Procédures légères
Etude du rôle protecteur d’une protéine anticoagulante dans la drépanocytose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
425 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendues drépanocytaires, elles subissent des injections répétées sous anesthésie, des prélèvements de sang et, pour une partie, un passage en hypoxie de trois heures destiné à déclencher des crises vaso-occlusives douloureuses, avant prélèvement des organes. Le porteur décrit ces crises comme transitoires et prises en charge par un antidouleur puissant administré en prévention. Il affirme que la souris est "le seul modèle animal de drépanocytose actuellement disponible" et conclut à la nécessité d'un "organisme entier" pour étudier l'inflammation multi-organes.
Objectifs
L’un des projets de recherche de notre unité consiste à développer un nouveau traitement contre la drépanocytose, une maladie génétique du sang qui touche les globules rouges. Actuellement, cette maladie ne peut pas être guérie et elle se traite difficilement. Ceci souligne le besoin pour les patients de pouvoir bénéficier de nouveaux traitements plus efficaces, ou qui pourraient être utilisés en combinaison avec les médicaments déjà existants, pour augmenter leur efficacité. Les principales complications de cette maladie sont des crises appelées "vaso-occlusives" (CVOs), qui sont très douleureuses, durent plusieurs jours et nécessitent d'être soulagées en urgence, à l'hôpital. Malheureusement, la répétition de ces crises entraine ensuite des dommages sur les organes des patients, ce qui peut entrainer leur dysfonctionnement complet, et la mort du patient. Afin de traiter ou prévenir ces crises, et donc apporter un bénéfice thérapeutique important aux patients, nous nous proposons de montrer qu'une protéine contenue dans notre organisme joue un rôle protecteur important chez les patients. De plus, nous souhaitons également évaluer si cette protéine est importante pour limiter la mise en place de processus qui se mettent en place progressivement (notamment l'inflammation) et qui conduisent à des dysfonctions des organes chez ces patients. Si les résultats obtenus lors de ce présent projet sont positifs, nous sommes également en train de développer au laboratoire un médicament capable de stimuler spécifiquemenent cette protéine, et nous sommes déjà prêts à démarrer le développement clinique de cet éventuel futur médicament. La drépanocytose étant une maladie particulièrement complexe, nous devrons tester nos molécules chez des souris drépanocytaires, qui sont les seuls animaux disponibles qui reproduisent fidèlement la maladie chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous espérons montrer pour la première fois un effet protecteur dans la drépanocytose d'une protéine naturellement présente dans notre sang, ce qui permettrait de développer ensuite un futur médicament. Ceci est particulièrement important car la drépanocytose est une maladie grave qui se traite très difficilement, et les traitements de fonds actuels sont limités, ne sont pas complètement efficaces, et/ou présentent des effets indésirables.
Procédures
Une partie des souris utilisées dans le projet seront tatouées au niveau des phalanges et un petit bout d’oreille sera prélevé (sans anesthésie), 10 jours après leur naissance, puis elles seront ensuite laissées dans leurs cages jusqu'à leur accouplement ; après 2 gestations, les souris seront euthanasiées. Les souris issues de ces accouplements seront tatouées au niveau des phalanges et un petit bout d’oreille sera prélevé (sans anesthésie), 10 jours après leur naissance, puis elles seront laissées dans leurs cages jusqu'à l'âge de 8-10 semaines. Elles seront ensuite injectées (pendant une durée de 30 secondes), sous anesthésie locale, tous les jours pendant 4 jours. Après 5 jours, elles seront injectées (pendant une durée d’1 minute), sous anesthésie générale, et laissées dans leurs cages pendant 2 mois, puis seront prélevées sous anesthésie générale (durée d'1 minute). 1) Une partie de ces souris seront alors remises dans leurs cages pendant 1 mois, injectées 1 fois (pendant une durée d’1 minute), sous anesthésie générale, et placées (ou non) dans des conditions dans lesquelles l'oxygène de l'air sera diminué (de 21 à 8%), pendant 3 h, et enfin replacées à l'air ambiant pendant 1 h. 2) Une autre partie de ces souris seront remises dans leurs cages pendant 1 mois, et elles seront injectées 1 fois (pendant une durée d’1 minute), sous anesthésie générale, puis laissées pendant une durée de 3 h. 3) Une dernière partie de ces souris seront remises dans leurs cages pendant 7 mois et seront prélevées sous anesthésie générale (durée d’1 minute), tous les mois. 4) Toutes les souris seront finalement anesthésiées (anesthésie générale), le sang sera prélevé (durée d’1 minute), et les souris euthanasiées. Finalement, les organes (foie, rate, poumons, reins) seront prélevés.
Impact sur les animaux
Les souris rendues drépanocytaires développent une maladie similaire à la drépanocytose humaine, et pourront développer des "crises vaso-occlusives" (comme les patients), engendrant pendant quelques jours une douleur, une perte de poids, une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Ces crises sont transitoires, mais seront soulagées avec l'administration d'un anti-douleurs puissant. De même, quand nous induirons les crises vaso-occlusives chez les souris rendues drépanocytaires, ceci engendrera une douleur d'une durée au maximum égale à la durée de l'intervention (3-4 h), ainsi qu'une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Cette douleur sera prise en charge par administration préventive d'un anti-douleur puissant, avant le déclenchement de la crise. Chez des souris rendues drépanocytaires, des témoins de l’hémolyse, de l’activation de la coagulation et de l’inflammation se mettent à augmenter au cours du temps, et une inflammation dans les organes apparait généralement au bout de 7 mois. Toutefois, ceci ne s’accompagne pas de manifestations cliniques et de signes de douleurs/souffrance au cours de ces 7 mois, en dehors de la survenue possible de crises vaso-occlusives transitoires. Dans ce projet, d'autres nuisances sont attendues pour les souris rendues drépanocytaires ou non, et sont liées à la préhension/contention des animaux, à l'inconfort dû au tatouage des phalanges (non douloureux) et au prélèvement d'un tout petit bout de peau très fine au niveau de l'oreille, aux injections (introduction d'une aiguille sous anesthésie) et aux prélèvements de sang, ainsi qu’à la perfusion intracardiaque, au prélèvement d’organes, et au sacrifice (tous sous anesthésie) en fin de procédures.
Devenir
En fin d'expériences, les souris seront systématiquement euthanasiées car des analyses post-mortem sur le sang ou sur des organes seront nécessaires. Lors de la génération et l’élevage des souris utilisées pour le projet, certaines souris auront été génétiquement modifiées et ne pourront donc être ré-utilisées ou replacées, et seront donc euthanasiées.
Remplacement
Les crises vaso-occlusives (CVOs) chez les patients drépanocytaires sont très complexes. Les cellules constituant les vaisseaux sanguins, mais également de nombreux types de cellules sanguines différentes, sont impliquées dans les mécanismes qui déclenchent ces crises. Ce système complexe ne peut à l'heure actuelle être remplacé par des systèmes in vitro, étant données les interactions multiples qui existent entre toutes ces cellules. De même, l'implication d'une protéine sur le développement de l'inflammation qui se développe dans les organes au cours du temps ne peut être mis en évidence que sur un modèle animal permettant d'analyser en même temps l'inflammation dans plusieurs organes, dans le contexte d'un organisme entier. De plus, pour un organe donné, il est encore impossible de reproduire tous les processus conduisant à l'inflammation dans cet organe, dans le cadre de la drépanocytose. En effet, ces processus sont pour l'instant encore largement méconnus. La mise en évidence de l'importance d'une protéine dans les CVOs et l'inflammation des organes qui en résultent, nécessite donc le recours à un modèle animal de cette maladie, et la souris est le seul modèle animal de drépanocytose actuellement disponible.
Réduction
Lors de l’élevage des souris utilisées pour le projet, les accouplements réalisés permettront de ne générer que des souris qui auront des caractéristiques génétiques leur permettant d'être toutes effectivement utilisées pour notre projet. Aucune souris avec des caractéristiques génétiques ne leur permettant pas d'être utilisées dans notre projet ne sera générée. La multiplicité des procédures utilisées nous permettra d'optimiser au maximum les souris générées et de limiter toute génération de souris qui ne seront finalement pas utilisées. La procédure employée pour rendre des souris drépanocytaires par greffe de moelle sera optimisée grâce à des études en début de projet, ce qui permettra ensuite d'utiliser le minimum de souris drépanocytaires donneuses pour greffer un maximum de souris receveuses. Dans les procédures déclenchant des occlusions vasculaires chez les souris rendues drépanocytaires, il est prévu de prélever une quantité de sang suffisante pour pouvoir répéter les analyses sur le sang et le plasma, sans avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris. Dans nos expériences, le nombre de souris à utiliser pour obtenir des résultats robustes a été déterminé en nous basant sur des expériences similaires qui nous ont ensuite permis d’utiliser des logiciels de statistiques spécifiques pour estimer ce nombre.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, un enrichissement est prévu dans les cages. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, avec un nombre d’individus par cage compris entre 3 et 5 (pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une population trop importante). Les injections et prélèvement seront effectués sous anesthésie générale (ou parfois locales). Lors des interventions consistant à rendre drépanocytaires des souris, celles-ci pourront développer des crises vaso-occlusives (CVOs) (comme chez les patients), qui sont douloureuses. Ces animaux resteront donc sous la surveillance quotidienne de l'expérimentateur, et tout changement de comportement et d’apparence physique, ainsi que des signes de douleur, seront recherchés. Si ces changements et ces signes sont détectés, un médicament anti-douleur très puissant sera administré et les souris resteront sous la surveillance de l'expérimentateur. Si ces changements persistent, l’animal sera euthanasié et l’expérience sera interrompue pour cet animal. Lors des interventions consistant à déclencher des occlusions vasculaires chez les souris rendues drépanocytaires, celles-ci resteront continuellement sous la surveillance de l'expérimentateur, à la recherche de tout changement de comportement et d’apparence physique, ainsi que des signes de douleur, comme précédemment. Si ces changements et ces signes sont détectés, un médicament anti-douleur très puissant sera administré et les souris resteront sous la surveillance de l'expérimentateur. Si ces changements persistent, l’animal sera euthanasié et l’expérience sera interrompue pour cet animal. Surtout, un médicament anti-douleur très puissant sera administré aux souris, en prévention, avant de déclencher l'occlusion vasculaire. Cette surveillance très rapprochée sera également réalisée lorsque nous analyserons l'installation de l'inflammation dans les organes, et des témoins de cette inflammation seront mesurés tous les mois, pour détecter si note protéine d'intérêt joue un rôle précoce dans l'installation de cette inflammation. L'inflammation dans les organes a été choisie comme un témoin des dysfonctions d'organes qui apparaissent à des âges plus élevés, pour éviter que les souris rendues drépanocytaires dans notre projet arrivent à ce stade.
Choix des espèces
Seule cette espèce possède un modèle génétiquement modifié mimant la drépanocytose, et qui reproduit de façon fidèle les manifestations cliniques de la maladie. Des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines maximum seront utilisées en tout début d'intervention. Cet âge est également nécessaire pour atteindre la maturité sexuelle des souris, avant leur accouplement dans une partie de notre projet. Les souris rendues drépanocytaires seront étudiées jusqu'à 7 mois après avoir été rendues drépanocytaires, pour éviter qu'elles atteignent un stade où des dysfonctions d'organes se mettent en place.
Effet de la complémentation en citrulline sur la vascularisation placentaire et la croissance foetale chez des brebis soumises à un stress thermique en fin de gestation
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
28 brebis gestantes vont être utilisées, puis replacées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une complémentation en citrulline et deux prises de sang à la jugulaire pendant le dernier mois de gestation, une partie étant placée en stress thermique qui peut provoquer une hyperthermie, des difficultés respiratoires et un risque accru d'avortement ou de mise bas précoce. Le porteur relie le projet au "besoin" d'atténuer les effets du stress thermique sur la productivité du bétail, et affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour valider une approche nutritionnelle. Le raffinement décrit une récompense en granulés après chaque prélèvement et l'absence d'anesthésie locale jugée plus douloureuse que la prise de sang.
Objectifs
Dans un contexte global de changement climatique, les animaux d’élevage sont de plus en plus fréquemment exposés au stress thermique. Sachant que c’est l'un des déterminants environnementaux les plus importants de la productivité du bétail, de nombreuses études montrent que le stress thermique en fin de gestation peut compromettre la croissance du fœtus, affecter l'absorption postnatale des immunoglobulines du colostrum et avoir des actions à long terme qui se traduisent par une réduction de la production laitière lorsque l’animal devient adulte. Afin de réduire les effets du stress thermique, les animaux sont en général placés à l’ombre et rafraichis grâce à des ventilateurs et des arrosages automatiques, mais toutes ces approches ne sont pas sans conséquences en termes de risque sanitaire pour les animaux ou de consommation d’énergie. C’est pourquoi, d’autres approches, en particulier nutritionnelles, peuvent être envisagées. Sachant qu’il a été démontré chez le bovin que le retard de croissance intra-utérin observé chez les veaux pourrait correspondre à une altération de la vascularisation placentaire, nous avons choisi un acide aminé impliqué dans la synthèse locale d’oxyde nitrique (NO) pour améliorer la régulation vasculaire placentaire. De plus, le projet sera réalisé sur des ovins car les pratiques de dessaisonnement en élevage, induisent un stress thermique en fin de gestation lors de dessaisonnement des animaux pour la mise bas du mois de septembre. Ainsi, l’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet de la supplémentation en citrulline dans le dernier mois de gestation chez la brebis, dans des conditions de stress thermique ou non, sur la vascularisation et la fonction placentaires, le poids des agneaux à la naissance et leur croissance post-natale.
Bénéfices attendus
Validation d'une approche nutritionnelle pour atténuer les effets négatifs du stress thermique sur le placenta et le poids des animaux à la naissance
Procédures
Les animaux auront 2 prises de sang réparties de la manière suivante: une à 110 jours de gestation et une à 140 jours de gestation. Chaque prise de sang dure environ 20 secondes.
Impact sur les animaux
Il n’est pas attendus de conséquences néfastes à la prise alimentaire de Citrulline qui est un acide aminé favorisant la santé vasculaire. Il pourrait arriver en revanche une hyperthermie des lots mis en stress thermique avec des difficultés de régulation de température et de respiration dues au stade de fin de gestation, et un risque accru d’avortements ou de mise bas précoce. Un petit hématome peut dans de rare cas subvenir à la veine jugulaire après les prises de sang.
Devenir
Les animaux seront replacés à l’issue de la procédure.
Remplacement
Le recours à l'animal est indispensable puisque l'objectif du projet est de valider une approche nutritionnelle pour permettre d'atténuer l'effet du stress thermique sur la croissance foetale.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés (7 femelles par lots) a été rationalisé dans le but de ne pas utiliser plus d'animaux que nécessaire pour pouvoir mettre en évidence un effet après analyse statistique. La taille de nos effectifs permettra de réaliser des analyses statistiques qui dépendront de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests de comparaison de type ANOVA. Si les conditions ne permettent pas d’utiliser des tests paramétriques, alors nous utiliserons des tests non paramétriques pour comparer les lots expérimentaux. Pour cette configuration, on réalisera le test de Mann et Whitney ainsi que le test de permutation pour mesures indépendantes via le logiciel R.
Raffinement
Les brebis étant des animaux grégaires, elles seront toujours manipulées par lot. Elles seront hébergées sur aire paillée et la contention des brebis pour le prélèvement sanguin se fera dans un espace réduit entre des claies. La cellule sera enrichie avec des miroirs et des filets de foin suspendus. Les prélèvements de sang par ponction à la veine jugulaire, seront réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. La présence récurrente des expérimentateurs en interaction positive en dehors de la procédure (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du stress face à la contention. Après chaque prélèvement et chaque échographie, les animaux recevront une récompense sous forme de granulés. Lors de la prise de sang, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général (pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité) ; il ne sera pas fait d’anesthésie locale qui s'avèrerait plus douloureuse que la prise de sang, et augmenterait le risque d’hématome. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera ensuite assurée dans le cadre du suivi de la mise à la reproduction. En cas d’apparition de symptômes, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Les ovins ont été choisis car c'est une espèce soumise au stress thermique en fin de gestaion lors de désaisonnement des animaux pour une mise bas en septembre. Les animaux utilisés sont en fin de gestation car l'objectif est d'évaluer l'effet de la supplémentation en citrulline dans le dernier mois de gestation sur la vascularisation placentaire et le poids des agneaux à la naissance, dans des conditions de stress thermique.
Etude du rôle de l’intestin contre les infections aux Escherichia Coli adhérentes et invasives chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
3000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à modéré. Elles subissent gavages et injections répétés puis une infection par des Escherichia coli associées à la maladie de Crohn, qui provoque douleur intestinale et perte de poids. Le porteur indique que seuls les mâles sont utilisés et que les femelles et le surplus d'élevage sont tués, l'ensemble des souris étant tué pour prélever les organes. Il affirme que la complexité des interactions entre pathogène, hôte et microbiote justifie le recours à l'animal, tout en reconnaissant avoir mené des tests in vitro sur l'effet du fer et du fucose.
Objectifs
La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire chronique de la paroi intestinale. Cette maladie s’accompagne d’infection par de nombreux pathogènes du microbiote dont les bactéries adhérente, invasive Escherichia Coli. Cependant, les facteurs déclenchant la virulence et l’effet délétère de ces pathogènes n’est toujours pas connu. Il est connu que le fer et le fucose sont des facteurs de virulences pour ces bactéries adhérente, invasive Escherichia Coli. Or ces deux nutriments sont essentiels pour l’Homme et sont absorbé au niveau intestinal, lieu de colonisation de ces bactéries pathogènes. L’objectif de ce projet est de déterminer si une mauvaise prise en charge du fer et du fucose par l’hôte contribuerait à la virulence des bactéries adhérente, invasive Escherichia Coli.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est la compréhension des mécanismes de compétitions nutritionnelle pour le fer et le fucose entre les pathogène et l’hôte et dans un plus long terme proposer une solution nutritionnelle pour les patients atteints de la maladie de Crohn afin de limiter le développement des pathogènes intestinaux.
Procédures
Sur animaux vigiles : identification et génotypage (10 secondes) + une à 2 contentions de 20 secondes pour le gavage/jour (maximum 2 gavages par jour et 5 gavages au total) + Contention pour injection en sous-cutanée (15 secondes par souris (contention + injection)). Sur animaux anesthésiés : Prélèvement sanguin (30 secondes par souris)
Impact sur les animaux
L’ingestion des bactéries Escherichia coli pathogène est nocif pour la souris car induit une douleur intestinale chez la souris ainsi qu’une perte de poids. De plus, les souris subiront un stress lors de de l’injection d’analgésique, de la contention et du gavage.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour des analyses concernant les procédures d'infection. Pour les animaux générés lors de l'élevage et qui ne peuvent être inclu dans les procédures d'infection, ils seront mises à mort. En effet, dans ce projet, seul les mâles seront utilisées.
Remplacement
Les modèles animaux sont développés ici dans le but d'obtenir des modèles pathologiques d'infection. Les processus d'infections sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux acteurs : le pathogène, l'hôte et son microbiote qui communiquent entre eux. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, des tests in vitro montrant l’influence du fer et du fucose sur les bactéries adhérentes, invasives Escherichia Coli ont été effectués.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par différents tests statitiques adaptés aux comparaisons effectuées. De plus, nous effectuons une étude pilote qui permet de déterminer la cinétique et la dose de fucose à utiliser, elle permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les gestes techniques réalisés sont maitrisés par notre équipe. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Le raffinement comprend l’utilisation d’antalgiques en cas de souffrance. Il comprend aussi l’utilisation d’anesthésiques (avant prélèvement sanguin) et d’analgésiques (30 minutes avant le prélèvement sanguin). De plus, pour les gavages des souris, nous utiliserons des canules adaptées à l'âge et à la physiologie de la souris (en inox). L'application des points limites établis pour chaque procédure de ce projet sera effectué. Les souris seront suivies et scorées tous le long des procédures. Les souris sont hébergés dans un environnement avec accès à la nourriture et l'eau ad libitum ainsi qu'un milieu enrichie (maison, coton pour nidification).
Choix des espèces
La souris (Mus muculus) est un modèle de choix pour les études des interactions hôte-pathogènes. Seule cette espèce possède des modèles où les gènes d'intérêts peuvent être suppriumé permettant l’étude de ce gène au cours de l'infection. De plus ce modèle d’infection est représentatif de la physiopathologie chez l’homme et récapitule ce qui est montré chez les patients atteints de la maladie de Crohn. Les souris utilisées seront âgées de 8-10 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal mature sans impact du sevrage au niveau du microbiote et du contenu en nutriment dans la lumière intestinale.
Les cellules ganglionnaires intrinsèquement photosensibles de la rétine (ipRGCs) et l’agressivité : effet direct de la lumière bleue ?
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 22
Autres rongeurs : 65
843 rongeurs, souris, rats et rats africains, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Ils subissent des tests d'agressivité où les affrontements provoquent morsures et griffures, des injections dans l'œil sous anesthésie, une chirurgie du crâne et des injections quotidiennes pendant trois semaines, pour tester un effet direct de la lumière bleue sur le comportement agressif. Le porteur indique que la lumière peut modifier l'anxiété et l'agressivité et que les injections répétées causent inflammation, douleur et perte de poids, les animaux étant tués pour prélever le cerveau. Il présente le rat africain comme un modèle diurne "plus représentatif de l'humain" et justifie l'usage d'animaux par l'absence de logiciel reproduisant fidèlement le cerveau.
Objectifs
La lumière influence en profondeur la physiologie et les comportements des organismes vivants. Chez les mammifères, en plus de permettre la vision, la lumière influence de nombreuses fonctions biologiques via des cellules spécifiques sensibles à la lumière, localisées dans la rétine et activées par la lumière bleue: il s’agit des cellules mélanopsinergiques. Les cellules mélanopsinergiques projettent dans différentes régions du cerveau et permettent la régulation par la lumière de la physiologie et du comportement selon 2 mécanismes principaux : 1, la synchronisation de l’ensemble des fonctions biologiques avec le cycle jour/nuit, un effet qui implique l’horloge biologique centrale . 2, des effets directs sur de nombreux comportements via la projection des cellules mélanopsinergiques vers d’autres parties du cerveau. La société moderne vit sous une illumination quasi-permanente, en particulier à la lumière bleue (LED, smartphones, écrans d’ordinateurs). Il est connu que l’exposition excessive à ces lumières enrichies en bleu, en particulier en fin de période d’activité (soirée), peut provoquer des troubles des rythmes biologiques du sommeil, et divers effets comportementaux associés, notamment une augmentation de l’agressivité. Dans ce projet nous posons la question suivante : est-ce que la lumière bleue peut exercer un effet direct sur le comportement agressif, indépendamment d’une altération des rythmes biologiques? En effet, les projections des cellules mélanopsinergiques atteignent notamment les structures du cerveau impliquées dans le contrôle de l’agressivité. Les objectifs du projet sont 1) de caractériser les effets de la lumière bleue sur le comportement agressif chez des modèles animaux 2) identifier les populations cellulaires du cerveau impliquées dans cet effet de la lumière bleue et 3) comprendre le rôle de structures spécifiques contrôlant l’agressivité dans ces effets sur le comportement agressif. Afin d’exclure un effet mettant en jeu l’horloge biologique centrale, l’exposition à la lumière bleue aura lieu spécifiquement à des créneaux de jour, auxquels elle ne peut pas entrainer de décalage de cette horloge.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de générer de nouvelles connaissances sur les effets de la lumière bleue sur le comportement agressif. Ces connaissances pourraient permettre d’élaborer de nouvelles stratégies vis-à-vis de l’éclairage/exposition à la lumière (intensité et spectre) dans les animaleries, afin de susciter au minimum les comportements agressifs. Les résultats obtenus seront aussi informatifs quant aux potentielles nuisances (facilitation d’un comportement agressif) induites par l’éclairage à dominante bleue chez l’humain. Ceci pourrait permettre de définir de nouvelles normes d’exposition lumineuse (environnements collectifs, agressivité pathologique) afin de diminuer l’expression des comportements hostiles. Enfin, en plus de renforcer les connaissances actuelles sur le comportement agressif de la souris, ce projet permettra aussi d’obtenir des informations sur le comportement d‘un modèle peu connu à ce jour le rat africain. Ce dernier pourrait donc représenter un modèle d’agressivité ainsi qu’un modèle des effets de la lumière bleue sur la physiologie et le comportement, plus représentatif de l’humain que le modèle de souris.
Procédures
Un groupe d’animaux est soumis à un examen de l’œil d’une durée de 20 minutes. Un mois plus tard il sera soumis à trois tests comportementaux d’une durée de 1 à 5 minutes. Les animaux seront ensuite soumis à un nouvel examen de l’œil. Deux semaines plus tard ils recevront une injection dans l’abdomen d’une molécule qui empêche les effets de la lumière bleue sur l’organisme (durée injection 30 secondes). Ensuite ils seront soumis à un test comportemental d’une durée comprise entre 1 et 5 minutes. Un groupe d’animaux recevra une injection dans l’œil sous anesthésie locale et générale. Un autre groupe subit une chirurgie du crâne d’environ 45 minutes. Après 2 semaines de repos les animaux reçoivent une injection journalière dans l’abdomen pendant 3 semaines. A l’issue ils seront soumis à un test comportemental d’une durée de 1 à 5 minutes. Avenant: Les tests comportementaux seront répétés 3 fois maximum avec un intervalle de 10 jours entre les tests afin de laisser l’animal se reposer. Avenant : les animaux de la lignée Maoa KO subissent un prélevement de la queue environ 6 jours après la naissance entrainant une douleur légère et temporaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances suivantes sont attendues : 1) l’impact de la lumière bleue peut changer le niveau d’anxiété et d’agressivité des animaux ce qui est l’objet de la question posée. 2) les tests comportementaux peuvent induire un stress ainsi que des blessures liées aux affrontements lors d’un des tests (plaies dues aux morsures et griffures). 3) les animaux sont soumis à différentes injections causant des désagréments communs (inflammation, douleurs, stress, risque infectieux, anxiété, perte de poids) ou spécifiques.
Devenir
Les animaux sont mis à mort afin de récupérer leurs cerveaux qui serviront pour analyse.
Remplacement
La première partie de projet consiste à obtenir des informations sur le comportement des animaux en réponse à une lumière bleue. Il n’existe pas de moyens de s’affranchir de l’utilisation d’animaux pour obtenir une réponse comportementale. Les deuxièmes et troisièmes parties consistent à obtenir des informations sur la chimie et le fonctionnement du cerveau animal. Or à l’heure actuelle aucun moyen alternatif (ex : logiciels informatiques) ne permet de représenter assez fidèlement le cerveau animal pour obtenir de telles informations.
Réduction
Une approche statistique a été utilisée pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats fiables et robustes. Ce nombre est également appuyé par des études précédentes.
Raffinement
Les animaux ont à leur disposition du matériel pour pouvoir nidifier et ronger. Un tunnel en plexiglas est également ajouté à la cage. L’hébergement des animaux est optimisé afin de diminuer les affrontements au sein d’une cage. Les animaux isolés physiquement peuvent néanmoins se voir, s’entendre et se sentir. Avant chaque procédure les animaux participent à un entrainement afin de les habituer au contact avec l’humain et à la procédure. Toute procédure invasive potentiellement douloureuse est réalisée sous traitement antidouleur. L’'état général de l'animal ainsi que celui de chaque œil seront vérifiés quotidiennement et la souffrance éventuelle entrainée par les procédures est évaluée grâce au comportement et à l’aspect physique des animaux. En cas de souffrance, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et un traitement requis mis en place. Des points limites onté été établis permettant l'arrêt des procédures et ainsi réduire la souffra,ce animal. Une étude préliminaire est mise en place afin d’optimiser les données obtenues tout en minimisant l’impact sur les animaux.
Choix des espèces
Afin d’observer des réponses comportementales et des effets de la lumière sur l’œil et le cerveau il est indispensable d’utiliser des animaux. La connaissance approfondie de la génétique de la souris permet l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Cela donne accès à des outils indispensables pour l’étude des fonctions des structures du cerveau impliquées dans le comportement agressif. Le rat africain est un modèle animal diurne correspondant au mode d’activité de l’humain. Il possède également une rétine dont la composition est proche de la rétine humaine. Des informations comportementales complémentaires pertinentes pour l’humain seront alors collectées. L’agressivité des rongeurs semble décliner avec l’âge a l’instar des capacités motrices. Pour ces raisons nous avons choisi de jeunes adultes (2-4 mois). Cela permet d’utiliser des individus avec un comportement agressif encore développé. Nous utilisons également une tranche d’âge resserrée afin de s’affranchir des trop fortes variations d’agressivité liées l’âge.
Quantification du rôle de la barrière cutanée dans l’adaptation à l’aridité chez les lézards Lacertidae
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
200 lézards de dix espèces sauvages vont être capturés puis utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avant d'être relâchés à leur point de capture. Seuls des mâles sont capturés sur le terrain, gardés cinq à sept jours et soumis à des mesures répétées de pertes en eau cutanée et à des mesures morphologiques, pour relier la topographie des écailles à l'adaptation à l'aridité. Le porteur indique que les nuisances tiennent surtout au stress de la capture, du transport et des contentions, qu'il déclare réversible. Il justifie le recours à des animaux sauvages par l'absence d'élevage de ces espèces et affirme que les collections de muséum ne permettent pas de mesurer les pertes hydriques.
Objectifs
Les variations spatiales de la disponibilité en eau et des conditions thermiques dans l'environnement favorisent l'évolution de tactiques spécifiques de conservation de l'eau et d'optimisation de son utilisation pour les besoins métaboliques. Chez les animaux ectothermes terrestres, la balance hydrique dépend de l'équilibre entre l'apport d'eau par l'alimentation et la consommation d'eau de pluie, d'eau stagnante ou d'humidité, la production d'eau métabolique et la perte d'eau par évaporation respiratoire, ainsi que la perte d'eau par évaporation cutanée, oculaire ou cloacale (perte d'eau cutanée). La perte d'eau cutanée est par ailleurs un élément prépondérant dans la perte évaporative totale. Ainsi, les adaptations à l’aridité chez ces organismes devraient impliquer des mécanismes de réduction des pertes hydriques cutanées et/ou respiratoires, ainsi que des modifications du métabolisme basal. Des adaptations structurelles du tégument semblent minimiser la perte d'eau et maximiser la locomotion et la résistance à la déshydratation chez les reptiles, dont la résistance cutanée à la perte d'eau dépend de l'épaisseur de la peau, des lipides de la couche cornée et de la couverture de la surface par les écailles. À ce jour, il n'existe aucune étude liant la caractérisation de la diversité interspécifique des pertes hydriques cutanées avec des mesures topographiques des écailles chez les reptiles. De fait, nous proposons ici d'analyser et de mesurer conjointement les pertes hydriques totales et cutanées et la topographie des écailles associées sur des lézards de différentes espèces de Lacertidae. En utilisant des espèces venant de milieux contrastés, nous pourrons ainsi mieux comprendre les mécanismes de résistance aux contraintes hydriques le long des gradients d'aridité et identifier les caractères et les espèces les plus sensibles à l'altération des conditions climatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de faire progresser la compréhension du rôle de la peau dans les adaptations aux contraintes hydriques le long des gradients d'aridité. Des premières études chez les reptiles montrent une relation négative entre les pertes hydriques totales et la température de l’environnement, et quelques travaux ont mis en évidence des relations entre l'aridité et la topographie des écailles, mais aucune étude n'a encore fait le lien entre les pertes hydriques cutanées et la topographie des écailles dans un contexte comparatif. Après l'achèvement de ce projet, ces données pourront être utilisées pour effectuer des modèles prédictifs afin d'étudier l'influence des variations climatiques futures sur la distribution de ces espèces. Enfin, ce projet va également fournir des données uniques sur une dizaine d'espèces de lézards, ce qui permettra de mieux comprendre l'écophysiologie hydrique comparative de ces espèces, certaines pouvant occuper des régions très arides.
Procédures
Nos protocoles impliqueront des captures sur le terrain, le transport des animaux et des mesures morphologiques (3 séries de mesure de 30 secondes le jour de la capture ou le lendemain), une acclimatation pendant 1 ou 2 journées, des mesures de perte hydriques cutanées (6 mesures successives de 3-4 minutes pendant une journée) et des mesures de pertes de pertes hydriques totales au repos (1 mesure pendant la nuit avec deux pesées avant et après le protocole) en cumulatif sur chaque individu de chaque espèce et chaque population du projet. Après 2 à 4 journées d'acclimatation et de surveillance, les animaux seront relâchés sur leur site de capture
Impact sur les animaux
Les mesures sont faiblement invasives et les nuisances seront essentiellement liées au stress de la capture et du transport et aux contentions. Les mesures répétées induisent un stress léger pour les animaux principalement du fait des contentions et du cumul des actes. Le stress induit par la contention est parfaitement réversible et n'entraîne pas de conséquences à long terme. Par ailleurs, le stress lié à l'hébergement sera réduit car les animaux seront gardés au maximum 5-7 jours en captivité puis relâchés.
Devenir
Tous les animaux seront relaché à l’endroit exacte de la capture. Les mesures effectuées comportent une part de stress; cependant, elles ne produisent aucune séquelle durable pour les animaux qui seront tous gardés en vie.
Remplacement
L'objectif de l'étude est de comprendre les adaptations physiologiques des lézards sauvages dans leurs environnements naturels. Nous ne disposons pas d'élevage de ces espèces et les collections de Muséum ne permettent pas de faire des mesures de pertes hydriques. Les animaux vivants capturés sur le terrain ne peuvent donc être remplacés par un équivalent cellulaire ou in silico ni par des individus élevés en captivité pour ce projet.
Réduction
Afin de garantir la puissance statistique de l'étude tout en réduisant l’effectif de l’étude, nous proposons d’échantillonner entre 1 et 2 populations de chaque espèce le long d'un gradient d'aridité de l'habitat entre les 10 espèces (depuis des espèces de milieux continentaux humides jusqu’à des espèces de milieux arides) et en capturant un nombre limité mais homogène de mâles dans chaque population (10 adultes). En matière d'analyse, cela impliquera une analyse de variance avec 10 espèces x 2 populations x 10 individus soit 200 individus.
Raffinement
Les individus maintenus en captivité seront acclimatés avant les mesures puis suivis quotidiennement. Les conditions d'hébergement seront enrichies (présence d’abris et de substrat) en suivant les recommandations zootechniques pour l'espèce. Nous nous appuierons sur un suivi journalier et scoré des individus pour quantifier plusieurs paramètres. Les comportements des animaux seront contrôlés visuellement chaque jour pour détecter l'apparition de comportements anormaux tels que prostration, léthargie, ou agitation. La masse corporelle sera suivie régulièrement (tous les 2 jours) afin de détecter toute perte soudaine de masse. Après les mesures, l’animal sera surveillé pendant 2-4 jours puis replacé dans son habitat naturel au point de capture.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont le lézard des souches (Lacerta agilis), le lézard des murailles (Podarcis muralis), le lézard vivipare (Zootoca vivipara), le lézard vert (Lacerta bilineata), le lézard ocellé, (Timon lepidus), le lézard de Bonnal (Iberolacerta bonnali), le lézard catalan (Podarcis liolepis), le lézard de Bédriaga (Archaelacerta bedriagae), l’Algyroïde de Fitzinger (Algydroides fitzingeri) et le lézard tyrrhénien (Podarcis tiliguerta). Ces espèces font partie de la famille des Lacertidae qui dispose d’une phylogénie complète et récente et est distribuée en Eurasie et en Afrique. Elle représente 360 espèces répartie dans 30 genres différents distribués sur un gradient d’aridité et dans une grande diversité d’habitats. Cette famille comprend de nombreuses espèces menacées d’extinction en Europe et à valeur symbolique et écologique forte. Ce projet visera à quantifier le rôle de la peau dans l'adapation à l’aridité et pour aider à identifier les epsèces les plus sensible au réchauffement climatique. Dans ce projet, uniquement des mâles sexuellement matures vont être mesurés afin de limiter la variabilité de taille, de statut physiologique et de cycle reproducteur entre individus pouvant influencer les pertes hydriques cutanées.
Impact d’une exposition aux nanoparticules de dioxyde de titane sur le développement et le fonctionnement des réseaux respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
1080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des mères gestantes ingèrent des nanoparticules de dioxyde de titane mêlées à de la pâte chocolatée, et l'activité respiratoire des nouveau-nés est mesurée sans intervention pendant onze jours, pour évaluer l'effet d'une exposition périnatale sur les réseaux respiratoires. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable majeur, seulement une légère hausse transitoire de la fréquence respiratoire des petits. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit "la complexité d'un organisme entier" et justifie l'essai par la définition de valeurs limites d'exposition pour l'humain.
Objectifs
Au cours de ces dernières années, le domaine de la nanotechnologie et des nanoparticules a subi une croissance fulgurante. Les propriétés uniques des nanoparticules ont permis de très nombreuses avancées dans les domaines technologiques (informatique, électronique), agroalimentaire, cosmétique ou encore médical. Cependant, du fait de leur taille extrêmement réduite (
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux appréhender les risques, durant la période périnatale, d’une exposition chronique aux nanoparticules de métal, telles que celles présentent dans l’alimentation ou certains produits tels que les médicaments ou encore le dentifrice. Ces travaux sont nécessaires afin de définir des valeurs limites d’exposition pour l’humain et identifier les conséquences de ce type d’exposition sur la mise en place et le fonctionnement des réseaux neuronaux vitaux tels que les centres respiratoires.
Procédures
Les expérimentations auront lieu essentiellement suite à la mise à mort des animaux, ou sur animal vigile qui ne subiront pas d'intervention (mesure de l'activité respiratoire de manière non invasive), durant 5 minutes, de manière quotidienne sur 11 jours. Des groupes d'animaux auront une alimentation normale à laquelle sera ajoutée une dose de pâte chocolatée seule ou associée à des nanoparticules de dioxyde de titane.
Impact sur les animaux
Nous n’attendons pas d’effets indésirables majeurs. Les animaux (mères et petits) ne montrent pas de déficit fonctionnel majeurs. Il n’y a pas de surmortalité des petits, pas de modification de leur développement (poids corporel, taille). Il est attendu une légère augmentation de la fréquence respiratoire des petits mais sans conséquence sur leur bien-être. Cette modification de la fréquence respiratoire ayant disparu au 7ème jour post-natal.
Devenir
Mise à mort
Remplacement
Il n’y a au jour d’aujourd’hui aucunes méthodes alternatives nous permettant d’aborder notre projet sans passer par l’étude de modèles animaux, que ce soit les approches in vitro, ou in silico, qui ne peuvent pas reproduire, ou modéliser la complexité d’un organisme entier. Néanmoins afin de remplacer au maximum l’utilisation d’animaux, nous utilisons un modèle informatique pour prédire la distribution des nanoparticules de dioxyde de titane dans les différents organes.
Réduction
Les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux n'excèdera pas 12 animaux, c'est à dire le nombre d'échantillon permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine lors de l’étude de l’activité respiratoire chez le nouveau-né. Par ailleurs afin de limiter le nombre d'animaux que nous serons amenés à utiliser, une banque de tissus (cerveau + moelle épinière) sera constituée afin de pouvoir mener ultérieurement des analyses immunohistochimiques complémentaires sans devoir sacrifier d'animaux supplémentaires.
Raffinement
Les animaux sont placés dans des cages adaptées par deux ou trois afin de maintenir la vie en collectivité dans un milieu enrichi (papier, abris). Les animaux engagés dans cette procédure seront habitués aux dispositifs expérimentaux autant que possible. Les animaux néonataux seront testés dans un environnement chauffé (lampe chauffante) pour prévenir les chutes de température et seront immédiatement remis à leur mère après l'expérimentation. Les procédures mises en place suivent également les normes en matière de raffinement des pratiques expérimentales, par exemple en utilisant une méthode volontaire per os de prise de nanoparticules, celle-ci se substituant aux méthodes "classiques" d'injections pouvant, quand elles sont réalisées sur le long court entrainer stress ou mal-être chez l'animal. En outre, nous utilisons une méthode de mesure de l'activité respiratoire in vivo non stressante et non invasive, où l'animal est placé dans une chambre d'enregistrement. Cette méthode est substituée aux méthodes classiques utilisant un masque, évitant ainsi une situation pouvant induire mal-être et stress chez l'animal.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental est motivé par le fait que la souris est un animal docile, facile à manipuler, ayant une bonne qualité maternelle, et résistant aux infections d'une façon générale, ce qui est un plus certain pour la réalisation de projets tels que le notre associé à un aspect développemental. En outre, nous disposons aujourd’hui d’un nombre conséquent de données sur ce modèle, ce qui justifie nos travaux sur ce modèle animal. Ce projet vise à étudier les conséquences de l'administration de nanoparticules sur le développement embryonnaire et ses conséquences post-natales. Les animaux exposés (femelles) le seront dès le début de la gestation jusqu'à la fin de celle-ci. L’étude se portera donc aux stades néonataux et embryonnaire puisqu’elle vise à étudier la mise en place des réseaux respiratoires.
Détermination de l’efficacité d’un antiparasitaire externe contre les tiques chez le chien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
18 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis replacés dans la colonie de l'établissement pour une étude ultérieure. Chaque chien est infesté avec 100 tiques à cinq reprises, les tiques restant fixées 48 heures avant retrait, pour mesurer l'efficacité d'un antiparasitaire en vue d'une autorisation de mise sur le marché. Le porteur indique que l'infestation reste trop brève pour provoquer une anémie et qu'une réaction allergique aux morsures pourrait survenir, traitée à la cortisone. Il présente le recours au chien comme obligatoire, l'espèce cible étant le chien dans une étude réglementaire.
Objectifs
Le développement d'antiparasitaires externes ayant pour but de protéger les chiens contre les insectes piqueurs et les tiques est nécessaire. En effet leur utilisation est la seule manière de prévenir la transmission de maladies graves pouvant être mortelles pour l'animal et dont certaines peuvent être transmissibles à l'Homme. La lutte et la prévention passe par l'utilisation de produits insecticides ou acaricides qui repoussent le parasite, ou le tuent après piqûre ou fixation. Afin d'obtenir une autorisation de mise sur le marché d'un nouveau médicament vétérinaire, la détermination de l'efficacité chez l'espèce cible, ici le chien, est obligatoire.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de confirmer l'efficacité d'un nouvel antiparasitaire externe chez le chien contre les tiques qui aura une efficacité de 3 mois.
Procédures
Les chiens seront infestés avec 100 tiques au total 5 fois pour une durée maximale de 4 jours. L'infestation pourra se faire sur animal sédaté afin de faciliter la pénétration des tiques dans le pelage. L'infestation correspond à la mise en place des tiques sur le pelage est prend environ 20 min par animal. Une fois les tiques fixées, elles seront retirées 48 heures après. Les chiens recevront un examen clinique complet au total 5 fois au cours de l'étude. Chaque examen prend en moyenne 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les chiens seront infestés avec 100 tiques chacun. La présence de tiques ne génère généralement pas de démangeaisons chez l'animal, contrairement à la présence de puces. Les tiques sont des parasites qui se nourrissent de sang: une infestation massive sur une longue période (plusieurs semaines) peut engendrer de l'anémie. Cependant les tiques ne seront laissées que 48 heures sur chaque animal ce qui n'est pas suffisant pour engendrer une perte de sang importante et donc être délétère pour l'animal.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés seront replacés dans la colonie de l'établissement utilisateur. Ils seront utilisés pour une étude ultérieure après un temps de pause adapté.
Remplacement
Cette étude est une étude réglementaire nécessitant le recours à l'animal cible, ici le chien.
Réduction
Le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe et permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables est de 6 pour une étude réglementaire d'un mois d'après les lignes guide de l'Agence Européenne du Médicament (EMEA) et de l'association mondiale pour la parasitologie vétérinaire (WAAVP: World Advancement for Animal Veterinary Parasitology). En raison de la durée de l'étude ( 3 mois), 2 animaux par groupe seront ajoutés, dans le cas où des animaux devraient être sortis de l'étude.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés aux conditions de l’étude pour une durée minimale de 15 jours avant la première infestation par les tiques. Les locaux d’hébergement climatisés toute l’année seront les mêmes que ceux de l'expérimentation, les animaux pourront simplement être changés de box pour faciliter le déroulé de l’étude. Les chiens seront logés à 2 pour 2 boxes communicant entre eux et un contact visuel et olfactif sera maintenu entre tous les chiens de l'étude. Au cours de cette période, des actions de renforcement positif seront mises en place en amenant régulièrement chaque animal dans la salle où seront réalisés les différents actes (examens cliniques, pesée, infestation par les tiques et comptage), en le laissant au minimum 5 minutes sur la table d’examen, au cours desquels il sera peigné par le manipulateur qui lui parlera afin de l'habituer au retrait des tiques, puis avant de quitter la salle, quelques croquettes lui seront données. Par ailleurs, cette salle est connue des chiens de l’Etablissement Utilisateur (EU), car ils y sont régulièrement manipulés pour des actes non invasifs : peignage, coupe de griffes ; il ne s’agira donc pas pour eux d’un lieu « nouveau ». Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’étude, et en cas d’observation anormale, le vétérinaire sanitaire de l’EU sera immédiatement averti. Les personnes en charge des soins quotidiens des chiens, et donc connues par ces derniers réaliseront l’habituation pendant la période d’acclimatation, la contention lors de chaque infestation par les tiques, puis les comptages et retraits de tiques. Une sédation pourra être réalisée lors de l'infestation par les tiques, en fonction de la docilité de l'animal, afin également de réduire la gène liée au déplacement des tiques en attendant leur attachement à la peau (ce qui prend en moyenne 15-20 min). Un examen clinique complet et une pesée seront réalisées pendant la période d'acclimatation, et avant chaque infestation. Un examen clinique prend en moyenne 10 minutes. Le principal point limite considéré ici serait une réaction de type allergique aux morsures de tiques qui pourrait se manifester par des rougeurs cutanées, des démangeaisons et une chute locale de poils. Si ce type de réaction est observé, l'animal recevra un traitement à base de cortisone afin de soulager les démangeaisons pour la durée de la présence des tiques dans le pelage. Si aucune amélioration n'est observée, le retrait de l'animal sera envisagé.
Choix des espèces
Le chien est la cible du produit testé; ainsi il doit être utilisé lors de cette étude clinique réglementaire. Des chiens adultes seront utilisés: ils seront la cible du produit testé suite à sa commercialisation.
Régulation de l’homéostasie intestinale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
117 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées et, pour une partie, une fenêtre d'observation implantée dans l'abdomen suivie de séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie. Le porteur indique que la pose de la fenêtre et la perte de perméabilité intestinale peuvent provoquer douleur, perte de poids, diarrhée et déshydratation, toutes les souris étant tuées pour analyses. Il présente les retombées, sur le syndrome du côlon irritable ou la maladie cœliaque, comme des applications potentielles à long terme d'une recherche avant tout fondamentale.
Objectifs
L’intestin joue un rôle essentiel dans l’absorption des nutriments qui proviennent de notre alimentation. Aussi, du fait de son contact direct avec l’environnement, il est susceptible d’être soumis à des attaques bactériennes et biochimiques qui peuvent compromettre l’étanchéité de la barrière intestinale. Cette barrière est formée par une unique couche de cellules, cellules épithéliales, qui tapissent l’intestin. Pour maintenir l'intégrité du tissu, l'ensemble de l'épithélium est remplacé en 3 à 5 jours (chez la souris). Ce renouvellement est permis par la division des cellules souches qui se trouvent dans des invaginations du tissus appelées cryptes. À la sortie des cryptes, les cellules se différencient en cellules épithéliales (sécrétoires, absorbantes, et entéroendocrines). L’intestin est un bon modèle d’étude de la migration cellulaire car les cellules différenciées vont ensuite migrer pour enfin être éliminées dans la lumière intestinale. L’objectif général est de comprendre les processus physiologiques au niveau du tractus gastro-intestinal.
Bénéfices attendus
Nous pensons identifier un nouveau mode de régulation du colon. Nous prévoyons aussi que notre projet contribue à expliquer comment la barrière intestinale est maintenue intacte. En général, notre étude sera bénéfique pour la communauté scientifique intéressée par l’intestin. Les avantages à long terme seront de mieux comprendre comment l’intégrité de la barrière intestinale est maintenue, avec des potentielles applications pour des pathologies comme le syndrome du côlon irritable ou la maladie cœliaque.
Procédures
Une premier lot d’animaux recevra une injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 1 à 5 jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Alternativement, de 2 h jusqu’à 72 h avant la mise à mort, les souris recevront une unique injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen (durée du geste inférieure à 10 sec) Dans un second lot, les souris recevront une injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 1 à 5 jours (durée du geste inférieure à 10 sec) et seront mises à mort après un jour de repos. Enfin un dernier lot d’animaux recevra une injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 1 à 5 jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Nous implanterons ensuite une fenêtre abdominale sur les souris anesthésiée (durée du geste 20 minutes) pour réaliser des sessions d’imagerie sur souris anesthésiées (durée d’imagerie 120 minutes par jour, pendant 2-3 jours).
Impact sur les animaux
Suites aux interventions subies par les animaux, des conséquences directes et courtes sont à prévoir : - Douleur liée à l’injection intrapéritonéale - Stress lié à la contention pour l’injection intrapéritonéale Suites aux interventions subies par les animaux, des conséquences indirectes et longues (i.e. jusqu’à la mise à mort sont à prévoir : - Douleur, perte de poids, inflammation à la suite de la pose d’une fenêtre d’observation - Douleur, perte de poids, diarrhée, déshydratation et/ou constipation liées à la perte de perméabilité de l’intestin
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L'intestin est un organe complexe qui implique de nombreux composants : bactéries, circulations sanguine et lymphatique, neurones, muscles, système immunitaire etc. Les objectifs de ce projet étant d'identifier le mode de fonctionnement du tissu ainsi que le maintien de son intégrité. La réduction à un système in vitro pourrait nous affranchir de découvertes pertinentes qui seraient liées à la complexité des interactions présentes dans l’intestin. Par exemple, comme la perturbation de l’étanchéité intestinale peut avoir des conséquences sur le système immunitaire, notre projet est étudiable seulement grâce à des études in vivo, impossible à remplacer par des approches in vitro. Cependant, certains aspects liés à l’intégrité de la barrière intestinale pourraient être explorés in vitro. À cette fin, nous générerons des organoïdes qui permettront de réduire le nombre de souris utilisées . De plus, nous utiliserons des méthodes substitutives partielles comme des explants de tissu observés ex vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables, soit entre 3 et 5 souris par expérience . Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l'échantillon, nous utiliserons autant que possible des compagnons de portée. Des expériences pilotes seront réalisées afin d’optimiser le niveau de perte d’adhésion entre les cellules épithéliales et la membrane basale. Ces expériences utiliseront des animaux des deux sexes et les tissus extraits seront utilisés à la fois pour l'histologie et l'extraction de protéines afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les croisements de souris seront optimisés pour produire tous les génotypes. Nous produirons un stock d'organoïdes à partir des mêmes souris pour les études in vitro de fonctionnalisation. Ces organoïdes peuvent être étendus, presque indéfiniment, afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires au projet et ainsi optimiser le nombre d’animaux. La prolifération et la migration des cellules seront étudiées dans la même souris. Ces souris seront également utilisées pour l'histologie et l'immunofluorescence. Cela permettra de réduire le nombre de souris nécessaires pour ces procédures. Notre analyse post-mortem sera faite à l’aveugle, ce qui assure l’impartialité des résultats obtenus.
Raffinement
- Pour les injections d’un produit non douloureux dans l’abdomen, une surveillance sera mise en place tous les jours jusqu’à la récupération post-mortem des tissus. Durant cette période, la mise au point de points limites permettra la détection de signes précoces de détresse ou de mal être avant que cela n’impacte les souris ou le projet. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront mis à mort - Pour la chirurgie, une gestion de l’analgésie-anesthésie est mise en place : les souris recevront des analgésiques en préopératoire ainsi que des anti-inflammatoires après la chirurgie. Nous utiliserons une anesthésie générale gazeuse. Durant le temps de la procédure nécessitant une anesthésie, un gel lacrymal empêchera le dessèchement oculaire et l’animal sera maintenu sur un coussin chauffant ou une chambre chauffante de manière à maintenir la température corporelle dans les constantes normales. L’animal est ensuite transféré dans une cage isolée (afin d’éviter toute lésion par une autre souris) et placée sur un tapis chauffant jusqu’à son réveil. De l’anti-inflammatoire sera ajouté à l’eau de boisson. Les animaux seront surveillés de près et mis à mort dès l’atteinte d’un point limite tel que décrit dans la grille de score.
Choix des espèces
La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage, sa reproduction facile et rapide qui permet l’obtention de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. De plus, les bases de données d'expression de la souris, les lignées de souris et les protocoles déjà établis permettraient d'étendre facilement ce projet à l'avenir en utilisant des modèles déjà existants, ou de comparer les résultats du projet à différents ensembles de données provenant d'autres projets. Par ailleurs, la souris est très proche de l'Homme au niveau génétique mais aussi métabolique et immunitaire, c'est donc un excellent modèle d'étude de perméabilité intestinale ainsi que migration cellulaire, la structure de l’intestin étant similaire à celle de l’Homme. Des animaux adultes seront utilisés car nous somme intéressé par la migration cellulaire et les jonctions inter-cellulaires dans des processus physiologiques, lorsque le développement de l’animal est terminé.
Traitement de l’information nociceptive chez l’animal naïf et parkinsonien
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance du sans réveil au sévère. Elles subissent une biopsie de la queue, une chirurgie crânienne pouvant aller jusqu'à deux heures et des stimulations douloureuses répétées trois fois par semaine pendant un mois, avec des lésions reproduisant la maladie de Parkinson entraînant perte de poids et déficits moteurs. Le porteur précise que les altérations de la sensibilité à la douleur ne peuvent être soulagées car elles sont l'objet même de l'étude, dont le but reste fondamental, la compréhension d'une région cérébrale. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit les réseaux cérébraux en jeu, l'animal vigile étant présenté comme "indispensable".
Objectifs
Le traitement des informations douloureuses est un des éléments essentiels à notre survie. Il apporte en effet un signal d’alarme pour limiter les dommages que pourraient potentiellement subir l’organisme. Ces réponses impliquent des réflexes rapides, des mécanismes attentionnels et l’intégration plus complexe des informations liées aux stimulus douloureux et au contexte. La douleur peut également être considérée comme pathologique et/ou être associée à une pathologie. C’est notamment le cas dans la maladie de Parkinson, dans laquelle de nombreux malades rapportent des douleurs spontanées, mais également des réponses exacerbées à des stimulus douloureux (hyperalgésie) et des douleurs en réponse à des stimulations normalement non douloureuses (allodynie). L’objectif de ce projet est double. Il s’agit : 1 / d’évaluer l’implication d’une région cérébrale dans l’intégration des informations liées à une douleur aigue. 2/ d’évaluer les altérations de cette intégration dans le contexte des symptômes douloureux liés à la maladie de parkinson.
Bénéfices attendus
L'objectif premier de cette étude est fondamental et concerne une meilleure compréhension fonctionnelle d’une région cérébrale encore peu connue. Mais les données obtenues amèneront aussi des informations sur des différences ou non de réponse selon le sexe et selon l’état pathologique, ici pour mieux comprendre les bases de la douleur présente dans la maladie de Parkinson. Cette information constitue un point de départ pour ultérieurement évaluer cette région cérébrale comme cible anatomique thérapeutique potentielle dans le cadre de la symptomatologie de la maladie de Parkinson.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie de queue autour de 6 jours post natal pour réaliser leur génotypage. Les animaux subiront une chirurgie de maximum 2h, et des tests comportementaux d’identification du seuil de sensibilité douloureuse et d’enregistrement de l’activité neuronale seront effectuées 3 fois par semaine, sur une période d’un mois et d’une durée moyenne allant de 10 minutes à 1h en durée selon les tests.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue nécessaire aux génotypage des animaux (autour de 6 jours post natal) induit une douleur légère de courte durée. La chirurgie peut entraîner une douleur postopératoire et une inflammation locale transitoire autour du dispositif des canules (peau du crâne). Les stimulations nociceptives entraînent potentiellement une douleur aiguë ponctuelle, objet de l’étude. Les lésions dopaminergiques modélisant la maladie de Parkinson peuvent entrainer une perte de poids sur les 10 premiers jours après la lésion. Des déficits moteurs liés à la modélisation de la maladie de Parkinson sont également attendus, ainsi que des altérations sensorielles des seuils de douleur qui ne peuvent être soulagées car c’est l’objet de l’étude.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle reproduisant la complexité des réseaux de structures cérébrales mis en jeu dans cette étude. Ainsi, les réponses cérébrales et comportementales à des stimulations douloureuses nécessitent l’animal entier, vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire le nombre d’animaux, mais en obtenant le maximum d’information scientifique par test. Les effectifs maximum nécessaires pour conclure ont été calculés statistiquement, mais des analyses intermédiaires des résultats en cours d’expériences permettront de potentiellement réduire ce nombre.
Raffinement
Les animaux seront suivis afin de déceler tout signe de mal-être (perte de poids, blessure ou plaie ouverte, dégradation de l'état du pelage, dos arqué…). Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées. Après la chirurgie, des grilles d’évaluation seront utilisées pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargé du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichis (bâton et fissure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nid)
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler spécifiquement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que l’étude des comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés
Évaluation de l’efficacité alimentaire par la mesure des isotopes stables du carbone et de l’azote
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
224 bars vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont élevés seuls en aquarium pendant huit semaines et subissent cinq prélèvements de nageoire et d'écailles ainsi qu'une prise de sang sous anesthésie, plus l'implantation d'une puce, pour mettre au point une mesure de l'efficacité alimentaire par les isotopes stables. Le porteur vise une sélection génétique plus simple des poissons sur ce caractère et présente les prélèvements comme des nuisances mineures qui cicatrisent vite. Il indique tuer les animaux faute de pouvoir les placer, leur fonds génétique interdisant selon lui un retour en milieu naturel, ces bars étant destinés à la consommation.
Objectifs
L’objectif du projet est la mise au point d’une méthode utilisant les isotopes stables du carbone et de l’azote comme indicateur de l’efficacité alimentaire chez le bar européen. Pour cela, le projet propose de coupler les mesures d’efficacités alimentaires en élevage individuel et en alimentation restreinte avec la vitesse d'absorption des isotopes stables du carbone et de l'azote de l'aliment par le poisson. L’élevage individuel des bars permettra de quantifier l’ingéré et la croissance individuelle des bars ce qui permettra de mesurer l’efficacité alimentaire individuelle des poissons. Avant de réaliser cette évaluation, les poissons seront acclimatés et nourris avec un aliment A. Lors de l’évaluation, les poissons seront nourris avec un aliment B. Les aliments A et B auront des valeurs d'isotopes stables du carbone et de l'azote différents grâce à l’utilisation de sources de matières premières différentes telles que du blé ou soja versus du maïs. Les valeurs des isotopes stables du carbone et de l'azote seront étudiées dans différents tissus comme les globules rouges, les écailles ou les nageoires par spectroscopie. La corrélation entre les facteurs de discrimination trophique de chaque individu et leur efficacité alimentaire sera ensuite évaluée.
Bénéfices attendus
Cette nouvelle méthode d’évaluation de l’efficacité alimentaire basée sur les isotopes stables permettra d’évaluer facilement les performances individuelles de poissons élevés en groupe, rendant ainsi plus simple et plus applicable à grande échelle une sélection génétique sur ce caractère.
Procédures
Pour réaliser ce projet, les animaux seront élevés individuellement et seront prélevés à cinq reprises d'un bout de nageoire et d'écailles. En fin de projet une prise de sang sera réalisée. Chacun de ces prélèvements prend moins d'une minute et sera réalisé sous anesthésie. L'élevage individuel durera 8 semaines.
Impact sur les animaux
Pour les besoins de l'expérimentation, les poissons seront élevés dans des aquariums individuels. Par ailleurs les poissons seront prélevés 5 fois au cours de l'expérimentation d'un bout de nageoire, d'un prélèvement d'écailles et une prise de sang sera réalisée en fin d'expérimentation. Les lésions engendrées par ces prélèvements cicatrisent rapidement, les poissons régénèrent en quelques semaines les écailles et les bouts de nageoires perdus. Les prélèvements répétés de nageoires n'engendrent pas d'effet négatif sur la nage des poissons. Les prélèvements de nageoires sont réalisés à l'aide d'un biopsie punch de faible diamètre , ce qui permet une reconstitution du tissu prélevé en moins de deux semaines. Enfin les poissons seront identifiés à l'aide d'une puce RFID injectée dans le muscle dorsale. Ces prélèvements et le marquage sont des nuisances mineures pour cet espèce.
Devenir
À la fin de l'expérimentation, les poissons seront euthanasiés. Les animaux ne seront pas utilisés dans un autre projet et ne peuvent être gardés dans les installations expérimentales. Le placement des animaux de bouche n'est pas aisé, ceux-ci étant destinés à la consommation humaine. Leurs fonds génétiques restreints ne permettent pas une remise dans le milieu naturel.
Remplacement
Ce type d'expérimentation, où la variation observée et recherchée est liée à l'individu, ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n'y a donc pas de remplacement possible. La mesure de l'efficacité alimentaire (ingéré/gain de poids) est un caractère complexe mettant en jeu une multitude de mécanismes comme la capacité à assimiler les nutriments, le métabolisme énergétique, l'activité de nage des poissons, la microflore intestinale... Ce caractère complexe étudié au niveau individuel n'a pas d'alternative non animale disponible du fait de ses nombreuses composantes et des variabilités individuelles qu'explore l'étude.
Réduction
Les effectifs ont été calculés à partir de données d’expérimentations précédentes sur le bar pour assurer une puissance de détection suffisante des effets escomptés.
Raffinement
Pour réduire la souffrance et l'angoisse, les animaux sont manipulés uniquement sous anesthésie pour toutes les mesures individuelles, et sont diposés dans des aquariums leur permettant un contact visuel avec des congénères. Les prélèvements de nageoire et d'écailles seront réalisés à chaque fois à une localisation différente. Tout au long de l'expérimentation, les poissons seront surveillés individuellement et soustraits à l'expérimentation en cas de souffrance.
Choix des espèces
Le bar est une espèce majeure de l'aquaculture méditerranéenne, pour laquelle la question de l'efficacité alimentaire se pose avec acuité, cet élevage consommant aujourd'hui, à quantité de production égale, près de deux fois plus d'aliment qu'un élevage de truite ou de saumon. Les animaux seront au stade juvénile (entre 20 et 100g de poids moyen) pour à la fois pouvoir mesurer des croissances significatives et permettre que les animaux soient dans un confort relatif dans les bacs individuels de 10 litres qui seront utilisés
Impact de la dérégulation de métabolites-cibles déficitaires au cours du vieillissement dans la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l’âge et potentiel thérapeutique de leur supplémentation – EU2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
2 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des gavages ou injections quotidiens jusqu'à deux mois, des prises de sang à la queue et passent des tests de force et d'endurance musculaires, rotarod, grille inversée et tapis roulant, avec des isolements de 48 heures en calorimétrie et des mises à jeun. Le porteur étudie le rôle de métabolites du tissu adipeux dans la perte musculaire liée à l'âge et l'intérêt de les supplémenter chez la souris âgée. Sur le remplacement, il affirme que seule une approche intégrée in vivo rend compte de l'action systémique de ces métabolites entre organes.
Objectifs
Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Or, il a récemment été montré que le vieillissement du tissu adipeux blanc (TA) pouvait avoir un impact délétaire sur la fonction musculaire, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, on retrouve les métabolites, de petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence un défaut de production de certains métabolites par le TA âgé qui corrèle avec une diminution de leur concentration circulante et intra-musculaire chez la souris âgée. Compte tenu de leur importance dans le maintien de l'intégrité musculaire, un défaut d’approvisionnement des métabolites du TA vers le muscle au cours du vieillissement pourrait participer au développement du processus sarcopénique ainsi qu’aux désordres métaboliques qui lui sont associés (intolérance au glucose, résistance à l’insuline). Ainsi, l'objectif de ce projet est 1. de tester si une carence en métabolites-cibles identifiés comme sous-produits par le TA avec l’âge participe à la faiblesse musculaire et aux désordres métaboliques qui lui sont associés. 2. de tester si supplémenter ces métabolites - individuellement ou en combinaison - chez la souris âgée (afin de restaurer leur disponibilité systémique) permet de prévenir/contrecarrer la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l'âge. Cette procédure sera réalisée à la fois dans l’Etablissement Utilisateur 1/2 (US006/CREFRE Inserm/UPS/ENVT Zootechnie Expérimentale Langlade, EU0583 APAFiS N°#45674) et dans l’Etablissement Utilisateur 2/2 (US006/CREFRE/INSERM/UPS/ENVT/Rangueil, EU0549 APAFiS N°#45663), certains équipements nécessaires au phénotypage de nos animaux n’étant disponibles que dans l’EU1 ou que dans l’EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sarcopénie liée à l’âge en évaluant l’impact d’une carence en métabolites-cibles (précédemment identifiés comme étant déficitaires au cours du vieillissement) sur la mise en place des désordres musculaires et métaboliques associés à l’âge. Le potentiel thérapeutique de leur supplémentation chez la souris adulte/âgée devrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir/contrecarrer le développement du processus sarcopénique ainsi que les désordres métaboliques qui lui sont associés.
Procédures
Certains animaux recevront un traitement pharmacologique quotidien soit par gavage (moins de 15 secondes par souris), soit par injection intra-péritonéale ou sous-cutanée (moins de 15 secondes par souris) pour une durée maximale de 2 mois (EU1/2). D'autres animaux seront supplémentées avec les métabolites-cibles de façon non invasive pour une durée de 2 à 6 mois en intégrant ces molécules à leur eau de boisson ou à leur nourriture (EU1/2). Ces animaux pourront être soumis à des prises de sang à la veine de la queue (espacées d'au moins 6 semaines, durée approximative d'intervention : 10 minutes par souris) (EU1/2). Leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive grâce à un système de résonance magnétique nucléaire (RMN) (temps de mesure moyen par souris : 90 secondes) et leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte (isolement en cage individuelle pendant 48h) (EU2/2). Leur fonction musculaire pourra être évaluée à l'aide de différent tests non invasifs (mesure de l'équilibre avec le système Rotarod (durée: 5 minutes maximum, répétée 2 fois avec 15 minutes de repos entre 2 essais ; analyse de leur démarche lors d'une marche spontanée à l’aide d’un test de distribution pondérale cinétique (KWB) (durée approximative: 5 minutes), mesure de leur force musculaire grâce à un dynamomètre relié à une grille (durée totale approximative: 5 minutes, 3 mesures consécutives séparées par 1 min de repos, expérience répétée une fois après 15 min de repos), test de suspension sur une grille inversée (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques secondes à 30 minutes), course sur tapis roulant (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques minutes à 45 minutes) (EU1/2). Des tests de tolérance au glucose (GTT) et à l'insuline (ITT) pourront également être réalisés (prélèvements de sang durant les GTT/ITT pour la mesure de la glycémie à 8 temps donnés espacés de 15 minutes minimum (8 x 5 secondes) suite à un gavage au glucose (moins de 15 secondes par souris) pour la GTT ou une injection intra-péritonéale d'insuline (moins de 15 secondes par souris) pour l'ITT (EU1/2). L'ensemble de ces tests pourront être répétés jusqu'à 4 fois dans la vie de l'animal, avec une période minimale de 6 semaines entre deux tests.
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : 1. stress des animaux au moment de leur réception (une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée); 2. L’isolement des souris pour la calorimétrie indirecte (48h au total, acclimatation puis mesure) est une source de stress. Les animaux gardent toutefois un contact visuel avec leurs congénères dans les cages voisines et sont rapidement remis dans leur cage d’origine.; 3. stress au moment des manipulations pour les tests de caractérisation de la fonction musculaire et métabolique (habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux); 4. Des gavages répétés quotidiennement peuvent induire une irritation de l'oesophage et des injections intra-péritonéales ou sous-cutanées répétées quotidiennement une douleur au niveau du point d'injection (les sites d'injection seront changés chaque jour) 5. la mise à jeun des animaux représente une source de stress (le temps de jeûne sera limité à 6 heures). 6. les prises de sang à la queue sont source d'inconfort (prélèvement d'un volume restreint de sang (80ul) espacé de 15 jours au minimum)
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.
Remplacement
Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie de la sarcopénie liée à l'âge et des désordres métaboliques qui lui sont associés, ainsi que leur potentielle amélioration par des stratégies de supplémentation en métabolites-cibles. Ceci nécessite de prendre en compte l'action systémique des métabolites-cibles administrés, ainsi que la contribution relative des différents organes métaboliques au phénotype, ce qui ne peut être réalisé que par une approche intégrée in vivo. Lorsque possible, une partie de l’étude sera réalisée sur des lignées immortalisées de cellules musculaires humaines afin de répondre à des questions plus ciblées ne nécessitant pas une approche intégrée.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques actuelles et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet. Compte tenu de la variabilité des capacités physiques et des paramètres métaboliques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 10 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Ce nombre d’animaux est classiquement utilisé dans la littérature pour réaliser ce type d'études, en particulier dans un contexte de vieillissement, où la variabilité inter-individuelle tend à augmenter avec l'âge. Dans un souci de réduction, le projet a été designé de façon à réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes d'animaux dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. De plus, une veille bibliographique sera effectuée afin d'éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes de recherche sur les mêmes molécules. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour l’analyse du métabolome (par spectrométrie de masse) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques. Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Lors du transport des animaux, l’enrichissement de leur cage sera multiplié afin de les occuper pendant le trajet (coton salivaire et bouts de bois à ronger en plus du matériel de nidification). Les animaux seront protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil ou des écarts de température. Leur exposition au bruit et aux vibrations sera limitée au maximum et les souris ne seront jamais transférées en présence d’espèces différentes – hors rongeurs – dans le même véhicule. Lors de leur arrivée à la zootechnie, les animaux seront placés en pièce d'acclimatation. Ils seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres). Les cages seront passées en revue deux fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur, problème de dentition, et pesés au moins une fois par semaine. Les tests fonctionnels seront réalisés suite à une habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux utilisés, afin de réduire le stress engendré et améliorer la reproductibilité des résultats. De plus, en ce qui concerne la stratégie de supplémentation en métabolites-cibles, une approche physiologique non invasive via leur eau de boisson/nourriture sera privilégiée afin d'améliorer le bien-être animal et réduire le stress lié aux expérimentations. Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris de différents âges : 3-6 mois pour les souris « jeunes», 10-14 mois pour les souris adultes d'âge moyen et 18-24 mois pour les souris « âgées » afin de caractériser la contribution d'un déficit en métabolites-cibles dans la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques qui lui sont associés au cours du vieillissement.
Mise au point , validation du modèle d’administration intracérébrale et de développement de l’atlas cérébral chez le miniporc
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
50 miniporcs vont être utilisés, une partie tués et 20 réutilisés, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Ils subissent une IRM et une injection intracérébrale sous anesthésie générale de six heures, avec prélèvement de liquide céphalorachidien sans réveil pour les animaux autopsiés et prélèvements sanguins sur animal vigile. Le porteur veut valider l'administration intracérébrale chez le miniporc pour évaluer la sécurité de thérapies du système nerveux central, en remplacement du primate non-humain. Il présente le miniporc comme proche de l'humain sur le plan phylogénétique et affirme qu'aucune alternative non animale ne permet cette validation.
Objectifs
L’objectif de ce projet est la mise point et validation du modèle d’administration intracérébrale chez le miniporc. Ce modèle sera validé grâce à l’injection d’un produit de contraste et d’un élément d’essai (dont la biodistribution sera évaluée) et via une évaluation histopathologique complète afin de confirmer que la procédure d’administration intracérébrale sera compatible avec une étude de toxicologie générale. Une fois validé ce modèle sera utilié dans l'évaluation préclinique et permettra de répondre aux exigences réglementaires dans le cadre de l’évaluation de la sécurité des produits pharmaceutiques utilisant des stratégies thérapeutiques innovantes du système nerveux central qui seront injectées par voie intracérébrale chez l’homme. De plus, un atlas morphologique du cerveau du miniporc sera développé en utilisant l’imagerie par résonance magnétique (IRM), ce qui permettra notamment de faciliter le ciblage cérébral dans le cadre d’étude préclinique évaluant les effets neurotoxiques d’un médicament administré par voie intracérébrale.
Bénéfices attendus
La validation du modèle d’administration intracérébrale chez le miniporc permettra d'évaluer la sécurité de futurs thérapies administrés par voie intracérébrale et contribuera à améliorer la sécurité des patients d'essais clinqiues. De plus, la validation pourra contribuer à la mise sur le marché de nouvelles thérapies sûres pour les patients atteints de pathologies du système nerveux central (exemple : maladies de Parkinson et Alzheimer).
Procédures
Pour les procédures 1 et 2, l’imagerie IRM et l’injections intracérébrale (1 occasion, d’une durée d’envion 6 heures) seront réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique et analgésie périopératoire (induction anesthésique via une injection intramusculaire) et antibiothérapie pour l’injections intracérébrale. Pour la procédure 3, l’imagerie IRM (1 occasion, d’une durée d’envion 2 heures) sera réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique. La procédure d’injection intracérébrale sera réalisée sous anesthésie générale volatile avec surveillance anesthésique et une antalgie suffisante. Des prélèvements de liquide céphalo-rachidien (LCR) seront réalisés en fin de procédure (avant mise à mort, d’une durée d’environ quelques minutes), sur animaux anesthésiés (sans réveil). Des prélèvements sanguins seront réalisés à raison de 3 temps (prédose, durant la phase d’observation et à la mise à mort). Dès que possible, les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal anesthésié à l’occasion des prélèvements de LCR. Pour les autres occasions, les prélèvements sanguins seront de courte durée (quelques minutes).
Impact sur les animaux
Les procédures d’administration intracérébrale sont pratiquées sur animaux anesthésiés qui seront mis à jeun la veille de la procédure. Lors du réveil anesthésique une désorientation/perte d’équilibre et une hypothermie peuvent être observées temporairement. En cas d’hypothermie, une prise en charge par lampe chauffante (et/ou coussin chauffant) sera mise en place. Des évènements anesthésiques liés à l’anesthésie volatile peuvent survenir (apnée). Des signes locaux (œdème) peuvent être observés au niveau cutané ainsi que des ulcères cornées liés à la durée de l'anesthésie. Pour les prélèvements sanguins (PS) qui seront réalisés sur animaux vigiles, ceux-ci pourraient être associés à des sensations désagréables de ponction mais seulement pendant une courte durée et des hématomes post-prélèvement. Les signes cliniques suivant pourraient être observés en cas de réaction exagérée au produit pharmaceutique de référence : • Troubles de la coordination des mouvements • Diminution de l’appétit • Somnolence • Vomissement • Diarrhée. Ces signes cliniques devraient être seulement transitoires et seront surveillés.
Devenir
Procédure 1 et 2 : Les animaux seront autopsiés à la fin de la procédure afin d’évaluer l’impact de la procédure d’administration intracérébrale d’un point de vue histopathologique et biodistribution. Ceci afin de valider le modèle, dans le contexte des études réglementaires de toxicologie. Procédure 3 : A la fin de la procédure, l’animal sera replacé en étude après une période de repos ou en stock. L’acquisition d’images IRM du cerveau n’étant ni invasive ni impactante pour les animaux, ceux-ci peuvent être réutilisés pour d’autres études.
Remplacement
Actuellement, il n’existe pas d’alternative non animale permettant d’évaluer la sécurité et la toxicité, notamment systémique et neurocomportementale des futurs candidats médicaments dans le cadre du développement de thérapies innovantes, telle que la thérapie génique. Il n’existe pas non plus d’alternative non animale pour valider que la technique d’administration intracérébrale aboutit à une exposition de l’animal au produit pharmaceutique de référence et que celle-ci est bien tolérée (analyse histopathologique). Le miniporc est un modèle animal pertinent car il est proche de l'Homme d’un point de vue phylogénétique et transcriptomique, permettant le développement de candidats médicaments et/ou de formulations innovantes dans les études de toxicologie.
Réduction
Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique (pharmacocinétique et la biodistribution du produit réference). De plus, dans les études réglementaires de toxicologie 3 animaux par groupe sont généralement utilisés. Au total, 50 animaux seront utilisés dans ce projet : 6 animaux pour l’étude pilote, 24 animaux pour l’étude principale et 20 animaux pour l’atlas cérébral. La Procédure No. 1, sur un nombre limité d’animaux, va permettre de mettre au point et valider la technique d’administration intracérébrale et avant le démarrage de la Procédure No. 2, qui a pour but de déterminer la toxicité d’un candidat médicament sur un nombre plus important d’animaux.
Raffinement
Le produit de contraste sera injecté à une seule occasion et à une dose pour laquelle aucun effet toxique n’est attendu. Le volume injecté est maitrisé et a été déterminé pour ne pas être associé à une mauvaise tolérance. Des points limites basés sur les examens neurologiques, l’état clinique et la perte de poids sont définis. Les animaux auront une période d’acclimatation aux conditions environnementales avant le début du projet. Un entrainement pour la pesée corporelle et des interactions positives avec le personnel seront mis en place. Pour limiter le stress des animaux lors des injections et prélèvements, les animaux seront manipulés régulièrement par les personnes en charge des procédures expérimentales (contention, suivi du poids). Des récompenses alimentaires seront distribuées après les actes contraignants (tel que les prélèvements de sang sans anesthésie et les contentions).Une protection mécanique préventive des yeux et des soins locaux (ocrygel) seront mise en place en pré-opératoire afin de réduire le risque d’ulcéres cornéens du à la durée de la procédure chirurgicale. L’injection intracérébrale sera réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique. Une analgésie et antibiothérapie préventive sera mise en place avant et après administration du produit de contraste et élément d’essai. Des mesures de prévention de l’hypothermie seront appliquées pendant l’anesthésie et au réveil. En raison du potentiel impact de l’administration intracérébrale, une évaluation neurocomportementale sera réalisée duant le pretest et à deux occasions après adminisration (+4h et +24h post-procédure). La mise à mort sera considérée pour les signes cliniques suivants : • convulsions ne rétrocédant pas spontanément ou à l'administration d'anti-convulsivants ou convulsions répétées dans la même journée • Incapacité prolongée de l'animal à se déplacer ou pertes d'équilibres durables impactant la qualité de vie de l'animal • perte d'appétit ne rétrocédant pas aux mesures de soutien • perte de poids supérieur à 20% • infection des plaies chirurgicales ne rétrocédant pas aux soins.
Choix des espèces
Les études réglementaires de toxicologie doivent se faire chez une espèce pertinente pour l’évaluation de la sécurité des futurs candidats médicaments. De nombreuses nouvelles stratégies thérapeutiques actuelles du système nerveux central (SNC) sont basées sur des produits biologiques ou de thérapie génique (oligonucléotide) qui nécessitent une homologie phylogénétique ou transcriptomique importante avec l’Homme afin d’évaluer les propriétés pharmacodynamiques du produit mais également les potentiels effets toxiques. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle non-rongeur est nécessaire dans ces études. Actuellement, le primate non-humain est la principale espèce « non-rongeur » utilisée pour évaluer les effets neurotoxiques d’un médicament administré par voie intracérébrale. L’objectif est donc de développer et valider l’administration intracérébrale chez l’espèce miniporc en remplacement du primate. La validation du modèle d’administration intracérébrale ne nécessite pas de pré-requis d’âge et se fera sur jeunes adultes/adultes comme pour les études de toxicologie réglementaire.