Procédures légères

Réutilisées pour 2 700 d'entre elles dans des projets sur le cancer ou le système nerveux central, tuées pour les 620 autres, 3 320 souris génétiquement modifiées sont déclarées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, sans intervention prévue. Le projet porte sur leur hébergement en cages ventilées et matériels stérilisés, l'immunodéficience de ces lignées les rendant vulnérables aux infections. Parmi elles, 320 souris "sentinelles" servent de détecteurs du statut sanitaire de l'animalerie, précisément parce que leur déficit immunitaire prononcé les rend très sensibles aux agents infectieux, et sont tuées entre quatre et cinq mois après lecture des contrôles. Les 300 reproductrices sont tuées à six mois, et le porteur présente l'ensemble du dispositif comme un objectif de raffinement destiné à empêcher l'apparition d'un "phénotype dommageable".

Objectifs

Le projet est porté par une plateforme qui élève des souris génétiquement modifiées au service de laboratoires qui les utilisent dans différents projets autorisés. Les animaux en élevage sont particulièrement fragiles ; différentes mesures sont mises en place pour les protéger en particulier des infections. Parmi ces mesures, en accord avec le vétérinaire référent de notre structure, nous utilisons des souris "sentinelles" du statut sanitaire, qui, du fait de leur déficit immunitaire prononcé, ont une grande sensibilité aux agents infectieux. De plus, parmi les souris élevées, certaines ont un déficit immunitaire modéré ; ces souris sont utilisées dans des projets d'études des cancers ou de maladies du système nerveux central qui nécessitent d'avoir recours à des greffes de cellules dites "étrangères". Les souris avec une immunodéficience modérée ne rejettent pas les cellules étrangères greffées. Le projet consiste à mettre en place des conditions environnementales adaptées pour héberger des souris présentant une immunodéficience et empêcher que l'immunodéficience ne conduisent à un état de mal-être. L'objectif du projet est donc d'empêcher l'apparition d'un "phénotype dommageable" dans le respect des 3R.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont : la réduction du nombre d'animaux élevés par maitrise du statut sanitaire et le raffinement des conditions d'hébergement permettant de minimiser au maximum les situations de mal être des souris hébergées.

Procédures

Aucune intervention prévue sur les animaux.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable prévus sur les animaux dans les conditions d’hébergement mises en place dans le projet.

Devenir

La plupart des animaux (2700) seront réutilisés dans des projets scientifiques en cancérologie ou étudiant des maladies du système nerveux central. Les animaux reproducteurs seront mis à mort après 6 mois d'âge (300). Les animaux sentinelles pour la gestion sanitaire de l'animalerie seront mis à mort après obtention des résultats des contrôles sanitaires soit entre 4 et 5 mois d'âge (320).

Remplacement

Les animaux hébergés dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents experts scientifiques, projets pour lesquels il n'existe à ce jour aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Les animaux sentinelles étaient initialement utilisés dans l'ensemble de l'animalerie pour surveiller le statut sanitaire ; nous les utilisons maintenant uniquement dans la zone d'élevage où les animaux sont particulièrement fragiles. Pour les élevages, l'utilisation d'animaux sentinelles est considérée comme le moyen le plus efficace de repérer des agents infectieux.

Réduction

La mise en œuvre de conditions d'hébergement limitant la contamination des souris immunodéficientes par des micro-organismes permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en limitant les infections qui pourraient avoir un impact sur la viabilité de ces souris. De plus, pour les lignées en élevage sur site, la stratégie d’accouplement à la demande et non en continue (présence d'un mâle en continu dans la cage des femelles) permet de limiter également la production d'animaux surnuméraires. L'utilisation des animaux sentinelles permet de contrôler la qualité du statut sanitaire et la bonne santé de l'ensemble des animaux dans la zone d'élevage ; les animaux sentinelles contribuent ainsi à une meilleure maitrise du nombre d'animaux élevés sur site.

Raffinement

Le raffinement des conditions d'hébergement passe par un hébergement en cage ventilée avec filtration de l'air sur filtre à haute efficacité de filtration pour exclure toute contamination dans l'air entrant et sortant cage à cage ; l'air de la zone d'élevage étant lui-même filtré et renouvelé à haute fréquence. Cette approche est couplée à une décontamination/stérilisation de l'ensemble des matériels pouvant être au contact des animaux (matériels d'hébergement, aliments, litière, matériel d'enrichissement, eau de boisson...etc): décontamination thermique,chimique, par irradiation aux rayons gamma ou par ultrafiltration avec stérilisation aux ultra-violets pour l'eau d'abreuvement. Enfin, le port d'équipements de protection individuelle pour les manipulateurs permet également de renforcer la barrière sanitaire mise en oeuvre pour éviter une contamination de l'animalerie et l'apparition de situations de mal-être chez les souris immunodéficientes en particulier. Le suivi des animaux est réalisé quotidiennement par des personnels expérimentés formé à l’utilisation d’un outil développé par le centre national 3R en Angleterre : l’échelle de la grimace de la souris qui permet d’identifier la douleur de façon précoce. Cette échelle est basée sur l’observation fine des yeux, du nez, des joues, des oreilles et des moustaches avec 3 niveaux d’expression. Les expressions faciales s’intensifient en réponse à une douleur, et peuvent être utilisées comme un élément de l’évaluation clinique. Des critères stricts et précoces de prise en charge de la douleur ont été définis.

Choix des espèces

La pertinence de l'espèce choisie a été justifiée dans les projets de recherche réalisés dans notre l'animalerie. Pour les animaux élevés sur site, ils sont transférés aux laboratoires pour une inclusion dans les projets de recherche à l'âge adulte soit entre 2 et 3 mois. Pour les animaux non élevés sur site, les animaux arrivent en provenance d'élevages agréés juste après leur sevrage. Pour les animaux sentinelles, ils sont remplacés à l'âge de 5 mois par des animaux dits "naifs". Le délai de 4 mois au sein de notre animalerie est un compromis pour repérer rapidement des contaminations récentes tout en utilisant un minimum d'animaux.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent de l'uranium dans leur eau de boisson pendant six mois, passent jusqu'à seize heures seules en cage à métabolisme pour le recueil des urines et des fèces, et subissent des échographies doppler de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie avant d'être tuées pour prélever le sang, les reins et les os. Le projet dispose déjà de sphéroïdes, d'organoïdes rénaux et de modèles osseux biomimétiques, et le porteur indique que les souris servent d'abord à évaluer la robustesse de ces modèles sans animaux, puis à observer la relation entre os et rein qu'il juge irréalisable in vitro. Il présente la mutualisation des prélèvements entre partenaires du projet comme sa mesure de réduction.

Objectifs

L’uranium est un métal lourd radioactif naturellement présent dans l’environnement. Du fait de cette présence naturelle mais également de ses propriétés de radioéléments il est utilisé par l’Homme pour diverses applications civiles et militaires. La population générale peut y être exposée par ingestion d’eau de boisson et/ou d’aliments contaminés. Diverses études épidémiologiques et expérimentales ont auparavant montré qu’une exposition environnementale, ou professionnelle à l’uranium peut induire des effets délétères sur les reins et les os connues comme étant les organes cibles de la toxicité aiguë de ce radioélément. Cependant d’importantes lacunes subsistent sur la compréhension des mécanismes à l’origine de cette toxicité ; de plus l’impact de cette toxicité sur la relation qui existe entre ces deux organes est très peu documenté - notamment dans le cadre d’une exposition chronique à faible dose qui correspond au risque d’exposition professionnelle ou de la population générale. Le présent projet permettra de comprendre les réponses biologiques et biochimiques existantes après une exposition chronique à de faible dose d’uranium au niveau des reins et des os ainsi qu’entre ces deux organes qui possèdent une relation physiologique importante. Le projet s’appuiera sur un modèle in vivo de souris non modifiées génétiquement qui a déjà prouvé être un modèle pertinent lors de précédentes études de toxicologie rénale. De plus, afin de limiter l’utilisation d’organismes vivants, le projet s’appuiera également sur différents modèles cellulaires 3D innovants (osseux et rénaux). Ils permettront d’évaluer en amont les mécanismes toxicologiques mis en jeu au cours d’une exposition chronique à faibles doses d’uranium. Les mécanismes et les voies cellulaires altérées au cours des études de toxicologie cellulaire seront par la suite analysés plus finement à l’aide du modèle in vivo dont il est fait mention. L’étude de ces réponses et de ces interactions physiologiques sera effectuée en collaboration avec des spécialistes du tissu osseux ainsi que des spécialistes des interactions protéines-ligands.

Bénéfices attendus

A court terme ce projet a pour objectif de mieux comprendre le comportement et le devenir de l’uranium (séparation en différence espèce chimique, interaction, distribution spatiale) dans les compartiments intra et extra-cellulaires des différents modèles osseux et rénaux chez l’animal, d’identifier les voies de signalisations cellulaires impactées, et différents biomarqueurs au sein et entre ces deux organes après une exposition chronique à faible dose. A plus long terme, ce projet a pour objectif de permettre une meilleure compréhension et une meilleure prise en charge des risques pour les populations et la santé humaine à la suite d’une contamination interne aux radionucléides.

Procédures

L’exposition par eau de boisson sera faite avec une surveillance du poids des biberons et du poids des animaux ; il n’est pas attendu de nuisance importante par rapport à l’exposition en cohérence avec les précédentes études publiées ; l’exposition interne à l’uranium doit conduire à une irradiation dans le domaine des faibles doses. Les animaux seront hébergés pendant un maximum de 16 heures individuellement en cage à métabolisme à 2 mois et/ou, 4 mois et/ou 6 mois selon la procédure expérimentale. Les analyses échographiques sont non-invasives et effectuées sous anesthésie : l’échographie aura lieu sous anesthésie légère pendant 30 à 45 minutes sous monitoring cardiaque et respiratoire. Elles seront réalisées avant l’exposition et à 2 mois et/ou 4 mois et/ou 6 mois selon la procédure expérimentale. Un prélèvement de sang est réalisé sur animal anesthésié juste avant son euthanasie de l’animal (2 min).

Impact sur les animaux

L’étude est susceptible de provoquer un léger stress chez les animaux qui seront amenés à être manipulé notamment lors du passage en cage spécifique pour la collecte d’urines et de fèces ; ainsi que pour le suivi par échographie doppler qui nécessitera une anesthésie préalable.

Devenir

Les animaux seront anesthésiés avant d’être mis à mort à la fin de l’exposition pour prélèvement terminaux (sang, reins, os) qui seront par la suite utilisés à des fins histologiques (marquages des tissus pour localisation de biomarqueurs cibles au sein des tissus), ainsi qu’en biochimie et biologie moléculaire (expression de gènes cibles, quantification de protéines et de marqueurs d’atteintes toxicologiques/pathologiques).

Remplacement

Le projet comprend l’utilisation de modèles cellulaires innovants dont des sphéroïdes et organoïdes rénaux ainsi que des modèles osseux biomimétiques qui permettront d’évaluer une réponse toxicologique et de mettre en avant des voies de signalisation propres à l’organe d’intérêt du modèle utilisé (reins ou os). L’utilisation d’animaux au sein de ce projet permettra dans un premier temps d’évaluer la robustesse du développement de nos nouveaux modèles 3D (application des principes de remplacement) ; mais également d’analyser les réponses biologiques et biochimiques à l’uranium au niveau systémique et donc d’intégrer les relations hormonales existantes entre les os et le rein ce qui n’est pas réalisable à l’heure actuelle avec des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé à l’aide de calcul statistique afin d’aboutir à un effectif minimal qui permettra un traitement des données statistiques à la suite de la procédure expérimentale. Les souris euthanasiées permettront de fournir des échantillons biologiques de façon mutualisées (os, reins, fluides biologiques etc) pour tous les partenaires impliqués dans le projet et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés si les études in vivo avaient été divisés entre les partenaires du projet.

Raffinement

Pendant toute la durée de l’étude, les animaux seront hébergés en groupe maximum de 5, avec un enrichissement supplémentaire (ouates, maisons…) comme mesure de raffinement. L’isolement pourra être fait uniquement en cas d’agression entre congénères. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé. Les points d’arrêt définis dans le projet seront appliqués à tous les animaux de l’étude présentant des signes comportementaux ou cliniques d’atteinte et conduiront à la mise à mort anticipée de l’animal (application du principe de raffinement).

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J est un modèle bien décrit dans la littérature. De plus les précédentes études sur la physiopathologie rénale effectuées au laboratoire après exposition interne à l’uranium ont permis à l’équipe porteuse des procédures d’expérimentation animale d’acquérir une expertise sur ce modèle de souris. Les animaux seront des adultes de 6-8 semaines au moment du début de l’exposition chronique. A cet âge, la physiologie rénale et osseuse est mature. Les animaux seront hébergés et mis en groupe à l’âge de 5 semaines afin de limiter les agressions entre congénères.

Cathétérisés à l'oreille sur animal vigile puis tués par surdose d'anesthésique, 100 lapins sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, leurs organes prélevés après la mort. Ils appartiennent à une lignée génétiquement modifiée privée d'oestrogènes, entretenue pour mesurer l'effet de ces hormones sur l'hypophyse, la thyroïde et les surrénales. Le porteur écrit qu'aucune habituation à la boîte de contention n'est prévue puisque la procédure n'a lieu qu'une seule fois, et attribue la douleur à la pose du cathéter sur animal éveillé. Il affirme qu'aucune stratégie de remplacement n'est possible, aucun système de culture ne reproduisant selon lui l'équilibre hormonal d'un mammifère.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer l’impact des œstrogènes sur le système de sécrétion interne d’hormones dans sa globalité (hormones produites par l’hypophyse, la thyroïde, et les surrénales). Cet objectif est rendu possible grâce à l’existence d’une lignée de lapin génétiquement modifiée déjà établie pour laquelle les animaux génétiquement modifiés sont dépourvus d’œstrogènes

Bénéfices attendus

Il est connu que les œstrogènes (hormones sexuelles) ont un effet global sur de nombreux paramètres physiologiques chez la femme (humeur, comportement, métabolisme, solidité osseuse, santé…etc). La majorité de ces effets fait penser à un dérèglement hormonal général, n’impliquant pas seulement les ovaires mais également les sécrétions hormonales d’autres glandes. Les attendus espérés du projet sont de mieux évaluer le rôle des œstrogènes sur la fonction endocrine globale de l’individu.

Procédures

Tous les lapins auront la pose d’un cathéter veineux auriculaire (1 seule fois, le temps de pose du cathéter est compris entre 30 secondes et 1 minute maximum) afin de leur injecter un anticoagulant (animaux vigiles) (1 seule fois, temps d’injection 10 secondes). Ils seront ensuite sédatés (1 seule fois, temps d’injection 10 secondes) avant d’être euthanasiés par surdose d’anesthésique (1 seule fois, temps d’injection compris entre 20 à 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés principalement à la pose du cathéter veineux (douleur liée à la pose du cathéter en vigile), au léger stress lié au transport entre l’élevage et le bâtiment où est pratiqué la pose du cathéter, et au positionnement de l’animal dans la boîte de contention. Dans une moindre mesure, ils peuvent résulter des injections (via le cathéter veineux) des produits vétérinaires pour éviter la coagulation et tranquilliser l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organes/tissus.

Remplacement

Aucune stratégie de remplacement n’est possible sur ce projet. En effet, à notre connaissance il n’existe aucun système de culture de différents organes complexes, comme les glandes productrices d’hormones, susceptible de reproduire in vitro l’équilibre hormonal d’un mammifère.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Cependant, le nombre d’animaux impliqués sera revu à la baisse tout au long de l’acquisition des résultats. Si, lors d’une première expérience impliquant une vingtaine d’animaux, nous ne voyions pas d’effet de l’absence des hormones sexuelles sur les autres glandes productrices d’hormones, les investigations seront arrêtées. Dans le cas contraire, 20 animaux sont requis par année supplémentaire afin d’analyser les glandes endocrines de 4 groupes de lapins. Cinq animaux par génotype et par sexe sont requis pour obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Une injection de tranquillisant sera réalisée avant l’euthanasie afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance ou l’angoisse. Par ailleurs, les animaux sont hébergés dans la lapinerie où les conditions d’élevage sont optimisées (boisson et nourriture à volonté, enrichissement du milieu). Aucune procédure d’habituation des animaux au placement en boîte de contention n’est envisagée étant donné que la procédure expérimentale n’aura lieu qu’une seule fois. Des points limites adaptés seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le lapin car d’une part, nous avons montré que le lapin représente un meilleur modèle que les rongeurs en ce qui concerne la production de ces hormones et d’autre part, nous possédons une lignée de lapin dépourvus d’œstrogènes qui est à la base de ce projet. Les animaux choisis pour l'étude seront des adultes âgés de 6 mois à 2 ans, car le projet se concentre sur l'imprégnation hormonale post-pubertaire.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une mutation qui les rend diabétiques et obèses, elles reçoivent un gavage quotidien six jours sur sept pendant douze semaines et subissent quatre échographies cardiaques de trente minutes sous anesthésie, avec épilation à la crème et injection intrapéritonéale d'un vasodilatateur. Le porteur affirme que ce protocole d'imagerie n'entraînera "pas de douleur, souffrance ou angoisse", et ne retient comme nuisances que le stress du transport pédestre entre bâtiments et celui du réveil d'anesthésie. Il justifie la mise à mort par la "nécessité" d'objectiver l'atteinte des microvaisseaux coronaires après la mort, pour un médicament déjà largement prescrit en clinique.

Objectifs

Les maladies des artères coronaires sont responsables d’une augmentation de la mortalité cardiovasculaire. L’objectif de cette étude est d’étudier la possibilité de la prévention de ces maladies en utilisant un traitement contre l’insuffisance cardiaque (Entresto) dont les effets coronaires sont inconnus à ce jour, dans un modèle de souris obèse diabétique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra l’évaluation de la capacité de l’Entresto à prévenir la dysfonction coronarienne microvasculaire.

Procédures

Les animaux prendront part à plusieurs imageries échographiques cardiaques réalisées à 8, 12, 16 et 20 semaines d’âge. Elles se feront sous anesthésie volatile et dureront 30 min maximum pour chaque souris. Durant les acquisitions les souris seront épilées au niveau de la zone d’intérêt avec une crème épilatoire pour peaux sensibles, elles seront sur un lit thermostaté pour compenser la chute de température corporelle liée à l’anesthésie et recevront un gel ophtalmique pour prévenir toute sécheresse oculaire. Les échographies auront lieu dans un autre établissement utilisateur que l’hébergement, Le transport des animaux vigiles prendra environ 10 min et se fera par voie pédestre dans des conditions de raffinement maîtrisées en utilisant des cages isolées des stimuli extérieurs. A partir de l’âge de 8 semaines et immédiatement après la 1ère échographie, une solution d’Entresto diluée dans du liquide physiologique sera administrée quotidiennement par gavage aux animaux du groupe traité jusqu’au terme du protocole, c’est-à-dire pendant 12 semaines, soit jusqu’à 20 semaines d’âge. Le volume administré quotidiennement per os sera de l’ordre de 300 µL. Les animaux des groupes diabétiques et contrôles non traités se verront administrer un volume similaire de liquide physiologique. Une trêve dominicale sera observée pour tous les animaux (traitement 6 jours / 7 pendant 12 semaines), compatible avec la pharmacocinétique de l’entresto décrite chez le rongeur. Un prélèvement sanguin caudal sera effectué sur les animaux vigiles à 8 et 20 semaines pour dosage plasmatique d'un marqueur d’efficacité du traitement.

Impact sur les animaux

L’imagerie échographique cardiaque implique l’administration intrapéritonéale d’un agent vasodilatateur qui sera réalisée sous anesthésie volatile afin de limiter le stress aux animaux. Le transport et le changement d’animalerie peuvent aussi induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport, pédestre, sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que les deux prélèvements caudaux peuvent également causer un stress léger. En revanche, aucun effet indésirable n’est attendu comme conséquence de l’administration de l’Entresto, qui est largement utilisé en clinique.

Devenir

La mise à mort des animaux à l’issue de la procédure expérimentale est justifiée par la nécessité d’objectiver la dysfonction coronaire microvasculaire par des études immunohistochimiqes post-mortem.

Remplacement

Les atteintes des microvaisseaux coronaires sont la conséquence de désordres métaboliques et physiologiques qui sont à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro et qui nécessitent l’utilisation d’un modèle animal. De plus, l’évaluation de l’effet de l’Entresto sur la microcirculation coronaire doit être effectuée in vivo pour que l’on puisse envisager une extrapolation des résultats à la situation clinique.

Réduction

L’utilisation de 24 animaux au total se répartissant en 8 animaux / groupe est un minimum pour l’analyse fiable des résultats. Nous fondons ce dimensionnement sur une étude préalable ayant mis en évidence une dysfonction coronaire microvasculaire par réduction significative de la réserve coronaire in vivo chez des rats obèses avec des effectifs similaires. Nous comptons également sur l’absence de mortalité observée précédemment au décours de ce protocole expérimental pour limiter au maximum la taille initiale des groupes expérimentaux.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec enrichissement du milieu de vie, un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites stricts et spécifiques au modèle animal et aux actes réalisés sont mis en place, via une grille de scoring, afin d’évaluer une potentielle souffrance. Une surveillance accrue de la consommation d’eau de boisson en raison de la polydipsie des animaux diabétiques sera réalisée, et la fréquence de change des cages sera augmentée si nécessaire. Les sessions d’imagerie échographique cardiaque se dérouleront sous anesthésie volatile, avec une anesthésie d’environ 30min. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et les fréquences respiratoire et cardiaque seront monitorées en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Le protocole d’imagerie échographique cardiaque n’entrainera pas de douleur, souffrance ou angoisse.

Choix des espèces

La lignée de souris choisie possède une mutation génétique qui la rend diabétique. Le modèle est très largement utilisé pour l’étude de maladies métaboliques car il reflète bien la maladie humaine , tout en étant moins sévère que d’autres modèles. Ce modèle constitue donc un outil largement utilisé pour l’étude de la maladie coronaire microvasculaire et de sa prévention. Les animaux seront accueillis à 7 semaines d’âge, à un stade de développement précoce de la maladie diabétique entraînée par la mutation dont ils sont porteurs. Le choix de ce stade précoce est guidé par la volonté d’étudier le potentiel de l’Entresto à prévenir la maladie coronaire microvasculaire.

Soumis à l'injection intramusculaire d'un produit épais sous sédation puis à des prélèvements sanguins deux fois par semaine, 960 rats mâles seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'objet du projet est un contrôle qualité de lot pour un médicament de castration chimique déjà commercialisé, la mesure de la testostérone dans le sang servant à valider l'efficacité de chaque flacon. Le porteur indique qu'un essai in vitro existe, qu'il est déposé dans tous les pays et présente des avantages éthiques, et que le passage par le rat intervient quand ce test in vitro donne un profil atypique. Il affirme alors que l'essai sur animaux est "nécessaire", et exclut toute réutilisation des rats parce qu'elle risquerait d'interférer avec un test suivant.

Objectifs

L’objectif du projet est de réaliser un contrôle qualité d’un médicament injectable à libération prolongée, à base d’une hormone qui libère les gonadotrophines (hormones sexuelles), et qui est utilisé pour le traitement de certaines maladies urologiques, gynécologique et pédiatriques (cancer de la prostate, endométriose...). Ce projet a pour but d’injecter chez le rat mâle le produit à différente concentration, avec trois durées de libération différentes et de mesurer par des analyses sanguines la cinétique d’apparition de la testostérone dans le sang pour valider l’efficacité du médicament à provoquer une castration chimique.

Bénéfices attendus

Ces essais sont utilisés à des fins réglementaires et médicales. Ce médicament est bénéfique dans le traitement des patients atteints de certaines maladies urologiques, gynécologique et pédiatriques (cancer de la prostate, endométriose...). Avant la libération du médicament, un contrôle qualité est requis. Une alternative in vitro à ce test existe, néanmoins le substrat particulier dans lequel cette analyse in vitro est réalisée est parfois défaillant, invalidant le test alors que le médicament fonctionne normalement, et dans ce cas le contrôle qualité doit être répété via la méthode in vivo historique chez le rat.

Procédures

Les interventions sur les animaux sont les suivantes : L’injection en IM d’un produit épais réalisé sous sédation, les prélèvements sanguins répétés pour permettre l’obtention de sérum. Ils sont réalisés 2 fois par semaine avec un intervalle de 3 jours.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces essais sont : L’injection en intra-musculaire (IM) d’un produit épais. Les prélèvements sanguins répétés pour permettre l’obtention de sérum peuvent amener à un stress lié à la contention de l’animal et également des saignements localisés chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de protocole ou en cas d'atteinte de points limites. La réutilisation des animaux pour un autre essai n’est pas possible car cela pourrait interférer avec le résultat de ce second test.

Remplacement

Les essais in vitro comporte de nombreux avantages (éthiques, rapidité, flexibilité) et permettent de valider la conformité de la cinétique de libération du produit. Ils sont déposés dans tous les pays mais néanmoins en cas de résultats non conforme avec un profil atypique de libération, l’essai in vivo est nécessaire pour valider les échantillons et vérifier l’efficacité du produit.

Réduction

Le responsable de projet s’assure dans la mesure de ses connaissances que le scientifique ait évalué les aspects 3Rs. Des groupes de 3 rats par flacon de médicament (soit 6 rats par type de produits, 2 flacons par produits) ont été identifiés comme la taille minimale de l’échantillon pour avoir des résultats valides comme indiqué dans l’AMM.

Raffinement

Les rats sont hébergés en groupes sociaux, avec différents enrichissements dans leurs cages (e.g. tunnel, lanières de papier foisonnantes ). Ils sont observés chaque jour par du personnel formé et compétent et des points limites sont mis en place). Les animaux seront manipulés par des méthodes à faible stress, et les contentions seront limitées aux gestes d’injection et de prélèvement. Avant l’injection du produit, les animaux recevront une sédation et analgésie par administration sous cutanée. En cas de boiterie suite à l’injection du produit, des anti-inflammatoires non-stéroïdiens pourront être administrés. Avant les prélèvements de sang à la veine caudale, les rats sont positionnés dans une enceinte chauffante pendant 10 minutes pour faciliter le prélèvement. Les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivent la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisés que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. Si l’accès à la veine caudale n’est pas possible, consultation du service vétérinaire pour utiliser une autre voie. Une injection de solution saline est effectuée en sous cutané pour réhydrater l’animal après chaque prélèvement sanguin.

Choix des espèces

Espèce sur laquelle le test in vivo a été validé historiquement (réponses pharmacodynamiques proches de celle de l’homme), et décrite dans les dossiers d’AMM. Test in vivo historiquement développé et validé sur la souche de rat mâle agé de 12-14 semaines comme décrit dans les dossiers d’AMM. Ce qui correspond à une tranche de poids de 300 à 400 grammes environ.

Pour mettre au point un système de suivi automatisé du comportement des rats, 120 individus sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, puis tués parce que "l'expérimentation est terminée". Chacun reçoit sous anesthésie gazeuse une puce d'identification implantée sous la peau, après rasage, incision et fermeture par agrafe. Le porteur présente le dispositif comme plus respectueux du comportement naturel des rats, qui vivent en groupe dans un environnement enrichi pendant plusieurs mois. La justification de la mise à mort tient en une phrase, alors que la procédure décrite se limite à la pose d'une puce et que les lignées utilisées ne présentent aucun phénotype invalidant.

Objectifs

Les modèles animaux permettent de comprendre les mécanismes liés à des pathologies humaines. Pour caractériser correctement ces modèles en particulier au niveau comportemental, nous avons besoin de comprendre leurs comportements en conditions normales (non pathologiques). Pour cela, nous développons un système de suivi comportemental sur le long terme dans des conditions de vie permettant l'expression de comportements naturels des animaux. Le présent projet vise à mettre en place ce système de suivi comportemental automatisé pour le rat (qui a déjà été mis au point pour la souris). Nous devons trouver les conditions idéales de mesures des comportements et améliorer la détection automatique de comportements d'intérêts.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de proposer une méthode de caractérisation comportementale de rats vivant en groupe dans un environnement enrichi. Les données collectées sont donc représentatives du comportement spontané des animaux. Elles sont robustes car collectées sur plusieurs jours, en environnement enrichi. Le suivi individuel permet de construire des profils comportementaux individuels tout en considérant les relations sociales de l'animal au sein de son groupe. Ce projet constitue la base de développement de nouvelles méthodes de phénotypage comportemental, plus respectueuses du comportement naturel des rats.

Procédures

Les animaux subissent une implantation en sous-cutané d'une puce d'identification sous anesthésie gazeuse (l'anesthésie dure 5 minutes en tout). Au cours de cette anesthésie, l'animal subit un rasage de la zone d'insertion (1 minute), une désinfection de la zone (1 minute), une injection sous-cutanée d'un antidouleur (20 secondes), l'incision de la peau (20 secondes), l'insertion de la puce d'identification (20 secondes) et la fermeture de la plaie avec une agrafe (30 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une insertion sous-cutanée d'une puce d'identification par radio-fréquence réalisée sous anesthésie gazeuse et analgésie locale (sous-cutanée).

Devenir

Les animaux sont mis à mort car l'expérimentation est terminée.

Remplacement

Les marqueurs de diagnostic clinique de maladies neurpsychiatriques sont de l’ordre comportemental (anomalies de la communication sociale, anomalies cognitives, comportements stéréotypés). Il est donc nécessaire d’étudier le comportement des individus modèles pour pouvoir identifier clairement les mécanismes liés à ces anomalies issues de mutations génétiques. Le rat est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines. Les modèles cellulaires ne peuvent être utilisés qu’une fois que les anomalies comportementales ont été décelées, pour mieux comprendre les bases moléculaires de ces anomalies comportementales.

Réduction

Ce projet constitue une étude pilote pour mettre en place le système de suivi de rats. Il est donc exploratoire. Nous réduisons le nombre d’animaux utilisés au maximum tout en conservant la possibilité de saisir la diversité comportementale que peuvent présenter les rats des lignées étudiées. La précision du système de suivi comportemental permettra de mesurer et de décrire finement les comportements en utilisant des données collectées sur peu d’individus mais sur plusieurs jours chacun. Nous veillerons à utiliser le moins d'animaux possibles en mesurant les mêmes animaux pendant de longues durées (plusieurs jours).

Raffinement

Les lignées utilisées ne présentent pas de phénotype invalidant particulier. Les expériences comportementales réalisées n’engendrent qu’un stress limité et très ponctuel (insertion de la puce d'identification). Pour réduire la souffrance des animaux lorsque nous insérerons les puces d'identification, nous aurons recours à une anesthésie générale gazeuse et un analgésique local en sous-cutané. Les expériences comportementales réalisée ensuite n'engendrent pas de stress supplémentaire car elles sont réalisées en conditions proches de celles de l'hébergement, dans un environnement enrichi.

Choix des espèces

Le rat possède des capacités cognitives plus développées que la souris dans certains domaines (empathie, apprentissage, collaboration par exemple). La caractérisation comportementale du système social du rat permettra de fournir une base pour étudier les bases neurales de telles fonctions cognitives élaborées. Les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines (mise en place de l’identification par puce) puis conservés pendant plusieurs mois avec enregistrements ponctuels pour la mise en place du système. Nous prenons des animaux jeunes pour pouvoir les conserver longtemps une fois équipés de puce, dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés dans cette étude pilote.

Gardés vivants à l'issue de la procédure, 20 000 rats vont subir une biopsie de l'oreille dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, leur devenir étant ensuite décidé par le chercheur en charge de la lignée. Chaque animal reçoit une bague à une oreille et un poinçon de 1,5 mm à l'autre, entre 12 et 15 jours de vie, avant le sevrage, pour permettre le génotypage. Le porteur justifie ce calendrier par l'organisation de l'animalerie, un gain "de temps, de place et de travail" et une capacité d'hébergement limitée. Ces 20 000 interventions accompagnent la gestion d'un élevage de lignées transgéniques créées sur commande, activité que l'établissement décrit comme une prestation.

Objectifs

Réaliser une biopsie d'oreille sur les rats génétiquement modifiés afin de pouvoir génotyper les animaux d'intérêt (Fondateurs, maintien de lignées, ou validation de cryoconservation des modèles).

Bénéfices attendus

Caracérisation génétique des lignées commandées pour les projets scientifiques des chercheurs et optimisation de la gestion des élevages. Il est important de réaliser le génotypage des animaux tôt, afin d'avoir les résultats si possible avant le sevrage, pour constituer les cagées directement. Cela permet un gain de temps, de place et de travail dans l'animalerie.

Procédures

Nous identifions les animaux par la pose d'une bague d'oreille et nous génotypons les animaux par une biopsie de 1.5mm de diamètre sur l'autre oreille à l'aide d'une pince spécialement dédiée. Cette procédure est réalisée une seule fois par animal. L'acte de biopsie et identification est très rapide (maximum 20 secondes pour les 2 actes d'identification et de biopsie). L'animal est donc contenu durant quelques secondes seulement et remis immédiatement à la mère.

Impact sur les animaux

Le poinçon peut entrainer douleur légère et de courte durée au site de prélèvement

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à la suite de cette procédure peu invasive. La biopsie permettra de déterminer le génotype de l'animal. Le chercheur en charge de la lignée déterminera son devenir en fonction des projets qu'il mène.

Remplacement

Pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour le prélèvement de tissus.

Réduction

La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente. Le raffinement de nos techniques de transgénèse, de procréation médicalement assistée et de cryoconservation permet de générer de moins en moins d'animaux pour l'ensemble des prestations de l'institut, ce qui permet de réduire de manière importante la quantité d'animaux générés et donc biopsiés. De plus, nous utiliserons dès que possible, de schémas d’accouplement optimisés ne nécessitant pas ou peu de génotypage, afin de produire un maximum d’animaux « utiles »

Raffinement

La méthode de poinçon à l'oreille est éprouvée, précise, rapide et standardisée ce qui limite les effets indésirables stress/douleurs sur les animaux. De plus, les animaux sont surveillés quotidiennement ce qui permet de faire un suivi de la cicatrisation dans le temps. Nos rats sont hébergés en cages ventilées, en groupe, avec de multiples enrichissements : bâton de bois à ronger, balles de bois à ronger, nids, croquettes de nourriture au fond de la cage.

Choix des espèces

Le rat, comme la souris , est un très bon modèle d'expérimentation animale car il est de petite taille, son génome est parfaitement connu et il a un taux de reproduction très rapide. Il est couramment utilisé par les chercheurs qui nous commandent des prestations de création de lignées transgéniques Les rats seront prélevés entre 12 et 15j de vie, avant le sevrage. Cet âge a été judicieusement choisi car avant 12j, l'oreille ne s'est pas assez développée et ce n'est qu'un bourgeon sur lequel il est difficile de réaliser une biopsie. et après 15j, nous n'aurions pas les résultats de génotypage avant le sevrage (3 semaines), ce qui ne nous permet pas de faire les cagées définitives. Notre capacité d'hébergement est limitée et il nous faut donc optimiser la place constamment. Ce fonctionnement nous permet d'économiser du temps, des ressources et de la manutention pour les animaliers.

Soumis à des instillations oculaires répétées, jusqu'à huit par jour, 1 500 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, la grande majorité tuée à l'issue et environ 150 réutilisés. Certains reçoivent aussi une injection dans l'œil sous anesthésie, et des prises de sang sont prévues pour doser le principe actif. Le porteur qualifie ces examens de non invasifs et semblables à ceux pratiqués en cabinet d'ophtalmologie, et prévoit, si un œil traité ne répond plus à la lumière, le "remplacement de l'animal". Il annonce 25 études d'efficacité sur cinq ans et affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'œil dans sa "globalité fonctionnelle".

Objectifs

La variation du diamètre pupillaire est un phénomène physiologique observé lors de l’adaptation à la lumière et à l’obscurité. On parle de mydriase lorsqu’une dilatation de la pupille est observée en réponse à une diminution des stimuli lumineux, tandis que l’état de myosis correspond à un rétrécissement de la pupille en réponse à un excès de lumière. Ces phénomènes oculaires nécessitent un circuit complexe comprenant la rétine, le nerf oculomoteur, les aires du cerveau responsables de la vision et la pupille, acteur final de ce circuit. Ces deux phénomènes, mydriase et myosis, peuvent avoir une cause thérapeutique. En effet, la mydriase est utilisée en routine dans les cabinets ophtalmologiques afin de pouvoir effectuer un examen du fond d’œil grâce à l’utilisation de collyres mydriatiques (atropine, tropicamide, phénylephrine), tandis que le myosis peut être lié à certains médicaments comme dans le traitement du glaucome. Également, certains implants sont développés afin de maintenir une dilatation de la pupille lors de certaines chirurgies, notamment la chirurgie de la cataracte. Certaines pathologies peuvent également induire un état de mydriase ou de myosis permanent, comme certaines affections oculaires aigüe (par exemple des kératites), des paralysies du nerf oculomoteur, un traumatisme cérébral ou oculaire, le syndrome de Claude Bernard-Horner, le syndrome de Pourfour-Petit ou encore certaines formes de migraines ophtalmiques. Les effets indésirables des collyres mydriatiques actuellement commercialisés sont divers, car ces produits peuvent passer dans la circulation sanguine et induire des conséquences systémiques chez les utilisateurs, notamment chez les enfants. De plus, certains patients peuvent s’avérer non-répondeurs car certaines résistances à l’atropines sont actuellement connues. L’objectif du projet est la mise en place, au sein de l’établissement utilisateur, d’un modèle spécifiquement dédié au test d’efficacité de nouveaux traitements capables d’agir sur le diamètre pupillaire, aussi bien dans le but de développer des potentiels nouveaux candidats médicaments que dans l’amélioration des traitements existants. Nous envisageons de réaliser 25 études de test d'efficacité de molécules sur 5 ans pour ce projet.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est celui de tester l’efficacité de différentes molécules pouvant agir sur la variation du diamètre et de la surface de la pupille afin de développer des nouveaux traitements et/ou d’améliorer des traitements existants. La recherche de nouveaux traitements est constante et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

La prise d’image pour l’évaluation des variations du diamètre et de la surface de la pupille est non invasive et réalisée chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et également chez l'animal en clinique vétérinaire. Cela sera effectué à chaque fois qu'une molécule est testée afin d'en évaluer l'efficacité. Les examens oculaires sont également effectués sur animaux vigiles sans anesthésie et sont effectués en routine chez l’homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourrons être effectués d'une à plusieurs fois par semaine. Les administrations de produits se feront principalement par instillations (gouttes oculaires) et cette procédure ne dure que quelques secondes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (minimum 1 administration et maximum 8 administrations par jour). Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin avec une procédure qui dure cinq minutes tout au plus. Les injections oculaires seront effectuées une seule fois pour un animal au cours de la procédure. L’anesthésie générale est administrée par voie intramusculaire tandis que l’anesthésie locale est sous forme de gouttes oculaires. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt (durée de moins d'une minute pour le prélèvement). De manière générale, les études auront une durée variable qui pourra aller d'1 jour à un mois ou plus selon le nombre de molécules à tester.

Impact sur les animaux

La variation du diamètre et de la surface pupillaires ne sont pas douloureuses chez l’homme ni chez l’animal et des traitements induisant ces variations sont utilisés en routine dans les cabinets ophtalmologiques et vétérinaires afin d’effectuer des examens oculaires. Un effet indésirable possible est une altération rapide et transitoire de la vision après le traitement, de manière semblable à ce qui se passe chez l’homme dans un cabinet ophtalmologique suite à l’administration d’un agent mydriatique. Il est également possible que les animaux présentent des signes après la période de washout dans l’œil ou les yeux traités, par exemple aucune réponse à la lumière. Dans ce cas, différentes solutions sont possibles : extension de la période de washout, administration dans l’autre œil si un seul œil est traité ou remplacement de l’animal. Dans le cas où un implant est administré sans chirurgie par voie intraoculaire, une inflammation pourrait être observée suite à l’injection. Malgré le soin et la vigilance apportés à la manipulation des animaux, un stress est toujours possible lors des observations et des administrations.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux ayant reçu une administration de produits seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Les animaux n’ayant pas reçu la totalité de la procédure expérimentale (estimé à environ 10%) pourront être gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure, après avis du vétérinaire si besoin.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse …) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données ; chaque groupe traité sera comparé avec les autres afin d’en évaluer l’efficacité ou avec un traitement de référence, les cas échéants. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. La possibilité d’effectuer les administrations dans les deux yeux sera évaluée à chaque fois que le design le permet afin de limiter le nombre d'animaux en étude. De plus, les évaluations choisies pour ce modèle sont non invasives et ne causent aucune douleur chez l’animal.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront placés préférentiellement par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement. Les examens choisis pour évaluer l’efficacité des traitements sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Le choix du lapin pour ces études est lié à la taille plus importante de l'œil permettant de mesurer de manière efficace les variations du diamètre et de la surface pupillaire. Les conditions d'observation des signes cliniques seront également facilitées. De plus, la taille de l’œil de lapin permet l’administration d’implants injectés sans chirurgie par voie intraoculaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront environ 8 à 15 semaines au début de l’étude, âge minimum pour la maturité visuelle.