Procédures légères

200 xénopes vont être utilisées, gardées en vie et réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent une injection d'hormone dans les sacs lymphatiques du dos pour provoquer la ponte, avec une contention à pleine main pour récolter les ovocytes, le porteur imposant six mois de repos entre deux pontes. L'objet est d'étudier le rôle de protéines, les histones, dans le développement embryonnaire, en lien avec des tumeurs de l'enfant. Le porteur affirme utiliser aussi des cellules humaines in vitro mais conclut que la régulation à l'échelle de l'organisme entier ne peut être modélisée en culture.

Objectifs

Notre information génétique est contenue sous forme de molécules d’ADN dans les noyaux de nos cellules. L’ADN est compactée en une structure dynamique appelée chromatine et cette organisation épigénétique est indispensable au bon fonctionnement des cellules. L’unité de base de la chromatine est le nucléosome, qui comprend de l’ADN enroulé autour de protéines appelées histones. Ces histones, qui sont critiques pour la régulation de l’expression des gènes, sont par ailleurs retrouvés mutés dans des formes de cancer très agressif, comme les glioblastomes pédiatriques. Dans une perspective tant scientifique que sociétale, il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes moléculaires associés aux histones dans ces fonctions cellulaires et au cours du développement de l’organisme.

Bénéfices attendus

Xenopus laevis, espèce non mammifère, est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés tétrapodes, notamment grâce à son développement embryonnaire externe et le grand nombre d’embryons qu’on peut produire par expérience. Il représente donc un outil précieux pour mieux comprendre les processus développementaux des modèles tétrapodes mammaliens dont l’homme. L’analyse du génome de xénope montre d’importantes similitudes avec le génome humain - près de 80% des gènes identifiés dans des maladies humaines sont aussi conservés chez le xénope. Parmi ces facteurs très conservés on retrouve les histones. Les mutations des histones sont fréquemment retrouvées dans certaines formes de tumeurs cérébrales très agressives et de tumeurs osseuses de l’enfant et jeune adulte. Ces mutations apparaissent très tôt au cours de la vie et les dérégulations épigénétiques associées perturbent le bon développement embryonnaire et favorisent la tumorigénèse. Introduire ces mutations responsables de pathologies humaines dans l’embryon de xénope et caractériser leurs effets moléculaires, cellulaires et développementaux permet de mieux comprendre la biologie de ces tumeurs et in fine améliorer le traitement des patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à l’injection sous cutanée d’une substance non toxique et indolore en une seule administration (durée du geste inférieur à 20 secondes).

Impact sur les animaux

L’ovulation des xénopes femelles est induite par l’injection d’hormone gonadotrope chorionique dans les sacs lymphatiques dorsaux. Ceci implique le stress de l’animal dû à la contention pendant le geste technique et la douleur de la piqure. Les femelles en stimulation sont ensuite remises séparément dans des bacs situés à l’écart, dans une pièce isolée du passage des personnels afin d’éviter toute forme de stress qui risquerait de compromettre le succès de la ponte. La récolte des ovocytes nécessite une contention de la femelle à pleine main tout en dirigeant le cloaque vers la coupelle où les œufs doivent être déposés. Cette manipulation, plutôt délicate, nécessite de la dextérité et un peu d’habitude, afin de minimiser le stress généré chez l’animal, et est réalisée par des expérimentateurs préalablement formés.

Devenir

Animaux gardés en vie. Les femelles seront maintenues en hébergement et seront utilisées à nouveau dans des projets de recherche, selon les besoins et avis du vétérinaire.

Remplacement

Les mutations des histones touchent une partie de la protéine qui est importante pour sa fonction. Plusieurs mutations ont été découvertes et de façon frappante, elles sont associées avec des types de tumeurs spécifiques, des localisations différentes et des âges différentes des patients. Afin de caractériser les effets de ces différentes mutations, nous utilisons des approches parallèles et complémentaires. Nous avons établi des modèles de cellules humaines dans lesquelles nous avons introduit ces mutations spécifiques de différents types de tumeurs. Ceci nous permet d’analyser et comparer leurs effets génomiques et épigénomiques, moléculaires et cellulaires, et de générer des hypothèses sur le mode opératoire des histones mutantes. Cependant la régionalisation tumorale, en termes de localisation mais aussi d’âge des patients implique des régulations développementales fines au niveau de l’organisme entier, qui ne peuvent pas être modélisées dans des cellules en culture. Le xénope présente un avantage considérable en termes de 3R - le développement ex utéro des embryons présente la possibilité d’une observation non-invasive à tous les stades.

Réduction

L’utilisation d’animaux vivants dans ce projet revêt un caractère de stricte nécessité pour les raisons suivantes : - L’induction hormonale de la ponte constitue la seule méthode pour obtenir en grande quantité des embryons. De plus le recours à la fécondation in vitro permet d'obtenir le développement synchrone des embryons et des stades précis, en nombre suffisant pour satisfaire aux analyses statistiques (tests de conformité à un standard). -D'autre part, il s'agit de la seule façon d’obtenir des ovocytes matures/oeufs de manière non invasive (sans chirurgie). Pour réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet, nous prenons en compte que : -Nos analyses fonctionnelles sont restreintes aux stades embryonnaires antérieurs à la forme larvaire autonome. -Les femelles ont une période reproductive longue (15 ans et plus), et peuvent donc être induites à pondre de nombreuses fois pendant cette période. Ceci permet donc de restreindre le nombre d'animaux utilisés. -Par ailleurs, bien que la mise à mort d’animaux qui n’ont subi aucun geste expérimental et qui ne présentent pas de phénotype dommageable ne nécessite pas d’autorisation de projet, il est à noter que les testicules des mâles euthanasiés disséqués pour la fécondation in vitro sont utilisés pour plusieurs expériences et par plusieurs expérimentateurs minimisant ainsi le nombre de mâles euthanasiés.

Raffinement

Dans le but de réduire le plus possible toute douleur, souffrance ou stress, nous imposons une période de repos de 6 mois aux femelles entre deux pontes.

Choix des espèces

Le xénope occupe une place phylogénétique-clé (vertébré tétrapode non-mammifère) et est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. C’est le premier génome amphibien séquencé et l’analyse montre d’importantes similitudes avec le génome humain, notamment 79% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont leur orthologues chez Xenopus. X. laevis est un modèle de choix en biologie du développement, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses d’embryologie expérimentale dès la fécondation et une observation non-invasive à tous les stades. Tout comme le poisson zèbre, le xénope fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Il s’agit d’animaux adultes ayant atteint la maturité sexuelle pour qu’ils puissent se reproduire.

30 lapines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 25 destinées à l'adoption et 5 environ euthanasiées. Chaque animal est anesthésié et rasé sur le ventre, puis des poux humains sont déposés sur sa peau pour se nourrir de son sang pendant une heure, à raison de trois gorgements par semaine pendant cinq ans. L'objet est de maintenir un élevage de poux de corps humains pour l'étude des maladies qu'ils transmettent. Le porteur indique n'avoir trouvé aucune membrane artificielle capable de nourrir ces poux et retient le lapin, décrit comme "docile" et de grande taille, comme hôte.

Objectifs

L’élevage des poux humains est bien établi dans notre unité depuis 15 ans. Grace à cet élevage et à coté des agents connus, le rôle du pou de corps dans la transmission de plusieurs agents infectieux autresà été démontré. Cet élevage de poux est primordial pour l’étude de certaines maladies vectorielles d’où l’intérêt de ce projet. Les poux sont des ectoparasites hématophages. Le lapin est utilisé comme hôte, permettant de fournir 3 repas sanguins par semaine nécessaire au développement des poux.

Bénéfices attendus

Il permettra de maintenir une souche de poux du corps humain (Pediculus humanus corporis) nécessaire pour différents projets de recherche évaluant les interactions entre les pathogènes et le vecteur (poux) dans la transmission des maladies humaines et animales

Procédures

Les lapins seront anesthésiés par voie intramusculaire par un cocktail de kétamine/xylazine puis la profondeur de la narcose sera contrôlée (réflexe palpébral, dépression respiratoire). L'animal sera alors placé dans la gouttière où se trouve un tapis chauffant et un onguent ophtalmique (Ocrygel) lui sera appliqué. Le ventre sera rasé à la tondeuse et désinfecté à l'alcool chirurgical puis les poux y seront déposés pour un gorgement d'une durée maximale d'une heure. L'animal sera continuellement surveillé pendant la procédure afin de détecter tout signe d'éveil, qui entraînerait l'arrêt immédiat de la manipulation. A la fin du gorgement, tous les poux sont récupérés et l'animal est nettoyé à l'aide d'un aspirateur à faible puissance afin de s’assurer qu’il ne reste pas de poux. Sa peau est de nouveau nettoyée avec une compresse légèrement imbibée d'antiseptique puis l'animal est remis dans sa cage. Il sera surveillé régulièrement jusqu'à son réveil. Les piqûres de poux ne causent généralement pas de gêne à l'animal mais toute manifestation d'inconfort entraînera l'application d'une crème anti-démangeaisons (Cortapaisyl).

Impact sur les animaux

Aucun

Devenir

La procédure étant légère, les animaux en fin de projet qui ne sont pas trop agressifs seront adoptés. Cela représente la majorité des lapins (soit 25/30). Sur 30 lapines utilisées sur les 5 ans, 5 en moyenne doivent être euthanasiés

Remplacement

Aucune alternative de remplacement des lapins pour l’engorgement des poux n’est actuellement disponible, malgré les différents essais que nous avons réalisés dans notre laboratoire pour gorger les poux sur des membranes artificielles comme c’est le cas des moustiques, puces, punaises de lit et triatomes que nous élevons également au sein de notre laboratoire

Réduction

Seulement six lapins seront utilisés par an en alternance pendant la durée totale de ce projet (60 mois), ce qui fait un total de 30 lapins. Les poux doivent être nourris 3 fois par semaine, les lapins seront utilisés en alternance pour chaque gorgement. Approximativement, chaque lapin sera donc utilisé 2 fois par mois, soit 24 fois par an.

Raffinement

La totalité de la procédure se déroulera sous anesthésie . Le dessèchement de la cornée sera soulagé par l'application d'un onguent ophtalmique (Ocrygel) et les éventuelles démangeaisons conséquentes aux piqûres de poux seront apaisées par une crème anti- démangeaisons (Cortapaisyl). Les lapins sont visités chaque jour y compris les week-end et jours fériés pour s’assurer que les animaux ont de la nourriture et de l’eau. Ils seront manipulés en dehors des procédures expérimentales, dans un espace calme, par du personnel formé et habitué. Les cages de chaque lapin seront enrichies avec du foin et des jouets en bois. Malgré cette surveillance pour réduire les douleurs et le stress, si nous constatons qu’un animal présente des signes de souffrance tels qu'une détresse respiratoire, prostration, atonie, ou un défaut d’alimentation avec une perte de poids >20%, l'animal sera isolé pour des soins. Si nous observons aucune amélioration il sera euthanasié par surdosage d'Euthasol.

Choix des espèces

Le lapin (New Zealand) est l’espèce animale la plus appropriée pour nourrir les poux, compte tenu du fait que c’était l’espèce qui a été utilisée pour adapter et établir un élevage de poux de corps humain au laboratoire. Ces lapins sont de grande taille à l'âge adulte et permettent de nourrir un grand nombre de poux en une seule fois. Par ailleurs, ils sont dociles et donc faciles à manipuler, ce qui est un avantage quand on doit travailler avec ces animaux trois fois par semaine. Ce projet n'inclura que des lapins adultes en raison de leur taille. La taille de leur ventre permettra de nourrir plus de poux en une seule fois et d'utiliser moins d'animaux.

60 lapines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart euthanasiées par ponction cardiaque terminale, celles dont la réponse immunitaire est jugée insuffisante pouvant être replacées. Elles reçoivent deux injections d'un vaccin expérimental puis deux prélèvements de sang à l'oreille, pour produire des sérums riches en anticorps. L'objet réel est de sélectionner la composition d'un futur vaccin anti-rotavirus destiné aux porcs d'élevage. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour obtenir ces sérums polyclonaux et retient le lapin comme "espèce alternative classiquement utilisée".

Objectifs

De très nombreux sérotypes de rotavirus sont susceptibles d’infecter les porcs d'élevage causant des pertes économiques à toute la filière et affectant sérieusement le bien-être et la santé des porcelets. Il n'y a pas à ce jour de solution vaccinale satisfaisante. La grande variabilité génétique de cette espèce sur le terrain, engendre une variabilité de protection apportée par les approches classiques monovalentes de vaccination à partir d’antigènes anciens et non ciblés.L'objectif de cette recherche est d'obtenir des sérums hyper-immuns, en vue de réalisation de test in vitro de seroneutralisation pour investiguer les réaction immunitaires croisées entre différentes souches de rotavirus issues du terrain. Ces tests permettront de déterminer la composition optimale d'un vaccin spécifiquement adapté aux rotavirus prévalents actuellement en Europe. Ce vaccin sera utilisé pour vacciner les mères, qui transmettront alors aux porcelets leurs anticorps maternels. Ces anticorps protègeront les porcelets de la maladie dans leurs premiers jours de vie, période de sensibilité maximale au rotavirus. Il s'agit d'une transmission passive d'anticorps de la mère à la descendance, leur conférant un panel complet d'anticorps polyclonaux, approche immunitaire la plus efficace en matière de protection.

Bénéfices attendus

Ces tests permettront de caractériser les protections croisées pouvant exister entre les souches circulant sur le terrain, puis de sélectionner les souches de virus pertinentes pour le développement d'un vaccin ciblé et efficace, et les assemblages d’antigènes apportant un élargissement optimal du spectre de protection vaccinale.

Procédures

Pour tous les animaux (60) : injection d’un vaccin expérimental adjuvé: 2 injections sous-cutanées en un point entre les épaules à 4 semaines d'intervalle (environ 5 secondes); 2 prélèvements de sang à 3 semaines d'intervalle (2 mL, veine marginale de l'oreille, animal vigile, environ 10 secondes).

Impact sur les animaux

Hormis les 2 injections des vaccins expérimentaux (1 mL par injection, injection sous-cutanée en un point à chaque fois, entre les épaules) et les 2 prélèvements de sang (artère auriculaire), aucune nuisance particulière n'est attendue sur les animaux. Les virus entant dans la composition du vaccin étant inactivés, et l’adjuvant étant classiquement utilisé dans le cadre de vaccins commerciaux, aucune réaction générale n’est attendue. Comme lors de toute administration de vaccin, de légères réactions locales transitoires ne sont pas à exclure.

Devenir

Tous les animaux dont les réponses immunitaires donnent des taux d'anticorps exploitables pour les séroneutralisations seront euthanasiés. Les animaux dont la réponse immunitaire n'est pas satisfaisante pourront être replacés si possible.

Remplacement

Il n'y a pas de méthode alternative permettant d'obtenir les sérums requis par le projet. L’administration de vaccins expérimentaux dont les antigènes sont des virus entiers permet d’obtenir un panel d’anticorps polyclonaux représentatif des réactions immunitaires réelles sur le terrain. L'étude de séroneutralisation doit se faire avec ces anticorps polyclonaux, l'utilisation d'anticorps monoclonaux ne serait pas représentative de la réaction immunitaire complète de l'animal in-vivo. Dans le cadre du projet global de développement à long terme d'un vaccin pour les mères afin de transmettre leurs anticorps aux petits, la solution vaccinale apporte une réponse plus efficace et plus simple que d'administrer des anticorps monoclonaux anti-rotavirus directement aux porcelets (plus large spectre, plus rapide à produire, mise en application plus simple et plus éthique de vacciner les mères).

Réduction

Le nombre minimum d'animaux par groupe (3 animaux) est proposé pour tenir compte des différences individuelles de réponse immunitaire. De plus, la quantité de sérum obtenue par lapin (10 mL) à J49 est suffisante pour permettre de réaliser de nouveaux tests de séroneutralisation dans les années futures si de nouvelles souche virales émergeaient et devaient être testées (aliquotage des sérums prélevés, avant conservation à -80°C pour constitution d'une sérothèque). La constitution de cette sérothèque évitera d’utiliser d'autres lapins pour obtenir de nouveau de tels sérums.

Raffinement

Les sérums seront obtenus sur lapin EOPS et non pas sur porc (espèce cible du vaccin) car l’obtention de sérum hyper-immuns à partir de porcs nécessiterait l'hébergement de ces animaux sur une période plus longue (le temps que les animaux deviennent immunocompétents). De plus, la source de lapins EOPS utilisée sera confirmée exempte de rotavirus, alors qu’il n'existe pas de porc EOPS sans anticorps anti-rotavirus. L'utilisation de porcs serait très risquée techniquement (la présence d’anticorps anti-rotavirus nuirait au développement de la réaction immunitaire recherchée) et de nature à susciter des répétitions d’étude. Les animaux seront hébergés de façon collective, par groupes de 3, ceci leur permettant d'exprimer leur comportement grégaire. Même si à J0 les animaux seront non matures (âge 10 semaines), seules des femelles seront utilisées pour éviter les comportements agressifs entre mâles. Le prélèvement cardiaque final se fera sur animal non vigile après euthanasie et vérification de l'arrêt cardiaque. Tous les animaux seront observés quotidiennement pour surveiller leur état de santé et d’éventuelle réaction locale. En cas de dégradation de leur santé une euthanasie est prévue afin d’éviter toute souffrance. Enrichissement : Mise en place de tuyaux en PVC, diffusion de musique, distribution de pebble toys (gallettes de fruits compressés) pour enrichir le milieu des animaux.

Choix des espèces

Le lapin est une espèce alternative classiquement utilisé pour l'obtention de sérum. Ce sont des lapins EOPS (exempts d'organisme pathogènes spécifiques), notamment sans anticorps rotavirus ce qui interfèrerait avec la procédure. Animaux de 10 semaines afin que leur système immunitaire soit mature .

325 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés la semaine suivante dans une autre séance de travaux pratiques. Chaque étudiant reçoit un rat, lui administre une injection intrapéritonéale d'anesthésique et évalue la profondeur de l'anesthésie, le risque décrit étant une surdose provoquant un arrêt cardio-respiratoire. Le projet sert la formation d'étudiants au suivi d'une anesthésie, dans le cadre d'un programme pédagogique national. Le porteur indique que la réutilisation dépendra de l'état clinique des animaux et de l'avis du vétérinaire.

Objectifs

Dans le cadre du programme pédagogique national de notre formation, les étudiants doivent acquérir différentes compétences, notamment celle de « mener des études à l’échelle du vivant ». En première année, l’acquisition de cette compétence doit se faire notamment lors d’un ensemble d’enseignements destinés à apprendre aux étudiants comment « Organiser et mettre en place une procédure d’expérimentation animale dans le cadre de la règlementation en vigueur ». C’est dans le cadre de ces enseignements que ce TP a lieu. Lors de ce TP, les étudiants réalisent une anesthésie chimique chez le rat et doivent évaluer la profondeur de l’anesthésie de leur animal à intervalles réguliers. Les objectifs pédagogiques de ces travaux pratiques sont donc de plusieurs ordres : - D’un point de vue pharmacologique : apprendre à reconnaître les signes cliniques permettant d’évaluer le temps d’induction d’une anesthésie, sa profondeur et sa durée d’action chez le rat. - D’un point de vue éthique : sensibiliser les étudiants à l’importance de la surveillance d’un animal anesthésié, à la détection et à la prise en compte des signes cliniques de l’anesthésie (fréquence respiratoire, réflexes cutanés) chez l’animal. De plus, une réflexion est menée par les étudiants en amont du TP sur le respect des 3 R dans ce protocole - D’un point de vue expérimental chez l’animal : former les étudiants à la préhension / contention du rat vigile et à la réalisation d’une injection intrapéritonéale (IP) chez le rat ; apprendre à observer les animaux anesthésiés ; savoir recueillir des données expérimentales de façon exhaustive afin de répondre à l’objectif de l’étude (sensibilisation à la nécessité de préparer une étude afin d’en tirer les résultats attendus sans avoir besoin de les reproduire).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’apprendre aux étudiants de 1ère année du BUT Génie Biologique option Biologie Médicale et Biotechnologie à réaliser des expérimentations in vivo de physiologie et pharmacologie. En effet, ce diplôme est réglementé au niveau national et le contenu des enseignements est défini selon un programme pédagogique national. Dans le cadre de ce programme, les étudiants doivent acquérir différentes compétences, notamment celle de « mener des études à l’échelle du vivant ». En première année, l’acquisition de cette compétence doit se faire notamment lors d’un ensemble d’enseignements destinés à apprendre aux étudiants comment « Organiser et mettre en place une procédure d’expérimentation animale dans le cadre de la règlementation en vigueur ». Ainsi ce TP s’inscrit parfaitement dans ce cadre et les bénéfices attendus pour les étudiants sont les suivants : - apprentissage de la manipulation du rat vigile : pesée, identification, préhension, contention et injection IP - apprentissage du déroulé d’une étude en pharmacologie in vivo : recueil de données et traçabilité, choix des paramètres à étudier afin de réaliser un suivi exhaustif des animaux, analyse et interprétation des résultats - mise en pratique des éléments vus en cours théoriques sur l’éthique en expérimentation animale, notamment mise en évidence des règles de bien-être animal au cours du TP. L’enseignant s’assure tout au long du TP du respect de l’éthique et interroge régulièrement les étudiants sur les éléments indispensables au respect du bien-être animal dans ce protocole. Enfin, ce TP permettra de sensibiliser les étudiants à la différence de réponse des mâles et des femelles face à ce mélange anesthésique / analgésique et donc de la nécessité d'adapter les doses des molécules.

Procédures

Les animaux recevront une injection intrapéritonéale unique d'un mélange anesthésique / analgésique. La profondeur de l'anesthésie sera évaluée pendant toute la durée de celle-ci. A ces doses, une anesthésie d'environ 40 minutes est attendue chez les mâles et 60-70 min chez les femelles. Aucune autre intervention ne sera réalisée sur les animaux lors de cette séance de TP.

Impact sur les animaux

Tout d'abord, la contention et la manipulation des rats entrainent du stress chez les animaux, les injections par voie intrapéritonéale engendre une légère douleur au site d’injection. Un effet indésirable possible pour le rat est la surdose d'anesthésique, qui peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire de l'animal dans les 5 minutes suivant l’administration des molécules.

Devenir

Tous les animaux seront réutilisés la semaine suivante dans un TP de pharmacologie (procédure légère). Les responsables du projet ont soumis cette possibilité préalablement auprès de la Structure en charge du Bien-Etre Animal, dont leur établissement dépend. Cette dernière leur a envoyé un avis de principe favorable au regard des procédures prévues dans les 2 protocoles, mais la réutilisation dépendra de l'état clinique des animaux au moment de la réutilisation et donc de l'avis du vétérinaire référent.

Remplacement

Dans le cadre de la formation de nos étudiants, le programme pédagogique national prévoit, dans la compétence « mener des études à l’échelle du vivant » que les étudiants apprennent à « Organiser et mettre en place une procédure d’expérimentation animale dans le cadre de la règlementation en vigueur ». C’est dans le cadre de ces enseignements que ce TP aura lieu. Ce TP doit permettre d’une part d’évaluer in vivo les effets des molécules étudiées (anesthésiques) et d’autre part l’apprentissage par nos étudiants de la technique d’administration IP chez l’animal vigile. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de remplacement permettant une formation appropriée de nos étudiants tant sur le plan technique (manipulation de l’animal vigile, administration des substances chez l’animal vigile…) que sur le plan pharmacologique (observation des effets induits par les substances étudiées, pratique des méthodes d'évaluation des effets). Toutefois, afin de favoriser l'apprentissage des étudiants et d'éviter d'intégrer des animaux d'entraînement, des vidéos présentant la réalisation des gestes techniques (préhension, contention, injection IP) leur seront présentées. De plus, les étudiants pourront au cours du TP s'entraîner à réaliser les injections en manipulant des seringues/aiguilles dédiées sur un support inerte (éponge).

Réduction

Les étudiants seront répartis par binôme, mais chaque étudiant aura la responsabilité du traitement et du suivi de son propre animal. Chaque promotion comporte au maximum 56 étudiants, avec 1 rat par étudiant. La promotion est répartie en groupes de 14 étudiants et les TP ont donc lieu sur 4 séances (1 séance par groupe d’étudiants). Chaque séance est encadrée par un enseignant et un rat de démonstration sera nécessaire pour chaque séance. Cinq rats supplémentaires seront également prévus chaque année en cas de soucis lors des TP (rat dont l’état de santé ne permet pas l’intégration au protocole expérimental par exemple). Ainsi 56+4+5=65 rats seront nécessaires pour un an pour 56 étudiants et 65*5= 325 rats sur 5 ans pour 280 étudiants. Ces chiffres seront évidemment revus à la baisse si le nombre d’étudiants est inférieur à 56 par promotion. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans notre établissement, ces rats seront également réutilisés la semaine suivante dans le cadre d'un autre TP, réalisé par les étudiants de 2ème année: cette réutilisation a été validée prélablement par la Structure chargée du Bien-Être Animal. Enfin, les animaux proviendront de notre propre élevage et afin d’éviter au maximum les animaux surnuméraires, des mâles et des femelles seront indifféremment utilisés pour ces TP, tout en respectant l’attribution d’animaux d’un même sexe par séance de TP. Afin de garantir un apprentissage de qualité à nos étudiants, il n’est pas possible de diminuer plus le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes socialement harmonieux et en présence d’un enrichissement comprenant 2 éléments (tunnel en plastique noir et bâtonnet en bois ou noix à ronger), dont une rotation sera réalisée au cours de l'hébergement. Tout animal stressé ou malade (poils hérissés, prostration…) ou qui n'aura pas pris de poids par rapport à la semaine précédente (comme attendu aux vues de l'âge des animaux) sera exclu du protocole. Les animaux anesthésiés seront réchauffés grâce à une lampe et leurs yeux seront protégés grâce à l’application d'un collyre lubrifiant et hydratant. Préalablement aux séances de TP, les animaux seront habitués à la préhension et à la contention dans le but de limiter leur stress lors de leur utilisation par les étudiants et seront récompensés après chaque acte en amont et pendant le protocole. De plus afin de limiter le stress des animaux, les étudiants seront sensibilisés au fait de rester calmes et de ne pas être bruyants lors des séances de TP impliquant l’utilisation des animaux. Pendant le protocole, les animaux seront soumis à une anesthésie/analgésie, la composante analgésique étant apportée par l'une des molécules présentes dans le mélange anesthésique. Pour limiter tout risque de surréaction chez les femelles, plus sensibles aux molécules anesthésiques/analgésiques que les mâles, celles-ci recevront une dose adaptée à leur sexe et seront utilisées lors des séances de TP ayant lieu l'après-midi, car les rats sont plus sensibles le matin à ces molécules. En cas de signes de détresse cardio-respiratoire, les enseignants effectueront un massage cardiaque et procéderont à la mise à mort de l'animal par injection de produit dédié si ce massage s'avère insuffisant. Cependant ceci ne devrait pas se produire aux doses utilisées de produits anesthésiques/analgésiques. Enfin, toujours pour diminuer le stress des rats après le protocole, la répartition des animaux dans leur cage d’hébergement initial sera conservée jusqu'au protocole suivant.

Choix des espèces

Le rat est une des principales espèces utilisées en recherche et notamment en physiologie et pharmacologie. Il est donc nécessaire que nos étudiants soient formés à la manipulation et à l’observation des rats. De plus, sa taille permet une surveillance aisée de l’animal lors de l’anesthésie, notamment pour différencier les respirations thoraciques et abdominales, ce qui fait du rat, un animal de choix d'autant plus pour une première formation à des étudiants. Les animaux utilisés auront entre 5 et 7 semaines. Etant donné qu’il s’agit du premier TP avec des rats in vivo réalisé par nos étudiants, utiliser des animaux relativement jeunes, de petite taille, permettra de diminuer leur appréhension et donc le stress ressenti par les animaux.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une injection unique d'un stimulant du système immunitaire, puis est mis à mort pour prélever les organes et évaluer le rôle de l'intégrine beta8 dans les réponses immunitaires innées. Le porteur affirme que la complexité du réseau de cellules immunitaires ne peut être reproduite in vitro. Les bénéfices annoncés se limitent à une meilleure compréhension des mécanismes, sans application décrite.

Objectifs

Le système immunitaire défend l’organisme contre les agents pathogènes notamment infectieux. Cependant toute réponse immunitaire doit être contrôlée : une réponse trop faible serait inefficace, et une réponse trop forte contre nos propres tissus peut mener à des maladies auto-immunes. L’intégrine beta8 (abrégé b8) a été impliquée dans la régulation des réponses immunitaires adaptatives. L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle de b8 dans la régulation des réponses immunitaires innées à l’échelle de l’organisme chez la souris. Dans ce projet, seront utilisés des animaux génétiquement modifiés permettant (1) de suivre l’expression de b8 ou (2) d’entrainer la perte de l’expression de cette protéine dans certaines cellules de l’immunité innée (les cellules dendritiques). Pour voir l’impact de b8 sur l’immunité innée, un stimulant des réponses immunitaires sera injecté à ces animaux et le suivi des réponses sera réalisée 24h après.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à étudier le rôle d’une protéine b8 dans la régulation des réponses immunitaires innées. De manière générale, ce projet permettra d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les réponses immunitaires innées sont régulées par b8. Ces résultats seront non seulement essentiels pour l’expansion des connaissances fondamentales sur les réponses dépendantes de b8 mais mettrons aussi en exergue des pistes potentielles pour l’amélioration les réponses vaccinales et antitumorales.

Procédures

Une injection sur animaux vigiles d'un stimulant du système immunitaire (durée 10 sec).

Impact sur les animaux

L’animal peut ressentir un stress lié à l’injection. Le produit injecté permet de mimer une infection en stimulant le système immunitaire mais n’induit pas d’inflammation excessive. Aucune douleur n'est attendue dans les 24h que dure le protocole, mais il est possible que l’animal ressente un léger inconfort du fait de la légère inflammation induite.

Devenir

Les animaux seront mises à mort avec une méthode reglementaire en fin de procédure pour collecter ensuite les organes, ce qui permettre d'évaluer l'impact de la délétion ciblée de la protéine b8 sur les réponses immunitaires étudiées.

Remplacement

Le but de cette étude est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels la réponse immunitaire et la mise en place de réponses extrêmement régulées sont maintenues dans l’organisme. Comme la complexité de l’environnement tissulaire, le réseau complexe de cellules immunitaires impliquées dans la régulation des réponses immunitaires étudiées dans ce projet ne peuvent être reproduits in vitro, cette étude nécessite la réalisation d’expériences à l’échelle de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux (12 par groupe expérimental) dans chaque procédure expérimentale a été calculé à minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Le sexe n’ayant pas d’effet sur le phénotype observé, les souris mâles et femelles seront utilisées indistinctement. Cela permet d’utiliser l’ensemble des souris générées lors des croisements et donc de diminuer le nombre total de souris nécessaires à la réalisation du projet.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement. La procédure sera réalisée après un temps d’acclimatation d’une semaine minimum pour toutes les souris après sortie de l’elevage. Il s’agit ici de procédures courtes sur 24h et ne générant normalement pas de douleur. Pour le bien-être des animaux, ils seront surveillés dans l'heure suivant l'injection du stimulant. En cas exceptionnel de détérioration de l’apparence de l’animal et/ou de son comportement, l'animal sera mis à mort (point limite).

Choix des espèces

Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude des réponses immunitaires. La sélection de la souris permet également de bénéficier d’un nombre important d’animaux transgéniques développés précédemment (comme c'est le cas ici) et facilite donc le raffinement du plan expérimental. Nous utiliserons ici 2 lignées d'animaux transgéniques ne présentant aucun phénotype dommageable. Des souris adultes entre 8 et 25 semaines seront utilisées dans ce projet. Cette fenêtre a été choisi car à cet âge les souris ont un système immunitaire mature et non vieillissant.

120 macaques de trois espèces vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés, chaque animal subissant un examen IRM d'une à quatre heures sous anesthésie générale. Le projet compare la neuroanatomie et les comportements sociaux des espèces pour étudier l'hypothèse du "cerveau social" des primates. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale et que les rongeurs ne conviennent pas, l'étude de cerveaux post-mortem ne suffisant pas selon lui. Les retombées annoncées relèvent de la connaissance fondamentale, avec la constitution d'atlas anatomiques.

Objectifs

L'hypothèse du "cerveau social" évoque la possibilité que certaines parties du cerveau des primates soient dédiées à la gestion des interactions sociales et la représentation abstraite de la structure du groupe social. En étudiant l'évolution biologique du système nerveux de différentes espèces de macaques montrant des comportements sociaux différents (ici Macaca mulatta, M. fascicularis et M. tonkeana), le but ultime de nos recherches est de participer à l'étude du fonctionnement et des origines du cerveau social des primates. À terme, notre projet de recherche permettra de comparer les comportements et la neuroanatomie de différentes espèces de primates non-humains. Un maximum de 120 macaques (jusqu’à 40 individus de chaque espèce de macaques) sera étudié. Leurs comportements sociaux seront étudiés par des observations éthologiques classiques et des prises de données semi-automatisées. Leur neuroanatomie fonctionnelle sera étudiée par une technique d’imagerie par résonnance magéntique peu invasive (IRM). Des études complémentaires sont déjà effectuées par notre équipe sur des échantillons post-mortem de cerveaux de macaques. L’étude de macaques vivants est indispensable pour étudier, entre autres, l’activité cérébrale au repos des macaques (accessible dans le cadre d'acquisitions de données IRM chez le primate non-humain anesthésié). Nos recherches permettront de mieux comprendre l’architecture du système nerveux des primates en relation avec leurs comportements sociaux. Ces connaissances fondamentales pourraient apporter de nouvelles perspectives concernant les cibles biologiques dans la prise en charge des maladies mentales humaines se caractérisant par des comportements sociaux inadaptés à la vie en société.

Bénéfices attendus

Les retombées potentielles de ce projet scientifique seront multiples. Elles permettront de mieux comprendre l’évolution et l’architecture du système nerveux des primates en relation avec leurs comportements sociaux. D’un point de vue fondamental, elles permettront d’émettre de nouvelles hypothèses concernant les causes biologiques des différences de socialité observées au sein du genre Macaca. Nos recherches participeront à établir des atlas de l’anatomie du cerveau pour des espèces de macaques, encore actuellement inconnue comme c’est le cas du macaque de Tonkean. D’un point de vue pratique, nos recherches pourraient nourrir de nouvelles perspectives quant aux cibles biologiques en lien avec des maladies mentales humaines, se caractérisant par des comportements sociaux maladaptés à la vie en société.

Procédures

Les animaux seront soumis à un examen IRM non invasif d’une à quatre heures sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Toutes les nuisances sont considérées comme légères. Les nuisances sont limitées au stress, en lien avec la capture, séparation des congénères, au transport et à l’anesthésie (nausée, hypothermie, désorientation).

Devenir

Les animaux impliqués dans ce projet de recherche vivent en semi-liberté en groupe naturalistique multi-mâles, multi-femelles. L’utilisation des animaux dans le présent projet n’a pas d’impact sur leur santé physique et mentale future, d’où la possibilité de les garder en vie.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non-animale à ce projet. Au vu des différences comportementales, neuroanatomiques et phylogénétiques, l’utilisation de rongeurs n’est pas une alternative envisageable pour décrire les différences de neuroanatomie fonctionelle corrélant avec les différences de socialité au sein du genre Macaca. Notre équipe étudie aussi des échantillons de cerveau post-mortem de différentes espèces de macaques. Toutefois, cette étude post-mortem ne permet pas d’acquérir des données de neuroanatomie fonctionelle, impliquant ainsi la nécessité d’étudier des individus vivants dont nous pouvons observer les comportements sociaux et les corréler aux images neuroanatomiques.

Réduction

D’après la littérature, un nombre raisonnable d’individus pour étudier la neuroanatomie d’une espèce de primates non-humains, mâles et femelles, est de 30-40 individus. Notre projet impliquera donc un maximum de 40 individus par espèce considérée. Nos données seront comparées aux acquisitions IRM existante en libre accès web. La neuroanatomie de certaines espèces que nous étudierons (macaques rhésus et macaques crabiers) est déjà décrite dans la littérature. Toutefois, ces études concernent des sujets vivants dans des environnements peu ouverts et au sein de groupes sociaux peu nombreux – ce qui influence la neuroanatomie des individus. Les aménagements du site offrent des configurations de groupes sociaux unique, permettant ainsi d’avoir accès à des données neuroanatomiques plus fidèles et plus représentatives des conditions écologiques dans lesquelles ces animaux vivent à l’état sauvage.

Raffinement

Les animaux vivent en groupe social dans des parcs en semi-liberté. L’examen d’imagerie (IRM) auquel ils sont soumis est non invasif et sera réalisé sous anesthésie générale avec surveillance vétérinaire. L’examen IRM n’occasionne pas de capture supplémentaire des animaux, il sera réalisé à la faveur de leur contrôle sanitaire périodique.

Choix des espèces

Afin d'étudier l'évolution du cerveau social des primates, il est nécessaire d'impliquer différentes espèces de primates non-humains. En effet, les différences interspécifiques ont une importance cruciale concernant des mécanismes d'évolution biologique étudiés. De plus, nous savons qu'il existe un lien entre la phylogénie et les comportements sociaux au sein du genre Macaca. Ainsi, il existerait une dimension héréditaire et génétique, entre socialité et neuroanatomie chez ces différentes espèces de macaques. Par conséquent, l’utilisation du modèle macaque en IRM est indispensable et pleinement justifié par la nature et les objectifs de notre projet de recherche. Les animaux seront impliqués dans notre procédure à partir de l’âge de 18 mois, ce qui correspond à un âge supérieur où le sujet serait sevré en condition naturelle.