux comprendre et étudier ces phénomènes pathologiques qui touchent à la fois l’humain et l’animal, et de chercher des traitements à ces maladies et leurs comorbidités.

Procédures

Micro prélèvements (durée : 1 minute, fréquence : deux fois par semaine au maximum), prise de sang (durée 2 minutes, fréquence : 4 fois, à minimum trois semaines d’intervalle), pesée (durée : 30 secondes, fréquence : une fois par semaine)

Impact sur les animaux

Signes cliniques associés à l’obésité et au phénotype diabétique, stress et douleur associés aux prélèvements sanguins à la queue, stress associé à la pesée, stress associé à la contention.

Devenir

Mise à mort ou expéditions chez le scientifique. Les animaux non expédiés chez le scientifique seront mis à mort car présentant un phénotype dommageable et ils ne peuvent pas être proposés à l’adoption.

Remplacement

L’étude de la pathologie du diabète et de l’obésité, et la recherche de traitements nécessite encore à ce jour l’utilisation de modèles in vivo, des modèles alternatifs inertes systémiques complets n’existant pas encore à ce jour.

Réduction

Suite à l’analyse de nos statistiques de production et d’envoi d’animaux à la communauté scientifique, il a été décidé de réduire le niveau de nos colonies et de réduire le nombre de reproducteur de 20%. En choisissant le schéma d’accouplement consanguin (frère-soeur) mâle obèses (homozygotes pour le gène d’intérêt) avec femelles non-obèses (hétérozygotes pour le gène d’intérêt), nous optimisons le nombre d’animaux portant le phénotype d’intérêt au sein de la portée en réduisant les animaux réformés n’ayant pas le bon génotype. L’accouplement homozygote par homozygote n’est pas possible car les femelles homozygotes ne produisent pas de lait. De plus, certains scientifiques ont besoin d’animaux témoins non-obèses (de génotype hétérozygote).

Raffinement

Les animaux ont accès à de l’enrichissement dans leurs cages (mouchoirs et frisure de carton). Les animaux sont manipulés avec des méthodes à faible stress (manipulation par le corps). Dès que possible, les microprélèvements sont favorisés au lieu de prise de sang. Des points limites spécifiques et précoces ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces très utilisées en recherche. Ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables. Ce sont les espèces qui permettent à la communauté scientifique de réaliser un certain nombre d'études en recherche et développement grâce aux données historiques et à leur connaissance de ces modèles animaux. Les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines car c’est à partir de cet âge que le phénotype diabétique/obèse commence à s’exprimer.