Procédures légères

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur provoque une sécheresse oculaire par des injections de scopolamine quatre fois par jour et une exposition à un courant d'air continu dix heures par jour pendant douze jours, avec suivi de la production de larmes et de l'état de la cornée. Le projet étudie le rôle d'un récepteur, RAGE, dans cette pathologie, sur des souris dont ce gène est inactivé. Le porteur affirme que l'étude "ne peut pas" être menée chez le patient pour des raisons éthiques et que la règle des 3R ne permet pas de remplacer le modèle animal.

Objectifs

L'oeil sec est une pathologie de la surface oculaire, très fréquente, touchant environ 50 à 60 % des personnes de plus de 50 ans. Notre objectif est de caractériser le récepteur RAGE, ses voies cellulaires, et l'expression phénotypique du syndrome sec oculaire dans plusieurs tissus et fluides de l'oeil (cornée, conjonctive, cellules à mucus, larmes) ainsi qu’au niveau physiologique (développement de la maladie) chez des souris KO RAGE -/- et chez des souris "sauvages" soumises à des conditions environnementales connues pour être à risque de syndrome sec oculaire. La conduite de cette étude sur l’oeil sec in-vivo ne peut pas être menée directement chez le patient pour des raisons éthiques évidentes. Ainsi, celle-ci nécessite un organisme vivant, afin d’avoir une vue d’ensemble sur le développement de la maladie et sur les acteurs impliqués dans la survenue et le caractère cyclique de cette pathologie. Considérant la règle des 3R, nous ne pouvons pas recourir au remplacement du modèle animal décrit.

Bénéfices attendus

Le récepteur des produits avancés de glycation (RAGE) est un récepteur ubiquitaire dans l'organisme, connu pour être pro-inflammatoire, pro-thrombogène, ou encore pro-apoptotique au niveau cellulaire. Notre objectif est de caractériser le récepteur RAGE, ses voies cellulaires, et l'expression phénotypique du syndrome sec oculaire dans plusieurs tissus et fluides de l'oeil (cornée, conjonctive, cellules à mucus, larmes) ainsi qu’au niveau physiologique (développement de la maladie) chez des souris KO RAGE -/- et chez des souris "sauvages" soumises à des conditions environnementales connues pour être à risque de syndrome sec oculaire. Ainsi, nous essayons par ce projet de mieux connaitre les voies d'activation cellulaire de RAGE dans la pysiopathologie du syndrome sec oculaire. Un des bénéfice majeur de ce travail pourrait être une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques complexes du syndrome sec oculaire, notamment les voies d'activation de l'inflammation au niveau de la surface oculaire.

Procédures

Des souris KO RAGE -/- et des souris "sauvages" RAGE +/+ de la lignée C57 Black 6 (âgées de 4 à 6 semaines) seront soumises à des stimuli environnementaux connus pour être à risque de survenue de sécheresse oculaire (comme une attention soutenue sur une tâche nécessitant de la concentration, et/ou une condition venteuse avec hygrométrie faible). En parallèle, des souris témoins des 2 fonds génétiques seront utilisés comme contrôle de l’expérimentation. Dans un premier temps, l’ensemble des souris seront placées dans leur cage en condition standard pendant 8 jours: température 23 +/- 2°C, humidité 50 à 75%, alternance 12 heures lumière - obscurité (8h to 20h), et eau/alimentation ad libitum. Pour les groupes « oeil sec », l’induction du syndrome se fera par l’injection sous-cutanée 4 fois par jour (8h00, 12h00, 14h00 et 17h00) de scopolamine (0.5 mg/0.2 ml; Sigma-Aldrich) en alternant le flanc gauche et droit. Les souris seront de plus exposées à un courant d'air continu à partir d'un ventilateur placé à 15 cm devant la cage (courant d’air de 2-4 m/secondes) dans une pièce à environnement contrôlé (30-35 % humidité, 23°C, alternance jour/nuit 12h) et ce pendant 10 heures par jour durant 12 jours consécutifs. Le modèle de maladie de l’oeil sec proposé dans ce projet a déjà largement été utilisé sans effet nocif perceptible lié au traitement à la scopolamine ni à une faible humidité [Luo, L. et al., 2004 ; Yeh, S. et al., 2003]. Pour les groupes témoins, les souris seront placées dans un environnement non stressant contenant 50 à 75% d'humidité à la température de 23 +/- 2°C, sans exposition à l'air forcé et eau/alimentation ad libitum. Lors de l’expérimentation, des tests « non invasifs » seront réalisés afin d’évaluer au jour le jour l’avancée du syndrome . Tout d’abord, la perte de production de larmes sera testée en utilisant des fils de coton imprégnés de rouge de phénol qui seront placés dans le ménisque des larmes du canthus latéral pendant 30 secondes (1 fois par jour pendant la durée de l'expérimentation). Ce test est considéré comme équivalent au test de Schirmer mené chez les patients souffrant d’un syndrome de l’oeil sec (bandelette buvard graduée permettant de quantifier la production lacrymale sur 5 minutes). En parallèle, l’étude de l’intégrité des épithéliums sera réalisée en utilisant l’instillation de fluorescéine (1%) et l’utilisation d’une lampe à fente (1 fois par jour pendant la durée de l'expérimentation).

Impact sur les animaux

La provocation expérimentale d'un oeil sec n'est pas anticipé comme étant une condition risquant de provoquer une douleur majeure ou une angoisse animale. Les symptômes de syndrome sec oculaire sont une sensation de corps étrangers, une brulure oculaire, une rougeur oculaire et une irritation de surface. Cependant, en cas de constation d'un comportement douloureux (intolérance majeure à la lumière, animal prostré, ne s'alimentant plus) ou d'un ulcère cornéen profond (stromal profond de la cornée) et/ou à risque de perforation cornéenne, l'animal sera anesthésié et sacrifié par surdosage en produits anesthésiques (Pentobarbital 150 mg/kg en injection intrapéritonéale), aboutissant à une apnée conduisant au décès. Ce type de symptômes ou constation clinique est exceptionnellement lié à un syndrome sec oculaire chez l'Homme. Ils sont le plus souvent dus à des commorbidités oculaires sous jacentes (pathologies inflammatoires, troubles liés à l'innervation cornéenne, anomalies des cellules souches limbiques, pathologies infectieuses cornéennes).

Devenir

Tous les animaux sont sacrifiés avant prélèvement de leurs globes oculaires.

Remplacement

La conduite de cette étude sur l’oeil sec in-vivo ne peut pas être menée directement chez le patient pour des raisons éthiques évidentes. Ainsi, celle-ci nécessite un organisme vivant, afin d’avoir une vue d’ensemble sur le développement de la maladie et sur les acteurs impliqués dans la survenue et le caractère cyclique de cette pathologie. De nombreux travaux déjà publiés sur l’étude des anomalies de la surface oculaire (cornée, conjonctive, larmes) ont établi que l’utilisation du modèle souris apparaissait comme la meilleure solution. De plus, l’équipe de recherche possédant et utilisant déjà la lignée RAGE -/-, ce choix apparait de fait logique et justifié. Enfin, ce cercle vicieux de l’oeil sec et son processus pathologique dynamique pourront être étudiés sur ce modèle et corrélés avec les agressions subis par l’oeil humain et les capacités de cicatrisation de ce type de tissu vivant. Considérant la règle des 3R, pour le remplacement nous avons réalisé toutes les premières études en utilisant des cellules en culture afin d'éviter l'inclusion d'un trop grand nombre d'animaux.

Réduction

Afin d'inscrire cette expérimentation animale dans le cadre de la Règle des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer), nous réduirons notre étude à 4 groupes distincts (pour tenir compte de la variabilité expérimentale): chaque groupe sera constitué de 10 souris pour un effectif total de 40 souris. Pour rappel: Ce protocole expérimental utilisant la souris nécessitera la constitution de 4 groupes distincts dont les effectifs ont été calculés pour réduire au maximum le nombre de souris afin d'optimiser la puissance statistique. En tenant compte de la variabilité expérimentale concomitante à la conduite de tels projets chaque groupe sera constitué de 10 souris pour un effectif total de 40 : Groupe 1 : Souris Wild-Type *Groupe contrôle (effectif :10); Groupe 2 : Souris RAGE -/- *Groupe contrôle (effectif :10); Groupe 3 : Souris Wild-Type *Groupe OEil-sec (effectif :10); Groupe 4 : Souris RAGE -/- *Groupe OEil-sec (effectif :10). Ces effectifs nous permettront d’obtenu des tests statistiques non paramétriques (Kruskal-Wallis et Mann-Whitney U test).

Raffinement

Dans l'optique de raffiner au mieux notre protocol, nous veillerons au bien-être animal (pas de surpopulation dans les cages, éviter les actes douloureux inutiles, enrichissement des cages avec des roues de course, des tubes en plastique, boîtes en carton et des matériaux de nidification). Points Limites: la provocation expérimentale d'un oeil sec n'est pas anticipé comme étant une condition risquant de provoquer une douleur majeure ou une angoisse animale. Les signes cliniques et fonctionnels du syndrome sec oculaire sont minimes à modérés: une gène oculaire à type de grains de sable, des sensations de brûlures oculaires superficielles, un prurit, une vision trouble fluctuante. L'ensemble de ce protocole ne doit pas normalement entrainer de souffrance animale. Malgrès tout, en cas de constation d'un comportement douloureux (intolérance majeure à la lumière, animal prostré, ne s'alimentant plus) ou d'un ulcère cornéen profond (stromal profond de la cornée) et/ou à risque de perforation cornéenne, l'animal sera anesthésié et sacrifié par surdosage en produits anesthésiques (Pentobarbital 150 mg/kg en injection intrapéritonéale), aboutissant à une apnée conduisant au décès. Ce type de symptômes ou constation clinique est exceptionnellement lié à un syndrome sec oculaire chez l'Homme. Ils sont le plus souvent dus à des commorbidités oculaires sous jacentes (pathologies inflammatoires, troubles liés à l'innervation cornéenne, anomalies des cellules souches limbiques, pathologies infectieuses cornéennes).

Choix des espèces

Comme évoqué dans les paragraphes précédents, le choix de la souris comme modèle d’étude va permettre : - une analyse biomoléculaire proche de la cornée humaine du fait de sa forte homologie anatomique et fonctionnelle avec l’espèce humaine. - l’utilisation du modèle murin dans le syndrome sec expérimental qui est d’ores et déjà largement décrit et reconnu au travers de la littérature. - d’utiliser les nombreux outils moléculaires accessibles, développés et validés dans le modèle murin ; et en particulier l’utilisation de souris dont le gène étudié (RAGE) est inactivé. Nous utiliserons des souris mâles Black 6 (souris « C57BL/6JRj, Janvier Labs ») âgées de 4 à 6 semaines. Ainsi toutes les souris ont le même poids et sont sevrées de l’allaitement maternel. C’est également la période optimum pour la cicatrisation des tissus.

1 200 rongeurs, six cents souris et six cents rats, vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger, réutilisés ensuite dans d'autres travaux pratiques. Ils servent à entraîner des stagiaires aux gestes de base, préhension, contention, injection intra-péritonéale de sérum physiologique, et à des tests de comportement, open-field, labyrinthe en croix surélevée, planche à trou et chambre claire-obscure. Ces manipulations n'ont pas de finalité de connaissance mais visent la formation réglementaire des concepteurs et applicateurs d'expériences. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution ne restitue les comportements de l'animal et que les gestes doivent être acquis sur l'espèce cible vivante.

Objectifs

Les personnels des établissements utilisateurs d'animaux à des fins scientifiques ont pour obligation d'être compétents en expérimentation animale. Cette compétence repose pour les concepteurs sur un niveau de formation initiale, une formation spécialisée et une formation continue. Pour les applicateurs, la compétence repose sur la formation spécialisée et la formation continue. Le projet de travaux pratiques présenté ici comprend la partie pratique des deux programmes de formations spécialisées "concepteur" et "applicateur". Il comprend deux procédures expérimentales : un TP pour acquérir les gestes de base : préhension, contention, administrations, prélèvements et un TP pour se familiariser aux tests de comportements pratiqués chez les rongeurs : Open-field, Labyrinthe en croix surélévée, planche à trou, chambre claire-obscure.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont l'apport d'une compétence pratique à la préhension, la contention, certaines techniques d'administration et de prélèvements et de se familiariser à des tests simples mais néanmoins informatifs pour l'étude du comportement des animaux.

Procédures

Pour le TP sur les gestes de base, les actes les plus contraignants sont l'administration de sérum physiologique en intra-péritonéale (piqûre d'aiguille). Ce sont dans les deux cas des gestes brefs qui durent quelques secondes. Pour le TP sur le comportement, les actes expérimentaux réalisés sur les animaux ne sont pas douloureux, tout au plus, il sont stressés quelques minutes du fait d'un environnement nouveau. Les trois tests expérimentaux durent entre 3 et 10 min chacun. Les deux TP sont des procédures expérimentales de classe légère.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être manipulés en réduisant au maximum les nuisances, car ils le seront selon les recommandations du Centre 3R anglais. Les nuisances les plus importantes seront tout au plus de gravité légère et comprennent une administration intra-péritonéale (nuisance équivalente à une piqûre d'aiguille).

Devenir

Les animaux seront réutilisés car ils auront été impliqués dans des procédures légères uniquement.

Remplacement

Pour ce projet, il n'existe pas de méthodes de substitution qui pourrait restituer fidèlement les comportements et réactions des animaux qui peuvent être complexes. Les gestes étant spécifiques de l'espèce rat ou souris, ils doivent être acquis chez l'espèce cible. Toutefois, des outils vidéos en provenance d'une source reconnue de tous (NC3R = Centre 3R anglais) et d'un intérêt indéniable seront utilisés en tout premier lieu, avant la pratique car ils présentent des méthodes modernes, de préhension/contention par exemple. La mise en place des TP sur animaux vivants est donc complétée par une approche préalable complémentaire basée sur les vidéos du centre NC3R. Les gestes ou approches à acquérir imposent que l'animal soit vivant pour évaluer les critères de réussite.

Réduction

Nous sommes attentifs à réduire au maximum le nombre d'animaux, à un rat et une souris par stagiaire, ce qui permet d'atteindre l'objectif pédagogique visé. Par ailleurs, les animaux impliqués dans le TP comportement, nécessairement naïfs, seront utilisés dans un second temps pour le TP gestes de base, permettant de mutualiser l'utilisation d'animaux entre les différentes procédures. Ils ne seront pas euthanasiés mais seront également impliqués quelques mois après la formation dans d'autres TP universitaires (qui feront l'objet de demandes d'autorisation de projet indépendantes de celle-ci).

Raffinement

Les animaux impliqués dans les procédures expérimentales de ce projet sont hébergés dans la zone d'hébergement pendant plusieurs semaines avant les TP, avec une enrichissement social et physique (acclimatation). Les procédures menées sont tout au plus de classe légère (administration intra-péritonéale de sérum physiologique). Les tests de comportement sont tout au plus un peu stressants pour les animaux. Dans ces conditions, aucune administration d'antalgique ne sera réalisée car elle n'est pas pertinente. Les autres gestes comme la préhension et la contention ne sont pas douloureux. Toutefois, une attention particulière sera portée à l'atteinte de potentiels points limites qui sont malgré tout très peu probables.

Choix des espèces

Les espèces qui seront utilisées dans ce projet correspondent aux espèces cibles, c'est à dire aux espèces du module complémentaire de la formation règlementaire en expérimentation animale. Ce sont les espèces dont les stagiaires auront besoin pour leurs futures activités de recherche. Les animaux seront des animaux matures de six semaines au moins. Nous utilisons ces stades car les animaux adultes correspondent aux animaux utilisés classiquement pour les tests de comportement prévus. Ce sont par ailleurs des stades où les animaux sont facilement manipulables pour les travaux pratiques (sachant que nous choisissons des souches d'animaux connus pour être calmes).

40 génisses vont être utilisées dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger, gardées en vie à l'issue, dix réutilisées et trente rendues à l'élevage. Elles reçoivent un traitement hormonal de synchronisation, un dispositif vaginal et un ou deux transferts d'embryons sous anesthésie épidurale, avec des prélèvements sanguins. Le projet compare deux protocoles de production d'embryons in vitro pour améliorer les taux de gestation des schémas de sélection bovine, dont le porteur reconnaît qu'ils servent des activités commerciales. Il conclut lui-même que l'effectif limité rend peu probable la mise en évidence d'une différence significative entre les lots.

Objectifs

Actuellement, les biotechnologies de l’embryon sont largement utilisées par les entreprises de sélection bovines afin d’accroitre le progrès génétique par la réduction de l’intervalle entre générations et l’augmentation de l’intensité de sélection. La production in vitro d’embryons après ponction ovocytaire, couplée au génotypage, est théoriquement l’approche la plus efficace. Toutefois, les conditions de production in vitro sont sub-optimales et altèrent globalement la compétence au développement des embryons: alors que le taux de gestation atteint les 60% pour des embryons produits in vivo, la réimplantation d’embryons génotypés produits in vitro et congelés ne conduit à une gestation que dans moins de 35% des cas. Ces résultats engendrent d’importantes pertes économiques et de progrès génétique qui rendent nécessaire une optimisation des conditions de production in vitro. Au cours d’un précédent projet de recherche, un nouveau protocole de production d’embryons in vitro a été développé. Ce nouveau protocole a donné des résultats prometteurs en utilisant des critères d’évaluation in vitro (taux de développement, qualité morphologique, comptage cellulaires, survie à la congélation) et doivent désormais être validés par mesure des taux de gestation après transfert dans des femelles receveuses. En effet, l’évaluation in vitro de la qualité des embryons constitue encore un vaste sujet d’études car aucun critère in vitro ne semble aujourd’hui prédire de manière fiable le potentiel de développement in vivo après transfert dans des femelles receveuses. Avant d’être transféré aux professionnels et épprouvé à plus large échelle, le nouveau protocole de production doit donc être testé en conditions expérimentales, sur un nombre réduit de receveuses bien caractérisées. Le projet présenté dans ce document vise donc à obtenir des données préliminaires en transférant des embryons produits in vitro selon 2 protocoles différents (témoin et le protocole optimisé) dans 40 femelles receveuses préalablement synchronisées (2 lots de 20 receveuses).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'obtenir des données préliminaires sur les taux de gestation permis par le protocole optimisé et donc rassurer les professionnels sur son efficacité avant de l'intégrer à leurs activités commerciales et ainsi de le tester à plus large échelle. In fine, l'amélioration des taux de gestation conduira à une meilleure efficacité des schémas de sélection, notamment par la diminution du nombre d'animaux donneurs et receveurs nécessaires à la procréation des futurs taureaux d'insémination (impacts économique, environnemental, social).

Procédures

Les génisses expérimentales seront soumis à 1 ou 2 transferts d'embryons après anesthésie épidurale et traitement hormonal de synchronisation des chaleurs (incluant 1 injection intra-musculaire et la pose/retrait d'un dispositif vaginal) ainsi qu'à des prélèvements sanguins (2 à 4 en fonction du nombre de transferts d'embryons réalisés).

Impact sur les animaux

Peu de nuisances sont attendues sur les animaux de ce projet. La procédure expérimentale 1 est une pratique courament utilisée par les professionnels chez les bovins et qui ne semble pas impacter la santé et le bien-être des animaux. La procédure expérimentale 2 concerne peu de prise de sang (2 à 4 prises de sang

Devenir

Tous les animaux expérimentaux resteront en vie après chacune des procédures expérimentales. Les génisses gestantes à l'issue des transferts d'embryons seront vendues dans des élevages commerciaux comme femelle laitière prête à vêler. Les génisses vides après 2 transferts seront éventuellement recyclées pour un autre projet de recherche ou de formation mais pourront également être mises à la reproduction hors expérimentation.

Remplacement

Compte-tenu de l’objectif même de l’étude, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo. De plus, les techniques utilisées dans ce projet sont des pratiques couramment réalisées en élevages qui ne sont susceptibles d'engendrer qu'une douleur légère et très ponctuelle chez les génisses.

Réduction

Au total, 40 femelles seront utilisées dans ce projet. Compte-tenu de ces effectifs limités, il est peu probable que le dispositif puisse mettre en évidence une différence significative de taux de gestation entre les lots. Cette première étape de validation permettra essentiellement d’obtenir des données préliminaires avant d’envisager une validation à plus large échelle, en conditions de terrain.

Raffinement

les génisses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales...). De plus, une anesthésie épidurale sera réalisée préalablement au transfert d'embryons.

Choix des espèces

Compte-tenu de l’objectif même de l’étude, aucune autre espèce animale ne peut être choisie. La race Prim’Holstein choisie est la 1ère race laitière française en effectif, et est particulièrement concernée par les biotechnologies de l’embryon. Les animaux utilisés dans ce projet seront des génisses, toutes pubères. Le modèle génisse a l’avantage, par rapport à un modèle vache, de ne pas présenter de biais expérimentaux liés à l’historique des femelles (conditions de mise bas, interactions avec la production laitière….). Sur le terrain, les transferts sont également majoritairement réalisés sur des génisses car les taux de réussite sont supérieurs à ceux obtenus sur vaches.

7 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur provoque une dermatite atopique, un psoriasis ou une dermatite de contact par des agents chimiques ou biologiques, ce qui déclenche démangeaisons intenses, rougeurs et lésions cutanées, puis on leur administre des composés par gavage. Le projet, mené par une entreprise pharmaceutique, sert à sélectionner des candidats médicaments issus d'un criblage sur cellules. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours aux modèles animaux pour avoir une vue globale de la maladie et de la diffusion des composés.

Objectifs

Les maladies inflammatoires cutanées chroniques dont les plus fréquentes sont la dermatite atopique (DA) et le psoriasis (Pso) touchent entre 10 et 20% d’enfants en France et entre 2-3% de la population française, respectivement. Ces maladies se manifestent en poussées qui se caractérisent par des démangeaisons persistantes intenses, des rougeurs et des lésions cutanées récurrentes pouvant aller jusqu'à des surinfections impactant directement la qualité de vie des patients. Les origines de ces maladies restent complexes et multifactorielles (immunologiques, génétiques, environnementaux, infection bactérienne). D'autre part La dermatite de contact (DC) est une inflammation de la peau provoquée par le contact direct avec des irritants ou des allergènes. Les symptômes comprennent un prurit et parfois une douleur à type de brûlure. Les modifications cutanées comprennent un érythème, une desquamation, un gonflement de la peau et parfois des bulles et des ulcérations. Les traitements pour ces dermatites reposent sur des émollients et corticoïdes en application topique, des anti histaminergiques ainsi que la Puvathérapie. Cependant, ces traitements ne permettent pas de stopper la maladie mais de soulager les symptômes. D’où l’intérêt actuel de se focaliser sur de nouvelles thérapies avec le développement d’anticorps monoclonaux et de petites molécules inhibitrices. Galapagos a mis au point plusieurs tests in vitro permettant d’induire différentes voies de signalisation dans des cellules humaines ou murines. Grâce à la miniaturisation, nous avons pu mener plusieurs campagnes de criblage à haut débit qui ont permis d’identifier des molécules chimiques ou des cibles biologiques capables de bloquer ces voies de signalisation in vitro. Ces molécules vont être optimisées dans le but d’en faire des médicaments. Dans le cadre de ce projet, les candidats-médicaments qui auront montré un potentiel significatif d’inhibition des voies de signalisation ciblées dans les différentes pathologies seront retenus pour être évalués in vivo sur des modèles animaux. Ce programme de découverte de médicaments sera mené avec plusieurs séries chimiques agissant via des modes d’action moléculaires différents, mais tous pertinents dans l’objectif de diminuer les symptômes des différentes pathologies d’intérêt. Des combinaisons entre ces modes d’actions seront envisagées au cours de ce programme et testées sur les modèles animaux.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des modèles de dermatite atopique, psoriasis et de dermatite de contact chez la souris afin de tester l’efficacité de nos composés. Ces modèles seront induits par des agents chimiques et/ou molécules biologiques en injection intradermique ou en application topique. Les composés seront administrés par gavage. Un prélévement sanguin sera également éffectué pour suivre la pharmacocinétique des composés testés.

Impact sur les animaux

Les animaux developperont les signes cliniques des du psoriasis et de la dematites atopique et dermatite de contacte qui se caractérisent par des démangeaisons persistantes intenses, des rougeurs et des lésions cutanées récurrentes.

Devenir

Tous les animaux dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptées à l'espèce. Le réalisateur s’assurera de la mort effective de l’animal avant l’élimination du cadavre. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro. L'utilisation de modèles animals est indispensable pour avoir une vue globale de la physiopathologie de la maladie ainsi que la pharmacocinétique des composées sur l'ensemble des organes ce que ne permet pas les modèles in vitro.

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie sera envisagé par inhalation d’isoflurane (induction 4%, maintien 2%). De la buprénorphine à 0,01-0,2 mg/kg/8h en sous cutanée sera utilisée en cas de signes de douleur. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature

418 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés en vie ensuite. La plupart subissent une seule prise de sang à l'oreille, une centaine étant suivie deux ans avec jusqu'à six prélèvements, accompagnés de tests comportementaux (test d'approche, réactivité à un objet nouveau, réactivité à l'humain). Presque tous sont réutilisés dans d'autres projets de recherche agronomique, les vieux reproducteurs étant proposés à l'adoption et les jeunes non retenus réintégrant le circuit commercial du lapin de chair. Le porteur présente le projet comme visant à améliorer le "bien-être des animaux non-humains" en élevage, en développant un marqueur du stress.

Objectifs

Contexte : Les pressions environnementales (effondrement de la biodiversité, pollution, réchauffement climatique) et les nouvelles attentes de la société (acceptabilité de l’élevage) nous amènent à repenser les systèmes d’élevage dans une perspective de transition agroécologique qui inclut une meilleure prise en compte du bien-être animal. En France l’élevage de lapins est réalisé en grande majorité en conditions intensives. Les animaux sont conduits en bâtiment garantissant un niveau d’hygiène élevé car la santé des lapins est réputée très fragile. Mais les lapins logés en cages grillagées et à forte densité sont dans l’impossibilité d’exprimer les comportements propres à leur espèce : ronger, bondir, se dresser, brouter… L’initiative citoyenne européenne « end of cage » a été prise en compte par la commission européenne ce qui devrait déboucher vers une interdiction de l’élevage en cage d’ici 2027. Il est donc urgent de concevoir de nouvelles façons d’élever les lapins pour permettre aux animaux d’accéder à un meilleur bien-être tout en gardant une santé satisfaisante.

Bénéfices attendus

Les lapins font partie des espèces d'élevage élevées en totale claustration. Il y a donc une nécessité à faire évoluer leurs conditions d'élevage pour améliorer leur bien-être. L'évaluation de l'impact de ces conditions de vie sur le stress des lapins est importante pour permettre d'améliorer le bien-être animal. Le projet vise à développer un biomarqueur du stress. Pour les chercheurs, il y a un enjeu fort à disposer d’indicateurs pertinents pour évaluer le bien-être animal dans différents environnements, différentes conditions de vie et pour différentes populations. Les connaissances générées par le projet contribueront à guider l'évoluation des conditions d'élevage des lapins.

Procédures

L’expérience prévoit de réaliser des prises de sang pour chaque animal. Ces échantillons nous permettront de récupérer les globules blancs pour réaliser des extractions d'ADN. Des observations de comportement non invasives seront également prévues pour évaluer le stress : notation des répertoires d’expression d’émotions positives (curiosité, calme, approche et contact avec l’homme) et négatives (prostration, inhibition, déplacements brusques ou circulaires, agressivité envers l’homme). Nous réaliserons également divers tests de comportement : test d’approche, réactivité à un objet nouveau, réactivité à l’homme… La plupart des animaux subiront une unique prise de sang. Mais une centaine d'animaux fera l'objet d'un suivi au cours de leur vie (pendant 2 ans). Ces lapins subiront au maximum 6 prises de sang à des âges clés: sevrage, prépuberté, puberté, mise à la reproduction, etc.

Impact sur les animaux

La plupart des animaux subiront une unique prise de sang. Mais une centaine d'animaux fera l'objet d'un suivi au cours de leur vie (pendant 2 ans). Ces lapins subiront au maximum 6 prises de sang à des âges clés: sevrage, prépuberté, puberté, mise à la reproduction, etc. La prise de sang sera réalisée à l'oreille avec des aiguilles très fines et en prélevant au maximum 1 ml de sang/animal. La contention sera douce. Compte-tenu de la quantité de sang prélevée et de l'espacement de plusieurs semaines entre les prises de sang, les atteintes seront minimes. Les animaux réutilisés sont engagés dans des projets de recherche agronomique (sélection génétique, conception de systèmes d'élevage innovantes) et subissent essentiellement des mesures zootechniques (pesées, quantité d'aliment consommée, nombre de petits). Il n'y a pas d' effet cumulatif négatif attendu.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à la suite de leur prise de sang et poursuivent leur élevage et leur expérimentation. Un programme de replacement des animaux concernera les vieux animaux reproducteurs. Les animaux de 70j qui ne seraient pas retenus pour la reproduction réintègreraient le circuit commercial de l'élevage du lapin de chair.

Remplacement

Le projet vise à développer un biomarqueur du stress pour améliorer les conditions d'élevage des lapins. Les lapins font partie des espèces d'élevage élevées en totale claustration. L'évaluation de l'impact de ces conditions de vie sur le stress des lapins est importante pour permettre d'améliorer le bien-être animal. L'élevage des lapins bénéficiera de ces connaissances dans le futur. Le biomarqueur étudié est complexe et ne peut pas être investigué par des méthodes alternatives n'utilisant pas d'animaux. Il est donc important de pouvoir mettre au point cet indicateur et de réaliser des mesures sur les lapins (espèce de destination).

Réduction

L'étude prévoit de réaliser des prises de sang sur un maximum de 418 lapins. La quasi-totalité des animaux seront réutilisés d'autres projets déjà autorisés et en cours. Ces animaux sont engagés dans différents projets de recherche agronomique : mesure d'ingestion d'aliment, étude de génétique, résistance aux maladies, conditions d'élevage différentes (cages ou accès au pâturage). Le présent projet s'appuie donc sur l'opportunité de la présence de plusieurs dispositifs expérimentaux en cours et peu invasifs pour échantillonner différents animaux reflétant la population de lapins d'élevage, sans mobiliser de nouveaux animaux expérimentaux. Par ailleurs, le projet est organisé en plusieurs étapes dont la validation successive conditionne la poursuite du projet. La mise au point de la méthode nécessitera de prélever une dizaine de lapins. Une fois cette étape validée, nous établirons la cinétique de raccourcissement des télomères en suivant une centaine de lapins au cours de leur vie. Puis, nous définirons la variabilité de ce biomarqueur dans différentes races. Nous validerons ensuite la pertinence de l'indicateur pour évaluer le stress en mesurant la longueur des télomères chez une cinquantaine de lapereaux exposés à un sevrage précoce (dans le cadre d'un programme d'étude de la résistance aux maladies). Enfin, nous mesurerons cet indicateur chez des lapins élevés dans des conditions de vie différentes (au maximum 240 lapins).

Raffinement

Tous les lapins feront l’objet d’un suivi approfondi de leur état corporel (pesées périodiques), et de leur santé (examens cliniques réguliers pour détecter les troubles digestifs, pododermatites, pasteurelloses...). Les animaux seront tous vaccinés dès le sevrage contre la myxomatose et la maladie virale hémorragique du lapin (VHD). Les observations de comportement nous donneront également des informations sur l'état émotionnel des lapins dont nous tiendrons compte dans nos interactions avec les animaux. Les manipulations seront faites avec douceur en réalisant une contention sécure évitant des blessures aux animaux. Les animaux seront placés dans une petite boîte à rebords bas pour leur éviter d'avancer, ou déposés sur une table munie d'une surface antidérapante (serviette éponge pliée) pour leur éviter de glisser. Ils seront calmés et rassurés par des caresses douces. La prise de sang sera réalisée à l'oreille avec des aiguilles très fines et en prélevant au maximum 1 ml de sang/animal. La plupart des animaux subiront une unique prise de sang. Mais une centaine d'animaux fera l'objet d'un suivi au cours de leur vie (pendant 2 ans). Ces lapins subiront au maximum 6 prises de sang à des âges clés: sevrage, pré-puberté, puberté, mise à la reproduction, etc.

Choix des espèces

Les lapins sont majoritairement élevés en cage et subissent des restrictions fortes à leur bien-être. Il y a donc un intérêt fort à déployer des recherches visant à améliorer leurs conditions de vie. L'objectivation de leur bien-être ou de leur stress est nécessaire. L'analyse de la longueur des télomères chez cette espèce permettrait d'évaluer le stress et de guider l'évolution des systèmes d'élevage de lapins. Les animaux sont utilisés tout au long de leur vie, à tous les stades physiologiques, du sevrage à la réforme ou la mort afin de voir l'évolution de la longueur des télomères au cours de leur vie. Ils seront représentatifs des populations de lapins d'élevage.

600 chauves-souris et oiseaux sauvages vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchés sur le site de capture. Chaque individu subit une prise de sang à la veine alaire et deux écouvillonnages, salivaire et cloacal, pour une manipulation d'environ deux minutes. Le projet cherche à relier la dégradation de l'habitat à la présence d'agents pathogènes chez ces réservoirs, sur un territoire insulaire tropical. Le porteur indique exclure des prélèvements les espèces les plus fragiles et relâcher directement juvéniles et femelles gestantes ou allaitantes.

Objectifs

La caractérisation des pathosystèmes circulant dans des cycles enzootiques passe incontournablement par l’identification de ses agents étiologiques à partir des prélèvements sur les hôtes vertébrés concernés. Les chiroptères et l’avifaune sont des réservoirs d’un grand panel d’agents pathogènes à importance médicale (i.e. SARS-CoV2, arbovirus). Les facteurs favorisant ce portage sont encore mal connus et la relation avec l’état de conservation de l’habitat est importante à définir pour mieux évaluer les risques de transmission et de circulation associés à sa fragmentation/dégradation. Les espèces animales concernées sont protégées au sein du territoire donc il est nécessaire de mettre en lumière l’importance de la préservation de leur habitat pour garantir les services ecosystèmiques protectifs vis-à-vis de l’émergence des maladies infectieuses. Le projet proposé porte alors sur l’influence de la biodiversité des écosystèmes et de leurs modifications d’origine anthropique sur (i) les populations des chiroptères et oiseaux réservoirs de maladies infectieuses, et (ii) sur la prévalence d’agents pathogènes associés. In fine, les objectifs spécifiques du projet faisant l’objet de la présente demande sont les suivants : - d’évaluer l’impact de la dégradation de la couverture végétale et de l’anthropisation sur les chiroptères et oiseaux réservoirs d’agents pathogènes à importance médicale. - d’évaluer la prévalence d’agents pathogènes à importance médicale chez ces deux grands groupes de réservoirs vertébrés. - d’évaluer cette fréquence selon le caractère « dégradé » ou non de l’environnement.

Bénéfices attendus

Les facteurs favorisant le portage d’agents pathogènes chez les oiseaux et les chiroptères sont encore mal connus et sa relation avec l’état de conservation de l’habitat est importante à définir pour mieux évaluer les risques de transmission et de circulation associés à sa fragmentation/dégradation. Les espèces animales concernées sont protégées au sein du territoire donc il est nécessaire de mettre en lumière l’importance de la préservation de leur habitat pour garantir les services écosystémiques protectifs vis-à-vis de l’émergence des maladies infectieuses (bénéfice à moyen-long terme). De plus, ce projet permettra améliorer les connaissances quant aux interactions hôtes-agents pathogènes qui opèrent dans des cycles enzootiques jusqu’à alors non explorés dans les sites d’étude (bénéfice à moyen-long terme).

Procédures

3 prélèvements uniques seront effectués sur chaque individu : une prise de sang à la veine alaire (20 à 50 microl) un écouvillonnage salivaire et un écouvillonnage cloacal. Durée total de la manipulation (~2 min par individu)

Impact sur les animaux

Stress lié à la capture et douleur inférieure ou égale à une piqûre pendant la période de manipulation/prélèvement (~2 minutes)

Devenir

Animaux libérés dans le site de capture dès la fin des prélévements. Durée manipulation : ~2 min /individu

Remplacement

Non applicable. Seules les captures suivant le design d’échantillonnage cité au préalable permettront de répondre aux questions du projet. En effet, des collections d’échantillons ne sont pas disponibles vu que cette étude constitue la première à se focaliser sur le sujet sur le territoire.

Réduction

L’inventaire acoustique non invasif effectué dans les phases préliminaires du projet INSULA a été la stratégie permettant une réduction des sites de captures (de 36 sites à 12), et par conséquent, le nombre de spécimens à capturer et à prélever.

Raffinement

1-Limiter la durée de manipulations (~2 min) et le nombre de prélèvements (seulement un prélèvement par type d’échantillon/geste). 2-point de compression du point d’injection et libération le plus rapidement possible des spécimens capturés.

Choix des espèces

L’objectif est d’évaluer les différences de diversité entre les hôtes et les pathosystèmes associés, selon le niveau de dégradation de l’habitat. Les chiroptères et l’avifaune sont des réservoirs d’un grand panel d’agents pathogènes à importance médicale (i.e. SARS-CoV2, arbovirus), mais le plus souvent les espèces jouant le de principal amplificateur et/ou disperseur ne sont pas connues. L’étude de la diversité d’agents pathogènes associés à ces deux groupes de réservoirs potentiels doit passer par l'étude d'animaux sauvages, sans a priori d'espèces, pour avoir la vision la plus complète possible des cycles microbiens. Afin d’établir le lien entre la diversité des hôtes et des pathosystèmes de façon non biaisée, la méthode d’échantillonnage sera utilisée dans les 12 sites ne cible pas une espèce de chiroptère ou d’oiseau particulière. Seuls les colibris et les espèces Monophyllus plethodon et Eptesicus guadeloupensis seront exclus des prélèvements, au vu de leur fragilité, et seront relâchés directement. Adultes. Plus pertinents d’un point de vue épidémiologique, pouvant héberger des traces d’infections passées et être impliqués dans les cycles enzootiques d’agents pathogènes. Moins vulnérables pour les captures. Les juvéniles et les femelles gestantes et allaitantes (chauves-souris) seront relâchés. Les captures seront faites en dehors de la saison de reproduction.

760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles portent une mutation provoquant une myopathie et reçoivent des molécules par injection ou dans leur nourriture, ou une thérapie génique injectée quelques jours après la naissance, avant des tests répétés de force et de mobilité (grip test, test d'agrippement, roue d'activité, open field). Le porteur indique, d'après la littérature, une perte de poids de 15 % et une perte de force musculaire de 25 % chez les souris malades. Les bénéfices pour les patients humains sont présentés comme "un premier pas avant l'application à l'homme", au conditionnel.

Objectifs

Le Récepteur de la Ryanodine RyR1 est un canal calcique essentiel à la contraction des cellules musculaires. Deux mécanismes physiopathologiques principaux ont été identifiés comme conséquences des mutations du gène RYR1 codant pour ce canal : une baisse de la quantité de protéine ou une altération de sa fonction canal. Dans les deux cas, la conséquence de ces mutations est une baisse des relâchements de calcium à l’origine de myopathies comme la myopathie à cores que nous étudions. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement curatif pour ces myopathies c’est pourquoi l’objectif est d’évaluer des nouvelles stratégies thérapeutiques qui visent ces deux voies physiopathologiques. Dans un précédent projet, nous avons étudié les effets d’agents thérapeutiques sur un modèle de souris de myopathie à cores liée à une baisse de RyR1 induite par injection de tamoxifène (modèle RyR1-Rec). Ainsi dans ce nouveau projet nous nous intéressons principalement au mécanisme physiopathologique lié à une altération de la fonction canal du Récepteur à la Ryanodine RyR1.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettrait d’identifier des agents pharmacologiques qui engendrent une augmentation de la force musculaire des souris myopathe. Par ailleurs, la thérapie génique testée permettrait de restaurer un phénotype sain chez notre modèle de souris. Sachant qu’il n’existe pas de traitement curatif pour ces myopathies, ce projet est un premier pas avant l’application à l’homme.

Procédures

Pour la thérapie pharmacologique, les molécules seront administrées aux animaux conscients agés de 8 semaines soit par injection intrapéritonéale (1 fois par semaine), soit par le biais de la nourriture (croquettes à façon) ou de l'eau de boisson, en fonction des données disponibles sur la biodisponibilité et les modes d'administration déjà décrits. Pour la thérapie génique, les souris seront injectées en intrapéritonéale quelques jours après la naissance pour augmenter l'efficacité du traitement (P2 à P15), réduire la quantité de virus à injecter et augmenter l'immunotolérance A partir de l’âge de deux mois, les souris effectueront des tests de mesure de force musculaire et de mobilité pendant 3 mois. Ils sont tous non invasifs et non douloureux. Le grip test sera réalisé une fois par semaine pendant 3 mois tandis que le test d'agrippement, la roue d'activité et l'open field seront réalisés une fois par mois.

Impact sur les animaux

D’après la littérature, les souris RyR1I4895T hétérozygotes ont une perte de poids de 15% et une perte de force musculaire de 25% par rapport aux témoins (Zvaritch et al., 2009).

Devenir

La mise à mort des animaux est effectuée à la fin de l’expérience (à l’âge de 5 mois). A ce moment-là les muscles seront prélevés pour des analyses biochimiques et moléculaires.

Remplacement

L'objectif de notre étude est d'identifier des agents ayant la capacité de restaurer la force musculaire chez des patients atteint de myopathie à cores. Nous avons criblé des agents sur leur capacité à améliorer l'activation des relâchements calciques intracellulaires des cellules musculaires in vitro. Par ailleurs, la thérapie génique est également testée préalablement sur des cellules de patient en culture, afin de mettre en évidence un bénéfice sur les relâchements de calcium. Mais les relâchements de calcium représentent une étape en amont de la contraction musculaire, et la validation finale de l'effet des traitements sur la force ne peut se faire qu'in vivo, en mesurant leur impact sur le développement de la force musculaire des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupes et le nombre de répétitions des expériences sont réduites au maximum tout en optimisant l'interprétation statistique des résultats. L'ensemble de ces agents a d’abord été évalué in vitro sur des cellules musculaires de patient myopathe en culture. Ce crible permet de réduire considérablement le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe avec enrichissement du milieu de vie ; un suivi quotidien de leur bien-être sera assuré. Le modèle sur lequel nous allons travailler a été décrit dans la littérature, ce qui nous permet de définir des points limites.

Choix des espèces

C'est l'animal sur lequel la majorité des pathologies humaines sont étudiées, car les techniques actuelles permettent facilement de reproduire les mutations à l’origine de maladie humaine chez le modèle murin. D'autre part c'est sur la foi d'études sur la souris que les stratégies thérapeutiques sont approuvées ou non pour un usage médical. Les souris seront utilisées lorsque la force musculaire commence à diminuer, à l'âge de 2 mois d'après les données de la littérature (Zvaritch et al., 2009). Pour la thérapie génique, les souris seront utilisées quelques jours après la naissance pour augmenter l'efficacité du traitement (P2 à P15), réduire la quantité de virus à injecter et augmenter l'immunotolérance, et leur force musculaire sera suivie pendant 3 mois.