Procédures légères

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit pendant un à trois mois un régime enrichi à 60 % de lipides pour développer une obésité avec insulinorésistance ou diabète, et toutes passent des mesures de composition corporelle qui les enferment seules dans un tube environ 80 secondes. La mise à mort sert à prélever sang et tissus pour situer une apolipoprotéine, l'ApoM, dans le tissu adipeux et son inflammation. Le porteur décrit des retombées de "connaissances théoriques" sur la biologie du tissu adipeux et indique que de nouvelles explorations physiologiques "nécessitent" le recours à l'animal.

Objectifs

L’obésité, caractérisée par un excès de tissu adipeux, s’accompagne à long terme de complications métaboliques et cardiovasculaires dont les mécanismes d’installation sont encore à clarifier. D'autre part, cette pathologie est décrite comme étant associée à une inflammation à bas niveau avec un recrutement de macrophages pro-inflammatoires. Longtemps considéré comme un tissu de réserve énergétique, le tissu adipeux est maintenant reconnu comme un organe central du métabolisme énergétique qui produit et sécrète des facteurs. Nommés adipokines, bénéfiques ou délétères, ces facteurs peuvent agir à distance ou au sein même du tissu. Une meilleure connaissance de ces adipokines participe à la compréhension des complications métaboliques associées à l'excès de masse grasse ainsi qu'à l'inflammation systémique ou adipocytaire souvent associée. Nous avons mis en évidence une nouvelle adipokine, l'ApoM,dont les caractéristiques fonctionnelles ont été très peu explorées dans le domaine de l’obésité; elle a été initialement décrite produite par le foie. Nous émettons l’hypothèse qu’une altération de la production de l'ApoM par le tissu adipeux pourrait contribuer au développement d’une inflammation locale voire sytémique. D'autre part, nous souhaitons étudier la localisation de cette adipokine au sein du tissu adipeux, mais également dans les adipocytes, cellulesconstituant majoritaires, ce qui pourrait nous aider à mieux comprendre son rôle dans ce tissu et cette cellule.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous apporter de nouvelles conaissances théoriques sur la biologie du tissu adipeux et mieux caractériser le lien entre l'ApoM et l'inflammation d'une part et l'ApoM et la fonction lipolytique (cette activité consiste en l'hydrolyse des triglycérides, réserves énergétiques de l'organisme, mobilisés lors des périodes de déficit énergétique comme après un jeûne, un exercice physique,...) des tissus adipeux d'autre part.

Procédures

Les principales interventions sont les suivantes : alimentation de certains animaux par du régime enrichi en lipides à hauteur de 60% pendant 1 ou 3 mois; mesure de la composition corporelle de manière mensuelle sur tous les animaux de la procédure n°1, mesure qui dure en moyenne 80 secondes par animal.

Impact sur les animaux

Des nuisances seront à noter lors de la mesure des compositions corporelles des animaux qui sont alors contraints dans un tube et isolés de leurs congénères pendant environ 80 secondes. Des nuisances, liées à la mise en régime enrichi en graisses pendant plusieurs mois pourront survenir, tels que développement d'une obésité associée à une insulino-résistance ou à un diabète.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. En effet, le sang et de nombreux tissus seront prélevés pour des analyses d'expressions géniques, protéiques, de cytométrie en flux, histologiques ou immunocytochimiques de marqueurs ou cellules impliqués dans les processus inflammatoires ou permettant de visualiser des changements de localisation de notre apolipoprotéine d'intérêt.

Remplacement

Une corrélation négative entre l'expression de l'APOM dans les tissu adipeux blancs et l'indice de masse corporelle a été décrite chez l'Homme. Ainsi chez des personnes obèses présentant la plus forte inflammation le niveau de l'ApoM adipocytaire est grandement diminué par rapport à des sujets normo-pondérés pour lesquels le tissu adipeux est extrêmement peu inflammé. Pour mieux comprendre les liens entre ces deux phénomènes des analyses sont menées chez l'Homme mais de nouvelles explorations physiologiques nécessitent l'usage de modèles animaux. Ces expériences seront également complétées par des approches utilisant des cultures cellulaires et la mise en contact de milieux conditionnés d'adipocytes sur des lignées de macrophages.

Réduction

Grâce à l'utilisation du Minispec, appareil permettant de mesurer la répartition des masses grasse et maigre, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal mensuel de l'évolution des ces paramètres sans avoir à mettre à mort les animaux. Comme l'animal est son propre contrôle, des analyses statistiques appariées type test de Wilcoxon pourront être utilisées. Sinon, la plupart du temps nous utiliserons des analyses à comparaisons multiples (ANOVA à une ou deux voies) grâce à un logiciel que nous maîtrisons bien depuis plusieurs années.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie, dans des cahes sur portoirs ventilés en respectant le nombre maximal indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnets en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootcehnie soit par les expérimentateurs en charge du projet.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Les animaux sont mis en régime dès leur sevrage et seront hébergés ainsi au maximum pendant 3 mois. Lors d'une précédente étude, nous avons pu montrer, par l'expression de quelques marqueurs, que le pic de l'inflammation était atteint dans les conditions décrites ci-dessus. Pour ce qui concerne la localisation cellulaire d'ApoM, il n'est pas nécessaire d'attendre si longtemps. Le tissu adipeux doit rester dynamique et répondeur aux divers stimulis, ce qui est constaté chez des animaux jeunes.

2 185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent en intraveineuse des cellules tumorales humaines ou murines pour reproduire des leucémies, des lymphomes ou des métastases sanguines, puis subissent des injections répétées, des prélèvements de sang à la veine saphène et des séances d'imagerie sous anesthésie deux à trois fois par semaine. Le projet ne teste aucun traitement, il cale les conditions de greffe comme la densité cellulaire et la souche en amont d'études pharmacologiques menées ailleurs. Le porteur affirme que la recherche d'efficacité chez l'animal reste "indispensable" et présente cette mise au point comme un moyen de réduire le nombre d'animaux des études futures.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste en la mise en place d’un modèle tumoral « orthotopique » ou « métastatique » chez la souris par injection de cellules tumorales (humaines ou murines) par voie intraveineuse (IV) dans le but de mimer des tumeurs hématologiques (leucémies, lymphomes,…) ou des métastases expérimentales en « court-circuitant » les premières étapes du phénomène métastatique pouvant provenir de tumeurs solides (migration dans la matrice extracellulaire, intravasation dans le vaisseau sanguin) pour ne mimer que la dissémination dans la circulation sanguine. La mise au point et la caractérisation de ce modèle se situe en amont des études d’activité et d’efficacité anti-tumorale, afin de définir les caractéristiques de croissance, les conditions optimales de greffe (densité cellulaire, souche de souris, …), ainsi que la durée limite de l’étude sur laquelle nous pourrons réaliser les études pharmacologiques ultérieures. Ces études de mises au point sont primordiales puisqu’elles permettent d’acquérir une bonne connaissance des modèles et constituent un paramètre essentiel pour une évaluation pharmacologique optimale de nos produits anti-cancéreux. Des cellules cancéreuses humaines ou murines vont être greffées par injection intraveineuse, chez des souris soit immunodéprimées (c’est-à-dire avec un système immunitaire déficient voire absent) pour permettre la greffe de tumeurs humaines, soit immunocompétentes (c’est-à-dire avec un système immunitaire parfaitement fonctionnel) pour permettre la greffe de tumeurs murines. Ce second modèle permettra l’évaluation de produits anti-cancéreux ayant recours au système immunitaire pour être actif et efficace (comme l’immunothérapie ou les thérapies ciblées). Ce projet décrit deux modalités de suivi de la dissémination tumorale au cours du temps ; la première, qui sera privilégiée, utilise l’imagerie optique, mais ne peut être mise en œuvre que selon la disponibilité de lignées tumorales génétiquement modifiées pour être bioluminescentes. La seconde se basera sur des analyses ex-vivo après prélèvement des tissus et organes des souris

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en oncologie. Les bénéfices attendus du projet sont la détermination des conditions optimales de greffe en intraveineuse (limitation de la variabilité inter individuelle et temps d’expérimentation correct pour pouvoir ensuite faire une étude pharmacologique) pour ensuite évaluer et sélectionner sur ces modèles, le meilleur candidat médicament (études réalisées dans le cadre d’un autre projet autorisé) . Ces modèles permettront de déterminer l’indication thérapeutique du candidat médicament, en monothérapie ou en combinaison avec d’autres molécules pour son développement clinique futur.

Procédures

Injection intraveineuse des cellules tumorales sur animal vigile (1 fois, moins de 30 secondes)) Injection intra-péritonéale de l'agent réactif pour les mesures en bioluminescence , 2 à 3 fois par semaine (moins de 10 secondes) ; 1 à 2 prélèvements de sang par microsampling par semaine à la veine saphène (moins de 30s) suivant les recommandations de la structure de bien-être animale ; anesthésie générale pour l'imagerie par bioluminescence, quelques minutes, 2-3 fois/sem.

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress/douleur peut provenir : De l’envahissement tumoral/ mestastases lié au modèle pathologique recherché. De la greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse. La contention d’une durée maximale de 30s peut générer du stress et l’injection (moins de 30s) de la douleur. De l’injection en intra-péritonéale du substrat réactif (luciférine) pour les mesures d’imagerie par bioluminescence : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur. Pour les prélèvements de sang, il est nécessaire de tondre les pattes arrières de l’animal. La contention ainsi que la tonte de la patte d’une durée maximale de 30s peuvent générer du stress. Du prélèvement de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur. De l’induction de l’anesthésie pour la mesure d’imagerie : l’induction qui est rapide peut générer du stress.

Devenir

Toutes les souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude et les organes et le sang pourront être prélevés afin de vérifier l’envahissement tumoral et/ou métastatique via des analyses qualitatives.

Remplacement

La recherche d’efficacité de candidats chez l’animal reste aujourd’hui indispensable, c’est pourquoi les conditions expérimentales doivent être le plus possible fiabilisées afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux pour les études pharmacologiques ultérieures. Ce projet permet de déterminer ces conditions.

Réduction

Le système d’imagerie optique est non invasif et permet de suivre un même animal au cours du temps, réduisant considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. Concernant les procédures pour lesquelles nous utiliserons des lignées tumorales non génétiquement modifiéesne permettant donc pas des mesures par imagerie bioluminescence, si les méthodes de détection des cellules tumorales dans le sang prélevé par microsampling (prélèvement de petits volume de sang, répétés au cours du temps sur un même animal) sont validées et corrélées avec l’envahissement tumoral réel, alors cette méthode pourra permettre d’effectuer le suivi de l’évolution sur un même animal et réduira donc considérablement le nombre d’animaux utilisés. Ce projet sert à définir les conditions expérimentales optimales de greffe et leurs caractéristiques de progression tumorale en amont des projets de recherche de traitements efficaces. Il contribue ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ces futures études en permettant une bonne connaissance des caractéristiques expérimentales comme la variabilité et de définir ainsi les designs et effectifs adaptés afin de garantir la réussite de ces études. Un accompagnement par le service bio-statistiques permettra de déterminer les meilleures conditions de expérimentales.

Raffinement

L’évaluation de la dissémination tumorale par bioluminescence est une technique non invasive pour l’animal et qui ne requiert qu’une simple anesthésie de courte durée. Le suivi du développement tumoral en imagerie sera effectué 2 à 3 fois/semaine, sous anesthésie gazeuse, sur une surface plane et thermostatée. Une surveillance accrue sera réalisée si les souris présentent un fort signal de bioluminescence. La mesure du poids corporel sera effectuée 2 à 3 fois/semaine ainsi que le suivi des signes cliniques. Cette surveillance accrue vise à suivre et anticiper l’application des points limites si nécessaire. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants, et ce afin de les protéger de tout risque d’infection et/ou contamination. Des prélèvements de sang « en microsampling » peuvent être mis en œuvre afin de réaliser le suivi de la dissémination cellulaires dans le cas où l’utilisation de l’imagerie n’est pas possible et que la détection des cellules dans le sang est possible. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excèdera pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Cette technique de prélèvement, peu invasive, rapide, et pour de très petits volumes, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémie physiologiques et le bien-être animal. Dans le cas de greffes de cellules sans possibilité d’imagerie, les organes et tissus d’intérêt doivent etre prélevés en fin d’étude. Ces prélèvements terminaux sont réalisés sous anesthésie complétée d’une analgésie et sans réveil des souris. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Un enrichissement de milieu (éléments de nidification) adapté va également permettre de surveiller leur état général par l’observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage étudiés et donc déployés chez la souris que chez le rat. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle le plus couramment utilisé pour ce type de recherche en immuno-oncologie. Le choix du modèle animal est dicté par la tolérance des cellules à proliférer dans l’organisme de l’animal (souris immunocompétentes et/ou immunodéprimées) et le choix de la souche par les études de dissémination tumorale qui permettent de définir les conditions optimales de greffe. Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines en début d’expérimentation. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous n’excéderons pas 10 mois d’âge à la fin des études.

949 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles de la maladie d'Alzheimer, elles sont génotypées par prélèvement d'oreille ou de queue, opérées par injection dans le cortex moteur et soumises à des tests d'apprentissage sur roue avec isolement partiel, pour étudier le rôle du vieillissement de cellules gliales dans le déclin cognitif. Le porteur indique que l'isolement peut induire des "troubles dépressifs" et que la chirurgie provoque une douleur atténuée par des antidouleurs. Les souris des procédures sont euthanasiées pour prélèvement des tissus, tandis qu'une cohorte de lignées est conservée pour des études ultérieures.

Objectifs

La cognition et son déclin avec le vieillissement font partie intégrante des maladies psychiatriques et neurodégénératives liées au développement et à l'âge, en particulier dans la maldie d'Alzheimer. Si les circuits neuronaux sont à la base de l'organisation cérébrale, une accumulation de preuves a désormais mis en évidence le rôle potentiel des cellules oligodendrogliales dans la plasticité cérébrale et la cognition. Dans ce projet, nous allons tenter de comprendre si le phénotype vieillissant des cellules oligodendrogliales peut directement participer à l'apparition de symptômes dans le modèle murin d'Alzheimer, notamment en accélérant la neurodégénérescence axonale. Ce projet est divisé en plusieurs étapes, à partir d'un modèle murin d'Alzheimer 5xFAD : 1/ Caractériser l'effet du vieillissement oligodendroglial sur les capacités cognitives ; 2/Identifier les gènes dérégulés dans les cellules oligodendrogliales ; 3/ Caractériser le rôle de gène cibles oligodendrogliaux dans l'apparition de déficits cognitifs. En caractérisant l'effet du vieillissement des cellules oligodendrogliales sur la cognition, notamment dans un modèle murin de maladie d'Alzheimer, notre projet pourrait donner lieu à des développements cliniques à fort impact, pour une maladie encore sans traitements efficaces.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet répondra aux besoins scientifiques suivants. À court terme : une meilleure compréhension du rôle des cellules oligodendrogliales et des voies dérégulées dans l'apparition des déficits cognitifs dans un modèle murin de maladie d'Alzheimer. À long terme : développer des stratégies translationnelles basées sur une réactivation et rajeunissement des cellules oligodendrogliales pour ralentir la neurodégénérescence dans la maladie d'Alzheimer, et donc retarder l'apparition de symptômes chez les patients. Le déclin de la cognition cérébrale représente un problème majeur de santé publique, car les déficits d'apprentissage développemental et la démence liée à l'âge peuvent fortement affecter la qualité de vie des personnes et les dépenses de santé globales.

Procédures

Les souris seront soumises à un bref (5 secondes, une fois) punch d'oreille pour le génotypage après sevrage. D'autres devront être génotypés avant sevrage, en prélevant un échantillon de queue (sous anesthésie, 5 secondes, une fois). Des animaux subiront une anesthésie à l'isoflurane. Certaines souris seront injectées chirurgicalement dans la zone corticale motrice (chirurgie de 30 minutes, comprennat le temps pré- et post-opératoire, une fois). Des souris seront soumises à des tests comportementaux afin d'évaluer leur capacité d'apprentissage moteur (2 semaines, isolement partiel, une fois). Les souris seront anesthésiées avant d'être euthanasiées (1 minute, une fois).

Impact sur les animaux

Lors du génotype avant sevrage ou pendant la chirurgie, on pourrait noter quelques saignements. Lors des tests comportementaux, les souris seront partiellement isolées et peuvent donc présenter des troubles dépressifs. Après la chirurgie, les animaux pourraient ressentir de la douleur, qui devrait etre limitée par les traitement anti-douleur prévus.

Devenir

Tous les ensembles expérimentaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Une cohorte des lignées de souris générées Tet1cKOxAD sera conservée dans notre animalerie, pour des études ultérieures.

Remplacement

Si des progrès ont été réalisés pour modéliser les pathologies et la connectivité neuronale dans les cultures (organoïdes par exemple), ces modèles ne suffisent pas à appréhender pleinement les fonctions cognitives au niveau de l'organisme et comment pouvoir les maintenir malgrès le déclin observé avec l'âge. À l'heure actuelle, il est nécessaire d'utiliser des modèles de souris pour mieux aborder le rôle de cellules spécifiques et de voies moléculaires dans la mémoire et l'apprentissage. En parallèle, nous exploitons des modèles in vitro de co-cultures primaires, de lignées cellulaires et de cellules souches pluripotentes induites humaines. En effet, pour optimiser notre approche lentivirale, nous allons d'abord tester notre protocole sur des lignées cellulaires Olineu, afin de limiter les étapes d'optimisation sur des cultures cellulaires primaires.

Réduction

Afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires dans chaque procédure expérimentale afin de détecter un effet statistiquement pertinent, nous avons effectué une analyse de puissance grâce à plusieurs tests statistiques. En raison de la variabilité interindividuelle, nous avons prévu d'inclure 5 souris par groupe, pour chacun des essais comportementaux. Nous n'avons remarqué aucune différence de comportement entre les sexes lors de nos études précédentes, nos cohortes seront donc composées de souris des deux sexes. Pour les animaux sacrifiés pour les cultures de tissus, nous devons mettre en commun 3 tissus de souris par expérience. Notre expérience avec ce modèle de co-culture suggère de prévoir 4 répétitions par test in vitro, pour chaque lecture (immunohistochimie, électrophysiologie,...).

Raffinement

Les animaux sont sous la surveillance et l'observation quotidiennes de soigneurs animaliers formés et chargés de veiller à leur bien-être. Pour la procédure d'apprentissage de la roue complexe, les animaux seront hébergés individuellement jusqu'à 7 jours dans une cage enrichie, dans laquelle nous n'observons normalement aucun phénotype d'isolement social. Il est à noter que les cages de comportements sont transparentes, donc l'isolement est partiel : les souris sont isolées mais maintiennent un contact visuel et auditif auprès de leur cohorte (10-20 souris). Cependant, si nous observons un changement de comportement ou un manque d'intérêt pour la roue, l'animal sera exclu de la procédure et replacé dans sa cohorte de groupe. Pour la chirurgie stéréotaxique, les souris recevront une injection d'anti-douleurs et seront sous anesthesie profonde. Pendant la chirurgie, nous placerons l'animal sur un tapis chaufant et appliquerons une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée et couvrirons les yeux pour éviter une exposition intense à la luminosité pendant la procédure. La chirurgie sera réalisée dans des conditions stériles (gants, outils, instruments,...). Après la chirurgie, l'animal sera placé sous une lampe chauffante jusqu'au réveil anesthésique. Des granulés alimentaires ramollis et de l'eau supplémentaires seront fournis à l'intérieur de la cage pour les animaux, afin de fournir un soutien trophique général et de garantir que la perte de poids est limitee. Si l'état général du corps atteint des points limites, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie.

Choix des espèces

Les modèles de souris sont pertinents car ils sont couramment utilisés dans les études comportementales portant sur les fonctions et les déficits cognitifs. L'existence de lignée knock-out ou modèles de la maladie d'Alzheimer nous permet de recréer des modèles pertinents dans notre établissement. Pour les procédures comportementales, les souris adultes seront utilisées à l'âge de 4 mois. Pour les procédures utilisées en culture, les souriceaux de 7 jours seront utilisés pour collecter les tissus cérébraux.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées pendant la gestation et la lactation à des mélanges de polluants, elles subissent une série de tests comportementaux, activité locomotrice, anxiété, apprentissage et mémoire spatiale, avant d'être euthanasiées pour prélèvement des tissus cérébraux. Le porteur indique que l'exposition pourrait altérer l'apprentissage et la mémoire, effets que le projet vise justement à déterminer. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer l'animal entier pour l'étude des effets comportementaux, une partie des analyses étant faite in vitro.

Objectifs

L’évaluation des effets de contaminants chimiques se fait encore actuellement substance par substance, ce qui ne reflète pas de manière réaliste l'exposition environnementale. Ce projet vise à étudier chez la souris les effets neuraux de mélanges réalistes de polluants chimiques, identifiés dans des matrices et cohortes humaines, et à des doses faibles estimées pour cette exposition environnementale. Ce travail combinera des approches complémentaires d’analyses comportementales, neuroendocrines, cellulaires et moléculaires afin de caractériser les effets et les modes d'action de ces mélanges et ainsi participer à travers les données produites à l'amélioration de l'évaluation des effets de mélanges de substances chimiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de cette étude sont i) l'obtention de données sur les effets potentiels sur la santé humaine de l'exposition à deux cocktails de contaminants environnementaux, ii) l’identification de biomarqueurs pertinents de l’exposition qui peuvent servir à l’évaluation du risque pour la santé humaine, et iii) l’établissement et l’amélioration d'approche d'évaluation des effets de mélanges de contaminants chimiques à des doses de l'ordre de l'exposition environnementale.

Procédures

Les animaux analysés seront exposés pendant les périodes gestationnelle et lactationnelle à de très faibles doses de substances chimiques, incorporées dans un morceau de pâte à cookie proposé aux mères gestantes sans contrainte. Les animaux issus de ces mères exposées, seront séparés en deux lots. Un premier lot subira une euthanasie réglementaire sous analgésié/anesthésie après sevrage. La mort de l’animal est immédiate dès le début l’euthanasie et la procédure dure environ 15 minutes. Le deuxième lot sera analysé dans 5 tests comportementaux. Après sevrage, les animaux seront évalués pour leur activité locomotrice (1 fois 2h) puis état d’anxiété basale (1 fois 10 min), et à l’âge adulte, pour l’apprentissage et la mémoire spatiale (4 essais de 90 secondes chacun par jour pendant 8 jours, puis deux tests finaux de 60 secondes chacun, 20 minutes et 24h-72 h après le dernier test), puis pour leur activité locomotrice (1 fois 2h) et état d’anxiété basale (1 fois 10 min). A l’issue de ces tests, les animaux subiront une euthanasie réglementaire sous analgésié/anesthésie. La mort est immédiate dès le début de l’euthanasie et la procédure dure environ 15 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales d’anesthésiques et d’antalgiques peuvent générer une douleur légère au point de piqûre. Un léger inconfort peut être généré par la première introduction des souris dans les dispositifs utilisés dans les tests comportementaux. Les effets comportementaux potentiels de l’exposition développementale aux mélanges de contaminants, qui sont à déterminer dans ce projet : effets locomoteurs, troubles anxieux, altération de l’apprentissage et de la mémoire.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés pour prélever les tissus nécessaires à la réalisation des analyses neuroanatomiques et immunohistochimiques.

Remplacement

L’évaluation pour la santé humaine des effets de l’exposition aux polluants chimiques repose sur l’utilisation des modèles rongeurs et la caractérisation dans ces modèles in vivo des effets et des mécanismes de ces substances. Jusqu’à présent, ces critères ne peuvent être étudiés que dans ces modèles in vivo. Une méthode alternative ne peut remplacer l’animal entier notamment pour l’étude des effets comportementaux. Néanmoins, certains aspects de cette étude seront remplacés par de la modélisation mathématique et une approche in vitro de cultures de cellules.

Réduction

Les effectifs utilisés (450 au total) ont été calculés au plus juste afin d'obtenir une puissance statistique significative. L’utilisation des animaux servira seulement pour l’exposition aux mélanges complets, afin de caractériser les effets et les mécanismes d’action des mélanges. La comparaison des effets de certaines substances seules à ceux des mélanges, ou la dissection des mécanismes moléculaires des polluants du mélange seront effectuées in vitro sur des cultures de cellules. Par ailleurs, plusieurs régions cérébrales ainsi que plusieurs organes seront collectés et stockés pour des études ultérieures.

Raffinement

Les animaux seront produits et hébergés localement, conformément à la législation en vigueur, afin d'éviter tout stress lié au transport, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifiés. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12 h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement. De plus, une habituation à l'expérimentateur est pratiquée pendant au moins une semaine avant le début des tests comportementaux, afin d'éviter tout stress lié à la manipulation. La mise en place de points limites précoces permet une surveillance adaptée des animaux et une prise en charge antalgique ou anesthésique dès que nécessaire.

Choix des espèces

La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études comportementales et neuroendocrines grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...), et de données dans la littérature permettant d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Les tests réalisés depuis le sevrage jusqu'à l'âge adulte sur les souris mâles et femelles permettent d'avoir une analyse longitudinale des effets à court et à long terme.

1 036 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent trois irradiations de l'abdomen sous anesthésie, des coloscopies pour l'administration d'un patch ou d'un gel, puis un prélèvement sanguin terminal, l'irradiation pouvant toucher l'intestin grêle et provoquer un amaigrissement et un gonflement abdominal irréversibles. L'objectif déclaré est de tester des traitements régénératifs contre les lésions du côlon provoquées par la radiothérapie chez des patients atteints de cancer pelvien. Le porteur affirme qu'évaluer un tel traitement exige un modèle animal intégré et que les organoïdes ne sont pas techniquement possibles ici.

Objectifs

L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer les bénéfices thérapeutiques des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ainsi que des molécules anti-inflammatoires et antifibrotiques lorsqu'elles sont intégrées dans un dispositif médical innovant auto-enroulé ou dans une solution liquide gélifiante à 37°C. L'objectif principal est de traiter de manière ciblée et locale les lésions colorectales radio-induites, en favorisant la régénération tissulaire et en réduisant l'inflammation et la fibrose associées à ces lésions. Par conséquent, ce projet vise à améliorer la qualité de vie des hommes et des femmes atteints de radioproctopathie.

Bénéfices attendus

Le projet de recherche scientifique vise à apporter plusieurs bénéfices dans le domaine de la prévention et du traitement des lésions radio-induites dans le côlon, notamment : - Meilleure compréhension de la dynamique précoce des lésions radio-induites : Le projet permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents aux lésions radio-induites dans le côlon. Cela inclut l'identification des processus cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement initial des lésions, ainsi que l'évolution de ces lésions au fil du temps. Cela permettra une détection précoce plus précise et une intervention thérapeutique plus efficace. - Développement d'un traitement préventif : Le projet vise à développer des approches thérapeutiques préventives pour réduire le risque de lésions radio-induites dans le côlon. Cela pourrait inclure l'utilisation de molécules spécifiques, de dispositifs de libération locale ou d'autres stratégies novatrices visant à protéger les tissus normaux contre les effets néfastes de la radiothérapie. Un tel traitement préventif pourrait contribuer à améliorer la qualité de vie des patients en limitant les lésions radio-induites. - Développement d'un traitement curatif de la radioproctopathie : la radioproctopathie désigne les lésions radio-induites spécifiquement localisées dans le colon descendant-rectum. Le projet vise à développer des traitements curatifs ciblant cette condition. Cela pourrait impliquer l'utilisation de molécules thérapeutiques spécifiques, de dispositifs de libération locale ou d'autres approches novatrices pour promouvoir la guérison des lésions, réduire l'inflammation, restaurer la fonction normale du colon et éviter la fibrose. Cette approche curative pourrait améliorer la qualité de vie des patients et réduire les complications à long terme. En somme, les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Il comprend une meilleure compréhension de la dynamique précoce des lésions radio-induites dans le colon, ainsi que le développement de traitements préventifs et curatifs pour la radioproctopathie. Ces avancées contribueront à améliorer les résultats cliniques, à réduire les effets indésirables de la radiothérapie et à améliorer la qualité de vie des hommes et femmes atteints de cancer pelvien.

Procédures

- Irradiations locales au niveau de l'abdomen sous anesthésie gazeuse (maximum 6 minutes), 3 fois avec un intervalle de 48 heures entre chaque séance. - Coloscopie sous anesthésie gazeuse, d'environ 10 minutes, une ou deux fois selon le groupe pour l’administration du traitement (patch ou gel). - Prélèvement de 10 ml de sang à partir de l'artère mésentérique avant l'euthanasie, d'environ 2 minutes, sous analgésique et anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Les deux modèles d’irradiation localisée du colon, chez le rat, utilisés dans ce projet sont déjà utilisés dans le laboratoire. Ce modèle d’irradiation du côlon peut toucher une petite zone de l’intestin grêle, qui est mobile, entraînant des signes cliniques spécifiques irréversibles : amaigrissement de l’animal accompagné d’un gonflement au niveau de l’abdomen. La mise en place du système enroulé se fait sous coloscopie avec anesthésie, de même pour le liquide gélifiant qui sera administré par voie rectale sous anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de valider in vivo sur un modèle de pathologie radio-induite cliniquement relevant l’efficacité de traitements locaux combinés. Pour évaluer l’efficacité thérapeutique d’un traitement, il est nécessaire d’utiliser un modèle intégré in vivo. De plus l’effet de ces traitements, pour qu’ils soient pertinents, nécessitent leur interaction avec les différents compartiments du côlon, condition retrouvée chez le modèle animal intégré. D'autre part, l'utilisation des organoïdes pour la réalisation de ce projet n'est actuellement pas techniquement possible, car il est nécessaire d'obtenir une monocouche orientée de cellules.

Réduction

Pour atteindre la pertinence statistique, les groupes sont classiquement constitués de 10 à 20 individus selon le paramètre utilisé. Une analyse sera réalisée afin de comparer tous les groupes entre eux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée des expérimentations. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par le suivi de son comportement et de son aspect physique (aspect du poil, prise alimentaire, présence de fèces dans la cage, perte de mobilité…). De plus, des dispositifs d'enrichissement seront mis en place dans les cages pour créer un environnement stimulant pour les animaux. Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et euthanasié si son état est jugé irréversible.

Choix des espèces

Le rat est un modèle clé en recherche préclinique, en particulier dans la recherche pharmacologique et toxicologique, en raison de sa similitude avec l'être humain dans l'élimination des toxicités. Le protocole d’irradiation proposé a été mis au point au laboratoire chez le rat. La taille du rat permet aisément la réalisation d’irradiations fractionnées. En outre, nous utiliserons des animaux de 275 g à 300 g pour les différentes études citées ci-dessus (rats à l’âge adulte). Pour la mise en culture des CSM (hors du champ d’application), nous utiliserons des rats GFP mâles ou femelles d6 semaines provenant de notre élevage interne. La multi-potentialité des CSM et leur capacité réparatrice est réduite avec l’âge, nous isolerons donc les CSM à partir de rats juvéniles.

1 984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après deux à trois injections de candidats vaccins ARN, la moitié est infectée par aérosol avec le bacille de la tuberculose puis mise à mort quatre semaines plus tard, les souris qui perdent du poids pouvant l'être plus tôt. Le porteur indique tester une vingtaine de candidats au service de l'objectif de l'OMS "En finir avec la tuberculose d'ici à 2030". Il affirme qu'une réponse immunitaire protectrice ne peut être validée que sur un "organisme entier" et retient la souris comme "meilleur compromis éthique".

Objectifs

La tuberculose reste un problème majeur en santé publique touchant des millions d’individus. L’infection par Mycobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose, est généralement traitée par antibiotiques. Cependant, ces bactéries présentent actuellement des niveaux alarmants de résistances à ces antibiotiques, constituant une menace majeure pour la santé et la sécurité sanitaire. Il y a donc urgence à développer des traitements alternatifs. Si les vaccins sont reconnus comme des outils très efficaces pour atténuer la résistance aux antibiotiques, la mise au point d'un vaccin efficace contre les bactéries intracellulaires telles que Mycobacterium tuberculosis, reste à développer. En effet, le seul vaccin actuellement approuvé contre la tuberculose est une souche de Mycobacterium bovis atténuée (BCG). S'il est efficace chez les jeunes enfants, son efficacité chez les adultes, reste insuffisante pour induire une protection efficace. Le développement d’un vaccin antituberculeux efficace produisant une immunité protectrice à tous les âges est donc une priorité absolue pour endiguer la propagation de la tuberculose résistante aux antibiotiques afin d’atteindre l'objectif défini par l'Organisation Mondiale de la Santé "En finir avec la tuberculose d'ici à 2030". L’objectif de ce projet est de développer de nouveau vaccins antituberculeux efficaces en utilisant des approches innovantes. Le but du projet est de produire des vaccins mRNA permettant l’expression des antigènes de Mycobacterium tuberculosis définis et de tester l’efficacité de ces vaccins dans des modèles animaux. Les bénéfices du projet seront la production de vaccins antituberculeux protecteurs efficaces contre des souches de Mycobacterium tuberculosis résistantes aux antibiotiques. Une fois défini, ces vaccins seront testés dans des essais cliniques chez l’homme pour être développés pour la population humaine. Il est prévu dans le projet de tester une vingtaine de candidats vaccins dans des expériences de protection chez la souris.

Bénéfices attendus

Dans son ensemble, le projet devrait aboutir à la production de vaccins antituberculeux protecteurs efficaces contre l’infection par Mycobacterium tuberculosis, et pourrait ainsi palier le problème du développement de souche bactériennes résistantes aux antibiotiques, qui est un des problèmes majeurs de santé publique défini par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ce projet devrait permettre de définir un protocole vaccinal chez la souris qui nous aidera à déterminer une stratégie vaccinale efficace contre la tuberculose chez l’homme. En effet, dans le cadre d’un projet européen plus large, les formulations vaccinales et le protocole de vaccination, une fois établis chez la souris, seront alors évalués chez le primate non humain et lors d’essais cliniques chez l’homme avec l’objectif de développer un vaccin antituberculeux pour la population humaine. Par ailleurs, en cas de succès, la stratégie de caractérisation et d’élaboration de nouveaux vaccins basé sur l’identification d’antigène et d’expression par ARNm pourra alors être utilisée pour la mise en place de nouveaux vaccins contre d’autres infections intracellulaires pathogènes.

Procédures

Pour tous les animaux, 2 à 3 injections de vaccins à l’aide de seringues sur animaux vigiles prenant une dizaine de secondes par animal. Les injections sont espacées de 21 jours. 1 prélèvement sanguin un jour après la dernière injection prenant quelques secondes par animal. Pour la moitié des animaux, une infection par des bacilles tuberculeux par voie aérosol est réalisée ; la durée de l’exposition est d’une vingtaine de minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront 2 à 3 doses de vaccin par voie intramusculaire. Il est maintenant reconnu que les vaccins à base d’ARNm n’entrainent que des effets indésirables légers et plus particulièrement une douleur de courte durée sur le site d’injection lors de la vaccination. D’autre part il est important de noter que les formulations vaccinales seront préalablement testées pour leur biodélivrance et leur toxicité par le laboratoire les produisant. Ainsi, concernant les animaux impliqués dans cette demande, ils ne recevront que des formulations n’induisant que des effets secondaires légers généralement observés lors d’une vaccination. La vaccination des souris n’induit que des douleurs légères. Cependant 4 semaines après la dernière injection, les souris seront infectées par des bacilles tuberculeux. Les souris sont mises à mort 4 semaine après l’infection. Cette période est choisie car cela permet aux bactéries de se multiplier dans les organes sans développer de signe pathologique de la tuberculose. Les dommages et effets indésirables pour les animaux sont donc considérés comme modérés dû à la présence de foyer de multiplication des bactéries dans la rate et les poumons mais sans symptôme pathologique.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort car le projet nécessite de faire des analyses sur des organes vitaux. Ces organes ne pourront être prélevés qu’après mise à mort de l’animal.

Remplacement

Il s’agit ici de tester différentes formulations de vaccins de type ARNm. Toutes les questions pouvant être apportées par l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules isolées à partir de sang telle que l’expression des ARNm ou l’activation des cellules du système immunitaire seront réalisées in vitro. Cependant, l’induction d’une réponse immunitaire est un phénomène complexe faisant intervenir de nombreux types cellulaires dans différents organes et ne peut être étudiée que dans sa globalité. En effet, il existe de nombreux éléments inducteurs et régulateurs impliquées dans ces réponses et certains ne sont pas encore connus. L’évaluation de l’efficacité des vaccins sur l’induction d’une réponse immunitaire protectrice devra donc être analysée et validée sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur la forte expérience de nos collaborateurs sur la conception d’études de ce type et validée par des biostatisticiens. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux strictement nécessaire pour atteindre l’objectif fixé. Les expériences passées ont montré que le nombre d’animaux par groupe utilisé ici (5) est le minimum requis pour obtenir des résultats pertinents et statistiquement significatifs. Un nombre inférieur d’animaux pourrait conduire à une expérience non interprétable du fait d’un manque de puissance des données générées. La répétition de l’expérience pourrait être nécessaire pour la robustesse des données établies. Par ailleurs, nous utiliserons des techniques expérimentales nous permettant d’analyser sur un seul individu de multiples facteurs caractérisant la réponse immunitaire pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un environnement protégé et hébergées en groupe, avec une litière appropriée, des matériaux de nidification, et une nourriture adaptée. La durée et les doses sont calculées pour ne pas induire d’effet indésirable, tout en atteignant les objectifs scientifiques. Néanmoins, des observations régulières des animaux seront effectuées tout au long des expériences. Pour les souris qui seront infectées par Mycobacterium tuberculosis, nous serons sensibles à l’apparition du moindre signe clinique telles la parésie et la piloérection qui sont précurseurs, sur la base d’expériences passées, d’une perte de poids. Dès apparition de ces signes cliniques, un suivi strict du poids d’abord 2 fois par semaine puis à fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids sera effectué (de 2 fois par semaine à tous les jours jusqu’à 2 fois par jour, l’animal sera mis à mort en fin de journée s’il est estimé que le point limite sera atteint avant la pesée du lendemain matin). La perte de poids ou l’apparition de symptômes importants suggérant une souffrance de l’animal caractérisée par un score défini par une table de score clinique seront considérés comme point limite; les animaux concernés seront mis à mort. Pendant la durée de l’expérience, les animaux restent dans leur environnement habituel.

Choix des espèces

La souris présente le meilleur compromis éthique entre modèle mammifère, résultats le plus proches de l’humain. Les métabolismes sont bien caractérisés et largement comparables à ceux de l’homme. Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel comme modèle pour l’infection par Mycobacerium tuberculosis permettant d’analyser les réponses immunitaires dirigées contre le bacille, mais aussi qui permet d’analyser et d’évaluer le contrôle de la prolifération bactérienne dans les organes cibles, et donc l’effet protecteur. En conséquence, les connaissances acquises seront vraisemblablement transférables à l’homme. D’autre part, de nombreux outils très performants sont disponibles pour l’analyse de réponses immunitaires chez la souris nous permettant d’avoir des réponses claires et précises en utilisant de faibles quantités d’échantillons et permettant ainsi d’analyser différents facteurs. De plus de nombreuses données sont déjà disponibles (par notre expérience et dans la littérature) nous permettant de valider les résultats par comparaison. Le système immunitaire étant parfaitement développé chez les individus matures, nos travaux sont effectués sur des animaux adultes. Les souris de 6 semaines seront livrées. Les manipulations sont toujours planifiées après avoir laissé une semaine d’adaptation aux animaux.

Privation de nourriture pendant une nuit, jusqu'à huit administrations par sonde gastrique en une journée, antibiotiques ou régime riche en graisse pendant dix jours à quelques semaines, chirurgie intracérébrale : selon les groupes, 2 402 souris subissent ces procédures, en plus de tests comportementaux de mémoire, de sociabilité, d'anxiété, de dépression et de sensibilité aux effets des drogues, sans que le texte nomme ces tests. La déclaration compte 749 souris en souffrance légère et 1 653 en souffrance modérée, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour prélever leur cerveau, dans un projet sur l'influence des bactéries intestinales sur les effets de récompense de la nicotine. Le porteur qualifie de "minimes" les "dommages escomptés pour les animaux", et retient parmi les points limites une perte de poids de plus de 20 %, une diarrhée de plus de deux jours sous antibiotiques, un poids dépassant 45 g ou une locomotion "fortement compromise" par le régime gras. Les effets possibles cités comprennent aussi ceux d'une vagotomie, section du nerf vague, que la description des procédures ne mentionne pas.

Objectifs

L’objectif général du projet est de comprendre dans quelle mesure et comment les bactéries intestinales influencent les processus associés à l’addiction aux drogues et plus particulièrement à la nicotine, composé actif principal du tabac. En effet l’addiction reste un enjeu de santé publique majeur, le tabac étant la principale cause de mortalité précoce, et il reste beaucoup à découvrir sur les mécanismes qui sous-tendent cette pathologie. Tous les individus n’ont pas le même risque de développer une addiction après avoir expérimenter une drogue telle que la nicotine. Plusieurs facteurs génétiques et environnementaux contribuent à augmenter ce risque chez certains individus. De plus en plus d’études montrent un rôle très important de la flore intestinale dans le fonctionnement du cerveau et dans le développement de maladies psychiatriques y compris dans l’addiction. Cependant les mécanismes d’action mis en jeu sont encore très peu connus. On sait que les drogues activent le circuit dit de récompense au sein du cerveau. En plus des neurones, le cerveau comprend également un ensemble de cellules dites gliales qui servent de support à l’activité neuronale et mettent en jeu des mécanismes de défense. Il est connu que ces cellules influencent la réponse des neurones du circuit de la récompense aux drogues. De plus en plus d’études suggèrent que les bactéries intestinales influencent fortement leur activité. Ainsi, les objectifs précis du projet sont de caractériser l’impact de la flore intestinale d’une part sur l’activité des neurones et des cellules gliales du circuit de la récompense, et d’autre part de comprendre le lien mécanistique qui existe entre flore intestinale, cellules gliales et neurones en réponse à la nicotine.

Bénéfices attendus

L’addiction aux drogues représente l’un des enjeux majeurs des systèmes de santé, et leur prévalence s’accroit, sans aucun traitement suffisamment efficace à ce jour. Le projet permettra d’identifier de nouveaux facteurs de prédisposition à l’addiction et en particulier à l’addiction à la nicotine, principal composé actif du tabac. A court terme, il permettra d’identifier dans quelle mesure et comment les bactéries intestinales modifient la réponse du cerveau à la nicotine. Identifier les souches de bactéries, leurs métabolites et mécanismes d’action impliqués dans les effets des drogues, grâce à des approches précliniques impossibles à mettre en œuvre en recherche clinique, pourra ouvrir à plus long terme sur de nouvelles stratégies d’intervention pour aider à la prévention et /ou à la cessation du tabagisme basées notamment sur l’utilisation de prébiotiques et /ou de probiotiques précis et sur des modifications des habitudes de vie ayant une action directe sur la composition de la flore intestinale. .

Procédures

Les animaux seront soumis à différents tests comportementaux, à raison d’un test maximum par jour, dans le but de tester leurs fonctions locomotrices, mnésiques et sociales, leurs états émotionnels de type anxieux ou dépressif, ainsi que leur sensibilité aux effets hédoniques des drogues. Ils seront soumis à une administration intragastrique; dans la majorité des cas elle sera réalisée une fois par jour pendant 10 jours et une minorité d’animaux recevront jusqu’à 8 administrations en une journée mais seulement une journée. Une minorité d’animaux devront être privés de nourriture mais uniquement pendant une nuit et l’eau sera laissée à volonté. L’exposition à des antibiotiques ou à une nourriture riche en graisse sera réalisée pendant 10jours à quelques semaines chez certains animaux. En outre, certains animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale au cours une infusion ou implantation intracérébrales sera réalisée. La chirurgie dure environ 30 minutes puis l’animal aura une semaine minimum pour récupérer.

Impact sur les animaux

Les dommages escomptés pour les animaux sont minimes car nous mettrons tout en œuvre pour supprimer douleur et souffrance qui pourraient être induites par les différentes procédures, d’autant plus que les animaux doivent être en bonne santé pour être soumis aux différents tests. Les différents modèles et protocoles qui seront employés pour perturber la flore intestinale ont déjà été testés et validés, et n’ont pas été associés à des altérations majeures de la santé physique ou émotionnelle des animaux. Ils ont été choisi sur cette base. On peut s’attendre cependant à voir l’apparition d’états d’inconfort de type anxieux passagers chez certains animaux soumis à une nourriture riche en gras, exposés à l’administration intra-gastrique, ou à certains tests comportementaux de dépression, ou à une privation alimentaire pendant une nuit, ou à une chirurgie intracérébrale ou de vagotomie. Ces nuisances seront gérées par des points limites spécifiques et précoces et par un protocole d’anesthésie et d’analgésie en cas de chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les cerveaux devront être prélevés pour des expériences ex vivo.

Remplacement

Pour évaluer le rôle des bactéries intestinales, et identifier les mécanismes mis en jeu, sur les processus associés à la dépendance à la nicotine, il est essentiel de faire des mesures sur des modèles animaux ayant un circuit intestin-cerveau fonctionnel, et d’étudier les comportements de prise volontaire et les états psychologiques associés aux effets hédoniques des drogues au plus près de la façon dont ils se manifestent chez l’homme. Ceci ne peut, par essence, être réalisé autrement que sur des animaux vivants, ayant une connectivité physiologique entre intestin et cerveau et un degré de développement de leurs fonctions émotionnelles et cognitives suffisants pour en faire des modèles d’étude pertinents.

Réduction

La méthodologie statistique a été discutée en amont de la soumission de ce projet avec des biostatisticiens. Dans les études prévues, notamment l’étude des comportements, la variabilité inter-individuelle est élevée. Il est donc nécessaire de tester au moins 10 et 12 animaux, respectivement, par groupe expérimental, sexe et conditions (parfois en deux réplicas) pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Pour l’étude de l’expression des gènes, les experts en bioinformatique préconisent un minimum de 4 animaux par condition. Un groupe contrôle sera systématiquement prévu pour chaque jeu d’expériences et sera spécifique de chaque condition expérimentale testée. Le nombre d’animaux par groupe se base d’une part sur notre expérience solide des procédures et des modèles et souches d’animaux qui seront utilisés dans ce projet, et d’autre part sur la littérature, très abondante sur le sujet et dans laquelle les mêmes souches de souris sont couramment utilisées. Notre expérience dans les différents aspects du projet nous a déjà permis de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Les paramètres mesurés seront ensuite comparés entre groupes, sexes et conditions avec des statistiques appropriés, pour mesurer l’effet des différents facteurs et de leur interaction possible sur les différents paramètres d’intérêt. Sur cette base, nous nous efforcerons de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés en ajustant au mieux les protocoles expérimentaux et les analyses statistiques pour obtenir des résultats statistiques robustes tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle des animaux testés.

Raffinement

Avant chaque expérience nous passerons plusieurs jours à manipuler les animaux afin de les habituer à l’expérimentateur et à la manipulation. Il y a aura, sauf circonstance imprévue, seulement un expérimentateur par groupe expérimental. Pendant toutes les expériences de comportement les animaux seront manipulés très régulièrement (presque tous les jours), ce qui les rend très peu réactifs émotionnellement à la manipulation, et ce qui permet de détecter le moindre changement d’attitude ou l’apparition de signes externes inquiétants. Pour les autres expériences, ils seront laissés tranquille dans leurs cages au maximum et surveillés plusieurs fois par semaine. Nous enrichirons le milieu avec du coton, et/ou des igloos en carton, et nous nous rapprocherons du comité responsable du bien-être animal pour redéfinir les conditions optimales d’enrichissement si besoin. Concernant les chirurgies, des antidouleurs seront appliqués. Si apparition des signes d’infection et en accord avec le vétérinaire des antibiotique seront donnés. L’état général et les signes de douleur des animaux seront évalués régulièrement. Au moins une fois par jour les animaux sont examinés pour des signes de détresse (changements de posture, yeux plissés, manque de toilettage) et l’incision est examinée pour signes d’infection. Si nécessaire, des doses supplémentaires d’analgésique seront données. Si au bout de 24h le traitement s’avère inefficace et les points limites atteints les animaux seront mis à mort. Ces points correspondent à : une prostration, dos courbé et expression facial très altérée, ou dénutrition majeure, ou perte de poids supérieure à 20%, ou diarrhée systématique pendant plus de deux jours suite aux antibiotiques, ou prise de poids supérieure à 150% ou poids dépassant 45g ou locomotion fortement compromise suite au régime riche en graisse ). Pour l’ensemble du projet une pesée quotidienne et l’utilisation des traitements décrits ci-dessus seront appliqués en cas de dégradation de l’état de l’animal avant atteinte des points limites.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les mécanismes et comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions physique et émotionnelle reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également manipuler l’activité du cerveau, la flore intestinale et le génome sans dommages durables pour les individus. La souris est, en outre, un modèle particulièrement intéressant lorsqu'on souhaite étudier la flore intestinale et son lien avec le cerveau. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), afin que le cerveau soit suffisamment développé notamment pour l’étude de leur comportement Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mâture pour la réussite et la reproductibilité des interventions, et l’homogénéité de leur comportement