Procédures légères
Enseignement pratique de physiologie et d’expérimentation animale sur rongeur (rats et souris)
- Enseignement supérieur
Rats : 200
675 animaux non-humains vont être utilisés, 475 souris et 200 rats, en majorité tués et 25 souris proposées à l'adoption, dans des procédures allant du sans réveil au léger. Les étudiants s'entraînent à la contention et aux injections, mesurent la glycémie après injection de glucose et prélèvements de sang à la queue, tandis que d'autres souris sont euthanasiées pour prélever l'intestin et que les rats sont canulés puis tués sans réveil pour prélever le cœur. Le porteur décrit une formation à la physiologie couplée à la formation réglementaire, réservée aux étudiants volontaires ayant validé leurs examens, et affirme utiliser surtout des animaux de réforme déjà destinés à l'euthanasie. Il revendique le maintien de travaux pratiques sur animaux non-humains comme nécessaire à l'apprentissage des gestes, malgré des simulations numériques employées en amont.
Objectifs
Le projet que nous proposons est un projet de formation des étudiants à la physiologie animale et s'inscrit dans la troisième année de notre parcour. Afin de réduire l'utilisation d'animaux pour la formation d'un étudiant à la physiologie nous avons modifié notre programme de cours afin qu'il soit couplé à la formation réglementaire d'applicateur des procédures et de soins aux animaux décernéé par notre établissement et habilitée par le ministère de l’Enseignement supérieur et la CNEA. Notre formation nécessite la réalisation de travaux pratiques sur des rongeurs pour compléter les connaissances acquises pendant les enseignements par des études expérimentales et pour initier aux techniques de l’expérimentation animale (préhension, contention, anesthésies des animaux, prélèvements d’organes, études de mécanismes in vitro et in vivo). Le maintien des travaux pratiques permet d’augmenter les chances de réussite des étudiants à leur arrivée sur le marché du travail. Ils permettent aussi de maintenir une confrontation directe des étudiants avec l’expérimentation animale et de les conforter dans leur plan de formation ou au contraire de leur laisser la possibilité d’une réorientation afin d’éviter des prises de conscience trop tardive, source d’échec et de difficultés pour les étudiants. Tous les étudiants de la formation n'effectuent pas ces travaux pratiques nécessitant l'apprentissage des techniques d'expérimentation animale. Seul les étudiants volontaires et ayant validés les enseignements de physiologie avec une note supérieure à 10/20 et un examen éthique et réglemantaire avec une note supérieure à 12/20 peuvent réaliser les procédures décrites dans cette saisine. Les autres étudiants réalisent des travaux pratiques sur des logiciels de simulations.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de maintenir une confrontation des étudiants destinés à la recherche médicale avec la manipulation et l'expérimentation animale. Cette confrontation de l'étudiant à la réalité de l'expérimentation animale permet de conforter ou à l'inverse d'infirmer les choix d'orientation des étudiants. Ce projet est aussi nécessaire pour l'initiation des étudiants à la physiologie animale. Avec ce projet, chaque étudiant qui travaille en trinôme aura utilisé en tout 1 animal pour apprendre la contention d'animaux vigiles, les injections sur rongeurs, pour étudier la régulation de la glycémie, la régulation de la pression artérielle, la régulation de la fonction digestive et cardiaque, l’analyse électrocardiographique du cœur, la réalisation d’une culture primaire, mais aussi l’anesthésie d’une souris. Avec un animal (majoritairement des animaux de réformes qui étaient destinés à l'euthanasie pour tri génétique par exemple), les étudiants volontaires, sélectionnés sur leur maitrise de l'éthique et la réglementation en expérimentation animale et ayant les prérequis académiques necessaires à la poursuite de leur cursus en physiologie pourront valider leur diplome de physiologie et la formation réglementaire d'application des procédures et de soins aux animaux. Le couplage de notre formation avec la formation réglemantaire agréeé par la CNEA permet de former directement les étudiants aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale et à l'utilisation de méthodes alternatives quand cela est possible. Pour les laboratoires de recherche, cela permet de recruter dès le master 1 des étudiants formés aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale et detenteur d'une habilitation d'applicateur des procédures.
Procédures
Durant nos trois procédures les animaux seront soumis à différentes interventions. Dans la première procédure , les animaux seront manipulés par les étudiants afin d'apprendre la préhension, la contention, l'injection intrapéritonéale et la mesure de glycémie. Dans cette procédure ils recevront une injection intrapéritonéale de glucose suivie de 5 prélevements de 3µl de sang au bout de la queue afin de mesurer la glycémie. Dans la seconde procédure, les souris recevront une injection d'anésthésiant et une injection intrapéritonéale soit d'un régulateur sympathique soit d'un régulateur parasympatique. Certaines souris seront euthanasiées afin de prélever l'intestin et du tissu adipeux dans l'objectif d'étudier la physiologie intestinale et de réaliser une culture primaire d'adipocytes. Dans la troisième procédure les rats reçoivent une injection de morphinique suivie d'une anesthésie sans réveil. Pendant l'anesthésie, les rats sont canulés sur la jugulaire et la carotide afin de mesurer la pression arterielle et de recevoir une injection en intraveineux d'un régulateur sympathique et parasympathique. Ensuite le coeur de ces animaux est prélevé afin de réaliser un TP la physiologie cardiaque.
Impact sur les animaux
Afin d'éviter toute nuisance pour les animaux, les travaux pratiques sont réalisés par trinôme d'étudiants dans un box isolé en présence d'un enseignant. Lors de nos protocoles la préhension des animaux pourra générer du stress. Afin de le limiter, la préhension sera réalisée avec un tube et les animaux seront habitués à être manipulés. Ensuite lors de la contention et des injections intrapéritonéales qui dureront moins d’une minute les animaux ressentiront du stress et la douleur d’une piqure d’aiguille. Pour le protocole de mesure de glycémie comme pour le protocole de mesure d’un électrocardiogramme les nuisances attendues seront aussi du stress lié à la manipulation des animaux et la douleur d’une piqure d’aiguille. Cette nuisance sera très courte et durera moins d’une minute. Pour la mesure de glycémie le protocole nécessite aussi le retrait de la nourriture pendant 6h. Pendant ces 6 heures les animaux pourront néanmoins boire à volonté. Pour les deux protocoles, suite à l’injection qui générera la douleur d ‘une piqure d’aiguille nous gardons la souris sous surveillance pendant 1 heure afin d’observer les signes cliniques et de comportement. Si le comportement de la souris est anormal après l’injection (souris prostrée, qui évite les interactions avec les congénères, saignements apparents) nous procédons immédiatement à son euthanasie. Pour le protocole sur les rats les nuisances attendues seront aussi un stress lié à la préhension et la douleur d’une piqure d’aiguille. Sinon pendant la période d’hébergement le projet n'aura aucun impact sur les 5 libertés individuelles de l'animal. Nos animaux pourront s'alimenter à leur convenance ce qui n'induira aucune sensation de faim ou de soif. Comme nos conditions d'élevages seront adaptées à la physiologie des animaux, nos souris ou nos rats n'auront aucune sensation de peur, de détresse, de stress physique ou thermique et de manque d'interaction sociale. Enfin, notre surveillance régulière aura pour but de prévenir toute douleur, lésion ou maladie sur nos animaux.
Devenir
Quand cela sera possible nous essaierons de placer à l'adoption des souris. Par expérience nous arrivons à faire adopter tous les ans quelques souris aprés l'accord de la vétérinaire responsable de notre animalerie en lien avec la ddpp. Les autres souris seront euthanasiées car non replaçable dans d'autres procédures. De plus dans la plupart des cas, il s'agira de souris qui étaient déja destinées à l'euthanasie et reutilisées pour nos séances de travaux pratiques. Pour les rats il s'agit d'une classe sans réveil ou le coeur est prélevé
Remplacement
Afin de remplacer les animaux nous avons arrété tous les travaux pratiques qui utilisaient des animaux jusqu'en fin de deuxieme année de notre formation. Nous les avons remplacés par des expériences de simulation numérique ou par des vidéos (par exemple pour le comportement). En trosième année de notre formation nous utilisons des logiciels de simulations afin de remplacer au maximum l'utilisation d'animaux. L'utilisation de logiciels de simulation permet parfaitement aux étudiants avec des prérequis académique trop faible , ou n'ayant pas validé les examens sur l'éthique et la réglemantion avec une note supérieure à 12 /20, ou ne désirant pas utiliser d'animaux d'acquerir les compétences en physiologie animale. Pour les autres étudiants le maintient de travaux sur animaux et l'apprentissage des techniques d'expérimentation (contention, préhension, injection ...) l'utilisation d'animaux est necessaire pour l'obtention du niveau d'applicateur des procédures et de soins aux animaux. Cependant pour remplacer les animaux vivants, les étudiants commencent l'apprentissage sur des souris de substitutions en Latex.
Réduction
Pour réduire au minimum le nombre d'animaux utilisés nous avons remplacé des séances de TP initialement pratiquées sur des animaux par des méthodes alternatives utilisant par exemple des logiciels de simulation en expérimentation animale, mais aussi par des supports vidéos que nous avons réalisés. L’enchainement des travaux pratiques est effectué de façon séquencée, cad que nous commençons par les expériences in vivo, puis après mise à mort nous récupérons les organes pour les expériences ex-vivo. Enfin, concernant les souris nous utilisons quand cela est possible des souris de réforme, normalement destinées à l’euthanasie pour tri génétique ou fin de protocole. Pour terminer, afin de réduire le nombre de rats et de souris utilisés dans l'étude, les groupes sont constitués en fonction du nombre strict nécessaire d’animaux pour chaque groupe de TP (il y a 5 trinômes dans chaque groupe d’étudiants et il y a 6 à 8 groupes en moyenne chaque année). Nous prévoyons pour la formation d’un étudiant qui dure 3 ans qu’il utilisera 1 animal. Enfin, pour réduire nous permettons seulement aux étudiants volontaires, avec des prerequis académiques solides et validant des compétences en éthique et reglementation de réaliser les TP necessitant l'utilisation d'animaux. Par cette approche quand dans le passé tous les étudiants utilisés environ 3 souris et 3 rats pour leur formation, aujourd'hui seulement 60 à 70% des étudiants vont utiliser des animaux à raison de 1 animal par étudiant.
Raffinement
Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse, infligées aux animaux nous avons réorganisé complétement nos programmes de physiologie pour intégrer des nouveaux enseignements sur la réglementation, l’éthique, les modèles murins, la prise en charge de la douleur, etc ... Cela permet de sensibiliser et de former les étudiants avant toute manipulation. Concernant l’hébergement, tous nos animaux sont dans un environnement enrichi de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour réaliser des nids. Afin de réduire le stress et la souffrance des animaux au maximum, nous utiliserons un prétraitement avec un morphinique avant l’anesthésie. Les animaux sont manipulés dans des petits box isolés pour réduire tout le stress pouvant venir de l'environnement. Enfin pour terminer l'entrainement des étudiants est d'abord réalisé sur des souris en latex permettant d'apprendre le geste avant d'utiliser des animaux vivants.
Choix des espèces
Nous adaptons les espèces en fonction des besoins. Les rats présentent l’avantage de pouvoir être manipulés plus facilement pour les expériences in et ex vivo. Les souris sont parfaites pour apprendre aux étudiants à manipuler un animal avec moins d’appréhension. Enfin, notre formation d'applicateur des procédures et de soins aux animaux est agréée sur rongeurs souris et rats. Pour les rats nous utilisons une lignée non-consanguine (Srague-Dawley) de 10-14 semaines c’est l’âge idéal d’utilisation des animaux et celui le plus utilisé dans la littérature. Pour les souris : nous utiliserons des souris adultes et quand cela est possible de réforme. L'âge précis n'a pas d'importances dans notre cas. Pour la souche elle peut varier avec les animaux de réforme mais dans la majorité des cas nous aurons des souris de lignée consanguine (C57BL6) et quand nous les commandons nous achetons des souris non consangunes (Swiss) de 10 semaines.
AVENANT Impact de la modulation β3-adrénergique sur la fonction vasculaire dans le choc septique expérimental
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
354 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Elles subissent une ligature et ponction caecale, chirurgie qualifiée de sévère qui provoque un choc septique, puis selon les séries une échocardiographie, la pose d'un cathéter carotidien, une injection de Bleu Evans ou une étude de survie sur cinq jours. Le porteur décrit une douleur traitée par buprénorphine et des séries écourtées à 18 heures pour limiter la souffrance, la série de survie étant suivie chaque jour avec mise à mort possible au point limite. Il affirme que le choc septique ne peut être modélisé in vitro et revendique un modèle proche des situations cliniques humaines, le plus utilisé dans la littérature.
Objectifs
La présente demande est un avenant au projet autorisé en cours. Le choc septique est défini comme la forme la plus sévère d’une infection caractérisée par une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Le choc septique est un problème majeur de santé publique, responsable de 15% des admissions et de 40% de mortalité en réanimation. Le choc septique est associé à une dysfonction du système cardiovasculaire et immunitaire. En effet, afin de combattre l’infection, l’organisme active une série de phénomènes au niveau vasculaire notamment pour permettre l’arrivée des globules blancs sur le site inflammatoire. L’activation excessive de ces mécanismes conduit entre autre à un phénomène d’hypotension (chute de la pression dans les vaisseaux) menant à un défaut d'apport en oxygène aux organes. La présence des récepteurs β3-adrénergiques (β3-ARs) au niveau vasculaire, dont la concentration croît durant une infection (inversement aux β1, β2-ARs), pourrait jouer un rôle dans l'hypotension. La vasodilatation excessive, responsable de l'hypotension, est contrée par l’organisme grâce à une modulation de la vitesse et de la force de contraction du cœur. L'utilisation de ligands β-adrénergiques, des β1-bloquants, permet ainsi de moduler la fonction cardiovasculaire dérégulée pendant l’état de choc septique via le système nerveux. En effet, il a été prouvé que l’administration de β1-bloquants lors du choc septique améliorait expérimentalement la réactivité vasculaire à un vasoconstricteur de vaisseaux de gros et petits calibres. Parallèlement, la quantité de sang éjectée par le cœur, était améliorée alors que les animaux présentaient la même fonction cardiaque et le même volume de fluide perfusé témoignant peut-être d’une moindre fuite liquidienne au niveau vasculaire induite par le choc septique. Les β1-ARs étant très peu présents dans les vaisseaux, notre hypothèse est que, durant le choc septique, la modulation des β3-ARs au niveau vasculaire modifie la vasoréactivité. L'hypothèse de ce travail est qu'en agissant sur les β3-ARs, les fonctions vasculaires et cardiaques des patients septiques pourraient être améliorées.
Bénéfices attendus
En mettant en évidence un effet de la modulation des β3-ARs sur la perte de la vasoréactivité dans le choc septique, il est attendu un bénéfice sur la prise en charge clinique du choc septique. En effet, un traitement modulant les β3-ARs pourrait améliorer la chute de la contraction vasculaire et diminuer la vasodilatation excessive conduisant à l’hypotension lors du choc septique.
Procédures
Les animaux (n=354) seront soumis à une procédure chirurgicale pendant 15 minutes, la ligature et ponction caecale, de type sévère conduisant à un état de choc septique. C’est 18 heures après cette intervention que les analyses in vivo et ex vivo (procédure 2) débuteront pour les animaux de la première série (n=178). Les animaux de la première série seront soumis à une évaluation hémodynamique par échocardiographie pendant 15 minutes et par l'implantation d'un cathéter carotidien pour une durée d'environ 15 minutes sous anesthésie. La mise à mort des animaux sera effectuée à la fin de la procédure de cathétérisme carotidien et permettra le prélèvement des organes et du sang permettant les analyses ex vivo (myographie, rapport poids humide/sec pulmonaire) et biochimiques. Les animaux de la deuxième série (n=110) traités pendant 24 heures seront soumis à une étude de survie sur 5 jours. Les animaux de la troisième série (n=66) recevront une injection de Bleu Evans (procédure de 10 minutes) dix-huit heures après la chirurgie CLP pendant une heure avant d'être mis à mort.
Impact sur les animaux
La ligature et ponction caecale, notre modèle, est une procédure chirurgicale sévère qui induit un choc septique chez l'animal. Cette procédure va induire une douleur chez l'animal qui sera traitée grâce à l'administration d'un analgésique, la buprénorphine à la posologie de 0,2mg/kg une heure avant la chirurgie, 3 heures après la chirurgie puis 1 fois/jour. Le stress et la douleur engendrés chez les animaux de la première et troisième séries sont limités dans le temps avec des analyses in vivo et des prélèvements suite à la mise à mort 18h après la chirurgie. Une observation de l'état général des animaux de la deuxième série sera réalisée chaque jour et dans le cas où un point limite est atteint, la mise à mort de l'animal pourra être décidée.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux (n=354) seront mis à mort à la suite des procédures pour réaliser le prélèvement des organes.
Remplacement
Tout d'abord, ce modèle est choisi par rapport à sa proximité avec les situations cliniques humaines. En effet, on ne peut pas modéliser le choc septique avec d’autres types de modèles, par exemple in vitro, puisqu’on étudie plusieurs fonctions biologiques et leurs interactions : fonction cardiaque, fonction vasculaire, et le métabolisme. De plus, il n’existe pour l’heure nulle autre expérimentation que le modèle animal afin de remplacer l’utilisation des souris pour les procédures expérimentales prévues dans ce projet (ligature et ponction caecale, échocardiographie, cathéter carotidien, perméabilité vasculaire). Enfin, ce modèle est le plus utilisé dans la littérature (modèle de choc septique multi-microbiens) et il est maîtrisé par le laboratoire.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, les mâles et les femelles seront utilisés. Dix animaux par groupe (séries 1 et 2) et six animaux par groupe (série 3) sont nécessaires afin de ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Pour le raffinement, les animaux ne seront pas manipulés dans la même pièce que celle où ils sont hébergés. Les souris sont hébergées à 5 maximum par cage individuellement ventilées de 500 cm². Elles auront de l'eau et de la nourriture à volonté. L’enrichissement du milieu se fera avec des petits abris, des tunnels, du sizzle pad ou des bâtons à ronger. Les gestes chirurgicaux sont maîtrisés par le personnel de l’étude permettant ainsi une manipulation plus rapide conduisant à un réveil et à une récupération plus rapide en post-opératoire. Plusieurs types de mesures seront effectués sur un même animal en traitant la douleur induite par injection sous-cutanée d’analgésique (buprénorphine) une heure avant, 3 heures après la chirurgie puis 1 fois par jour. Les chirurgies se feront sous anesthésie gazeuse (isoflurane). Enfin, la durée de l’étude est courte (18 heures) pour la première et troisième séries d'animaux en post-opératoire afin de limiter les souffrances. Une observation des animaux de la deuxième série sera réalisée chaque jour, et dans le cas où un point limite est atteint la mise à mort pourra être décidée.
Choix des espèces
La souris C57BL/6 est une espèce fréquemment retrouvée dans la littérature sur le choc septique. Nos résultats seront ainsi plus facilement comparables avec la littérature. Le modèle animal dont nous avons accès est un modèle de souris rare KO pour le β1-AR, ce qui est un avantage pour les expérimentations puisque les animaux sont déjà connus des expérimentateurs. Les évaluations hémodynamiques, vasculaires et inflammatoires de ces souris KO pour le β1-AR subissant la CLP ou non permettront de mettre en évidence des effets modulatoires des β3-ARs en l’absence du β1-AR. Des souris de 20g-30g seront utilisées pour comparer avec les autres résultats dans la littérature, qui utilisent cette gamme de poids. Ces souris auront entre 12 et 16 semaines et les mâles et les femelles seront utilisés.
Caractérisations de la perception des vocalisations chez le babouin olive (Papio anubis).
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
20 babouins olive vont être utilisés, sans mise à mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit un enregistrement non invasif de son activité cérébrale par EEG sous anesthésie générale de 1 h 30 à 2 h 30, précédé d'une capture et d'un isolement de moins de 24 heures, pour comparer le traitement des vocalisations chez le primate et le langage humain. Le porteur précise que la capture privilégie une méthode sans contention, la télé-anesthésie servant en cas d'échec. Il affirme qu'explorer les origines du langage rend "indispensable" le recours à un primate non-humain, les babouins étant ensuite remis dans leur groupe social et réutilisés dans d'autres projets.
Objectifs
Le rythme est une caractéristique universelle des langues et joue un rôle essentiel dans la compréhension du langage. La mise en lumière de la corrélation entre la fréquence de la parole (2-7 syllabes/sec) et celle des oscillations neuronales a révélé l'importance des ondes cérébrales dans le traitement de la parole. En effet, les ondes s'ajustent au rythme des syllabes chez les auditeurs humains. Ce mécanisme de synchronisation entre les oscillations des ondes et le rythme des syllabes est proposé comme un élément clé du décodage de la parole par la segmentation des syllabes. Enfin, il a aussi été montré que ces mécanismes sont plus présents lorsque des sons sont présentés à un rythme de 4,5Hz, considéré comme le rythme optimal du langage. Les éléments temporels revêtent aussi une importance cruciale dans les communications acoustiques des animaux. Ils peuvent servir à signaler le degré d'urgence d'une situation, comme les cris d'alarme des marmottes à ventre jaune (Marmota flaviventris), ou à transmettre des informations sur leur état émotionnel, leur identité ou leurs intentions Au-delà de la simple capacité à générer des motifs rythmiques vocaux, certaines espèces, telles que les écureuils terrestres à manteau doré (Callospermophilus lateralis), ont également montré leur aptitude à traiter et à identifier les rythmes acoustiques produits par d'autres espèces voisines, et d’autres encore peuvent ajuster leurs rythmes de vocalisations ou de mouvement à des stimuli extérieurs. Cependant, et malgré ces similiarités entre humains et animaux sur l’utilisation et le traitement du rythme dans les productions vocales, nous n’en savons que peu sur la manière dont le cerveau des animaux traite les stimulus rythmiques. Afin de combler ce manque, ce projet vise à déterminer quels sont les processus neuronaux engagés lors du traitement de vocalisations conspécifiques par le cerveau des babouins dans le cadre d’une comparaison aux mécanismes utilisés lors du traitement du language chez l’Homme.
Bénéfices attendus
L'examen du traitement neurologique du rythme et des vocalisations au sein du cerveau des babouins revêt une importance cruciale pour l'élucidation des mécanismes sous-jacents à l'évolution du langage. Les babouins, en tant que primates non humains, constituent une opportunité unique d'explorer les fondements neurobiologiques de la communication vocale. Cette démarche peut contribuer à l'identification des structures neuronales impliquées dans le traitement auditif, et ainsi à dévoiler des points de convergence et de divergence avec les mécanismes humains. De surcroît, les conclusions tirées de ces recherches peuvent avoir des implications significatives pour la compréhension du développement précoce du langage chez l'humain et enrichir notre connaissance en neurosciences cognitives, particulièrement en ce qui concerne la perception auditive et le traitement des signaux sonores dans le cerveau.
Procédures
Chaque animal est soumis à un unique enregistrement non invasif de son activité cérébrale sous anesthésie. Chaque anesthésie devrait durer entre 1h30 et 2h30. le temps d'aqcuisition est limité à 45 minutes afin de limiter le temps d'anesthésie, le reste du temps sert à la préparation de l'animal et à 'installation du dispositif et à son calibrage. L'animal est isolé moins de 24h pour cet enregistrement ou par paire.
Impact sur les animaux
Stress lors des captures. Anesthésie. Isolement onférieur à 24h ou par paire.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les sujets seront maintenus en vie car les enregistrements ne sont ni invasifs ni douloureux, il seront donc replacés dans leur groupe sociaux respectifs et pourront être réultilisés dans d'autres projets.
Remplacement
Au regard de notre problématique, qui vise à explorer les origines phylogénétiques des mécanismes de traitement du language, il nous est impossible d'avoir recours à un autre modèle d'étude que l'animal.
Réduction
Le nombre de sujets critique (10 sujets) a été estimé en fonction des résultats publiés de travaux en imagerie cérébrale fonctionnelle sur des tâches similaires menées sur l’humain, avec des tests statistiques. Cinq animaux ayant déjà été testés selon le premier protocole (dont 3 pilotes), cela réduit le nombre de femelles à inclure à 8 pour la première procédure. Si et seulement si les résultats sont concluants, le deuxième protocole sera réalisé. Le premier pilote n'étant plus nécessaire car le même dispositif d'enregistrement est utilisé, le nombre d’individu a été porté à 12 afin d’inclure deux individus pilotes qui permettront de régler le protocole d’enregistrement (nombre de répétions et rythme), et d’assurer d’obtenir 10 enregistrements exploitables. Des stratégies de partage de données pourraient permettre de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le futur.
Raffinement
Les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par les responsables du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. Concernant la capture, elle est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. En cas d’échec de cette méthode, l’animal sera capturé par télé-anesthésie. Les enregistrementss seront réalisés sous anesthésie : les animaux seront sédatés par injection intramusculaire avant d’être stabilisés sous anesthésie gazeuse,puis un relais par perfusion est pris le temps de l’acquisition. Chaque anesthésie devrait durer entre 1h30 et 2h30 maximum. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires . Il a été décidé de mesurer les ondes cérébrales par EGG de surface, une méthode non-invasive, ne causant aucune souffrance ou risque pour l’animal. Le temps de stimulation a été limité à 45 min afin de limiter la durée de l’anesthésie. Les animaux seront capturés la veille de leur anesthésie, et seront réveillés dans leur loge à l’issue de l’enregistrement, ce qui limitera l’isolement de leur groupe d’origine au minimum (moins de 24h) ou ils seront capturés par paire si plusieurs individus du même groupe social sont inclus dans la même procédure. Les animaux seront réintroduits suivant la procédure validée par la SBEA dans leurs groupes après réveil complet validé par un vétérinaire.
Choix des espèces
Au regard de notre problématique, qui vise à explorer les origines phylogénétiques des mécanismes de traitement du langage, il est indispensable d’explorer notre hypothèse chez au moins un primate non-humain afin de mieux comprendre le dévelopement du langage. Le babouin olive (papio anubis) étant une espèce phylogéniquement proche de l’homme, chez laquelle de nombreuses similitudes, en matière de productions vocales et de traitement de signaux vocaux ont été démontrées. De ce fait, ils sont de parfaits candidats pour étudier l’évolution des mécanismes de traitement du rythme et de la parole. Ne seront selectionnées que des subadultes ou adultes (âgés de plus de 4 ans), afin que leur système communicatif et leur cerveau soit suffisamment développés.
Rôle de différents facteurs environnementaux périnataux sur le risque de développer une allergie
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
4 864 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mères et leur descendance subissent un puçage, une séparation maternelle de trois heures par jour, des gavages de contaminants alimentaires et des administrations intranasales, pour étudier l'effet de stress chimiques et psychologiques périnataux sur le développement d'allergies. Le porteur décrit la séparation néonatale comme un stress "nécessaire" à ses hypothèses. Il euthanasie les femelles exposées et leur descendance pour prélever des tissus, les mâles reproducteurs étant réutilisés, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut reproduire le passage transplacentaire et l'allaitement.
Objectifs
Les maladies allergiques, notamment alimentaires et pulmonaires, sont un problème majeur de santé publique. Elles résultent d’une réponse immunitaire inappropriée et excessive contre certaines protéines environnementales (aliments, pollens, acariens...), alors appelées des allergènes. Ces allergènes devraient être tolérés, car ils sont inoffensifs et peuvent même être essentiels au fonctionnement et à la croissance de l’organisme. L’allergie résulte ainsi de l’absence d’une « tolérance immunitaire », que l’on cherche à rétablir au cours des protocoles de « désensibilisation ». Une augmentation constante de la prévalence et de la sévérité des allergies est observée dans les pays industrialisés depuis plus de 30 ans, démontrant le rôle de facteurs non génétiques dans cette pathologie. Ainsi, différents facteurs environnementaux peuvent agir, dès le plus jeune âge voire pendant la grossesse, et favoriser le développement ultérieur de ces pathologies. Ces facteurs peuvent notamment interférer avec la maturation de la muqueuse intestinale, du système immunitaire, et du microbiote intestinal, les trois étant étroitement liés. Un défaut de l’un de ces paramètres peut être déterminant dans la propension du nouveau-né à développer, plus tard dans la vie, une allergie. Le but de ce projet est donc d’étudier l’effet de certains facteurs environnementaux périnataux sur le développement de ces différents paramètres dans la descendance, et d’analyser leur lien avec la propension à développer une allergie (alimentaire ou pulmonaire), ou au contraire une tolérance immunitaire. Nous réaliserons une évaluation du risque sanitaire liée à l’exposition à deux stress, seuls et combinés: un stress chimique, résultant d’une exposition réaliste à un mélange de contaminants alimentaires (« effet cocktail »), et un stress psychologique. Ces travaux sont basés sur la littérature et sur l’utilisation de données issues de l’analyse de cohortes mère-enfant pour l’identification de facteurs pertinents, mais ils ne cherchent pas à reproduire des travaux déjà réalisés. Ils permettront d’établir le lien de causalité entre les expositions et la pathologie observée dans les cohortes, et d’éclairer les mécanismes sous-jacents. Ils permettront ainsi d’enrichir la connaissance scientifique sur les facteurs environnementaux périnataux favorisant le développement des maladies allergiques, aidant ainsi à établir des politiques publiques de prévention efficaces.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront d’enrichir la connaissance scientifique sur les facteurs environnementaux périnataux favorisant le développement des maladies allergiques, aidant ainsi à établir des politiques publiques de prévention efficace. Ils fourniront également des modèles intéressants pour l’analyse d’autres facteurs périnataux pouvant favoriser, ou au contraire protéger, des allergies. Les résultats « négatifs » (résultats qui ne confirment pas l'hypothèse de l'étude) seront valorisés, notamment par des communications et des publications.
Procédures
- Les mères et la descendance seront identifiées individuellement par puçage : puces adaptées à l’âge des souris, injectées sous anesthésie légère. Le puçage est réalisé en 1-2 minutes. - Induction d’un stress psychique en séparant les portées des mères pendant 3 heures/jour, entre les 17e et 21e jours post-naissance - Des gavages intra-gastriques seront réalisés pour les expositions aux contaminants (uniquement si ces derniers ne peuvent être inclus dans les croquettes pour des raisons techniques) : 3 fois/semaine, pendant 8 semaines pour les mères, 3 fois/semaine pendant au maximum 8 semaines dans la descendance - Des gavages intra-gastriques sur animaux vigiles seront réalisés dans les animaux soumis au protocole d’induction de l’allergie alimentaire (1 gavage/semaine, pendant 7 semaines) - Des administrations intranasales sous anesthésie légère seront réalisées chez les animaux soumis au protocole d’induction de l’asthme (5 administrations, réparties sur 16 jours) - Deux à trois prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie légère, selon les groupes. Les prélèvements sont réalisés en 1-2 minutes maximum - Des prélèvements des fèces seront réalisés sur animaux vigiles : les fèces sont collectés au fond des cages, après mise des animaux en cage propre individuelle pendant quelques minutes.
Impact sur les animaux
Toutes les interventions sur animaux seront réalisées dans une salle dédiée par du personnel expérimenté, limitant au maximum le stress des animaux. On ne peut cependant exclure le stress lié aux manutentions répétées lors des administrations intra-gastriques, des anesthésies, des changes et des pesées. Le puçage est réalisé par voie sous-cutanée, à l’aide de matériel spécifique adapté à la taille des souris et sous anesthésie gazeuse. La douleur et le stress sont limités, restreints au temps de la manipulation. Les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie légère. Au maximum, 3 prélèvements sanguins/animal sont prévus, avec des intervalles et des volumes adaptés et conformes à la règlementation. Le stress est limité, lié à la contention. Un isolement des mâles en cage individuelle est réalisé pendant 7 jours, juste en amont des mises en accouplement, ce qui peut générer un stress modéré pour ces mâles. Le stress induit par la séparation néonatale est un stress nécessaire pour répondre à nos hypothèses de recherche, mais reste d’une durée modérée par rapport à d’autres modèles publiés. Les méthodes expérimentales sont donc modérées, voire légères pour les males reproducteurs.
Devenir
Toutes les femelles exposées et leurs descendances seront euthanasiées, pour prélèvementsprélever des tissus d’intérêt pour évaluer l’effet des expositions sur les différents paramètres de l’homéostasie (barrière intestinale, immunité, microbiote, métabolisme global) et de l’inflammation allergique..
Remplacement
Aucun modèle in vitro n’est disponible pour tester l’impact des facteurs périnataux (stress chimiques, stress psychique) sur la descendance : ces effets résultent en effet du passage transplacentaire et dans le lait maternel d’une information (stress chimique appliqué, molécules ou cellules inflammatoires en résultant...), et/ou d’un comportement impactant la mise en place in utero puis en période néonatale de l’homéostasie intestinale et systémique. L’impact de ces maturations altérées ne se révèleront que plusieurs semaines plus tard, sur la capacité à développer une maladie allergique. Cette étude, nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal permettant d’analyser de façon intégrative ces différents facteurs. Un modèle mère-enfant et un modèle expérimental d’allergie alimentaire/de tolérance orale induite chez le rongeur seront ainsi mis en œuvre. Afin de limiter le nombre d’animaux en expérimentation : - En amont, la sélection des stress chimiques les plus pertinents sera réalisée grâce à l’analyse de données épidémiologiques obtenues dans des cohortes mère-enfant, combinée à des tests in vitro. - En aval, et selon les résultats obtenus, des analyses in vitro sur des modèles cellulaires humains et murins plus complexes seront réalisés, afin de compléter et de conforter les données (effet doses, études mécanistiques,...),
Réduction
La taille des lots est fixée à 8-12 animaux/lot, selon les taux de reproduction et la descendance obtenue. Ce nombre d’animaux à inclure est déterminé par notre expérience, et permet de prendre en compte la forte variabilité interindividuelle observée sur les paramètres mesurés, tout en assurant une puissance statistique satisfaisante. Des analyses statistiques seront dans un premier temps réalisées sur l’ensemble des paramètres mesurés pour chaque animal, permettant d’identifier tout individu ou toute variable aberrante. Des analyses statistiques seront ensuite menées, visant à construire un modèle discriminant nos groupes de traitement à l’aide de tous les paramètres analysés, et permettant d’identifier les groupes de variables permettant de discriminer les lots. Des analyses sur chaque paramètre mesuré pris individuellement seront réalisées en parallèle, afin de confirmer nos observations. La combinaison de ces approches statistiques permettra une analyse objective et maximisée de l’ensemble des paramètres analysés.
Raffinement
Toutes les interventions sur animaux sont réalisées dans une salle dédiée par du personnel expérimenté, limitant le stress des animaux. Les cages sont enrichies par des sopalins et des coques type boite à œuf, permettant la fabrication d’un habitat et des nids. Les animaux sont hébergés par groupe, avec une taille de cage règlementaire adaptée au nombre d’animaux, permettant un comportement grégaire et sociable. Les cages sont placées en armoire ventilée, permettant une isolation phonique vis-à-vis de l’extérieur. Les animaux sont surveillés visuellement quotidiennement pour identifier rapidement tout animal en souffrance. Des points limites sont établis pour identifier ces animaux. Si un tel animal est identifié, une fiche de suivi individuel est initiée et l’animal sera isolé et surveillé spécifiquement plusieurs fois par jour, par les zootechniciens et les responsables de la procédure. En cas de non amélioration, il sera sorti de la procédure expérimentale et euthanasié. Par ailleurs, chaque animal est suivi par mesure hebdomadaire de son poids.
Choix des espèces
Le modèle souris présente de nombreux avantages, notamment la disponibilité de lignées caractérisées, un système immunitaire bien décrit, de nombreuses données sur la réponse allergique. De plus, de nombreux réactifs permettant l'étude du système immunitaire sont disponibles chez cet animal. La souche de souris utilisée est particulièrement utilisée dans nos protocoles du fait d’un phénotype biaisé vers une réponse immune de type Th2, mimant ainsi le sujet atopique (c’est-à-dire la prédisposition génétique à développer une allergie). Ce modèle est bien caractérisé et maîtrisé au laboratoire, ainsi que le modèle mère-enfant. La mère en devenir, gestante et/ou allaitante, sera exposée aux facteurs environnementaux via son régime alimentaire, à des doses réalistes, afin d’étudier l’impact de ces expositions en période critique sur la santé de la descendance, qui sera évaluée après le sevrage
Formation initiale des étudiants de Master Biodiversité, Ecologie et Evolution à l’abord des espèces piscicoles
- Enseignement supérieur
100 poissons d'eau douce vont être utilisés, sans mise à mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des étudiants de master s'exercent sous anesthésie au marquage par puce intramusculaire ou marque externe sur des cyprinidés et des percidés, et à l'échographie de reproduction sur des esturgeons du Danube. Le porteur reconnaît que l'injection de la marque dans le muscle dorsal correspond à une plaie cutanée pouvant pénétrer les fibres musculaires selon le geste de l'étudiant. Les poissons marqués sont ensuite relâchés ou remis dans leur bassin, une partie des esturgeons pouvant être réutilisée l'année suivante, et le porteur affirme qu'il est difficile de remplacer entièrement l'animal vivant dans cette formation.
Objectifs
L’objectif du projet est de faire acquérir aux étudiant(e)s la démarche pratique du biologiste aquacole. Dans un premier temps, les étudiant(e)s observent les différentes espèces de poissons d’eau douce vivant en canal ou bassins sur la station d’expérimentation, puis assistent à leur capture (deux méthodes montrées : la pêche à l’électricité et le guidage manuel vers une bâche de contention, méthode adaptée aux spécimens de grande taille) avant de réaliser quelques manipulations de base, nécessaires pour mettre en œuvre des contrôles et suivis biologiques. Après des démonstrations vidéos des gestes attendus, il s’agit, à l’occasion de deux ateliers, de faire pratiquer les étudiant(e)s sur poisson vivant et leur permettre ainsi l’apprentissage des gestes et bonnes pratiques d’échantillonnage/manipulations. L’identification des espèces, l’anesthésie du poisson et un marquage “simple” (injection intramusculaire d’une micropuce électronique de 12mm ou insertion d’une marque visuelle (spaghetti) externe) font l’objet de l’atelier “Marquage” effectué sur des espèces communes d’eau douce, essentiellement des Cyprinidés et des Percidés. Anesthésie, biométrie, contrôle d’identification (lecture du pit-tag porté par l’animal) et examen échographique de l’avancement de la maturité font l’objet de l’atelier “Echographie” effectué chez l’esturgeon du Danube Acipenser ruthenus conservé à la station. Dans le 3ème et dernier atelier, les méthodologies de suivi des espèces aquatiques par biotélémétrie sont présentées et les étudiant(e)s s’initieront à la pratique d’un suivi manuel par télémétrie radio ou acoustique sans utilisation d’animaux (attachement du capteur sur objet inerte téléguidé).
Bénéfices attendus
Ce projet permet aux étudiant(e)s d’aborder le poisson vivant et d’utiliser les anesthésiques en balnéation qui en facilitent l’approche, ainsi que de s’initier à des méthodes de marquage et de contrôle (pit-tag, échographie) peu ou non invasives couramment utilisées dans les suivis biologiques terrestres ou aquatiques en laboratoire ou milieu naturel. Etant en dernière année de leur cursus d’études en M2 Pro-Parcours Biodiversité et suivis environnementaux (BSE), les étudiant(e)s seront amené(e)s à effectuer leur stage dans des structures (laboratoires de recherche, ONG, associations de protection animale et environnementale, conservatoires des espaces naturels, bureaux d'études, ...) mobilisant fréquemment ces compétences, en particulier avec le développement croissant des pratiques de biotélémétrie (qui feront l’objet du 3ème atelier où les étudiant(e)s s’exerceront, sans utilisation d’animaux, aux technologies existantes pour le milieu aquatique). Bien que leurs enseignements théoriques soient plutôt orientés vers l’écologie terrestre, certain(e)s étudiant(e)s seront amené(e)s à côtoyer des espèces aquatiques dans leur pratique professionnelle. La formation sera particulièrement axée sur le bien-être animal (BEA) lors des manipulations, l’objectif étant bien l’apprentissage sur du vivant dans une démarche éthique. Aussi, des documents sur le raffinement des méthodes (« Marquage, bonne pratique et bien-être ») étayé par de nombreux cas d’études chez le poisson seront-ils fournis à chaque étudiant(e), complétés par un cours (1.5h) qui leur sera donné dans la même semaine sur la règlementation en matière de BEA en expérimentation animale.
Procédures
Pas de manipulations sur animaux vigiles, ni de procédures chirurgicales intrusives, ni de prélèvements tissulaires. Les procédures sont rapides, peu ou non invasives et concernent des individus différents (pas d’enchaînement des actes). – Atelier Marquage : les poissons cyprinidés et percidés pêchés à l’électricité dans le canal de la station sont placés en bassin pour observation et détermination des espèces par les étudiant(e)s avant d’être mesurés et marqués. Les poissons seront marqués une fois. Deux types de marque sont implantés : la marque spaghetti (au niveau des rayons de la nageoire dorsale) et le pit-tag (en intramusculaire entre la tête et la nageoire dorsale). Une seule marque est utilisée par poisson. Les repères anatomiques sont présentés aux étudiants avant marquage (vidéo) et ils peuvent s’entrainer au maniement de l’injecteur sur des objets inertes (bananes). L’ensemble des interventions sur l’animal (hors pêche) durent moins de 5 minutes et se font sous anesthésie. Après marquage (un poisson par binôme d’étudiant(e)s), l’animal est placé en bassin de réveil pour observation puis relâché dans le canal à la fin du TP. – Atelier Echographie : des géniteurs d’esturgeon du Danube conservés en bassins d’élevage sont placés 2 à 3 jours avant le TP dans un bassin de stabulation spécifique d’où ils sont ensuite prélevés un à un manuellement par les soigneurs. Le poisson (un pour 2 binômes) est transféré par les étudiant(e)s dans le bain anesthésiant situé à proximité, à l’aide d’une bâche de transport. Une fois anesthésié, l’animal est mesuré, identifié (lecture de sa marque pit-tag), observé (état sanitaire) et échographié (examen des gonades et autres organes). Les poissons seront manipulés une fois et sous la surveillance des soigneurs pour aider à la reconnaissance/interprétation des images de l’échographie et fiabiliser la pré-sélection (ou pas) des individus pour de futures reproductions. L’ensemble des interventions durent moins de 15-20 minutes et se font sous anesthésie. Après l’échographie, l’animal est replacé dans le bassin de stabulation (dans un compartiment dédié au réveil) pour observation jusqu’à recouvrement de sa pleine capacité de nage et de prospection, et libéré (cloison amovible) à la fin du TP.
Impact sur les animaux
Les procédures sont rapides, peu ou non invasives (soit respectivement, l’injection dorsale d’une marque de petite taille ou l’échographie) et concernent des individus différents (pas d’enchaînement des actes). Dans chacun des 2 ateliers, toutes les manipulations pratiquées se font sous anesthésie générale (par balnéation) puis les poissons sont replacés dans le canal ou le bassin d’origine après leur réveil. Il n’y a donc que peu d’effets indésirables attendus. Malgré tout, la nuisance de l’injection d’une marque (même petite) dans le muscle dorsal correspond à une blessure tissulaire de type plaie cutanée au point d’entrée pouvant se prolonger dans les fibres musculaires de façon plus ou moins importante selon le diamètre et la profondeur de pénétration de l’aiguille dans la musculature du poisson. L’injection par voie intramusculaire a été néanmoins privilégiée en première approche pour les étudiant(e)s car elle est adaptée par rapport à la taille des poissons sélectionnés vis-à-vis des marques utilisées et semble la moins risquée pour l’animal, même si le geste de l’étudiant(e) manque de précision (contrairement au marquage abdominal plus complexe pour des néophytes et plus dangereux pour le poisson, avec un risque de perforation des viscères). Donc en plus de la vidéo présentée et de l’entraînement proposé (injection sur bananes), le marquage du poisson sera surveillé de près et de bout en bout par les formateurs qui guideront les étudiants dans leurs gestes techniques à chaque étape pour limiter au maximum la sévérité de la blessure occasionnée.
Devenir
En fin de procédure 1 (pêche à l’électricité suivie d’un marquage dorsal par pit-tag ou marque visuelle spaghetti), les animaux endormis sont placés en eau claire dans un bassin de réveil pour que les étudiant(e)s puissent observer les différentes étapes du réveil. Tous les poissons marqués qui ont un comportement de nage normal à l’issue du réveil seront relâchés dans le canal d’origine. Le relâcher de l’ensemble des animaux (marqués ou non) ne sera effectué qu’à la fin du TP pour éviter tout risque de recapture lors de la seconde séquence de pêche électrique. S’agissant d’un TP prévu annuellement sur une durée de projet de 5 ans, tous les poissons capturés chaque année dans le canal (exclusivement pour le TP) seront systématiquement contrôlés, visuellement et/ou avec un lecteur de marque pit-tag, pour pouvoir être écartés (s’ils sont déjà marqués) des ateliers Marquage ultérieurs. En fin de procédure 2 (biométrie et échographie sur esturgeon du Danube), les animaux endormis sont replacés en eau claire dans leur bassin d’attente. Ils y sont maintenus isolés en compartiment de réveil (séparation par cloison amovible) pour pouvoir être observés jusqu’au recouvrement de leurs pleines capacités de nage et de prospection. La cloison amovible n’est retirée qu’à la fin du TP pour éviter tout double emploi des poissons entre groupes d’étudiant(e)s. Ensuite, les individus dont les indicateurs semblent favorables pour la reproduction seront conservés en bassin d’attente où ils resteront 2.5 mois (mi-janvier à début avril) jusqu’au contrôle final de leur maturation ; les autres, non pré-sélectionnés, seront remis dans le bassin d’élevage par les soigneurs à la fin du TP. En conséquence, ces poissons non pré-sélectionnés en année N et replacés avec le stock peuvent être de nouveau échographiés par des étudiant(e)s l’année suivante (même si la probabilité est faible en raison de la petite taille de l’effectif examiné en TP (n=7 individus/an maximum) par rapport au stock de géniteurs (n≈200 actuellement)). Enfin, les esturgeons qui se sont déjà reproduits ne seront pas ré-impliqués (gestion génétique et démographique du stock captif) et donc pas mis à disposition des étudiant(e)s.
Remplacement
Les étudiant(es) du Master Pro BSE disposent d’assez peu d’enseignements pratiques relatifs aux suivis biologiques terrestres ou aquatiques qu’ils pourront être amenés à faire en tant que biologistes dans leur pratique professionnelle, et il est difficile de remplacer (totalement) les animaux vivants par d’autres outils pédagogiques dans le cadre de leur dernière année de formation. Une vidéo a été réalisée pour expliquer et montrer aux étudiant(e)s la démarche et les gestes techniques inhérents à chaque atelier pour qu’ils voient déjà ce qu’il faut faire avant la séance ; cela remplace l’usage d’un poisson par séance pour la démonstration. Dans l’atelier 3, après présentation des méthodologies de biotélémétrie utilisées en milieu aquatique (vidéos), les étudiant(e)s s’initieront à la pratique d’un suivi manuel par télémétrie radio ou acoustique sans utilisation d’animaux (attachement du capteur sur objet inerte téléguidé).
Réduction
Les étudiants travaillent en binôme, un poisson est utilisé pour 2 étudiants pour réduire le nombre de poissons impliqués. Pour l’atelier “Echographie” sur l’esturgeon du Danube, ce sont 2 binômes qui travaillent simultanément sur le même poisson.
Raffinement
Toutes les manipulations se font sous anesthésie générale par balnéation pour limiter le stress des animaux. De plus, - pour les marquages, les animaux sont pêchés à l’électricité par des opérateurs habilités avec un appareil réglé pour une électrotaxie rapide des poissons sans tétanie. Après stabulation en bassin (eau du canal en circuit ouvert) de courte durée pour déterminer les espèces, les poissons choisis (taille suffisante, comportement/aspect normal : absence de lésions, calme, nage régulière) sont anesthésiés par balnéation (environ 4-5 min jusqu’à perte totale de l’équilibre) puis marqués en moins de 5 min par injection d’un pit-tag de 12mm en intramusculaire ou d’une petite marque visuelle externe (type spaghetti) sur leur nageoire dorsale. En routine, les marquages de ce type utilisés pour identifier les poissons, rapides et peu invasifs, sont réalisés sous anesthésie légère (dose sédative) mais ici, une anesthésie un peu plus profonde est privilégiée pour limiter le risque de souffrance animale durant l’apprentissage du geste par les étudiant(e)s. Injecteurs et zone d’implantation des marques sont tous désinfectés et les bains anesthésiants renouvelés et aérés (bulleur) si nécessaire. Enfin, avant de commencer, chaque étudiant(e) peut s’entrainer au maniement de l’injecteur sur des objets inertes (bananes) et les repères anatomiques qui leur ont été présentés au préalable (vidéo) sont rappelés à chaque marquage, surveillé par le(s) formateur-trice(s). - pour les échographies, les esturgeons sélectionnés de la même manière (état physique, comportement, nage) et placés en bassin de stabulation d’attente (eau de rivière ; débits, température et oxygène surveillés quotidiennement) 2 à 3 jours avant l’échographie pour faciliter la surveillance et l’accès aux animaux (densité de poissons réduite : 3-3.5 kg/m2), sont d’abord mis à jeun 24h (pour réduire les risques de régurgitation/contamination fécale) puis transférés un à un dans un bain anesthésiant à l’aide d’une bâche de transport (pour éviter de possibles lésions par frottements et conserver les animaux dans le noir afin de réduire le stress). En routine, le contrôle de pré-sélection d’esturgeons matures par simple échographie se fait sur animaux vigiles, en moins d’1 min par poisson sans provoquer d’altération du comportement. Mais pour le TP, tous les actes sont pratiqués sous anesthésie profonde pour supporter une durée d’intervention a priori de 15-20 min sous la surveillance des soigneurs.
Choix des espèces
Les espèces choisies pour l’atelier 1 (pêche à l’électricité/marquage) sont des cyprinidés et des percidés provenant de la rivière alimentant la station d’expérimentation, qui sont entrés à l’état larvaire et qui grandissent dans le canal approvisionnant les bassins extérieurs. Ces espèces d’eau douce sont communes en France, et sont donc les plus susceptibles d'être rencontrées par les futurs biologistes dans leur pratique professionnelle. L’espèce choisie pour l’atelier 2 (échographie) est l’esturgeon du Danube Acipenser ruthenus, une espèce élevée sur notre site pour des essais de biologie de la conservation. Les poissons utilisés dans l’atelier 1 sont au stade adulte pour faciliter la reconnaissance des espèces, les manipulations et les marquages (ratio poids marque/animal adapté), soit des individus d’environ 20 à 25 cm selon l’espèce considérée. Les esturgeons utilisés dans l’atelier 2 sont des adultes géniteurs des deux sexes, de suffisamment grande taille pour faciliter l’examen échographique et déterminer l’état d’avancement de leur maturité (soit des individus de 80 à 100 cm et de 3 à 5 kg).
Formation et entrainement aux gestes techniques chez le rongeur de laboratoire (souris et rats)
- Formation professionnelle
Rats : 400
2 500 souris et 400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce sont des animaux de surplus d'élevage, déjà destinés à la mise à mort, sur lesquels des personnes en apprentissage s'entraînent aux injections, aux prélèvements sanguins et aux perfusions, chaque animal subissant jusqu'à deux administrations et un prélèvement. Le porteur admet que des gestes encore mal maîtrisés peuvent rendre la contention plus longue et le geste plus douloureux. Il affirme que les réactions de l'animal vigile restent "indispensables" et ne peuvent être reproduites par des méthodes de remplacement, et présente le projet comme une réduction puisqu'il utilise des animaux voués à la mort.
Objectifs
L'utilisation d'animaux dans la recherche est parfois nécessaire, la recherche sur les cellules ou les modèles informatiques ne suffisent pas et il est parfois nécessaire de travailler sur organisme entier notamment en raison des nombreuses intéractions qui existent entre les différents organes. Ainsi l'utilisation des animaux de laboratoire permettent l'amélioration des connaissances de maladies complexes et la mise au point de traitement. L'espèce la plus utilisée étant la souris pour plusieurs raisons. La souris partage 90% de ses gènes avec l'Homme, peut souffrir des mêmes maladies (obésité, diabète, cancer...), supporte bien la consanguinité (lots d'animaux homogènes d'un point de vue génétique) et peut être modifiée ganétiquement (OGM avec par exemple invalidation d'un gène d'intérêt), peut aussi être modifiée au niveau de son microbiote (souris axéniques) et il existe de nombreux outils d'analyse (anticoprps par exemple). L'avantage aussi est la petite taille, elles est facile à héberger sous statut sanitaire défini, à élever et à manipuler. Il est important de savoir manipuler l'espèce dont on a besoin dans son projet scientifique, la réglementation demande à ce que le personnel soit formé et compétent. Les établissements utilisateurs accueillent le personnel des équipes de recherche qui va être amené à travailler sur les espèces souris et/ou rats dans le cadre de leurs projets de recherche. Le personnel de l'établissement utilisateur a pour rôle d'accompagner les utilisateurs et certains utilisateurs ont besoin d'être formés aux gestes techniques sur les animaux. Hormis la formation réglementaire (applicateur et concepteur), les utilisateurs ont parfois besoin de se former et s'entrainer en interne en fonction des besoins de leurs projets. Le personnel de l'établissement est formé, compétent et titulaire des formations réglementaires (concepteur ou applicateur et chirurgie expérimentale) et également à jour pour la formation continue. Le programme de ces formations en interne et la validation des gestes est assuré par le responsale du suivi des compétences de l'établissement. Le présent projet a pour but de lister certains gestes techniques réalisés sur des animaux de réforme dans le cadre d'apprentissage ou de training. Le projet global va utiliser au maximum 2300 animaux mâles et femelles de tout âge ne présentant pas de gène d'intérêt, n'ayant pas de phénotype dommageable et dont l'état de santé a été jugé satisfaisant.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de former les nouveaux entrants (zootechniciens nouvèlement recrutés ou personnels d'équipes de recherche utilisateurs du service de zootechnie) et de s’assurer qu’ils maîtrisent parfaitement les gestes d’administration de composés et de prélèvements sanguins avant de les laisser travailler en autonomie. La formation permet aussi d'éviter les biais et les erreurs, si la personne ne maitrise pas totalement les gestes, lors de la réalisation des projets scientifiques.
Procédures
Les gestes enseignés et/ou pratiqués seront diverses injections (intra-péritonéale, sous-cutanée, intraveineuse...), des prélèvements sanguins sous anesthésie et des perfusions. Des tests d'anesthésie pourront également être faits lors de la mise en place d'un projet incluant de la chirurgie ou dans le cadre du raffinement des procédures d'anesthésie. Chaque animal pourra faire l'objet au maximum 2 administrations (gavage ou injection) et d'un prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
Ce projet est réalisé pour valider ou former aux gestes techniques d’administration de substances et de prélèvements sanguins des personnes pouvant être novices, il est donc possible que certains gestes techniques encore mal maitrisés produisent une légère nuisance aux animaux (contention un peu longue par rapport à une personne plus habituée, stress de l’expérimentateur ressenti par l’animal, geste un peu plus douloureux car en apprentissage…).
Devenir
Après utilisation de ces animaux, ils seront mis à mort, comme cela était intialement prévu puisqu'il s'agit d'animaux non-utilisés (surplus d'élevage).
Remplacement
Pour l'apprentissage de l'approche de l'animal, de sa contention et des gestes techniques, les réactions comportementales de l'animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente et pour permettre aux participants d'aborder les animaux dans les conditions les plus proches de leur réalité quotidienne.
Réduction
Afin de réduire le nombre total d'animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons uniquement des animaux de surplus d'élevage, qu'il est prévu de mettre à mort dans la semaine. Nous réduisons également au maximum le nombre d'animaux utilisés pour chaque personne. Néanmoins, afin de limiter le nombre de gestes appliqués à chaque animal 3 animaux par participant sont nécessaires.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages de portoir ventilé, en groupe, avec de l'eau et de la nourriture ad libitum et de l'enrichissement (une maison + de quoi faire un nid). Les animaux sont surveillés quotidiennement par du personnel compétent qui vérifie l'état des animaux, le niveau du biberon et de la mangeoire. En cas de signes cliniques détectés, l'information est remontée et des points limites adaptés sont appliqués.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont les animaux de laboratoire utilisés dans le service de zootechnie Les animaux seront utilisés en fonction de leur disponibilité. Le critère d'âge n'est pas restrictif sur l'utilisation de ces animaux.
Effet de la consommation de sucre sur l’anxiété et les capacités mnésiques chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
228 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils sont soumis à six ou dix semaines de consommation d'eau sucrée puis à seize séances de tests d'anxiété et de mémoire, dont un test reposant sur une stimulation douloureuse brève, pour chercher un lien entre sucre et troubles cognitifs. Le porteur euthanasie ensuite les rats pour analyser leur cerveau. Il affirme qu'aucune alternative n'existe et que l'expérimentation animale offre un environnement "débarrassé du maximum de facteurs confondants", un contrôle qu'il oppose aux études chez l'humain.
Objectifs
Dans les pays développés, la consommation alimentaire peut être motivée autant, voire davantage, par le plaisir que par le besoin de se nourrir. De ce fait, des dérives sont observées dans les comportements alimentaires, comme une consommation excessive de sucres rapides. Des études émettent l’hypothèse qu’une consommation excessive chronique de sucres rapides dès l'adolescence peut être à l'origine de conséquences néfastes sur l'humeur et sur les capacités cognitives des individus. Notre projet vise à tester cette hypothèse, soit pendant soit après une phase prolongée de consommation de sucre, et ce dans le cadre de l’expérimentation animale qui permet l’élaboration d'un environnement contrôlé et débarrassé du maximum de facteurs confondants.
Bénéfices attendus
La consommation chronique de sucres rapides est connue pour induire des dysfonctionnements métaboliques et certains troubles du fonctionnement cérébral, en particulier ceux liés à l'état émotionnel du sujet. Cependant, les troubles cognitifs et mnésiques ne commencent qu'à être décrits chez l'Homme et il est encore difficile de déterminer les liens de causalité entre consommation de sucre et troubles cognitifs. Les expériences que nous proposons de mener chez le rongeur, forcément davantage contrôlées, permettront de participer à l'éclaircissement du lien de causalité potentiel entre le comportement alimentaire et les capacités mnésiques. Par ailleurs, les analyses biochimiques que nous mènerons sur le cerveau des animaux permettront de mettre en évidence des liens potentiels entre le comportement de consommation de sucre et une plasticité cérébrale qui pourrait participer à l’altération des processus cognitifs ou émotionnels.
Procédures
Les animaux seront soumis à une phase de consommation d’eau sucrée, pendant 6 ou 10 semaines (séances de 2h tous les 2 ou 3 jours). Certains seront soumis (ensuite ou pendant la phase de consommation) à des tests comportementaux qui permettront d’évaluer le niveau d'anxiété et les capacités mnésiques des animaux. Chacun de ces tests comportementauc s'étale sur 1 à 4 séances, à raison (selon les procédures) de 1 séance / jour ou 1 séance / 2 jours. Chaque animal sera soumis, au total, à 16 séances, chacune durant environ 5 min. Aucune intervention invasive n’est programmée dans ce projet.
Impact sur les animaux
Des troubles de l'humeur et/ou cognitifs sont envisageables chez les animaux consommateurs de boisson sucrée (le but de l'étude est de les mettre en évidence). Un stress léger peut être généré chez les animaux par la passation des tests d’anxiété et de mémoire (succession des tests sur 18 ou 29 jours, selon les procédures, et, parfois, exposition à une situation aversive). Un seul test est basé sur l'application dunique et courte d'une stimulation douloureuse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Le prélèvement de tissus (en particulier le cerveau) permettra l'analyse, à un niveau biochimique, des conséquences éventuelles de la consommation chronique de sucre.
Remplacement
L'utilisation d'animaux vivants et vigiles est forcément obligatoire pour mesurer la consommation orale d'une solution sucrée et ses conséquences éventuelles sur les capacités mnésiques et le niveau d'anxiété. Il n'y a actuellement pas d'alternative pour répondre aux questions abordées par le projet.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé au plus juste en fonction des prérequis statistiques et de notre expertise en matière de comportement, soit 12 animaux/condition pour les expériences de comportement et 10/condition pour les approches moléculaires. Des tests statistiques seront effectués sur les données et les expériences seront terminées dès que ces tests auront confirmé ou infirmé l'hypothèse que nous avons formulée.
Raffinement
Notre protocole expérimental impose que les rats, placés par paires dans des cages standard qui n'entravent pas la communication sonore et olfactive et où ils disposent de morceaux de bois à ronger, soient examinés (pesée, aspect externe) tous les deux jours. L'habituation à la personne et à la manipulation est donc assurée. Leur consommation d'eau, de nourriture et d'eau sucrée est mesurée à la même fréquence. L'isolement de chaque animal n'est réalisé que lorsqu'il est placé en situation de test (consommation de sucre sur 2h, tests de mémoire ou d'anxiété, activité locomotrice de 24h). L'enchaînement des rests comportementaux est élaboré pour qu'il soit compatible avec les règles du bien-être animal. Aucune chirurgie n'est programmée. la mise en place et le respect des points limites est assurée par la surveillance d'éventuels signes de détresse physique ou de changements de comportements majeurs des animaux ainsi que par l'évaluation de leur état général.
Choix des espèces
Le Rat représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires et l’addiction. Sur un plan évolutif, les rongeurs appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Le choix du Rat s’impose par l’existence de très nombreuses données anatomiques, électrophysiologiques et comportementales solides sur la cognition, mémoire, mais aussi l’anxiété et la dépression Les bases neurobiologiques de la mémoire, de l’anxiété ou de la dépression étudiées chez le rongeur, et notamment chez le Rat, ont permis de grandes avancées dans la compréhension de ces phénomènes physiologiques et pathologiques chez l’homme. Par ailleurs, le rat possède des capacités cognitives élaborées et un répertoire comportemental complexe. Animal social, il s’adapte bien à la vie au laboratoire et coopère facilement dans les tâches comportementales. Les tests comportementaux débutent à l'âge de 6 semaines, chez le rat adolescent. L'adolescence est une période critique dans le développement de comportement de recherche et de consommation de drogues ou de récompenses naturelles comme le sucre. La plasticité cérébrale, très importante à cet âge-là, est une source de vulnérabilité en termes de contrôle du comportement et de conséquences à la consommation excessive de sucre.
Identification de molécules bioactives pour traiter le diabète de type 2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger, pour cribler des molécules candidates contre le diabète de type 2. Elles sont soumises à un régime riche en graisses pour induire un diabète, reçoivent un traitement quotidien par gavage, une injection d'insuline et des prélèvements de sang à la queue. Le porteur reconnaît que l'induction du diabète chez des animaux sains peut altérer leur fonction hépatique et rénale, tout en classant l'ensemble en gravité légère. Il affirme que la communication entre organes impose de recourir à des "organismes complets".
Objectifs
L'objectif central de ce projet est d'identifier et de caractériser des molécules bioactives potentielles pour la prévention et le traitement du diabète de type 2 (DT2). Le DT2 est une maladie métabolique chronique qui affecte des millions de personnes dans le monde et présente une sérieuse menace pour la santé publique. Nos recherches visent à découvrir de nouvelles molécules ou à optimiser celles déjà identifiées, qui pourraient offrir des alternatives thérapeutiques plus efficaces et sûres que les traitements actuels.
Bénéfices attendus
La recherche sur le diabète de type 2 (DT2) a un impact direct sur des millions de vies à travers le monde. Ce projet, en se concentrant sur l'identification de nouvelles molécules bioactives, présente plusieurs bénéfices potentiels qui pourraient considérablement améliorer la prise en charge de cette maladie. Nouveaux traitements potentiellement plus efficaces : En identifiant des molécules bioactives inédites, nous pourrions découvrir des traitements qui surpassent en efficacité ceux actuellement disponibles. Ces molécules pourraient cibler la maladie sous des angles différents, offrant des thérapies plus adaptées à divers sous-groupes de patients. Réduction des effets secondaires : Avec la caractérisation détaillée de ces molécules, nous espérons trouver des candidats ayant un profil d'effets secondaires minimal, améliorant ainsi la qualité de vie des patients et réduisant les complications liées au traitement. Économies pour le système de santé : Le développement de traitements plus efficaces et sécuritaires pourrait réduire le nombre d'hospitalisations et de complications liées au DT2, entraînant des économies substantielles pour les systèmes de santé. Compréhension approfondie de la maladie : Au-delà de l'identification de molécules, notre recherche pourrait éclairer de nouvelles voies métaboliques ou biologiques associées au DT2, offrant ainsi de nouvelles cibles thérapeutiques pour le futur. Solutions naturelles et durables : Si des molécules bioactives sont identifiées à partir d'extraits naturels, cela pourrait conduire à des thérapies plus durables et éco-responsables, tout en valorisant la biodiversité et les savoirs traditionnels associés. En somme, les retombées de ce projet pourraient transformer la manière dont le DT2 est traité et compris, offrant de l'espoir à des millions de personnes et contribuant à une meilleure santé publique globale.
Procédures
Dans le cadre de notre projet sur l'identification de molécules bioactives pour traiter le diabète de type 2, voici les potentielles nuisances auxquelles les animaux pourraient être exposés : - pour tester l'efficacité de nouvelles molécules bioactives, la voie orale (gavage) est nécessaire pour cibler l'intestin. Le traitement est administré quotidiennement pendant la durée du protocole et une fois pour l'OGTT - Pour les tests de tolérance à l'insuline, les souris subissent une seule injection intrapéritonéale d'insuline. - De plus, les prélèvements de glycémie pendant 2 h sont effectués une seule fois en fin de protocole pour le test de tolérance orale au glucose ou le test de tolérance à l'insuline
Impact sur les animaux
Dans le cadre de notre projet sur l'identification de molécules bioactives pour traiter le diabète de type 2, voici les potentielles nuisances auxquelles les animaux pourraient être exposés : -Procédures : Pour tester l'efficacité de nouvelles molécules bioactives, la voie orale (gavage) est nécessaire pour cibler l'intestin. Ce geste ainsi que la contention des animaux lors du gavage peut induire du stress. De plus ,des prélèvements sang à la queue des animaux sont nécessaires, ce qui pourrait causer du stress aux animaux. -Effets secondaires des molécules : Comme pour tout nouveau composé, il existe un risque d'effets secondaires inattendus qui peuvent affecter le bien-être des animaux. - Risque de maladie : L'induction du diabète de type 2 chez des animaux sains pour les besoins de la recherche pourrait affecter leur état de santé général et leur bien-être. En effet, les régimes riches en graisses peuvent induire des altérations de la fonction hépatique et rénale par exemple.
Devenir
Les souris issues des procédures de classes légères 1 ou 2 sont ensuite euthanasiées afin de d'étudier la motilité intestinale de ces souris grâce à des capteurs isotoniques.
Remplacement
Pour identifier des acteurs moléculaires capables de ralentir les contractions duodénales, afin de restaurer l’activité neuronale hypothalamique et à terme l’utilisation périphérique de glucose, nous avons besoin d'individus vivants sous différents régimes mimant les conditions physiopathologiques (diabète & obésité) où nos molécules pourraient avoir un effet thérapeutique. De plus, notre projet implique la communication inter-organes, il n'est donc pas possible de se passer d'organismes complets.
Réduction
Nous planifions soigneusement les expériences et utilisons des méthodes statistiques appropriées pour évaluer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs avec l'effectif le plus réduit possible. De nombreuses études antérieures et notre expérience du modèle permet de limiter le nombre d’animaux. Par ailleurs, notre protocole a été soumis à une veille bibliographique minutieuse et validé par différents spécialistes du secteur. Les effectifs ont été optimisés afin d’assurer la reproductibilité de nos résultats tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.
Raffinement
Nous mettons mis en oeuvre diverses stratégies : - Formation et suivi des compétences de notre équipe afin de s'assurer que tous ceux qui s'occupent des animaux ou effectuent des expérimentations soient correctement formés pour le faire de manière éthique et humaine. - Hébergement enrichi : toutes les cages ont un igloo et 2 carrés de ouates poru fournir un environnement qui encourage les comportements naturels et permet aux animaux de vivre dans un environnement aussi proche que possible de leur habitat naturel. - Surveillance régulière : le bien-être et le comportement des animaux est vérifé quotidiennement et les souris sont pesées une à 2 fois par semaine pour vérifier que les points limite ne sont pas atteints (perte de poids atteignant 20%, altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de s’alimenter…), vocalisation, tremblements…, posture anormale (voûté ou déséquilibré pour soulager une zone douloureuse, démarche anormale, diminution des mouvements, prostration), détection/présence d’une anomalie (plaie, piloérection…). La surveillance des animaux et surtout leur comportement seront observés avec une grande vigilance.
Choix des espèces
La souris C57BL/6J réagit très bien aux régimes alimentaires déséquilibrés, modèle expérimental de référence dans l'étude du métabolisme glucidique. De plus notre équipe maîtrise l’utilisation de ces différents modèles chez la souris, nous permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux et d’assurer le suivi des souris. Stade adulte. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux.
Expression, localisation et rôle de trois neuropeptides et leurs récepteurs dans le testicule murin au cours de la première vague de la spermatogenèse
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
333 souris, la plupart des souriceaux, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré sans réveil pour dix-huit d'entre elles et léger pour les autres, toutes tuées avant le prélèvement du tissu testiculaire. Elles reçoivent une ou deux injections d'un inhibiteur de l'axe cerveau-testicule puis un neuropeptide, avant une mise à mort programmée à quinze, vingt-deux ou trente-six jours. Le porteur situe le travail dans la perspective d'optimiser la maturation in vitro de tissu testiculaire prépubère, pour restaurer la fertilité de garçons traités pour un cancer. Il affirme que la souris est le "meilleur modèle" faute d'échantillons humains disponibles.
Objectifs
Plusieurs neuropeptides et leurs récepteurs, présents dans le cerveau au niveau de l’hypothalamus et connus pour réguler le fonctionnement de l’axe cerveau-testicule, ont également été détectés au sein des testicules. Cependant, les études portant sur la distribution et le rôle de ces neuropeptides au niveau testiculaire, en particulier lors de l’entrée en puberté, sont encore peu nombreuses et parfois controversées. Des données suggèrent que certains de ces neuropeptides stimuleraient la production d’hormones stéroïdes, tandis que d’autres ne mettent en évidence aucun effet ou montrent qu’ils favoriseraient la conversion de la testostérone en œstradiol. Ces neuropeptides pourraient également être impliqués dans la maturation des testicules lors de l’initiation de la puberté et pourraient réguler localement la production des spermatozoïdes. L’objectif de ce projet sera d’analyser l’expression de trois neuropeptides et leurs récepteurs respectifs dans le testicule de souris lors de l’initiation de la puberté.
Bénéfices attendus
Les études portant sur les neuropeptides et leurs récepteurs dans le testicule lors de l’initiation de la puberté sont peu nombreuses et parfois controversées. Ce projet permettra d’étudier pour la première fois de manière approfondie et à l’aide de technologies de pointe l’expression, la localisation et le rôle de trois neuropeptides et leurs récepteurs respectifs au niveau testiculaire lors de l’initiation de la puberté. Ce travail apportera ainsi de nouvelles connaissances fondamentales sur le rôle de ces neuropeptides au moment du déclenchement de la puberté. Ces connaissances pourraient être utiles pour restaurer la fertilité de patients ayant bénéficié d’une cryoconservation de tissu testiculaire prépubère avant traitement d'un cancer.
Procédures
- Une injection d’un inhibiteur de l’axe cerveau-testicule à 10 jours pour le animaux mis à mort à 15 jours et 22 jours - Deux injections d’un inhibiteur de l’axe cerveau-testicule à 10 jours et 23 jours pour les animaux mis à mort à 36 jours - Une seule injection de neuropeptide ou de sérum physiologique à 14 jours, 21 jours ou 35 jours (24 heures avant la mise à mort) - Prélèvement d’un échantillon de sang avant injection de l’inhibiteur de l’axe cerveau-testicule (9 jours) et d’un échantillon de sang après mise à mort (15 jours, 22 jours et 36 jours)
Impact sur les animaux
Stress lié à la mise à mort. Stress lié à la contention : pour réduire le stress dû à la contention à son minimum, les animaux seront habitués à être manipulés de façon délicate et seront familiarisés avec la contention pendant la période d’acclimatation nécessaire avant d’être utilisés dans la procédure de recherche. De plus, la durée de la contention sera minimisée. Pour l’étude du rôle des neuropeptides au niveau testiculaire dans des conditions in vivo, qui nécessite l’administration d’acyline (blocage de l'axe hypothalamus-hypophyse-testicule) puis d’un neuropeptide, l’expérimentation n’entrainera que la douleur due à l’aiguille au moment de l’injection des traitements. Des effets secondaires à l’administration de l’acyline et des neuropeptides étudiés aux doses testées n’ont pas été rapportés.
Devenir
Les animaux ne pouvant pas vivre après prélèvement chirurgical du tissu testiculaire sans traitement hormonal de substitution, ils seront mis à mort en amont du prélèvement.
Remplacement
Dans ce projet, il n’est pas possible de remplacer le modèle animal. Les neuropeptides étudiés et leurs récepteurs ont été détectés au niveau testiculaire chez la souris. De plus, ce travail pourrait permettre d’optimiser le protocole de maturation in vitro du tissu testiculaire prépubère, en supplémentant les milieux de culture organotypique avec des neuropeptides ou les antagonistes de leurs récepteurs. Le protocole de culture organotypique, développé dans le but d’envisager une application clinique afin de restaurer la fertilité de patients ayant bénéficié d’une cryoconservation de tissu testiculaire prépubère avant traitement d’un cancer, peut difficilement être optimisé chez l’homme du fait de la rareté des échantillons de tissu testiculaire de garçons prépubères. La souris est le meilleur modèle pour l’optimisation de la spermatogenèse in vitro car une production de spermatozoides in vitro n’a été obtenue jusqu’à présent que dans cette espèce.
Réduction
Conformément à la règle des 3R, le nombre d'animaux nécessaires au projet a été réduit au maximum, en se basant sur les études déjà réalisées au sein du laboratoire et dans la littérature, ainsi que sur un calcul de puissance statistique, permettant d'avoir des résultats significatifs avec un minimum d'animaux. Nous limiterons ainsi le nombre de répétitions à maximum n = 6 testicules par expérience. Tous les souriceaux mâles de chaque portée seront utilisés, quelle que soit la taille de la portée. Les tissus qui ne seront pas exploités le jour du prélèvement seront cryopréservés. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé, tous les testicules prélevés seront analysés : pour chaque animal, une partie des analyses sera effectué sur un testicule et une autre série d’analyses sera réalisée sur le testicule controlatéral. De plus, les prélèvements sanguins réalisés pour vérifier que l’axe gonadotrope a bien été inhibé seront effectués sur les mêmes animaux qui serviront aux différentes analyses.
Raffinement
Les souriceaux seront conservés auprès de leur mère jusqu’au prélèvement tissulaire afin de ne pas perturber leur développement. Les animaux seront maintenus en contention dans la paume de l’expérimentateur ou sur une surface plane. Pour réduire le stress dû à la contention à son minimum, les animaux seront habitués à être manipulés de façon délicate et seront familiarisés avec la contention pendant la période d’acclimatation nécessaire avant d’être utilisés dans la procédure de recherche. De plus, la durée de la contention sera minimisée.
Choix des espèces
Plusieurs neuropeptides et leurs récepteurs ont été détectés au sein des testicules chez la souris. D’après la littérature, ils pourraient avoir un rôle dans la production de spermatozoïdes et/ou d’hormones stéroïdes. L’un des objectifs de ce projet sera d’étudier trois neuropeptides et leurs récepteurs lors de l’initiation de la puberté. De plus, les procédures de culture in vitro de tissu testiculaire prépubère nécessitent d’être optimisées dans le modèle souris. Un ajout de ces neuropeptides ou d’antagonistes de leurs récepteurs dans les milieux de culture est envisagé dans cette étude. L’effet de ces supplémentations sur la production de spermatozoïdes et d’hormones stéroïdes sera évalué. L’expression, la localisation et le rôle des neuropeptides et de leurs récepteurs seront analysés lors de l’initiation de la puberté chez la souris. Pour l’étude in vivo, des souris âgées de 6 jours, 15 jours, 22 jours et 36 jours seront utilisées. Pour l’étude in vitro, des tissus testiculaires de 6 jours seront cultivés pendant 9, 16 ou 30 jours (temps de culture correspondants aux contrôles in vivo).
Etude d’un traitement pharmacologique pour le traitement du lymphome B
- Recherche fondamentale
- Oncologie
170 souris immunodéficientes NSG vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour tester un traitement du lymphome B en collaboration avec un partenaire industriel. Elles subissent une chirurgie abdominale de vingt à trente minutes pour greffer des cellules humaines dans la rate, puis des injections et un gavage cinq fois par semaine, avant des prélèvements de sang. Le porteur indique attendre des douleurs post-opératoires et le développement du lymphome. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle alternatif" intégrant la diffusion du produit et que l'efficacité préclinique chez la souris est un "pré-requis indispensable".
Objectifs
Ce projet de recherche a pour but de mieux traiter les lymphomes B, des cancers du sang qui se forment à partir de lymphocytes B qui sont les cellules luttant contre les infections. Malgré des progrès thérapeutiques récents, certains types de lymphome B avec des mutations génétiques particulières sont mortels pour encore 40% des patients. Ce projet, mené en collaboration avec un partenaire industriel, a pour objectif d'étudier un traitement pharmacologique anticancéreux ciblant les tumeurs présentant des mutations pour un gène impliqué dans ce cancer. Actuellement, des données préliminaires sur des cellules humaines de lymphome B ont montré une sensibilité accrue des cellules à la molécule étudiée en cas d'inactivation du gène étudiée. Le traitement en question est une molécule impliquée dans la mort cellulaire. Ainsi, pour l'étude chez la souris, le but est de réaliser des greffes de cellules humaines dans la rate sur des souris immunodéficientes. Les souris seront ensuite traitées avec le médicament, en combinaison ou non avec une deuxième molécule agissant également sur la mort cellulaire, pour potentiellement renforcer l'efficacité du traitement. Ainsi, ce projet s'inscrit dans le développement de la médecine personnalisée pour le cancer visant à adapter les traitements médicaux en fonction des caractéristiques individuelles de chaque patient, notamment leurs mutations génétiques.
Bénéfices attendus
Ce projet est indispensable pour passer de la preuve scientifique établie sur des modèles cellulaires à la réalisation d'un essai clinique de la molécule chez les patients ayant un lymphome B muté pour le gène étudié. Si le traitement s'avère efficace, il pourrait augmenter considérablement la survie des patients ayant actuellement un pronostic très dévaforable. Ainsi, pour consolider les données scientifiques, il est nécessaire de passer par un modèle préclinique chez la souris avant de lancer un essai clinique chez l'homme.
Procédures
Les soumis seront soumise saux interventions suivantes: une procédure de chirurgie sous anesthésie gazeuse (durée: 20 à 30min) pour inciser l'abdomen et avoir accès à la rate. Puis, un million de cellules humaines seront injectées dans la rate, ensuite l'abdomen sera recousue. Les souris seront ensuite attribuées à des groupes de traitement pour être traitées ou non avec 2 traitements pharmacologiques anticancéreux en combinaison ou seul. Le premier traitement sera injecté dans l'abdomen de la souris (10 secondes) une fois par semaine et le deuxième traitement sera administré par voie orale (10 secondes) 5 fois par semaine. Enfin, deux prélèvements de sang par souris seront réalisés après l'administration des traitements.
Impact sur les animaux
Pour l’ensemble des souris, un stress lié à la contention des animaux est attendu (pesée, prise de température, manipulation dans la cage). Plus spécifiquement, des nuisances post-opératoires sont attendues pour les souris en raison de la chirurgie sous anesthésie. Cette chirurgie est nécessaire à l’implantation de cellules humaines du fait de l’incision de la cavité abdominale lors des injections de cellules dans la rate. Après cette injection, des douleurs sont attendues en raison du développement du lymphome ou du vieillissement de la souris. Enfin, une douleur brève et circonscrite est attendue pour l'ensemble des souris qui recevront une injection de la molécule dans l'abdomenn (10s maximum pour une injection). Pour la deuxième molécule, la nuisance se fera au moment de l'administration par voie orale avec une sonde de gavage (5 à 10s maximum). Concernant les effets indésirables des deux molécules, il n'y a pas de toxicité particulière attendue chez la souris susceptible d'entraîner une souffrance avec les doses utilisées. Pour un des deux traitements, une toxicité sanguine légère est décrite chez la souris qui se traduit par une diminution des globules rouges et des lymphocytes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. En effet, les souris NSG présentent un phénotype dommageable susceptible d'entraîner une souffrance à long terme pour l'élevage. Ensuite, les souris qui subirot la chirurgie et les traitements seront mises à mort dès que l'information scientifique sera obtenue pour éviter des souffrances inutiles.
Remplacement
Il n'existe pas encore de modèles alternatifs susceptibles de tester à la fois l'effet de la molécule étudiée dans ce projet directement sur les tumeurs tout en intégrant l'étude de la diffusion du produit dans un organisme. De plus, la réalisation d'études d'efficacité préclinique cherz la souris est actuellement un pré-requis indispensable avant de mener une étude clinique chez l'humain.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans nos expériences, les mesures suivantes seront prises : 1/ Partage des échantillons cellulaires post-mortem de souris au sein de l'équipe, de sorte qu'un même échantillon puisse servir à plusieurs projets, évitant ainsi d'utiliser plusieurs souris pour des expériences similaires. 2/ Réalisation d'analyse statistique pour comparer les groupes de souris et déterminer les différences qualitatives et quantitatives. Cela aide à éviter de répéter des expériences inutilement, ce qui réduira le besoin d'animaux. 3/ Optimisation de l'utilisation du matériel prélevé sur les tumeurs en le conservant de manière à ce qu'il puisse être utilisé plusieurs fois. Cela inclut la congélation des cellules provenant de différents organes, l'extraction de l'ADN et la préparation des organes pour des analyses. Cette approche évitera la duplication des expériences. 4/ Evaluation précise de la viabilité des échantillons avant injection chez la souris pour éviter d'injecter des souris inutilement.
Raffinement
Les souris immunodéficientes ne présentent pas de signes de souffrance particuliers puisque leur phénotype dommageable ne pourra pas s'exprimer lorsqu'elles sont élevées en conditions stériles. Les animaux qui subiront la chirurgie d'implantation de cellules humaines dans la rate (sous analgésique et anesthésie) seront laissées sur plaque chauffante à la fin de l'intervention et surveillées jusqu'au réveil complet puis replacées dans leur cage. Un hydratant occulaire aura été administré pour éviter un desséchement occulaire pendant l'anesthésie. De l'eau gélifiée et des croquettes humidifiées seront mises à disposition dans la cage des animaux pendant les 72h post-opératoires. Ces animaux seront observés 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète de la suture afin de mettre en évidence toute souffrance de l’animal. Si une infection cutanée est constatée, la plaie sera désinfectée deux fois par jour avec une solution antisceptique jusqu’à disparition des signes d’infection. Pour réduire au minimum la douleur associée au developpement d'un lymphome, des points limites assez prédictifs pour limiter les souffrances seront mise en place. La mise à mort de l'animal sera pratiquée lorsque l'un des points limites suivants sera atteint : mise en évidence d'une hépatosplénomégalie (gonflement de la rate ou du foie) par palpation de l'abdomen des souris, réduction de l’activité (prostration), poil hérissé et dos vouté. Les souris seront donc surveillées 3 fois par semaine jusqu'à l'âge de 1 an avec une prise de poids et de température hebdomadaire afin de mettre en évidence l'un des points limites qui entraînera alors la mise à mort de la souris. Dès qu'une perte de poids sera constatée par rapport au maximum mesuré dans les semaines précédentes, il sera ajouté de la gelée et des croquettes mouillées dans la cage. Si une perte de poids aggravée est constatée, la souris sera immédiatement mise à mort. Pour les souris ayant une baisse légère de température elles seront placées dans une enceinte chauffante pendant 48h. Si la température de l’animal ne remonte pas, il devra être mis à mort. Au delà de 1 an, les souris seront mises à mort si aucune prise tumorale n'est observée.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale de choix pour étudier l'impact d'un traitement pharmacologique sur des greffes de cellules humaines. En effet, chez la souris, nous avons accès à des modèles très immunodéficients tels que les souris dites NSG présentant des déficits complets en cellules immunitaires. Ce modèle représente donc un modèle de choix pour reconstituer des pathologies humaines telles que des lymphomes par greffe de cellules humaines en évitant ainsi un rejet de greffe. Cette immunodéficience permet en outre l'apparition de métastases ce qui permet d'observer l'action d'un traitement pharmacologique sur la dissémination cellulaire. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte de ces animaux. La maturité des animaux est indispensable pour étudier la pharmacocinétique (c'est-à-dire le devenir du médicament dans l'organisme) des produits chez la souris. En effet, le métabolisme est aussi influencé (absoprtion, diffusion, élimination du médicament) par la maturité de l'animal.
Exploration du tandem CD44/E-sélectine : Implications dans la chimiorésistance et la migration des cellules de Leucémies Aiguës Lymphoblastiques T et B.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier la résistance des leucémies aiguës lymphoblastiques à la chimiothérapie. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques de patients, jusqu'à seize injections de chimiothérapie et un prélèvement de moelle osseuse au niveau du fémur, geste que le porteur décrit comme le plus invasif du protocole. L'expansion leucémique provoque une perte de poids, une augmentation de la taille de la rate et parfois une prostration avant la mise à mort. Le porteur reconnaît qu'une partie du projet est réalisable in vitro mais affirme que la migration des cellules "ne peut être jugée" que sur l'animal.
Objectifs
Les leucémies aiguës lymphoblastiques sont des cancers du sang dont le pronostic diffère grandement entre les patients jeunes et âgés. En effet, l’intensification de la chimiothérapie menée ces dernières années a permis d’améliorer la survie et la rémission des patients (superieur à 85% pour les enfants ; seulement 50% chez les adultes). L’une des explications de ces différences de survie propose que des facteurs physiologiques produits par le corps influencent la résistance des cellules leucémiques aux traitements. Si les cellules leucémiques se propagent dans la quasi-totalité des différents organes du patient, le tissu d’expansion de prédilection reste malgré tout la moelle osseuse, retrouvée dans les os. Or, la moelle osseuse est un environnement qui évolue grandement au cours du vieillissement. Il est par exemple pauvre en adipocytes (cellules graisseuses) à la naissance et devient très riche en ces cellules avec l’âge. Dans les os riches en adipocytes, les cellules leucémiques deviennent « dormantes » ce qui s’accompagne d’une résistance aux agents utilisés en chimiothérapie. Des travaux récents montrent que, dans ce contexte, les cellules leucémiques « dormantes » présentent l’expression forte d’une protéine de surface dont la fonction majeure est d’être un récepteur à une protéine exprimée à la surface des cellules endothéliales, qui tapissent les vaisseaux sanguins. Différents arguments laissent penser que cette liaison à la protéine endothéliale est utilisée par les cellules leucémiques pour échapper à la chimiothérapie. On parle alors de « niche chimiorésistante ». Notre projet a pour vocation de mieux comprendre ce mécanisme propice à la chimiorésistance des cellules leucémiques et de proposer l’inhibition de cette liaison comme piste thérapeutique. Le repositionnement d’une molécule utilisée en essai clinique sur une autre pathologie sanguine, qui empêche toutes les interactions avec la protéine des cellules endothéliales, semble être très pertinente dans notre contexte. Nous proposons donc son association à la chimiothérapie conventionnelle pour déloger les cellules leucémiques de leur niche chimiorésistante.
Bénéfices attendus
La rechute des leucémies aiguës lymphoblastiques est un enjeu majeur dont il faut améliorer la prise en charge. À ce jour, quelques thérapies innovantes commencent à émerger mais leurs limites apparaissent déjà puisque quelques cas de résistance sont relatés. L’ultime alternative proposée aux patients est la transplantation de cellules souches hématopoïétiques provenant d’un donneur compatible, qui est curative mais ne concerne qu’une partie des patients, principalement des patients jeunes. Les avancées récentes de la recherche permettent de proposer d’autres pistes thérapeutiques aux patients. Malgré tout, ces dernières présentent des limites, ainsi une meilleure compréhension de la chimiorésistance est nécessaire pour proposer de nouveaux traitements aux patients pour lesquels la réponse aux traitements conventionnels n’est pas pleinement satisfaisante. Récemment, une entreprise a développé une molécule spécifiquement dans le but d’empêcher l’interaction du couple ligand/récepteur qui nous intéresse. Cette molécule est actuellement utilisée dans un essai clinique pour son rôle pertinent permettant d’empêcher la formation de caillot sanguin dans la drépanocytose, une maladie génétique héréditaire touchant les globules rouges. La validation de l’intérêt d’inhiber cette interaction dans le cas des leucémies aiguës lymphoblastiques pourrait rendre éligible ce type de cancer du sang à un essai clinique étendu. De façon plus large, les traitements actuels proposés aux patients sont majoritairement développés pour cibler la cellule cancéreuse. Mais l’ensemble des connaissances démontre que la cellule cancéreuse communique avec son environnement cellulaire et qu’aujourd’hui, la thérapie innovante se doit d’intégrer cette vision d’ensemble. C’est exactement l’objectif de notre étude.
Procédures
Les animaux seront soumis au maximum à : - Une injection de cellules leucémiques de patients. Cet acte, qui ne dure que quelques secondes, est effectué sous sédation. Cette injection est un acte unique dans toutes les procédures. - Selon les procédures, les souris subiront ensuite une injection d’agents utilisés en chimiothérapie conventionnelle selon le même protocole que pour l’injection de cellules leucémiques. Cet acte effectué sous sédation ne dure que quelques secondes. - Selon les procédures, les souris subiront également l’injection (durée : 5 secondes) dans la cavité abdominale, d’autres drogues utilisées en chimiothérapie conventionnelle. La molécule à tester sera quant à elle injectée en sous-cutanée (durée de l’acte : 5 secondes). L’application d’un anesthésique local précèdera l’ensemble des ces injections qui seront toutes réalisées sur des souris vigiles. Selon les procédures, le nombre d’injections va de 1 à 16. - Enfin un prélèvement de moelle osseuse sera effectué sous sédation et analgésie. Pendant l’acte, les souris sont maintenues sur un tapis chauffant afin de réguler leur température. Ce prélèvement est effectué une seule fois dans l’ensemble des procédures. L’injection en sous-cutanée de l’analgésique est effectuée juste avant la sédation. Cet acte prend 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Notre expérience dans la réalisation de protocoles similaires dans un modèle murin, nous permet de nous attendre à des nuisances modérées sur les animaux utilisés dans ce projet. Plusieurs points sont à retenir : - Puisque l’injection des cellules leucémiques et/ou de certaines drogues utilisées en chimiothérapie est effectuée sous sédation, le stress provoqué à l’animal est principalement lié à la contention avant anesthésie. C’est pourquoi nous mettons en place une autre technique pour le transfert des animaux de leur cage vers la cage de sédation, sans contention par l’intermédiaire d’un tube de transfert dans lequel viennent se loger les animaux. Malgré tout, une douleur peut être engendrée par la piqure au site d’injection, comme c'est le cas pour les patients traités par certaines chimiothérapies. - L’expansion leucémique des cellules de patients dans le modèle murin provoque à long terme une perte de poids de l’animal ainsi qu’une augmentation de la taille de la rate. En point ultime d’expérience, nous notons parfois une prostration/manque de mobilité de l’animal. - La chimiothérapie utilisée provoque également une perte de poids liée à l’ensemble des effets adverses des agents utilisés. - Enfin, le prélèvement de moelle osseuse est le geste le plus invasif effectué dans nos procédures. Ce geste se fait au niveau des fémurs, la mise en place d’un traitement analgésique est associé.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans nos procédures seront euthanasiés soit dès la fin des traitements soit dès apparition de signes de souffrance au cours de la courbe de survie. Notre étude porte sur l’importance de la liaison d’un couple récepteur/ligand dans la moelle osseuse des cellules leucémiques chimiorésistantes. L’euthanasie est donc nécessaire pour récupérer les cellules leucémiques retrouvées dans les différentes moelles osseuses. C’est pourquoi, lors de l’euthanasie des animaux, plusieurs os (fémurs, vertèbres thoraciques et vertèbres caudales) seront prélevés pour en extraire les cellules leucémiques et/ou pour effectuer des coupes histologiques permettant d’analyser finement la localisation des cellules leucémiques dans la moelle osseuse.
Remplacement
L’objectif de notre projet étant d’étudier les communications des cellules leucémiques avec leur environnement, en particulier dans un contexte de résistance aux traitements, aucun modèle ne représentant que partiellement un organisme ne pourra mimer l’intégralité et la complexité des interactions. Aujourd’hui, la culture in vitro de cellules leucémiques avec un autre partenaire cellulaire est maîtrisée. Cependant, ce système ne peut pas être étendu à la co-culture avec plus de deux ou trois partenaires cellulaires, et ne représente donc pas la diversité des intervenants cellulaires de la moelle osseuse. Malgré l’émergence des mini organes sur puce (« organ on chip »), il n’existe aucun modèle assez complexe pour mimer l’intégralité des interactions que nous évoquons dans notre étude. C’est pour l’ensemble de ces raisons que le modèle animal ne peut être remplacé par un modèle simplifié in vitro concernant la partie du projet qui évalue la pertinence de l’ajout d’un inhibiteur de la liaison récepteur/ligand à la chimiothérapie conventionnelle. La seconde partie du projet qui évalue la diminution de fonction du récepteur d’intérêt pour la liaison à son ligand sera menée partiellement in vitro. En effet, il est possible de modifier la fonction du récepteur des cellules leucémiques puis d’évaluer la capacité de liaison à son ligand in vitro. Malgré cette preuve de concept in vitro, l’utilisation du modèle animal ne pourra être intégralement remplacée puisque l’objectif ultime de cet axe est d’évaluer le rôle de cette interaction récepteur/ligand dans la capacité des cellules leucémiques à coloniser différent organes. Ainsi, seul le modèle animal permettra de juger de la migration des cellules leucémiques de la circulation sanguine vers la moelle osseuse.
Réduction
Afin de développer le modèle préclinique le plus pertinent possible, nous tiendrons compte de la diversité de la maladie retrouvée chez les patients et nous utiliserons trois patients représentatifs, sélectionnés parmi les centaines de profils de patients disponibles au laboratoire. Les résultats obtenus à partir de notre modèle devraient ainsi être transposables à un nombre important de patients, limitant ainsi le nombre de modèles précliniques à mettre au point. De plus, il a été montré que les cellules leucémiques extraites des fémurs et des vertèbres thoraciques sont strictement identiques. Nous prélèverons donc les cellules leucémiques de ces deux localisations sur chaque animal, pour réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de nos résultats.
Raffinement
Dans l’ensemble des procédures associées à cette demande, les animaux sont hébergés avec maximum six individus par cage. Selon les voies d’injections, elles seront pratiquées sous sédation ou non. L’application d’un anesthésique local sera utilisé pour limiter la douleur associée à la piqure. Les prélèvements de moelle osseuse seront effectués sous sédation associée à un analgésique pour limiter la douleur provoquée par le geste. Une seconde injection d’analgésique pourra-t-être administrée si les animaux présentent des signes de douleur après la durée d’action (4 heures) de la première dose. Les animaux seront surveillées quotidiennement pour détecter tout mal-être éventuel (prostration, pelage hirsute et tout autre signe comportemental). L’apparition de ces critères, notés selon une grille remplie par les animaliers ainsi que les expérimentateurs, permettra une prise de décision rapide quant à la mise en place de la stratégie à adopter pour arrêter la souffrance. Les points limites de chaque procédure ont été déterminés.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris immunodéficientes adultes que nous utilisons au laboratoire depuis de longues années, pour leur incapacité à rejeter la greffe de cellules d’une espèce étrangère, ici de cellules humaines. Outre l’absence de rejet, ce modèle est pertinent pour l’étude des cancers du sang puisqu’il est capable de récapituler l’expansion leucémique de patients dans un modèle vivant. Les cellules de patients interagissent alors avec l’ensemble des constituants cellulaires et moléculaires de l’animal au même titre qu’une cellule leucémique interagit avec son environnement chez le patient. L’utilisation d’un tel modèle permet également d’adresser une question majeure qui est celle de la diversité inter-individus pour une même maladie. En effet, le terme générique de « leucémie » intègre un ensemble de sous-groupes de leucémies. Au sein de chaque sous-groupe, il est également admis qu’il existe une multitude de sous-sous-groupes de la même pathologie. Ainsi, pour une même maladie, deux patients peuvent avoir une réponse totalement différente aux traitements. Contrairement aux modèles strictement murins dans lesquels se développent une leucémie murine, le modèle de transplantation de cellules humaines chez des souris immunodéficientes permet d’aborder la diversité inter-patients et ainsi devenir un modèle préclinique de référence. L’utilisation de souris immunodéficientes adultes permet l’étude de la maladie humaine dans un environnement murin bien défini/décrit et compris dans la littérature.
Etude d’effets physiologiques de l’administration d’une solution probiotique lactofermentée chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger, pour étudier l'effet d'un jus de fruit probiotique lactofermenté sur l'intestin. Elles reçoivent la solution par voie orale à la pipette après dix jours d'habituation, subissent des prélèvements de sang, de selles et d'urine, et passent des tests d'anxiété en champ ouvert, en labyrinthe en croix surélevé et en boîte clair-obscur. Le porteur vise à terme le développement d'aliments probiotiques "à effets dirigés" pour les humains, un bénéfice renvoyé au long terme. Sur le remplacement, il affirme que les organoïdes ne permettent qu'une étude cellulaire et que les prélèvements de tissu intestinal total ne sont "pas possibles chez l'homme".
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier l’impact de l’administration d’un jus de fruit probiotique lactofermenté sur la physiologie du microbiote et de l’intestin. Le projet a recours à un modèle de souris afin de permettre l’étude de la physiologie de l'intestin et du comportement. La physiologie des animaux sera étudiée à partir d’analyse des selles, des urines, du sang, et de prélèvements intestinaux, ainsi que sur un plan comportemental avec une batterie de tests pour évaluer leur état d’anxiété. Un maximum de 100 souris sera nécessaire pour une étude scientifique pertinente. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d’améliorer la connaissance sur l’impact de produits probiotiques alimentaires vivants sur la physiologie de la muqueuse intestinale. Les bénéfices seront à destination des humains, pour valider l’effet sur la santé d’une administration de probiotiques vivants. Les bénéfices à long terme consistent à développer des aliments probiotiques vivants à effets dirigés et connus dans un but de personnalisation.
Procédures
Des prélèvements de sang, de selles et d'urine seront réalisées au moment des manipulations des animaux (3 fois pendant la durée du protocole et espacés de 14 jours). Les tests comportementaux consistent a l'étude de l'anxiété d'exploration. L'ensemble des tests dure 40 minutes. L'animal dans une boite blanche pour étudier son déplacement, dans un labyrinthe en forme de croix, avec deux bras donnant sur le vide et deux bras protégés, et enfin dans une boite présentant une zone d'ombre et une zone fortement éclairée.
Impact sur les animaux
L’administration manuelle de la solution peut entrainer un stress chronique car répété. Cependant, la qualité sucrée de la solution peut aussi induire un conditionnement de l’animal, de plus une période d'habituation de 10 jours d'administration d'eau à la pipette sera réalisée avant le début de l'étude. Les tests comportementaux peuvent induire un stress temporaire le temps de la passation.
Devenir
A la fin de l'étude, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir recueillir le matériel biologique pour les études au laboratoire.
Remplacement
Notre projet nécessite l'utilisation d'animaux de laboratoire car il n'existe pas de techniques actuellement satisfaisantes pour étudier le retentissement à un niveau physiologique de l'administration de probiotiques (actuellement recours à des organoïdes permet seulement l'étude au niveau cellulaire voir tissulaire). L'étude nécessite des investigations sur des prélèvements non possible chez l’homme (tissu intestinal total, tissu cérébral). L'utilisation d'animaux permet de garantir une qualité scientifique optimale, en contrôlant a maxima les influences du milieu extérieur, ce qui est impossible chez l'homme.
Réduction
Le nombre d’animaux destiné au projet a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux pour le protocole a été réduit au minimum mais reste élevé du fait de la variabilité importante et inhérente aux analyses comportementales. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons. Du fait du faible nombre de données les analyses seront menées par des tests non paramétriques.
Raffinement
Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue lors de l’exposition à la solution sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Afin de limiter la souffrance lors de l’administration de la solution, celle-ci n’est pas faite par gavage mais par délivrance orale à la pipette lors d’une manœuvre de contention manuelle. Pour limiter le stress engendré par la contention manuelle et l'administratin à la pipette, une période d'habituation de 10 jours d'administration de 20µL d'eau à la pipette lors d'une manoeuvre de contention manuelle sera réalisée, de plus l'habituation permettra de prévenir un biasi d'administration du volume par salivation ou régurgitation. Les cages d’hébergements seront enrichies (nid et bâton à ronger). Dans le cas où les souris mâles viendraient à se battre, il est prévu de les isoler en cages individuelles.
Choix des espèces
La connaissance de la physiologie intestinale et immunologique de la souris est avancée. Elle répond aux compétences de l’animalerie où l’expérimentation va être menée. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. 1 lot d'animaux sera acheté à l’âge de 6 semaines, et sera utilisé dans le projet à l’âge de 8 semaines, ce lot correspond à l'âge adulte jeune, et permet d'étudier le retentissement physiologique sur un organisme pleinement fonctionnel. 1 lot d'animaux « âgés » de 48 semaines sera utilisé pour l’étude afin d’étudier l’impact des produits sur la physiologie des sujets âgés.