Procédures légères

60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie euthanasiée pour prélever sérum et os, les animaux de maintien de lignée étant gardés vivants. Elles subissent un poinçonnage d'oreille, des recueils d'urine en cage métabolique, des injections de fluorochrome, puis une ponction intracardiaque terminale sous anesthésie, pour étudier deux protéines qui favorisent la formation osseuse. Le porteur affirme que les modèles cellulaires ne rendent pas compte de la structure osseuse en trois dimensions et conclut au recours "nécessaire" à la souris. Les retombées annoncées contre l'ostéoporose restent une identification de cibles thérapeutiques "potentielles", renvoyée au conditionnel.

Objectifs

L’ostéoporose est une maladie qui affecte plus de 200 millions de femmes dans le monde et qui survient lorsqu’il existe un déséquilibre entre la formation et la résorption osseuse. Cette maladie est caractérisée par une perte excessive de la masse osseuse ce qui aboutit à une diminution de la résistance osseuse et donc à une augmentation du risque de fracture. Les cellules souches de la moelle osseuse sont la source majeure de précurseurs ostéoblastiques qui sont les cellules à l’origine de la formation osseuse. Les mécanismes impliqués dans la différentiation des cellules souches en ostéoblastes ne sont que partiellement connus. Le but de ce projet est de caractériser des protéines qui favorisent la différentiation des cellules souches en ostéoblastes et donc favoriserait la formation osseuse. Dlx5 et Dlx6 sont notamment deux protéines qui sont exprimées par les cellules souches et qui sont impliquées dans la différentiation des ostéoblastes. L’objectif est de mieux comprendre leurs rôles dans la différentiation ostéoblastique et d’identifier des protéines qui intéragiraient avec et qui pourraient devenir des cibles thérapeutiques en favorisant la formation osseuse, ce qui réduirait le risque de fracture. Pour cela, nous étudierons l’effet de l’absence de ces deux protéines chez la souris sur le remodelage osseux (formation et résorption) et nous identifierons les protéines qui intéragissent avec.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension du rôle de ces deux facteurs de transcription dans la différentiation ostéoblastique et d’identifier potentiellement des partenaires qui pourraient devenir des cibles thérapeutiques en favorisant la formation osseuse.

Procédures

Tous les animaux : poinçonnage d’oreille pour identification et génotypage (dure quelques secondes), recueil d’urine en cage métabolique (entre 20 minutes et 2 heures maximum), injections intrapéritonéales de fluorochrome (2 injections à 3 jours d’intervalle, durent quelques secondes), anesthésie avec injections intrapéritonéales de kétamine/xylazine pour radiographie (environ 5mn par animal), ponction intra-cardiaque (réalisée sous anesthésie profonde) pour recueil de sang.

Impact sur les animaux

Les injections de fluorochromes peuvent entrainer une douleur minime ou un inconfort passager mais qui ne nécessite cependant pas de médication. De même pour le poinçonnage des oreilles qui sera effectué pour l’identification et le génotypage. Le recueil d’urine se fait en cage métabolique durant 2 heures maximum ce qui peut engendrer un stress pour les animaux du fait d’être déplacé dans un environnement qui ne leur est pas familier.

Devenir

Procédure 1 : Maintien de lignée : animaux gardés en vie. Procédure 2 : Effet de délétion sur la formation et la résorption osseuse : euthanasie afin de récupérer du sérum qui permettra de mesurer les marqueurs de formation osseuse par biochimie, et de récupérer différents échantillons qui seront prélevés pour l’analyse de la microarchitecture osseuse, de biologie moléculaire et immunohistochimiques.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettant pas de récapituler les intéractions des cellules osseuses avec leur environnement et les autres tissus ainsi que l’analyse de la structure 3D de l’os, le recours à l’animal est nécessaire. En effet nous souhaitons identifier dans un système biologique complet l’impact sur l’architecture osseuse de la délétion de deux protéines dans des cellules qui ont la capacité de former de l'os.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires.

Raffinement

Nous procéderons à une évaluation de la densité minérale osseuse par radiographie. Les souris seront anesthésiées. Le temps de la radiographie est d’environ 5 minutes par animal. Après acquisition de la radiographie les animaux seront maintenus à 37°C le temps de leur réveil puis remis dans leurs conditions d’hébergement initiales. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance régulière. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux aux différents temps des procédures, poinçonnage des oreilles (pour identification et génotypage), anesthésies, injections intrapéritonéales de fluorochromes (substance chimique capable d'émettre de la lumière fluorescente après excitation) dilués dans du sérum physiologique et isolement en cage métabolique entre 20 minutes et 2 heures maximum. Cependant, dans l’éventualité d’apparitions de trouble du comportement ou de troubles physiques, les mesures retenues, surveillance plus fréquente, apport de nourriture gélifiée, et administration d’analgésique seront mises en oeuvre.

Choix des espèces

Ce modèle est nécessaire afin d’étudier le rôle de la délétion dans un système biologique complet. Les animaux seront âgés de 3 et 6 mois afin d’étudier l’impact de la délétion dans des cellules qui ont la capacité de former de l'os à différents stades : fin de la croissance et vérifier si le phénotype est maintenu dans le temps.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent trois prises de sang et, pour deux tiers d'entre elles, deux vaccinations par voie nasale ou sous-cutanée contre le paludisme. Le porteur décrit un stress de contention, des hématomes possibles et une gêne nasale, et prévoit la mise à mort à J31 pour étudier les réponses immunitaires, notamment hépatiques. Il affirme qu'aucun modèle de remplacement ne reproduit la complexité du système immunitaire, cette étude étant présentée comme une preuve de concept.

Objectifs

Le paludisme est une maladie parasitaire responsable de 241 millions de cas et de 627 000 décès estimés dans le monde en 2020. Malgré les mesures préventives dont l'efficacité protectrice reste modérée chez les enfants, il existe un besoin urgent de développer de nouveaux candidats vaccins antipaludiques avec une efficacité protectrice d'au moins 75 % d'ici 2030 (OMS). Le paludisme a un cycle de vie complexe impliquant l'invasion et le développement à l'intérieur des hépatocytes et des érythrocytes de l'hôte mammifère. A chaque étape de son cycle de vie, le parasite à travers ses différentes formes exprime de nombreuses protéines cibles de candidats vaccins contre le paludisme. Les vaccins candidats en développement ne bloquent pas complètement la transmission et ne sont pas aussi efficaces contre les nouvelles variantes. Il est donc urgent de développer d'autres stratégies vaccinales pour induire une immunité protectrice et simplifier les conditions d'administration et de conservation. Ces dernières années, un candidat vaccin sous-unitaire contre la COVID-19, administré par voie nasale. Celui-ci induit des réponses immunitaires humorales et cellulaires aux niveaux systémique et muqueux assurant une protection contre tous les variants décrits jusqu'à présent, ce qui a conduit à une priorisation nationale pour des essais cliniques ces prochains mois. L’équipe souhaite sur la base de cette expertise développer un vaccin contre le paludisme qui induit des réponses humorales et cellulaires au niveau hépatique et systémique afin de conférer une protection contre l'infection à Plasmodium. Des travaux récents, en modèle d’hépatite B, ont montré que seule la vaccination nasale était en capacité d’induire une réponse cellulaire hépatique (lymphocytes) en comparaison d’une immunisation systémique renforçant l’intérêt de la voie nasale comme une solution pertinente. Pour ces raisons, nous proposons d'utiliser cette même technologie pour développer un vaccin nasal contre le paludisme, et valider dans un premier temps, l’induction d’une réponse immunitaire protectrice systémique et hépatique.

Bénéfices attendus

Le vaccin contre le paludisme actuellement le plus avancé montre des résultats qui sont loin de ceux attendus pour un vaccin idéal. Le vaccin a montré une efficacité d'environ 45 % pour protéger les enfants âgés de 5 à 17 mois au cours de la première année après la vaccination avec une exposition moyenne au paludisme, avec une efficacité diminuant avec le temps et jusqu'à environ 16 % dans les situations d'exposition élevée au paludisme, même dans la première année suivant la vaccination. Il est donc urgent de développer un vaccin plus efficace. Dans ce but, nous proposons d'utiliser une nouvelle plateforme vaccinale qui a montré des résultats prometteurs pour le COVID-19. La capacité du candidat vaccin à induire une forte réponse immunitaire humorale et cellulaire systémique et hépatique forte spécifique de Plasmodium pourrait être d'un grand avantage pour un vaccin antipaludique. De plus, si notre calendrier vaccinal à deux immunisations par voie intranasale montre des réponses immunitaires robustes, ce sera une grande avancée dans la recherche sur le vaccin antipaludique. En effet, le RTS,S est proposé sous la forme d'un schéma à quatre doses chez l'enfant à partir de 5 mois ce qui est une organisation difficile dans les pays endémiques (aiguille stérile, personnel médical) . De plus, cibler différentes étapes du cycle de vie du parasite pourrait aider à compléter des candidats vaccins plus avancés et permettre d'augmenter la protection si peu de parasites parviennent à échapper à l'immunité hépatique. Comme le vaccin candidat COVID-19 entrera en essais cliniques ces prochains mois, la sécurité et la toxicité de la plateforme vaccinale auront déjà été exploitées, ce qui constituera un grand avantage pour nous concentrer sur l'amélioration de l'immunogénicité et l'évaluation de la meilleure combinaison (foie + stade sanguin antigènes) du vaccin anti-paludique.

Procédures

Les animaux subiront tous 3 prises de sang à J0, J21 et J31. 1/3 subira en plus des prises de sang, 2 instillations par voie nasale à J0 et J21 et un autre 1/3 , 2 injections par voie sous-cutanée à J0 et J21. Les prises de sang et les instillations/injections ne durent que quelques secondes sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

A ce jour, aucune des expériences de vaccinations effectuées dans le laboratoire et utilisant des antigènes n'a produits d'effets indésirables sur les animaux. Les contentions engendrent du stress, les prises de sang peuvent entrainer un hématome ainsi qu’une douleur légère au niveau du site de prélèvement. La vaccination par voie sous-cutanée peut entrainer une infection au niveau du site d’injection et celle par voie nasale une légère gêne.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation à J31 de façon à pouvoir étudier les réponses immunitaires induites par les différents types de vaccination notamment les réponses immunitaires hépatiques.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucun modèle de remplacement capable de reproduire la complexité du système immunitaire et d'étudier l'ensemble des réponses immunitaires suite à une vaccination.

Réduction

Cette expérimentation est une preuve de concept qui permettra de récolter assez de données pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans la suite de nos expérimentations. Ne possédant pas non plus de données liés au sexe, nous avons décider de constituer des lots de 10 souris composés de 5 mâles et 5 femelles.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Une surveillance accrue sera effectuée à la suite de chaque procédure afin de détecter au pls tôt les points limites définis pour chaque procédure. Un enrichissement positif sera mis en place en introduisant un enrichissement permanent de type igloo dès la semaine d’adaptation des animaux. Un enrichissement positif ponctuel, à leur entrée dans la structure puis après chaque procédure, de type carré en kraft pendant 48h pouvant être dépouillé et permettant la confection d’un nid. Un dispositif de tunnel de préhension sera utilisé pour réduire le stress des animaux.

Choix des espèces

Le modèle d'étude d'un candidat vaccin administré par voie nasale est déjà établi chez la souris dans le laboratoire. De plus, la souris Balb/c est décrit dans la littérature comme le modèle de référence permetant l'étude des réponses immunitaires suite à une vaccination contre palsmodium. Tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire chez la souris. Des souris adultes sont utilisées car leur système immunitaire est complètement développé

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les mères sont exposées à trois fongicides utilisés sur la vigne, aux doses autorisées dans l'eau potable, et leur descendance passe une batterie de tests de développement et de comportement, réflexe de sursaut, orientation olfactive, habileté sociale, stéréotypies et anxiété. Le porteur affirme n'avoir observé ni douleur ni perte de poids lors d'expositions antérieures et présente les tests comme non invasifs. Il conclut qu'aucun marqueur biologique n'existe pour l'autisme et que l'évaluation ne peut se faire qu'au niveau comportemental, les retombées annoncées visant une éventuelle révision de la réglementation.

Objectifs

Les objectifs du projet de recherche sont d'étudier les effets de certains polluants fréquemment détectés dans notre environnement sur le neurodéveloppement et le vieillissement. Nous nous intéressons à différents polluants : les fongicides de la famille des anilinopyrimidines, le cyprodinil, le mépanipyrim, et le pyrimethanil. Ces 3 antifongiques sont très largement utilisés pour le traitement de la vigne et pour préserver les fruits de la moisissure grise après récolte. Nous avons récemment montré que l'exposition tout au long de la vie à un cocktail de ces 3 fongicides à la dose réglementaire autorisée dans l'eau potable (0.1 µg/L) conduit à un trouble du neurodéveloppement ainsi qu’à l’âge adulte, au développement d’un phénotype autistique. Nous souhaitons maintenant mettre en évidence les fenêtres de développement précoce critiques d’exposition aux fongicides afin de mieux comprendre leur rôle dans le développement des effets délétères pour ensuite examiner leur exposition ultérieure.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l’impact de l’exposition à des polluants environnementaux dans le développement des troubles neurodéveloppementaux et dans la mise en place de la pathologie autistique. Il aura des bénéfices pour la santé humaine car les expositions utilisées dans notre modèle correspondent aux doses règlementaires à ne pas dépasser dans l’eau potable et pourraient aboutir, à terme, à une modification de la réglementation actuelle.

Procédures

Les mères seront exposées à des fongicides à des doses réglementaires autorisées dans l'eau potable. La trajectoire du développement comporte l'ouverture des yeux (durée du test : 1 minute), l'examen du conduit auditif (durée du test : 1 minute), le réflexe de sursaut (durée du test : 1 minute), l'acquisition de la marche (durée du test : 1 minute), l'orientation olfactive (durée du test : 5 minutes) et l'activité motrice (durée du test : 10 minutes). À l'âge adulte, les animaux seront évalués pour leur habileté sociale, leur capacité à générer des stéréotypies motrices et cognitives ainsi que leur niveau d'anxiété. Chacun de ces tests durera entre 7 et 15 minutes et ne sera réalisé qu'une seule fois par animal.

Impact sur les animaux

D’après les expériences réalisées chez nos collaborateurs, l’exposition à des fongicides aux doses réglementaires autorisées ne présente pas d’effets indésirables notoires. Dans les expériences d'exposition aux pesticides menées tout au long de la vie, nous n'avons pas observé de douleur, souffrance, perte de poids ou stress consécutifs au traitement. De plus, en limitant la fenêtre d'exposition, nous ne nous attendons pas à observer d’effets indésirables notoires. Par ailleurs, la dose de fongicide utilisée est la dose maximale réglementaire autorisée dans l'eau potable. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux éthologiques non invasifs

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés soit par exposition au CO2, soit par dislocation cervicale sous légère sédation dans le cas de prélèvements de tissus à des fins d'analyses ex-vivo

Remplacement

La compréhension des mécanismes causaux de l’autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère d’aspect pour la pathologie autistique, et aussi d’évaluer le cas échéant l’efficacité d’une approche thérapeutique. L’évaluation des effets bénéfiques d’un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu’au niveau comportemental : en effet, il n’existe pas de marqueur biologique pour l’autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Nous utilisons des outils statistiques adéquats pour calculer précisément le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser les expériences

Raffinement

Nous raffinerons nos expériences en soulageant l’inconfort ou le stress potentiel subi par les animaux tout au long du protocole expérimental. Nous logerons les souris par groupes sociaux de 2 à 4 individus, mettrons à leur disposition le matériel nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et les manipulerons quotidiennement par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les animaux des deux sexes, les testerons dans différentes tâches et appliquerons les tests statistiques adéquats. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental. Pendant les expériences, nous suivrons quotidiennement le bien-être de nos animaux, en particulier leur poids et leur posture. Nous mettrons en place des points limites afin d’éviter de faire souffrir inutilement les animaux.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Les déficits comportementaux détectés chez les souris modélisant l’autisme sont suffisamment importants et robustes pour tester la validité d’aspect du modèle et, le cas échéant, permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les déficits comportementaux fixés.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent deux injections intrapéritonéales d'hormones de superovulation, puis tous les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale après sédation, pour prélever leurs gamètes. Ces animaux ne servent pas à la recherche mais à l'entraînement de médecins et de techniciens aux techniques de fécondation in vitro. Le porteur affirme que le modèle animal est "incontournable" car il n'existe selon lui aucun autre moyen de se procurer des gamètes que de tuer des animaux.

Objectifs

L'Assistance Médicale à la Procréation (AMP) fait appel à diverses techniques biologiques telles que la préparation de sperme en vue d'assistance médicale à la procréation, la fécondation in vitro, la congélation de gamètes et d'embryons, l'ICSI (Injection Intracytoplasmique de Spermatozoïde), la vitrification d'embryons, entre autres. Ces procédures demandent une haute technicité. Les différentes techniques et en particulier celles liées aux micro-manipulations sollicitent des compétences très spécifiques. Les thérapeutiques employées par les biologistes de la reproduction sont de hauts niveaux et nécessitent des habilitations pour une optimisation et une reproductibilité des résultats. C'est pour développer ces compétences pratiques et manuelles pour tendre vers une autonomie des professionnels de santé que cette formation est proposée. Elle se veut très pratique et elle permet notamment aux apprenants de manipuler des gamètes tout au long du cursus de professionnalisation sur des postes de micro-manipulations dédiés sous l’œil de praticiens aguerris.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de satisfaire les exigences de formation des médecins, pharmaciens, scientifiques et techniciens de laboratoire sur les méthodes de fécondation in vitro, avec ou sans micromanipulation.

Procédures

Chaque femelle recevra deux injections intrapéritonéales, espacées de 48 heures et d'une durée de 30 secondes chacune.

Impact sur les animaux

-Les pratiques de contention et de manipulation peuvent engendrer de stress pour les animaux. -Douleur suite à l’introduction des aiguilles dans les sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après une sédation profonde pour le prélèvement des gamètes

Remplacement

Le modèle animal est incontournable car La réalisation de fécondation in vitro nécessite des gamètes. Il n’existe pas d’autre moyen de se procurer des gamètes que de sacrifier des animaux.

Réduction

Aucune statistique n'est nécessaire dans ce projet qui a un but éducatif. L'utilisation des hormones de superovulation a pour but de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour prélever des gamètes, en permettant d'obtenir un plus grand nombre d'ovocytes par ovulation

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes sociaux en présence d'enrichissement (igloo et matériel de nidification), la nourriture et l'eau sont ad libitum. La température et l'hygrométrie des salles d'hébergement sont contrôlées et un cycle jour/nuit 12H est en place. L'injection intrapéritonéale sera pratiquée par des personnes habituées à ce geste technique après l’application d’une pommade anesthésiante sur le site d’injection. Un suivi quotidien sera réalisé pour évaluer l'état de santé des animaux, en prenant en compte les paramètres physiologiques, le comportement et l'apparence. Cette évaluation permettra de déterminer les points limites stricts et spécifiques du projet qui, s'ils sont atteints, nécessiteront l'arrêt de la procédure.

Choix des espèces

Les souris B6-CBA-F1 présentent une très bonne réponse à l’hyperstimulation ovarienne et une spermatogenèse de très bonne qualité, permettant des recueils de gamètes favorables à la réalisation de FIV et réduisant le nombre d’animaux nécessaires Les mâles seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines) car les animaux doivent être pubères pour produire des spermatozoïdes matures fécondants. Les femelles seront utilisées en période pré-pubère (6 à 8 semaines) car c’est l’âge où la super ovulation permet de recueillir les plus d’ovocytes matures.

440 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Un psoriasis leur est induit par application d'imiquimod avec épilation, puis elles reçoivent par gavage ou injection des inhibiteurs candidats, avec des prélèvements sanguins répétés en rétro-orbitaire sous anesthésie. Le porteur décrit une contention et des gestes générateurs de stress, et prévoit l'euthanasie pour prélever rate et peau. Il revendique un "fort besoin médical" pour le psoriasis et affirme que les modèles plus simples, invertébrés, ne permettent pas de valider l'approche.

Objectifs

Les ERAPs sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour traiter les maladies auto-immunes et autoinflammatoires. Les ERAP 1 et 2 sont des amino-peptidases intracellulaires (métalloprotéases) chargées de la transformation finale des antigènes peptidiques pour présentation par les molécules du CMH de classe I. Ils régulent ainsi la réponse immunitaire adaptative par les lymphocytes T cytotoxiques (LcT) et affectent l'immunodominance en impactant le répertoire peptidique global présenté par le CMH-I. Les enzymes ERAP ont des rôles complémentaires et des fonctions importantes in vivo. Un certain nombre d'haplotypes ERAP sont liés au risque de souffrir de diverses maladies auto-immunes ou auto-inflammatoires, notamment le psoriasis. Un obstacle scientifique est la disponibilité de petites molécules inhibitrices d'ERAP efficaces, sélectives et biodisponibles. Aucun inhibiteur d'ERAP n'a été évalué in vivo jusqu'à présent et les rapports sur la modulation de l'immunopeptidome par les composés ERAP ne sont pas disponibles. L'objectif du projet est d'identifier des inhibiteurs pharmacologiques d’ERAP à travers méthodes intégrés de chimie médicinale (du criblage fonctionnel de la présentation de l'antigène combiné au profilage des immunopeptidomes dans les cellules des patients) et l’évaluation préclinique de leur efficacité thérapeutique dans un modèle de psoriasis chez des souris presentant a systeme immunitaire humain (souris BRGSF-HIS).

Bénéfices attendus

Ce projet et les composés identifiés pourraient ouvrir la voie à des traitements personnalisés des maladies autoimmunes/auto-inflammatoires. A terme, nous souhaitons proposer de nouvelles options thérapeutiques pour la psoriasis qui est maladies à fort besoin médical.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins réalisés en rétro-orbitaire, à partir de J8 et chaque 2 jours après le début du protocole de traitement avec IMQ, jusqu'au sacrifice (J16). Ces prélèvements seront effectués sous anesthésie gazeuse à l'isofluorane 2%. Le volume maximal prélevé sera égal à 200μL. Pour chaque souris, le prélèvement sanguin durera au maximum 5 minutes, y compris la durée de l'anesthésie

Impact sur les animaux

Concernant les molécules candidates qui seront administrés, leur toxicité est préalablement testée par nos partenaires et leur administration tiendra compte des études de toxicité et de pharmacodynamique afin de ne pas avoir d'effets indésirables qui pourraient interférer avec les résultats de l'expérimentation. Cependant, les souris seront soumises à des procédures pouvant générer un stress, comme la contention, afin d'effectuer des traitements de gavage oral ou des ponctions intrapéritonéales ou un prélèvement sanguin sous anesthésie à l'isoflurane à 2 %.

Devenir

A l'issue de la procedure tous les animeaux seront euthanasiés sous anesthésie à l'isoflurane à 2% afin de prélever des échantillons de rate et de peau sur lesquels seront évalués tous les paramètres histologiques et biomoléculaires nécessaires pour définir l'efficacité ou non des composés testés.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, le criblage d'une série d'inhibiteurs d'ERAP1/2 préalablement modélisés et synthétisés par l'équipe partenairesera réalisé sur des modèles cellulaires, par quantification LCMS-MS. De plus une évaluation de la sécurité sera exprimée sous la forme d'un rapport IC50 et CC50 (test cellulaire à haut contenu d'apoptose ou de nécrose (Caspase-3/7 activité Propidium iodure) et évalué la plateforme Equipex Imaginex. Les inhibiteurs candidats seront préalablement testés par des expériences de pharmacodynamiques afin de garantir une exposition et une voie optimale avant les tests chez les souris BRGSF-HIS

Réduction

Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes d'interet et les differents paramètres mesurés. Le nombre d’animaux par groupe de n= 10 est calculé par une approche statistique qui integre la dispersion des valeurs individuelles et qui a été déterminé suite à des expériences pilotes ou sur la base des précédentes publications.

Raffinement

Afin de limiter la douleur, surtout pendant la phase d'épilation, toutes les souris seront traitées avec une injection sous cutanée de buprenorphine a la concentration de 0.05 mg/Kg. Les animaux sont observés et pesés d’une manière quotidienne pour une attention particulière aux points limites suivants: -une modification du comportement (prostration, poils hérissés, cris, blessure) - une perte de poids supérieur à 15%. Les souris montrat de signe de mal-être seront euthanasiées sous anesthésie gazeuse à l'isofluorane 2%.

Choix des espèces

La souris est une espèce modèle très bien documentée dans la littérature scientifique, offrant des outils optimisés pour l’étude des réponses immunitaires et des mécanismes physiologiques intégrés. Des modèles plus simples (invertébrés) ne permettent pas de valider les approches proposées. Le modèle expérimental murin de psoriasis que nous avons choisi d’utiliser est référencé et validé scientifiquement dans de nombreuses publications. Le modèle murin est donc le plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants tout en évitant au maximum la douleur et la souffrance chez l’animal. De plus, la souris BRGSF représente le modèle le plus immunodéficient généré à ce jour, avec un défaut des compartiments lymphoïde et myéloïde murin et représente donc un modèle animal fortement adapté pour la xénogreffe su systeme immunitaire humaine. La souris BRGSF représente le modèle immunodéficient plus efficace généré à ce jour, avec un défaut des compartiments lymphoïde et myéloïde murin, et représente donc un modèle animal fortement adapté pour la xénogreffe de tumeurs humaines et/ou du système immunitaire. L'inflammation cutanée de type psoriasis induite par l'Imiquimod (IMQ) semble liée à une production de cytokines, notamment d'IL23, par les cellules dendritiques. Dans le modèle BRGSF-HIS, nous proposons un boost de cellules dendritiques en utilisant hFlt3L. Comme les souris n'expriment pas ERAP2, l'utilisation d'une version humanisée semblerait être un solution pertinent pour tester les effets des nouvelles molécules basées sur l'inhibition des ERAPs dans la psoriasis. Le souris BRGSF-HIS seront utilisée a 12 semaine de vie, qui représentent le temps pour une reconstitution optimale d'un système immunitaire humain.

480 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart réutilisées pour d'autres enseignements, une vingtaine gardées en élevage, une cinquantaine adoptées et une dizaine tuées. Des étudiants de BUT apprennent sur elles les gestes de base, préhension, contention, prise de température, pesée et identification, puis cinq tests comportementaux nommés, planche à trous, traction, cheminée, rotarod et transition clair-obscur. Le porteur indique que les cadavres servent ensuite à des travaux pratiques d'anatomie et que l'adoption reste possible avec l'accord du vétérinaire. Il justifie le choix de la souris par le fait qu'elle représente la majorité des animaux utilisés en expérimentation.

Objectifs

L’objectif général du Bachelor Universitaire de Technologie, Génie Biologique, parcours Biologie Médicale et Biotechnologie (BUT GB BMB) est de former des jeunes au métier de technicien supérieur ou d’assistant ingénieur qui exerceront des activités dans les domaines de la santé humaine et animale, des biotechnologies, des industries pharmaceutiques et de la toxicologie. L'objectif du projet « Situation d’Apprentissage et d’Evaluation : Organiser et mettre en place une procédure d’expérimentation animale dans le cadre de la règlementation en vigueur » est de répondre aux contraintes du programme national du BUT GB BMB avec notamment comme apprentissage critique : l'acquisition des gestes de base sur la souris de laboratoire. Au cours de leur 1ère année d’études, les étudiants devront donc faire l'acquisition des gestes suivants : identification, préhension, contention, injections, prélèvements, prise de la température et tests comportementaux basiques pour évaluer les aptitudes psychomotrices et la bonne santé des animaux.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet pédagogique, les étudiant.es de BUT GB BMB pourront bénéficier d’un apprentissage pratique sur animaux vivants des gestes techniques de base sur la souris qui viendra en complément d’approches virtuelles et sur maquettes. Le suivi et le soin des souris sur 3 semaines permettra de sensibiliser par la pratique la notion importante de bien-être animal et les bonnes pratiques de laboratoire. Cette activité pédagogique concerne particulièrement les souris et par conséquent, les étudiant.es acquériront des connaissances pratiques sur cette espèce, dans le cadre de la mise en place de procédures d’expérimentation animale dans le cadre de la règlementation en vigueur. Par ailleurs, ce projet a été conçu dans le cadre d’apprentissages critiques du BUT GB BMB pour la formation de futurs technicien.nes ou assistant-ingénieur.es. Enfin, les données produites lors de ces activités (prises de poids, données de tests comportementaux…) seront utilisées pour l’analyse de données (tests statistiques) concernant d’autres apprentissages critiques du BUT GB BMB.

Procédures

Séances de 1 à 6 : Préhension- Prise de température : animaux vigiles, 2 par séance et par animal (12 fois/ animal réparties sur les 6 séances annuelle), 5 minutes Préhension-Pesée : animaux vigiles, 1 par séance et par animal (6 fois/ animal réparties sur les 6 séances annuelle), 2 minutes Préhension-Identification : animaux vigiles, 1 fois à la séance 1 de l’année en cours, par animal, 4 minutes. Séances 4 et 6 : réalisation de 5 tests comportementaux consécutifs sur animaux vigiles, espacés de 10 minutes, pour chaque souris. Test de la planche à trous (PT) : Dépôt d’une souris au centre du dispositif et dénombrement des trous visités pendant 5 minutes. Ce test est répétés 4 fois, soit 20 minutes par souris. Test de la traction (T) : Présentation du fil tendu à la souris et observation. Une souris en bonne santé effectue un rétablissement en 5 secondes voir moins. Le nombre d'animaux ayant eu une réponse positive (rétablissement en moins de 5 secondes) ou négative (rétablissement en plus de 5 secondes). 10-15 secondes maximum par souris. Test de la cheminée (C) : Les souris sont introduites dans un tube. Une fois arrivée à l’extrémité du tube, on bascule celui-ci verticalement. La souris en ressort à reculons. Le temps de sortie des souris est mesuré. 10-15 secondes maximum par souris. Test de coordination motrice ou test de la roue tournante (Rotarod ou R) : L'animal est placé sur le tambour du ROTAROD et le temporisateur démarre. Lorsque l'animal tombe, le temps de tenue en équilibre (en minutes et secondes) et la vitesse de rotation sont enregistrés pendant 5 min. Test d’anxiété de transition clair/ obscur ou « Dark and light transition » : Les souris seront habituées à la salle d’expérimentation avant le test d’anxiété. La souris est placée au milieu de la zone claire et laissée libre de mouvements pendant 5 minutes.

Impact sur les animaux

Etant donné que les étudiant.es seront inexpérimenté.es à la manipulation de souris vigiles, il sera possible que ces dernières ressentent du stress. Cependant, l’encadrement mis en place lors de ce projet, à savoir 3 encadrant.es lors des séances de manipulation des souris vigiles, permettra de contrôler et d’éviter des risques de blessures pour les animaux, mais aussi pour les étudiant.es. Trois tentatives de contention manuelle maximum pour chaque souris par étudiant.e seront fixées pour éviter de générer du stress. Tous les tests comportementaux que nous avons choisis sont basés sur des comportements et aptitudes naturels chez la souris et ne généreront donc à priori aucun effet néfaste.

Devenir

Tous les animaux qui ne seront ni adoptés ni réutilisés vivants pour une autre activité pédagogique, seront mis a mort. Ainsi, les cadavres serviront au travaux pratiques d'anatomie. Si les animaux peuvent servir à d'autres travaux pratiques, alors les souris seront gardées en vie. De plus, si des étudiants souhaitent adopter leurs animaux alors cela sera possible. Cette décision sera prise avec l'accord de la Structure de Bien Etre des Animaux et du vétérinaire référent si besoin et avec le responsable du projet.

Remplacement

Dans le cadre des apprentissages critiques concernant l’expérimentation animale dans la formation du BUT GB BMB, nous avons mis en place des méthodes alternatives pour l’anatomie (utilisation de maquette et de table numérique Anatomage), les gestes basiques (modèles en silicone, peluches pour l'apprentissage des injections et prélèvements…). Ce projet a été ainsi conçu avec le minimum possible d’animaux. Cependant, il apparaît incontournable de réaliser quelques gestes de bases sur souris vigiles dans ce contexte de formation de futurs personnels de laboratoire. Le modèle « souris », car le plus utilisé dans les projets d’expérimentation animale à des fins scientifiques, nous semble le plus pertinent pour ce projet pédagogique. Le remplacement total d’animaux vivants semble difficile pour le bon apprentissage de l’expérimentation animale.

Réduction

Une promotion d’étudiant.es s’élève à 48 maximum par an et elle est divisée en 4 groupes de TP de 12, puis en binômes de travail. Chaque binôme devra à la 1ère séance constituer 2 lots de 2 souris (Curieuses et non curieuses). Ces lots serviront à toutes les séances de travaux pratiques. En conséquence, le nombre maximum de souris s’élévera à 96 par an, soit 480 sur 5 ans. La taille des lots (2 souris) est la plus petite possible pour que l’enseignement soit bénéfique. Il ne permettra pas de réaliser des tests statistiques à l’échelle du binôme, mais sera possible à l’échelle de la classe.

Raffinement

Les souris sont hébergées par lot de 2, dans des cages dont la taille est règlementaire, avec enrichissement modifiable (tubes, feuilles de papier ouaté, dômes…). Cet hébergement sera réalisé dans une animalerie en conditions contrôlées (éclairement, température, hygrométrie) et dans le respect de la méthode des 3R. Seules des femelles seront utilisées pour éviter les comportements agressifs dans les cages. Un suivi de soin journalier sera effectué durant toute la période d'hébergement. De plus, les etudiant.es procéderont à un suivi pondéral, de température, ainsi qu’à des soins bi-hebdomadaires. Par ailleurs, les animaux ne seront pas manipulés tous les jours ce qui leur permettra de récupérer entre 2 séances de travaux pratiques. Les format.eurs.rices sont des experts en expérimentation animale, maitrisant tous les gestes basiques sur souris, ce qui donnera des conditions d’apprentissage optimales. Le nombre de séances (6) permettra une socialisation, voire une habituation des souris aux expérimentateurs (ici les étudiant.es), ce qui conduira à une diminution et même une suppression du stress et apportera donc un raffinement supplémentaire. Notamment, l’utilisation de la prise de température en début et en fin de séance permettra d’évaluer quantitativement le stress (« stress-induced hyperthermia », un indicateur reconnu du stress chez les rongeurs) produit par les séances de travaux pratiques. Ainsi, les étudiant.es pourront adapter leur comportement (calme, douceur dans les gestes…) à partir de ces données. Dans les cages, des tubes (enrichissement) seront disposés dans lesquels les souris pourront se cacher. Ce qui permettra de les déplacer sans contraintes vers les dispositifs de tests comportementaux.

Choix des espèces

61% des animaux utilisés à des fins scientifiques ou réglementaires (toxicologie…) sont des souris. Ainsi, le modèle souris est le plus fréquemment utilisé en expérimentation animale. Ce modèle est donc le plus pertinent pour former de futurs technicien.nes aux gestes de bases. Les rats, moins utilisés (9%), sont moins intéressants pour l’apprentissage, car plus impressionnants pour des débutants. Nous avons choisi d’utiliser la souche swiss, car elle présente un comportement plus docile qui facilite l’apprentissage. Les individus seront tous femelles pour éviter les comportements agressifs dans les cages. Les souris sont commandées à l’âge de 6 semaines, soit de jeunes adultes. A cet âge, il est possible de suivre une augmentation du poids de façon relativement homogène.

5000 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à terme. Chaque poisson subit sous anesthésie une biopsie de la nageoire caudale (fin clip) pour prélever son ADN et le génotyper, puis reste isolé jusqu'à quinze jours. Les individus non retenus sont euthanasiés et ceux conservés comme reproducteurs sont gardés jusqu'à dix-huit mois avant d'être tués à leur tour. Le porteur indique que le travail sur le génome ne peut se faire que sur un "organisme entier" et signale que certaines nouvelles lignées peuvent développer des phénotypes dommageables comme une scoliose ou un retard de croissance.

Objectifs

L’élevage et le maintien de lignées sont nécessaires à de nombreux projets scientifiques qui mènent leurs travaux de recherche sur le poisson zèbre au stade embryonnaire. Pour que les animaux soient des reproducteurs intéressants nous devons les choisir en connaissant leur patrimoine génétique. Pour ce faire nous devons avoir accès à leur ADN. Le prélèvement qui est alors pratiqué est ce que l’on appelle le « fin clip ». Ce geste consiste à faire une biopsie de moins de 3 millimètres de la nageoire caudale des poissons de plus de 3 mois de manière à récupérer l’ADN qui se trouve dans ce tissu. Lors de création de nouvelles lignées ou de nouveaux croisements entre mutants, dont nous ne connaissons pas encore la résultante phénotypique, les poissons peuvent pour certains avoir un phénotype qui serait qualifié de dommageable. L’impact que l’on peut avoir aux vues des maladies ciblées vont être des impacts sur la reproduction : retard de croissance, mort subite ou anomalies au cours du développement, diminution de la fécondité, anomalies physiques (déformations de la colonne de type scoliose). Une évaluation de ces observations sera faite en accord avec la SBEA (Structure chargée du Bien-Être Animal) pour suivre les animaux et éviter toute souffrance. Une évaluation éthique complémentaire sera alors demandée Ne seront prélevés, que les animaux que nous pensons pouvoir élever par la suite sans impact important sur la nage, la capacité à se nourrir et à se reproduire.

Bénéfices attendus

Le prélèvement tissulaire permet d’accéder à de l’ADN en quantité suffisante pour réaliser un génotypage complet ou pour rechercher les séquences génétiques d’intérêt. Ce travail permet de connaître le génome du poisson et de rapprocher ces informations génétiques des signes cliniques, des modifications histologiques et moléculaires étudiés. Ces corrélations vont permettre de mieux appréhender certaines maladies du système nerveux chez l’Homme.

Procédures

Les animaux ont un prélèvement cutané unique au niveau de la nageoire caudale qui dure moins d’une minute par poisson, inférieur à 3 mm réalisé sous anesthésie, cela nécessite une prise en charge de 3 à 5 minutes par poisson avec la surveillance du réveil. Les poissons demeurent ensuite isolés au plus 15 jours dans des bacs cloisonnés au sein du système commun d’hébergement. Exceptionnellement pour les poissons hébergés dans la pièce de quarantaine, si un prélèvement de ce type doit être réalisé, il suivra le même procédé et l‘isolement aura lieu en dehors du système, dans un aquarium plus petit, dont l’eau sera renouvelée tous les 2 jours après le nourrissage pour en préserver les qualités physico-chimiques.

Impact sur les animaux

Les poissons vont être pêchés à l’épuisette provoquant un stress et un frottement sur le corps de l’animal. Une biopsie cutanée de moins de 3 millimètres va être faite au niveau de la nageoire caudale provoquant un léger traumatisme avant cicatrisation et régénération en 2 semaines. Ils seront maintenus isolés jusqu’à l’obtention des résultats de l’analyse génétique. Cet isolement se fait dans le système pour leur garantir un environnement contrôlé et dure au maximum 15 jours. Si le prélèvement doit avoir lieu en quarantaine, ce qui est très rare, l’isolement se fera en dehors du système avec un changement d’eau tous les 48hrs et au maximum pendant une dizaine de jours. Le risque lié à l’anesthésie est présent mais reste limité car l’anesthésie n’est pas une anesthésie très profonde ni très longue. Si des symptômes en relation avec les manipulations génétiques apparaissaient de manière répétée, nous pourrions avoir l’émergence d’un phénotype dommageable tel que des anomalies au cours du développement (mort prématurée, malformation) ou des signes cliniques visibles une fois le poisson développé (malformations sur la colonne vertébrale (scoliose), des retards de croissance, des absences ou modifications de certaines organes ou fonctions…), ces effets indésirables seront évalués au fur et à mesure des lignées et pourront faire l’objet d’une évaluation éthique complémentaire s’ils semblent s’installer sur une lignée de poisson.

Devenir

Nous ne conserverons que les animaux avec le patrimoine génétique d’intérêt, les autres seront euthanasiés. Ces poissons seront regroupés en fonction de leur génotype et maintenus en tant que reproducteurs pour obtenir œufs et larves d'intérêt. Les animaux seront gardés jusqu'à l'âge de 18 mois, puis euthanasiés.

Remplacement

Le travail sur le génome corrélé à l’expression clinique (symptômes physiques), histologique et moléculaire (analyses des tissus), ne peut se faire que sur un organisme entier. Le poisson zèbre a 70% de son génome qui est commun à l’Homme d’où l’intérêt de pouvoir l’utiliser comme modèle pour la recherche scientifique. Les modifications génétiques sont bien maitrisées dans ce modèle animal et cela permet d’explorer de nouvelles pistes de recherche, et mettre en lumière de meilleures possibilités de traitement pour les maladies qui impliquent ces parties du génome notamment ici les maladies neurologiques.

Réduction

Les poissons génotypés sont les poissons qui sont issus de croisement d’intérêt ou qui ont eu des injections pour modifier leur génome au stade de l’œuf. Nous utilisons un minimum de 10 couples pour maintenir une lignée. Nous entretenons environ 200 lignées. Nous réaliserons ce geste au maximum sur un total de 5000 poissons au cours de ce projet qui doit courir sur 5 ans. En effet le nombre d’œufs par ponte peut être important, mais c’est une espèce qui accuse toujours une perte conséquente d’individus au cours du développement larvaire, et suite aux injections destinées à obtenir les modifications génétiques recherchées. Nous ferons le prélèvement sur les animaux de taille adaptée (corps d’une taille de 2 cm minimum) et qui semblent en apparente bonne santé pour ensuite être destinés à la reproduction. Ces croisements doivent générés des œufs et des larves qui seront inclus dans des recherches sur le développement, le phénotype, le comportement ou encore en imagerie.

Raffinement

L’hébergement est fait dans des aquariums de 3.5L (densité de 20 poissons maximum par aquarium) en groupe constitués à partir des connaissances génétiques et contient un sexe ratio si possible à 50-50. L’eau du système est contrôlée et circule de manière automatisée. Des contrôles indépendants de la qualité de l’eau sont réalisés en plus, régulièrement. Les animaux sont nourris plusieurs fois par jour à la fois avec une nourriture sèche et une nourriture vivante, pour que le comportement de prédation puisse s’accomplir. Les cultures, l’eau et les poissons font l’objet d’un contrôle sanitaire tous les 4 mois. Un cycle lumineux est mis en place 14-10 avec un changement progressif (aube et crépuscule). Un enrichissement visuel est prévu sur les paillasses pour limiter l’éblouissement (sticker de graviers). Lors des mises en accouplement des bacs spéciaux, mimant une plage sont utilisés pour favoriser le fraie et la récupération des œufs. De l’enrichissement social est également disponible à l’animalerie, en élevant des poissons sauvages physiquement différents de manière à pouvoir compléter les effectifs pour éviter les animaux isolés et maintenir les animaux au moins par 3 en conservant la possibilité de les reconnaitre facilement. La biopsie de la nageoire a lieu sur des animaux en apparente bonne santé, ayant atteint un développement (environ 3 mois, taille corporelle de 2 cm) qui limite le risque de l’anesthésie. Les gestes sont réalisés dans le calme et par des personnes formées (tutorat et vérification régulière de la pratique). L’utilisation de l’épuisette se fait avec des mouvements tranquilles et respectueux de l’animal pour limiter le stress. Les conditions environnementales sont adaptées à l’espèce et contrôlées par un système automatique. Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. Toute anomalie est rapidement signalée, prise en charge et tracée. Si un phénotype dommageable émerge au cours du suivi, il sera évalué, et un avis éthique complémentaire sera demandé.

Choix des espèces

Le zebrafish a une reproduction rapide et efficace qui se déroule à l’extérieur du corps des animaux adultes (ovipares). Les spermatozoïdes du mâle et les ovules de la femelle sont émis de manière concomitante dans le milieu extérieur pour assurer la fécondation qui conduit à la formation des œufs. Ces œufs, puis l’embryon qui s’y développe, sont transparents ce qui permet un accès très facile à ces cellules pour en modifier le génome lors des premiers stades de développement pour obtenir des animaux génétiquement modifiés (mutants, perte ou gain d’ADN). Ce travail va pouvoir être rapproché de ce qui se passe dans le génome humain lors de certaines maladies impliquant la génétique. Ces modifications vont avoir des conséquences moléculaires, cellulaires, histologiques et anatomiques qui vont pouvoir faire progresser les connaissances et aider à l’émergence de nouvelles pistes pour la recherche médicale. Les animaux seront en général prélevés aux alentours de l’âge de 3 mois (exceptionnellement sur des animaux de 2 mois mais ayant atteint une taille suffisante, autrement dit 2cm de long, nageoires non comprises). Cela nous permet d’avoir trié et conservé à un stade précoce, les animaux qui nous semblent en mesure d’assurer la génération d’œufs et de larves pour permettre les recherches scientifiques. Cet âge assure également une gestion plus facile de l’anesthésie par rapport aux stades plus jeunes.