Procédures légères
Développement de modèle de fibrose évoluant vers la cirrhose hépatique chez le rat. Application à l’évaluation de propriétés thérapeutiques de composés dans la décompensation aigue de la cirrhose.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
1 380 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 140 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une vingtaine de gavages, une injection de bactéries ou de LPS et une chirurgie abdominale avec ligature et perforation du caecum, pour reproduire une cirrhose décompensée et tester des composés. Le porteur indique s'attendre à des animaux en état de choc et en détresse cardio-respiratoire, et reconnaît limiter l'analgésie parce que la buprénorphine s'est révélée délétère et introduirait un biais. Il affirme que l'évaluation finale des composés reste "nécessaire" chez l'animal vivant.
Objectifs
La décompensation de la cirrhose est caractérisée par la jaunisse, l’œdème, l’ascite et des troubles du système nerveux central, elle conduit à la mort dans un délai de 5 ans. La transplantation hépatique doit être envisagée pour maintenir le patient en vie. Chez un malade chronique du foie, elle est appelée défaillance hépatique aigüe, elle provoque des défaillances d’autres organes (reins), qui sont souvent fatales. La décompensation aigue est provoquée par une inflammation induite par une infection microbienne ou prise abondante d’alcool. La recherche de moyens médicaux est nécessaire et nécessite des modèles animaux pour les développer. Notre projet vise donc à développer le modèle décrit proche de la situation vécue par les malades de cirrhose et à évaluer la capacité de nouveaux médicaments à améliorer leur état général. Pour satisfaire à la règle des 3 R, nous avons estimé le nombre d’animaux pour chaque procédure pour avoir une réponse statistiquement analysable. Les procédures seront appliquées par des personnes habilitées, dans un hébergement adapté et bénéficiant de l’enrichissement du milieu, respectant au maximum le bien-être des animaux. Afin de prévenir des souffrances non nécessaires et de ne pas altérer les résultats de l'étude, des points limites seront définis, au-delà desquels les animaux seront retirés de l'étude et mis à mort de façon éthique. Etant donné la complexité de l’évènement étudié qui produit le dysfonctionnement de plusieurs organes, il nous est impossible de totalement remplacer cette expérimentation par des expériences in vitro mais la sélection des composés est effectuée in vitro ce qui participe partiellement à l’emploi de méthodes alternatives. Ainsi le nombre total de souris prévu est de 1380 animaux sur 5 années.
Bénéfices attendus
Lors de défaillance hépatique aigue, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les multiples troubles qui affectent les autres organes le plus précocement possible. Aujourd’hui on utilise des traitements qui vont agir sur la pression sanguine, l’infection, les hémorragies du système digestif, ou le dysfonctionnement des reins à l’aide de corticoïdes. Le but est de préserver les fonctions vitales dans les meilleures conditions afin de conserver les chances de succès de la greffe du foie. Les traitements que nous espérons proposer visent à agir simultanément très tôy sur les mécanisme qui sont à l’origine des défaillances multiples des organes. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme).
Procédures
Les animaux recevront 20 gavages par sonde oro gastrique (volume de 2ml/kg), chaque gavage prendra 15 secondes au cours d’une période de 12 semaines. Les animaux subiront 1 seul prélèvement sanguin intermédiaire à la fin de la période d’induction de la fibrose (en 10 semaines) et un second prélèvement sanguin à la fin de la procédure ( à la douzième semaine), ils seront pratiqués sous anesthésie, la durée totale d’un acte (anesthésie et prise de sang) prend 5 minutes. Les animaux recevront 1 injection intrapéritonéale au moment du déclenchement de l'ACLF (injection LPS ou Bactéries à la fin de la douzième semaine), elle sera pratiquée sur animaux vigiles contraints. La durée d’un acte est de 30 secondes. Les gestes suivants seront réalisés aux animaux qui subiront une chirurgie abdominale : • rasage de la fourrure (état vigile) durée 3 minutes • 1 injection péritonéale d'agents anesthésiques (la durée d’un acte est de 30 secondes) • laparotomie, ligature et percement du cécum, suture du plan musculaire et du plan cutané (sous anesthésie). La durée totale de l’acte chirurgical sur l’animal anesthésié est de 10 minutes.
Impact sur les animaux
La rupture des fonctions hépatiques représente un évènement grave chez un patient, sa survie est engagée. Le modèle d’étude développé chez l'animal présente dans sa phase finale des signes cliniques d’inconfort manifestes. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de procédure au moment du prélevement terminal pour recueil des organes en vue d'analyses.
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présent chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée in vitro, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les pricipes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quelque soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/repression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevants. Nous écartons les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Ces études pilotes permettent sur la base des effets et résultats obtenus d'établir une approche statistique du choix des effectifs par un calcul de la puissance statistique.
Raffinement
L'utilisation du phénobarbital en temps qu'agent sensibilisateur à l'agent hépatotoxique à pour but d'homogénéiser, raccourcir le délai d'exposition et réduire les riques de mortalité, permettre de réduire le nombre d'animaux et la durée d'inconfort des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur introduirait un biais expérimental. Nous avons fait l'étude des effets de buprénorphine dans un de ces modèle qui se sont avérés délétères. Dans un premier temps une étude bibliographique plus approfondie sur l'emploi de moyen analgésique d'autres classes médicamenteuses est menée. Pour le modèle chirurgical , nous employons en prémédication la lidocaine localement et la buprénorphine pour la prise en charge de la douleur causée par l'acte chirurgical, la médication permet d'améliorer le bien être de l'animal en phase post-op et de réduire la durée de la période de récupération.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie. Le génome du rat et celui de l'homme ont 90% de leurs gènes en commun et ces derniers sont présents dans le même ordre sur les chromosomes, ce qui fait des petits rongeurs un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Très jeunes rats à l’arrivage (environs 21 jours, âge du sevrage), la taille optimale du rat pour commencer le traitement au phénobarbital a été déterminée à 100 g dans la littérature scientique.
Identification des précurseurs de macrophages
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent jusqu'à trois injections et un prélèvement de sang, certaines servant de donneuses de cellules de moelle osseuse transférées à des receveuses, pour identifier les précurseurs des macrophages. Le porteur indique que les gestes provoquent surtout un stress de contention de courte durée. Il affirme que ces mécanismes ne peuvent pas être reproduits de façon fiable en culture cellulaire et que les retombées contre les maladies inflammatoires relèvent du long terme.
Objectifs
Les macrophages, cellules du système immunitaire, se différencient à partir de cellules précurseurs hématopoïétiques de la moelle osseuse et migrent dans les tissus où ils protègent contre des maladies infectieuses. L’objectif du projet est de mieux comprendre processus qui gouverne leur différentiation et notamment de mieux identifier les cellules précurseurs de la moelle osseuse. Pour ce faire, nous recueillerons les différents précurseurs hématopoïétiques de la moelle osseuse de souris et les injecterons dans une souris receveuse afin de suivre leur différenciation en macrophages tissulaires dans des conditions inflammatoires et non-inflammatoires.
Bénéfices attendus
Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur l’origine des macrophages et les conditions requises chez l’adulte pour le recrutement des cellules précurseurs dans les tissues et leur différenciation en macrophages. Sur le long terme, ces découvertes permettront de mieux comprendre les maladies inflammatoires comme l’arthrite rhumatoïde et de trouver des nouveaux moyens de traitement. Les macrophages jouant un rôle clé dans la réponse contre des maladies infectieuses, ces expériences peuvent également apporter des moyens innovants de lutter contre des maladies virales ou bactériennes.
Procédures
Au maximum, 3 injections sont réalisées sur animal vigile, une injection sur animal anesthésié et un prélèvement sanguin pendant une période de 6 jours. L’intervalle entre chaque geste est minimum 24 heures. Chaque injection dure 1 à 2 minute, le prélèvement sanguin 3 minutes.
Impact sur les animaux
Les injections et le prélèvement sanguin sous anesthésie nécessitent une contention de courte durée qui peut stresser l'animal. L’injection dans la cavité abdominale sur animal vigile nécessite également une contention source d’inconfort pour l’animal pendant quelques secondes. Aucun geste n’est répétitif. Les produits administrés n’ont pas un effet de nuisance.
Devenir
Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse moléculaire et cellulaire.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la formation des précurseurs des cellules du système immunitaire et leur différentiation en macrophages ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduites de manière fiable par des expériences en culture cellulaire.
Réduction
Nos protocoles expérimentaux sont basés sur les paramètres décrits dans la littérature (ex : quantité des produits à administrer), permettant ainsi de réduire le nombre de variables testées, et donc le nombre de souris utilisées. Les sites d’injections ont été choisis de manière à obtenir un drainage quasi exclusif vers des ganglions lymphatiques précisément identifiés, afin de diminuer la variabilité inter-expérimentale. Les données obtenues pour les différents groupes sont comparées par le test statistique adapatés pour permettre de répondre aux objectifs. En prenant en compte la marge d’erreur et l’indicateur de dispersion des valeurs, l'analyse de 10 à 20 souris est suffisante pour tirer des conclusions statistiquement fiables.
Raffinement
Les animaux adultes sont habitués à la contention ce qui contribue à réduire le stress lié à l’injection sur animal vigile. Les injections et le prélèvement sanguin sont réalisés sur animal anesthésié .Quand cela est nécessaire une anesthésie locale est ajoutée à l'anesthésie générale pour renforcer la couverture analgésique. Un temps de récupération minimal de 24 h entre les gestes réalisés sur l’animal est accordé. Le bien-être de l’animal est évaluée par un personnel expérimenté, prenant en compte une surveillance des lieux de d’injection, le poids, l’apparence, le comportement, hydratation, respiration et l’aspect des fèces. Les critères sont notés. Lorsque qu’une anomalie est observée l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. Des points limites spécifiques ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les souris seront hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. L’hébergement bénéficie d’un enrichissement des cages : tunnel et abris, matériel de nidification et buches à ranger.
Choix des espèces
Les macrophages tissulaires, par exemple ceux des ganglions lymphatiques, et les processus controllant leur formation se ressemblent entre l’homme et la souris. La souris CD45.1 sera utilisée pour les transferts des cellules précurseurs afin de suivre leur différenciation en macrophages. Les souris donneuses seront utilisées à l’âge adulte (8-12 semaines) afin de garantir une hématopoïèse mature. Des nouveaux nées informeront sur la différentiation des macrophages dans un animal en croissance. Des receveuses adultes apporteront des connaissances sur le taux de remplacement des macrophages dans des conditions d’hémostasie, d’inflammation légère. Ces études enrichiront nos connaissances sur l’identité des précurseurs de ces macrophages et les conditions permettant leur remplacement.
Etude des capacités cognitives chez la poule domestique pondeuse adulte
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
25 poules pondeuses vont être utilisées, puis réutilisées dans d'autres projets de cognition, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont manipulées et testées quotidiennement pendant des séances d'apprentissage qui reposent sur une privation de nourriture de 14 à 22 heures pour maintenir leur motivation face à des récompenses alimentaires. Le porteur décrit des tests de cognition inspirés de ceux menés sur d'autres espèces et présente le projet comme un moyen d'améliorer les connaissances sur les capacités mentales de la poule. Il indique qu'un point limite défini au préalable peut conduire à l'euthanasie d'un individu.
Objectifs
L’objectif principal du projet est d’améliorer les connaissances fondamentales concernant les capacités cognitives déclaratives chez un oiseau domestique : la poule pondeuse. Le projet met en place différents tests de comportement pour étudier ces capacités cognitives
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamental permettra d’accroître les connaissances scientifiques concernant les capacités cognitives chez la poule pondeuse. Plus précisément, les tests en cognition prévus sont inspirés de tests déjà effectués chez d’autres espèces et qui ont permis de mettre en évidence de capacités déclaratives complexes chez ces espèces, dont certaines que l’on pensait propres à l’humain. Pour ces espèces, révéler ces capacités mentales a influencé la façon dont les animaux sont perçus et la façon de les élever, d’interagir avec eux.
Procédures
Les animaux vigiles sont manipulés par un expérimentateur avec qui le lien de confiance est privilégié et ne sont pas contraints. Les animaux sont manipulés tous les jours pour la pesée et lors des sessions d’apprentissage ou de test. Le temps de la pesée dure environ 1 minute, en comptant les temps de trajet (environ 5 secondes sur la balance). Les animaux sont testés tous les jours entre 6h et 16h. La durée des phases d’apprentissage et des phases de test programmée est variable selon le test cognitif et peut durer, au total, pour un test, entre 3 semaines et 2 mois. Chaque session de test quotidienne peut durer entre 10 minutes et 40 minutes, selon le type de test cognitif en question. Les animaux sont mis au repos 4 à 5 jours entre deux tests pour tester une capacité cognitive.
Impact sur les animaux
La phase d’apprentissage des animaux met en jeu une récompense alimentaire ; pour que cet apprentissage soit efficace les animaux doivent donc impérativement être à jeun afin de garder leur motivation et les intéresser à la tâche demandée. La durée de jeun programmée peut aller de 14 heures à 22 heures. Néanmoins les animaux reçoivent des récompenses alimentaires au cours de cette période de jeun, lors de leurs sessions d’apprentissage et de test (1 à 2 sessions par jour), sous la forme de vers de farine (de 30 à 120 vers par session) qui est un aliment très énergétique.
Devenir
Tous les animaux n’auront été utiisés que dans le cadre de tests en cognition et seront réutilisés pour d’autres projets concernant la cognition.
Remplacement
L’intérêt du projet est l’étude des capacités cognitives du modèle animal en lui-même, ce qui ne permet pas d’appliquer de mesure de remplacement.
Réduction
Le résultat principal recherché est une performance individuelle significativement supérieure au hasard, pour un nombre d’individus suffisant relativement aux pratiques retrouvées dans la discipline. Compte tenu de la variabilité inter-individuelle présente dans ce type de test et qui a déjà été expérimentée dans l’équipe, nous estimons qu’environ la moitié des individus testés réussira les étapes d’apprentissage avec succès. De plus, 1 individu permettra de réaliser d’éventuels ajustements pré-expérimentaux dans l’utilisation des dispositifs de test. Ainsi nous prévoyons d’impliquer indépendemment 6 individus dans chacun des tests cognitifs discutés, ce qui revient à un maximum de 25 individus au total. C’est donc ce nombre de 25 individus qui a été retenu pour l’ensemble de la procédure. Les animaux qui ne participent pas au test suite à l’étape d’habituation sont gardés afin de ne pas modifier la structure sociale du groupe, ce qui risquerai de perturber les comportements lors des tests. Sachant le nombre d’essais tests prévus est inférieur à 30, une approche statistique non paramétrique (approche adaptée dans le cas de petit nombre de données) est pertinente, en gardant une puissance statistique et un risque d’erreur statistique contraignants. Seront mesurés pour chaque individu l’évolution de la performance au cours des sessions d’apprentissage ainsi que la performance lors des sessions test.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe au sol sur copeaux et en groupe, avec un accès à un parcours extérieur (30m2) en plus de la pièce intérieure (25m2), ce qui leur permet d’exprimer leurs comportements naturels (bains de poussière, grattage de la terre, etc). De plus, perchoirs et autres objets d’enrichissement physique (bloc de paille, larges tubes) sont en quantité suffisante. Ces oiseaux sont déjà habitués aux manipulations puisqu’ils sont pesés régulièrement depuis leur éclosion et ont déjà été utilisés pour d’autres tests de comportement (protocoles hors champs validés par le CE). Avant chaque test cognitif, les animaux seront habitués à l’environnement de test (pièce située juste à côté de leur pièce d’hébergement) ainsi qu’aux vers de farine. Tout au long du projet, l’expérimentateur surveille l’état corporel de l’ensemble des individus et leur intégration au groupe social. Dès lors qu'un point limite qui a été définit au préalable est atteint pour un individu, alors la décision de l'euthanasier pourra être prise par le responsable de projet et le responsable bien-être animal.
Choix des espèces
Le projet consiste à révéler des capacités cognitives de haut niveau, encore inexplorées, chez la poule domestique pour améliorer nos connaissances sur les capacités mentales de cet animal. De ce fait, le projet est réalisé sur la race de poule pondeuse isa brown la plus utilisées en élevage en France. Les animaux utilisés ont plus de 6 mois et sont adultes. Ce stade a été choisi pour étudier les capacités mentales chez la poule pondeuses, adulte.
Effets d’une consommation de larves d’insectes sur les performances de croissance, la santé digestive et la qualité de la viande chez le poulet de chair mâle
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
162 poulets de chair mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent une prise de sang au sinus occipital à l'état vigile, geste que le porteur décrit comme pouvant provoquer un stress de contention, un état de choc transitoire et un hématome, pour mesurer l'effet de larves de mouche soldat noire sur leur croissance et leur viande. Les oiseaux sont élevés jusqu'à l'âge d'abattage, autour de 36 jours. Le porteur affirme que ces effets ne peuvent être étudiés ni in vitro ni in silico et met en avant l'intérêt des insectes pour réduire l'importation de soja.
Objectifs
Les insectes sont décrits comme une source de protéines d’intérêt pour l’alimentation animale. En particulier, certaines espèces comme la mouche soldat noire ont la capacité de convertir des substrats organiques variés, non valorisables directement par les animaux de rente (ex. déchets de l’agroalimentaire) en une source de protéines de qualité. A ce titre, leur utilisation en alimentation animale permettrait de limiter la compétition entre l’alimentation animale et humaine, et de réduire (voire de supprimer) l’importation de soja produit en Amérique du Sud (déforestation, production OGM…). L’objectif du projet est donc d’évaluer l’utilisation de produits « insectes » dans l’alimentation des poulets de chair, sur les performances zootechniques (croissance, efficacité alimentaire), la santé digestive, le bien-être des animaux et la qualité de la viande.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra notamment de compléter les connaissances sur l’utilisation d’insectes pour nourrir les poulets de chair, en particulier en apportant sur l’utilisation des larves entières (vivantes ou séchées), qui sont encore très peu étudiées. En outre, nous proposons d’étudier le potentiel de ces produits par une approche multicritère (effets sur les performances zootechniques, le système digestif et immunitaire, le microbiote, ainsi que sur la qualité des produits). Par ailleurs, les données collectées permettront également de réaliser une multicritère de la durabilité (évaluation environnementale, sociale et économique) de l’utilisation de ces produits afin de préciser leur intérêt pour l’ensemble de la filière avicole.
Procédures
Une prise de sang unique au sinus occipital sera réalisée sur un total de 162 animaux vigiles (72 et 90 prises de sang sur des animaux âgés respectivement de 14 et 35 jours). Le prélèvement au niveau du sinus occipital peut engendrer une réaction de stress à la contention de l’animal. L’animal peut également présenter un état de choc transitoire.
Impact sur les animaux
Le prélèvement au niveau du sinus occipital peut engendrer une réaction de stress à la contention de l’animal et un éventuel hématome.
Devenir
Tous les animaux soumis à procédure seront mis à mort en respectant la règlementation en vigueur.
Remplacement
Les connaissances sur l’utilisation des larves entières de mouche soldat noire pour nourrir les volailles sont encore très éparses dans la littérature, en particulier les effets sur la croissance des animaux et la physiologie/santé digestive. Dans le cadre de ce projet, l’utilisation des animaux ne peut donc être remplacée par un modèle d’étude in vitro ou in silico.
Réduction
Les animaux seront nourris à volonté à l’aide de mangeoires électroniques permettant la mesure individuelle automatique du poids et de la consommation alimentaire des animaux. Ce dispositif permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet d’un facteur 4 environ. Les variables mesurées sur les échantillons de sangs collectés seront des marqueurs du métabolisme et des statuts antioxydant et inflammatoire.
Raffinement
Les animaux seront élevés en groupe et au sol dans un bâtiment d’élevage standard. Le milieu sera enrichi avec des perchoirs permettant aux animaux de grimper et de se cacher (Perch'up). De plus, l’apport de larves contribue lui-même à enrichir le milieu de vie des animaux. Les effets sur le comportement et l’activité des animaux pourront être évalués à l’aide d’une méthode d’évaluiation du bien-être développpée par l’Institut Technique de l’Aviculture (EBENE®). Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement afin de détecter tout risque de souffrance ou de mal-être. Toute manifestation de symptômes comportementaux persistants définis par un point limite (animal prostré plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les animaux seront nourris à volonté à l’aide de mangeoires électroniques permettant la mesure individuelle automatique du poids et de la consommation alimentaire des animaux.
Choix des espèces
Le projet est un programme de recherche finalisée qui vise à étudier les effets (performances, santé digestive) de différentes sources d’insectes (farine, larves entières vivantes ou séchées) pour nourrir des poulets de chair. Il n’existe pas de modèle mathématique ni de test in vitro permettant d’atteindre cet objectif. La possibilité d’expérimenter chez l’animal cible du projet (poulet de chair) est la plus adaptée. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet sur des poulets à croissance rapide de différentes sources protéiques à base d’insectes sur toute la durée d’élevage. Ainsi, nous utiliserons des animaux de 1 jour, fourni par un couvoir commercial, et nous élèverons les animaux jusqu’à l’âge classique d’abattage soit 36 jours et un poids d’environ 2,4-2,5 kg pour un poulet de souche à croissance rapide.
Etudier le rôle de Clec1a dans un modèle murin de dommage tissulaire suite à une intoxication par l’acétaminophène.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Après un jeûne, elles reçoivent une injection intrapéritonéale de paracétamol à dose sous-létale, puis subissent des prélèvements de sang et le prélèvement du foie, de la rate et des ganglions, pour étudier le rôle du récepteur CLEC-1 dans les dommages du foie. Le porteur indique qu'à cette dose les souris ne perdent pas de poids et ne meurent pas, et qu'un mauvais état général conduirait à leur mise à mort. Les retombées pour l'être humain, un blocage de CLEC-1, sont renvoyées au long terme, tandis que le porteur affirme que ce dommage ne peut pas être reproduit in vitro et présente la preuve de concept chez l'animal vivant comme "essentielle".
Objectifs
La compréhension de la réponse immunitaire qui est impliquée dans de nombreuses pathologies telles que les maladies inflammatoires et auto-immunes est nécessaire afin de développer des approches thérapeutiques innovantes en cliniques. Aussi, il est important de déterminer finement les mécanismes liés à la réponse immunitaire dans des modèles in vivo chez la souris par le système d'ablation génétique d'un gène d'intérêt pour établir la preuve de concept de leur potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme seraient d'établir in vivo la preuve de concept que l'absence du récepteur CLEC-1 (C-type Lectin-1) permet de moduler la réponse immune suite à un dommage tissulaire et permet de rétablir l'homéostasie tissulaire qui est perdue dans de nombreuses pathologies suite à des inflammations ou des infections. Ceci ne peut pas être fait in vitro et cette validation est nécessaire in vivo pour observer l'homéostasie tissulaire. A long terme, le blocage de CLEC-1 par des voies thérapeutiques chez l'Homme pourra ainsi être envisagé.
Procédures
Nous injecterons par voir intrapéritonéale de l'acétaminophène aussi appelé paracétamol à des doses sous léthales à des souris contrôles sauvages (WT) et déficientes (KO) pour Clec1a sevrées de toute alimentation solide dans les 12h précédentes afin de reposer leur système hépatique. A cette dose sous léthale, les souris ne meurent pas et ne perdent pas de poids. Les souris seront étudiées ensuite à 24, 48, 72 ou 96h après l'intoxication sous anesthésie par inhalation d'isoflurane. Du sang sera prélevé au niveau de la veine faciale maxillaire des souris. Ceci permettra d’en isoler le sérum pour étudier le niveau des enzymes transaminases du foie ASAT et ALAT qui reflèteront le dommage tissulaire. Le foie ainsi que la rate et les ganglions seront prélevés pour analyser la réponse immunitaire par cytométrie de flux. Puis, ces animaux qui seront sous perte de conscience par l'isoflurane, seront mis à mort par inhalation de CO2.
Impact sur les animaux
Les animaux à cette dose sous léthale ne perdent pas de poids et ne meurent pas. Aucune altération de l'état général n'est habituellement observée par l’intoxication. Cependant, ce modèle d’intoxication à l’acétaminophène nécessite un sevrage préalable. Afin d’éviter les conséquences physiologiques néfastes pour les souris de baisse de température du au temps de jeûne nocturne, nous limiterons le jeûne nocturne à 12h avant l’injection à l’acétaminophène.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, plus aucune autre utilisation n'est possible car les animaux ont subi un dommage du foie donc les animaux même s'ils n'ont pas atteints le point limite, seront tous mis à mort au maximum 2 semaines après l'injection de l'acétaminophène.
Remplacement
Le meilleur moyen pour étudier le rôle d'une molécule sur une réponse immune qui est complexe et qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires est in vivo et ce en utilisant des animaux génétiquement modifiés ; en effet, notre molécule CLEC-1 étant exprimée par de nombreux types cellulaires et ayant un rôle sur de nombreux acteurs de l'immunité, il n'est pas possible de reconstituer un modèle de dommage tissulaire et d'étudier l'homéostasie d'un tissu dans des modèles in vitro.
Réduction
Nous limiterons le nombre de souris et utiliserons le minimum de souris estimé pour obtenir des différences significatives et reproductibles sur l'étude de la réponse immunitaire en prenant en compte l'hétérogénéité de ce modèle. Nous avons estimé le nombre minimum de souris à utiliser pour obtenir des différences significatives grâce au logiciel du « Experimental Design Assistant ». Nous envisageons donc d’utiliser 10 souris par groupes. Donc, nous planifions d'utiliser des groupes de 40 animaux WT et 40 animaux KO pour ce modèle d'intoxication à l'acétaminophène.
Raffinement
Les animaux à cette dose sous léthale d'acétaminophène ne perdent pas de poids et ne meurent pas. Aucune altération de l'état général n'est habituellement observée par l’intoxication. Cependant, ce modèle d’intoxication à l’acétaminophène nécessite un sevrage préalable. Afin d’éviter les conséquences physiologiques néfastes pour les souris de baisse de température du au temps de jeûne nocturne, nous limiterons le jeûne nocturne à 12h avant l’injection à l’acétaminophène. Par ailleurs, nous ajouterons des nids de coton dans les cages pour que les souris puissent se réchauffer. Un suivi quotidien du poids des animaux et de leur état général (attitude prostrée, poils hérissés, etc..) sera effectué. L’observation d’une perte de poids et/ou d’une attitude indiquant un état non naturel (attitude prostrée, poils hérissés, etc..) conduira à l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle de la léctine de type -C 1 (CLEC-1), nous devons utiliser des souris déficients dans le gène Clec1a (Knock Out KO) pour tester son rôle in vivo dans des modèles expérimentaux de dommage tissulaire induit par intoxication à l'acetaminophène. Ces souris ont été génétiquement modifiées pour déléter le gène clec1a. Ces souris sont donc spécifiquement confinées dans des cages bien répertoriées lors de l'élevage et du transport et ne sont pas mélangés à d'autres types de souris. La preuve de concept in vivo est essentielle et ces souris qui ont cette ablation génétique permettent de réaliser ce type d'expérience in vivo pour mimer ce qui se passe dans des pathologies en clinique.
Rôle de la réponse inflammatoire microgliale postprandiale dans le contrôle de la prise alimentaire, étude nutritionnelle.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale unique d'un agent modifiant les lipides sanguins puis d'un anesthésique, avant la mise à mort pour prélever le cerveau et analyser une réaction inflammatoire survenant après un repas gras. Le porteur limite les nuisances à la contention et à cette injection unique. Le bénéfice annoncé, mieux comprendre l'appétit et des troubles comme la boulimie ou l'anorexie, reste éloigné de ce protocole mécanistique.
Objectifs
L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (PIR) systémique est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme et les mécanismes biologiques sous-jacents induisant la PIR sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Récemment, l’équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules spécifiques chez l’individu sain en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas, et elle se produit dans une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. Les médiateurs biologiques qui déclenchent la PIR cérébrale ne sont pas identifiés. Une hypothèse serait que les lipides nutritionnels qui se retrouvent dans la circulation générale après digestion et absorption soient capables de stimuler la réponse des cellules du cerveau. La stratégie consistera à manipuler l’hypertriglycéridémie postprandiale et à mesurer la réponse cellulaire cérébrale. L’hypertriglycéridémie sera suivie par analyse biochimique sanguine, et la réponse cellulaire cérébrale sera mesurée par microscopie sur coupes de cerveau. Nous utiliserons : 1) une solution de nutrition parentérale à base d’huile de soja, qui permettra d’élever artificiellement les triglycérides plasmatiques en l’absence de prise de repas, 2) un agent pharmacologique qui permettra d’élever les lipides sanguins en l’absence de prise de repas, et 3) un agent pharmacologique qui limitera l’hypertriglycéridémie postprandiale. Ces agents pharmacologiques seront administrés par voie intrapéritonéale, qui constitue une voie d’administration adaptée pour ces études mécanistiques. Une étude dose-réponse au cours du temps sera réalisée aux temps : T0, T1h, T2h, et T3h. Les cerveaux de ces animaux seront étudiés après mise à mort afin d’analyser la réponse cellulaire cérébrale dans différentes conditions. 258 souris C57Bl6J seront utilisées dans ce projet.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mieux comprendre les caractéristiques de la PIR cérébrale et donnera des informations nouvelles sur l’intégration cérébrale de l’état métabolique chez l’individu obèse. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.
Procédures
Les animaux seront soumis à des contentions et des injections intrapéritonéales d’agent pharmacologique et d’anesthésique avant la mise à mort. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal. Les effets des traitements seront mesurés trois heures après injection.
Impact sur les animaux
Les expériences pharmacologiques durent 3 heures au maximum et ne génèrent pas de souffrance chronique. La contention des animaux et les injections intrapéritonéales d’agent pharmacologique et d’anesthésique avant la mise à mort représentent les seules nuisances sur les animaux dans ce projet. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal.
Devenir
Les 258 souris seront toutes mises à mort afin de prélever le cerveau en vue d’analyses histologiques.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.
Réduction
La procédure décrite (mise en place de conditions prandiales définies) a été optimisée, standardisée et validées précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Dans ce projet nous avons réduit à 1 au lieu de 2, les lots expérimentaux contrôles en condition préprandiale, sans exposition ultérieure à la nourriture. En effet ce groupe peut être mis en commun pour les expériences 2 et 3 (détaillées dans les procédures 2 et 3). Bien que les procédures 2 et 3 soient similaires d’un point de vue technique, elles sont dissociées pour des raisons pratiques (gestion et traçabilité des individus plus facile dans le projet global).
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les animaliers, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes mâles, âgées de 8 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé
Effets environnementaux sur la période gestation-vêlage chez une race bovine rustique : évaluation épigénétique du couple mère-veau
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
104 bovins de race rustique, soit 52 couples mère-veau, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réintégrés dans le troupeau de la ferme. Ils font l'objet de pesées mensuelles, de prises de sang, de collectes de fèces par fouille rectale et de poils, pour rechercher des signatures épigénétiques liées aux variations d'élevage au fil des saisons. Le porteur décrit des nuisances limitées à la contention et à des douleurs légères et transitoires. La finalité mêle connaissance fondamentale et objectifs technico-économiques d'optimisation des performances du troupeau.
Objectifs
Des études scientifiques, ont démontré que la santé, l’état corporel et l’environnement (stress, exposition au climat, et/ou aux toxiques) des mères au cours de la gestation, ont des effets sur le développement in utero des fœtus et sur la santé et les performances de la descendance à moyens et longs termes. Pour toutes les espèces, de l’Homme aux bovins en passant par les modèles - rongeurs, la gestation se caractérise par deux grandes périodes : le premier tiers correspond à l’acquisition de l’identité des cellules formant l’organisme (près de 200 types de cellules différents pour un individu) et à la mise en place des organes, les deux tiers suivants sont dédiés à la multiplication cellulaire et la croissance des organes avec une maturation de certaines fonctions vitales. Ces processus biologiques complexes mettent en jeu des signatures dites épigénétiques, qui s’apposent naturellement sur le génome. Ces signatures sont essentielles à l’établissement de l’identité cellulaire et sensibles à l’environnement. Dans ce sens, elles constituent une archive de l’historique de vie de l’individu. Notre projet constitue une étude inédite. Il vise l’identification de ces signatures pour une race bovine rustique, dans un contexte de conduite d’élevage, source de variations de l’environnement au cours des deux périodes-clé de la gestation en termes d’alimentation et d’exposition aux chaleurs estivales. Ainsi, le suivi de couples mère-veau tout le long de l’année permettra de rechercher les signatures épigénétiques chez les mères et les veaux autour du vêlage de printemps et d’automne. Ces nouvelles connaissances de biologie fondamentale sont nécessaires pour mieux comprendre comment le patrimoine génétique (génome) des fœtus s’adapte en termes de fonctionnement aux variations environnementales maternelles. Les signatures épigénétiques identifiées seront aussi sources d’indicateurs, utilisables comme références pour de futures évaluations des effets à longs termes de conduites d’élevage diversifiées.
Bénéfices attendus
L’originalité du projet réside dans une évaluation des effets de l’environnement sur le couple mère-veau par un suivi de signatures épigénétiques chez des vaches de race rustique. Par cette approche, nous recherchons à savoir si les variations de conduite d’élevage au cours de l’année en fonction de la saison, peuvent être enregistrées sous forme de signatures épigénétiques. En effet, au cours de l’année, les vaches sont élevées successivement en extérieur avec accès aux pâturages comme source d’alimentation et une exposition aux changements climatiques, puis en stabulation avec une distribution de fourrages dans un environnement plus contrôlé ; les naissances des veaux sont aussi saisonnées, soit au printemps soit à l’automne. La ferme expérimentale assure un suivi des couples mère-veau (données de santé, de poids et d’état corporel et de comportement) tout le long de l’année, permettant de documenter les effets de l’environnement observables sur les couples mère-veau. Le projet propose une nouvelle forme de suivi en identifiant les signatures épigénétiques révélatrices des effets des variations d’environnement chez les mères (autour de la période de vêlage) et chez les veaux (veaux de printemps et veaux d’automne). Ce sont de nouvelles connaissances de biologie fondamentale, rendues accessibles aujourd’hui, par l’avancée de les techniques d’analyse au sein de notre laboratoire. Elles amélioreront la compréhension que nous avons des capacités d’adaptation à l’environnement des animaux d’élevage : les signatures épigénétiques ainsi observées permettront d’établir des hypothèses fonctionnelles sur les mécanismes de régulation d’expression du patrimoine génétique en réponse aux variations environnementales. Les signatures épigénétiques identifiées constitueront une source d’indicateurs de l’historique de vie des individus. Cela contribuera à notre démarche visant le développement d’un nouvel outil de phénotypage de précision chez les bovins. Ces connaissances seront mobilisées pour réfléchir sur les stratégies de gestion des troupeaux à l’échelle d’élevage couplant utilisation d’une race rustique, périodes de vêlage et mécanismes d’adaptation des animaux d’élevage. Les objectifs seront l’optimisation des performances tant techniques qu’économiques associée à la préservation de la santé, du bien-être et des capacités adaptatives à diverses situations environnementales.
Procédures
Un total de 104 animaux, 52 couples mère-veau, seront inclus dans le protocole et suivis en collectant de nombreuses données observationnelles relatives à la santé et au bien-être des individus. Les animaux seront pesés mensuellement dans des installations dédiées situées sur la ferme (5 à 15 minutes par animal). De plus, des prises de sang, une collecte des fèces et de poils à des stades physiologiques déterminés fourniront les matériels biologiques nécessaires à des analyses complémentaires en laboratoire. Deux prises de sang seront effectuées chez les mères avant et après vêlage et chez les veaux avant et après sevrage (15 à 30 secondes par prise de sang). Seront réalisées une collecte de fèces par individu (avant vêlage pour les mères et avant sevrage pour les veaux ; durée = 30 à 45 secondes par animal) et une collecte de poils (avant vêlage pour les mères et avant sevrage pour les veaux ; durée = 30 à 45 secondes par animal).
Impact sur les animaux
Les nuisances sur les animaux seront limitées. Nous avons identifié un inconfort très modéré pouvant générer un stress, lié (1) à la contention des animaux lors des prélèvements et des pesées, (2) à la mise en place de la piqure lors du prélèvement de sang pouvant occasionner une douleur légère et transitoire, (3) aux prélèvements de fèces obtenus par fouille rectale chez les mères et en réponse à une stimulation rectale avec un thermomètre chez les veaux.
Devenir
Tous les couples mère-veau seront ré intégrés dans le troupeau de la ferme. Ils pourront être si nécessaire inclus dans de nouveaux protocoles puisque les nuissances de celui ci sont réduites au minimum.
Remplacement
Le projet vise à caractériser les effets environnementaux sur les individus. Il nécessite donc des approches menées in vivo. L’objet d’étude est le couple mère-veau d’une race locale et le sujet est l’adaptation de la race à son environnement. L’originalité du modèle repose sur les conditions d’élevage propres au système dans lequel cette race de vache évolue. Il ne peut donc y avoir de remplacement.
Réduction
Le nombre de vaches inclues dans le protocole (52) correspond à la totalité du nombre de vaches présentes sur la ferme expérimentale. Cet effectif est nécessaire afin de prendre en compte les aléas de la reproduction (échec de la mise en reproduction, arrêt de la gestation, gestation gémellaire) et la mortalité des veaux après vêlage (mort périnatale). Le taux moyen de productivité numérique (nombre de veaux sevrés sur nombre de vaches mises à la reproduction) sur la ferme est de 87 pour cent, ce qui fait 45 veaux attendus pour 52 vaches mises à la reproduction. En prenant l’ensemble des vaches, nous nous assurons ainsi de conserver un nombre suffisant de couples mères-veaux avec une répartition entre les groupes primipares et multipares équilibrés pour permettre une analyse statistique des données.
Raffinement
La ferme expérimentale dans laquelle les animaux sont élevés applique les principes des systèmes d’élevage agro écologiques : les vaches sont à la pâture d’avril à octobre, bénéficiant des prairies naturelles. Elles sont en stabulation de novembre à mars, afin d’assurer leur alimentation (foin et céréales autoproduites en AB). Les vaches vêlant sont rentrées au fur et à mesure des vêlages. La stabulation est équipée de brosses et les veaux disposent de guirlandes sensorielles pour leur enrichissement. Tout le personnel de la ferme est détenteur des qualifications nécessaires au suivi et aux prélèvements sur les animaux. Nous effectuerons les prises de sang à la veine sous la queue chez les adultes. Celle-ci est rapide à réaliser, peu douloureuse, avec une contention limitée pour assurer la sécurité de l’animal et celle du préleveur. Chez les veaux, il sera nécessaire de réaliser le prélèvement de sang à la veine jugulaire ; à cet âge, la veine caudale est trop fine et les vertèbres de la queue trop petites, ce qui met en péril la précision du geste. Les veaux seront régulièrement au contact avec l’homme et manipulés durant leur premier mois de vie en les maintenant en stabulation avec leurs mères après le vêlage. La ponction de sang sera de 10 ml, quantité extrêmement faible au regard du volume total de sang ; il est classiquement conseillé qu’une prise de sang n’excède pas 10% du volume de sang total. Chez les bovins on considère que le volume total de sang est de l’ordre de 70 ml/kg soit 3.5 litres chez le veau à la naissance et de 50 litres chez la vache adulte. Pour réduire la nuisance induite par la contention nécessaire pour les prélèvements et les pesées, nous ne multiplierons pas les manipulations des animaux dans les installations de contention pour les différents prélèvements. Nous réaliserons en effet les prélèvements de sang, de fèces et de poils prévus à l’occasion des mesures mensuelles de performances (pesées et notes d’état corporel). La contention des animaux sera faite dans noss installations de contention qui servent à contenir les animaux de manière à ne mettre en danger ni les animaliers, ni les animaux. Tous les prélèvements sont réalisés dans la cage de pesée animal par animal.
Choix des espèces
Il est pertinent d’utiliser pour cette étude une race bovine rustique car le monde agricole a besoin d'informations sur cette race préconisée pour le développement d'une agriculture durable et locale. Les vaches seront suivies à partir de leur mise à la reproduction (monte naturelle) jusqu’au vêlage ; les veaux seront suivis de la naissance au sevrage.
Modulation des niveaux de BIN1 et DNM2 dans le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Les souris qui perdent 20 % de leur poids en une semaine sortent du protocole, et une grille de score prévoit jusqu'à une "douleur intense", traitée par buprénorphine toutes les douze heures. 1 246 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées à l'issue, pour tester la modulation de deux gènes contre la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Le projet utilise trois lignées qui présentent, selon le porteur, les anomalies de la myéline de cette maladie, et 584 souris reçoivent entre leur premier et leur vingt-et-unième jour des injections de virus, certaines dans le nerf sciatique sous anesthésie. À six mois puis à un an, 720 passent un test d'agrippement où l'expérimentateur tire sur la queue, un tapis roulant, un cylindre rotatif surélevé, une immersion de la queue dans un bain-marie et une plaque chauffée à 52 °C. Le porteur affirme que ces lignées ne présentent "aucun signe de douleur", et déclare un niveau de souffrance sévère pour une partie des souris.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles souris. La maladie se manifeste au début de l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par des repliements complexes des gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses et une vitesse de conduction nerveuse réduite. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression de deux gènes impliqués dans une voie de signalisation associée à la CMT pour tenter d'atténuer les symptômes associés aux anomalies de la myéline. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique ainsi que par l'injection de virus adéno-associés couramment utilisés dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre quelle(s) voie(s) de signalisation sont impliquée(s) dans le dévelopement de la CMT. Une meilleure connaissance des processus moléculaires permettra de mieux comprendre la maladie et potentiellement de proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.
Procédures
Pour réguler l'expression des gènes impliqués dans la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, une partie de nos animaux (584 sur 1246) sera injectée (durée d'injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés entre le 1er et le 21ème jour après la naissance A soix mois et à un an, 720 souris (dont 360 injectés avec des AAV) seront soumises à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire, la coordination motrice, la sensibilité, ainsi que la conduction nerveuse. Pour évaluer la force musculaire, les souris sont placées sur la grille d'un dynamomètre et la force d'agripement sera mesurée. Pour évaluer la coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant et sur un cylindre rotatif. Pour évaluer la sensibilité, les queues des souris seront mises dans un bain-marie et la latence d'enlèvement de la queue sera mesurée avec une durée limite du test de 20 secondes. Les animaux seront également placés sur une plaque chaude à 52°C et la latence de réaction sera notée avant de sortir l'animal avec un temps limite de 30 secondes. Pour évaluer la conduction nerveuse, la mesure de l'activité électrique musculaire des animaux se fera sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons trois lignées de souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Au vu des phénotypes observés chez les animaux Mtmr KO âgés (et donc montrant un pourcentage plus important des repliements de la myéline), nous n’anticipons pas que nos modulations d'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée n'engendre de phénotypes plus grave qu’une diminution de la coordination motrice. Nous effectuerons néanmoins une étude des phénotypes dommageable sur ces animaux. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force musculaire, l’expérimentateur tire progressivement la queue de l’animal agrippé sur la grille du dynamomètre afin d’obtenir la force développée par la souris. Pour la coordination motrice, le fait de se déplacer sur un cylindre rotatif surelevé engenre du stress physique chez l'animal. Pour les tests de sensibilité, la chaleur ressentie par l'animal engendre un stress physique. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale. La chirurgie pour l’injection de virus adéno-associés au niveau du nerf sciatique sera réalisée sous une anesthésie générale, une antalgie en sous-cutané et en local sera réalisée avant et après la procédure.
Devenir
Nous feront une première étude préliminaire où les animaux seront euthanasiés à 6 mois pour étude histologique du nerf sciatique et vérification des phénotypes décrits dans la littérature scientifique. Nous nous formerons à l'injection intracérébroventriculaire et les animaux utilisés seront mis à mort le premier jour (P1) après formation. Nous nous formerons à l'injection intrathécale et les animaux seront euthanasiés 15 minutes après formation. Pour l'évaluation de phénotype dommageable et étude histologique à six mois après modulation de l'expression de Bin1 ou de Dnm2 par injection d'AAV, les animaux seront mis à mort entre 8 et 11 semaines, 2 mois après injection d'AAV pour étude histologique du nerf sciatique (signal GFP). Pour la caractérisation comportementale des animaux après modulation de l'expression de Bin1 ou de Dnm2 par injection d'AAV, les animaux seront mis à mort à 1 an après caractérisation comportementale pour étude histologique du nerf sciatique.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquée dans le développement de cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptomes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 8 souris par groupe pour l'étude de phénotypes dommageables et 15 souris par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats. Une première étude pilote sera réalisée à 6 mois avec un nombre réduit d'animaux. Nous effectuerons ensuite une étude de phénotypes dommageables et une étude histologique (8 animaux par groupe) à six mois. Nous réaliserons finalement une étude comportementale à 6 mois et 1 an tout en effectuant une étude histologique à 1 an (15 animaux par groupe).
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 5 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. La pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). En cas de douleur, et particulièrement après les injections intrathécales et intracérébroventriculaires, un analgésique pourra être administré (buprénorphine à la dose de 0.05 à 0.2 mg/kg selon l'intensité de la douleur) et l’étude pourra être prématurément stoppée. La douleur sera évaluée à l'aide d'un score. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas de la buprénorphine sera administrée quotidiennement par i.p. à dose de 0.05 mg/kg. Niveau 2 : douleur modérée, dans ce cas de la buprénorphine à dose 0.1 mg/kg sera administrée quotidiennement par i.p.. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas de la buprénorphine à dose 0.2 mg/kg sera administrée toutes les 12 heures. L'étude sera stopée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure des nerfs est trop différente. D'une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation sur le bénéfice de la structure des fibres nerveuses, de la coordination motrice, de la sensibilité et de la vitesse de conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, nous injecterons des virus adéno-associés chez des animaux âgés entre 1 et 21 jours selon la voie d'administration choisie pour cibler les cellules de Schwann avant l'apparition des symptomes. Les défauts de myélinisation s'aggravent avec l'âge des animaux modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Nous voulons donc réaliser une première étude histologique à 6 mois, âge auquel 10% des fibres présentent des défauts de myéline chez les animaux modèles de la CMT. Nous réaliserons ensuite une étude comportementale suivie d'une étude histologique à 12 mois, âge auquel les animaux modèles de la CMT présentent des déficits de coordination motrice et de vitesse de conduction nerveuse.
Evaluation de l’effet dose-réponse d’un vaccin vivant atténué contre Flavobacterium psychrophilum chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss).
- Recherche appliquée
- Maladies animales
630 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Vaccinées par immersion puis infectées par injection avec une souche virulente de Flavobacterium psychrophilum, elles servent à mesurer une dose létale 50 et l'efficacité du vaccin, le critère retenu étant la survie ou la mort. Le porteur indique que les poissons atteignant le point limite, défini par une détresse terminale (nage erratique, nécrose, animal ne répondant plus aux stimuli), sont mis à mort. L'objectif affiché est commercial, la mise sur le marché d'un vaccin pour la pisciculture de la truite.
Objectifs
Flavobacterium psychrophilum est une bactérie et l'agent responsable de la flavobactériose d’eau froide aussi connue comme syndrome de l'alevin de la truite arc-en-ciel qui revêt une importance économique notable . Cet agent pathogène est l'une des causes les plus courantes de maladie bactérienne dans la production aquacole en eau douce de la truite arc-en-ciel. Aucun vaccin commercialisé contre cet agent pathogène et ses manifestations cliniques n'est actuellement disponible. Le partenaire de ce projet a l'intention de commercialiser un vaccin vivant atténué contre Flavobacterium psychrophilum afin de contribuer à la prévention de la flavobactériose chez la truite arc-en-ciel. La souche vaccinale a conféré une protection significative à la truite arc-en-ciel lors d’épreuves d’infection réalisées avec la souche mère virulente isolée aux Etats-Unis. Plusieurs essais de vaccination de truites arc-en-ciel par immersion ont été réalisés à l'Université de l'Idaho. L'utilisation du vaccin a permis d'obtenir une protection significative par rapport au groupe ayant reçu le contrôle. Avant une mise sur le marché, il est nécessaire de valider l’efficacité du vaccin sur des souches responsables d’épisodes infectieux en Europe. Dans le contexte de la maîtrise de la pathologie infectieuse en production aquacole, ce projet vise à évaluer l’effet dose-réponse du vaccin vivant atténué contre l’infection par une souche virulente de la bactérie pathogène Flavobacterium psychrophilum isolée en France. Les poissons après avoir été vaccinés par immersion seront infectés dans des conditions contrôlées afin d’évaluer leur résistance et l'efficacité du vaccin.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mettre au point le protocole d’administration d’un vaccin (dose et temps de contact) et d’évaluer le potentiel protecteur de ce vaccin. Si les résultats sont positifs, le partenaire poursuivra les essais dans le but de mettre sur le marché et de commercialiser ce vaccin.
Procédures
Les deux étapes de vaccination (primo et rappel) sont réalisées par immersion pour répondre aux contraintes de la filière (praticité d’administration à l’échelle industrielle). Les infections expérimentales sont réalisées par injection. Elles sont réalisées sous anesthésie (par bain) et une seule injection par poisson est réalisée par des personnes compétentes en moins de 15 secondes. Les animaux sont mis à jeun 48 heures avant l’infection. Cette mise à jeun prévient toute régurgitation en cours d’anesthésie, diminue les besoins en O2 des poissons au cours des manipulations.
Impact sur les animaux
Le critère utilisé pour évaluer l’efficacité du vaccin est la résistance au pathogène suite à un challenge infectieux. La réponse est binaire : mortalité (avec précision du temps post-contamination avant la mort) ou survie. L’inocuité de la souche vaccinale a été démontrée lors d’expériences précédentes sur la truite arc-en-ciel menées par le partenaire du projet, aucun effet indésirable de l’étape de vaccination n’est attendu. Le stress lié à la manipulation (tri, pesée, transfert) et à injection lors du challenge sont compensés par anesthésie par bain (tricaïne à 100 mg/l).
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Le projet que nous menons chez la truite arc-en-ciel ne peut être réalisé sur cultures cellulaires car il est nécessaire, pour évaluer l’efficacité du vaccin de soumettre les poissons à des épreuves d’infections expérimentales permettant d’obtenir des critères d'appréciation quantitative de leur résistance.
Réduction
La mesure de la dose létale 50 (DL50) est un protocole de référence en expérimentation animale nécessitant 6 doses avec 10 poissons par condition. La mise en évidence de différences significatives entre les conditions de vaccination (dose et durée d’immersion dans le vaccin) nécessite 30 poissons par aquarium. Des effets dépendants du bac d’élevage étant classiquement observés lors des épreuves infectieuses, il est indispensable de dupliquer les groupes infectés. Les effectifs proposés sont ceux utilisés récemment pour les analyses statistiques lors de l’évaluation de vaccins contre F. psychrophilum. Dans un but de réduction, la mesure de la DL50 sera mutualisée dans d’autres projets employant le même lot d’animaux et les mêmes conditions du challenge infectieux (même souche, mode d’infection).
Raffinement
Les animaux sont observés au moins deux fois par jour afin de surveiller l'apparition du point limite qui sera suivi par une grille de scoring et défini par une détresse terminale par l’observation cumulée de 2 signes cliniques minimum correspondant à : une nage erratique, hyper ou sous ventilation, nécrose au point d’injection pouvant conduire à un choc osmotique (dérégulation des pressions), caudale rongée, animal ne répondant plus aux stimuli (épuisette). Une anesthésie par bain de tricaïne (100 mg/L) est réalisée avant de procéder à l’injection intramusculaire. Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères et les biomasses maximales (60g/l) sont rigoureusement respectées. La qualité de l’eau (T°C = 10°C, O2>7 mg/l, pH = 8, NO2
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est le modèle classique de la pisciculture continentale européenne : c’est la principale espèce d'élevage en France et c'est l'hôte naturel de Flavobacterium psychrophilum. Il est nécessaire de travailler sur des poissons vivants afin de mettre en place une mesure individuelle de la résistance au pathogène et permettre in fine l’evaluation de la protection du vaccin. Pour l'évaluation de la résistance à l’infection par Flavobacterium psychrophilum, les animaux sont utilisés au stade alevin, soit à des stades relativement précoces (5 g) où la sensibilité à des infections par Flavobacterium psychrophilum est maximale. De plus, c’est à ce stade que les animaux sont le plus sensibles à cette pathologie dans les élevages. L’objectif commercial est donc de vacciner les animaux sur ces stades précoces (1 g).
Le cervelet comme cible thérapeutique pour la maladie de Charcot
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une neurochirurgie d'injection dans le cervelet, un suivi moteur par deux exercices, puis un prélèvement de tissus nerveux après une dose létale d'anesthésique, pour évaluer une thérapie génique dans la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur emploie trois lignées transgéniques et affirme que ce réseau neuronal ne peut être reproduit in vitro dans une boîte de Petri, concluant que le modèle vivant reste une étape "requise" vers la clinique. Les retombées diagnostiques et thérapeutiques annoncées sont renvoyées au conditionnel et au long terme.
Objectifs
La maladie de Charcot ou sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable causée par la perte des motoneurones du cerveau et de la moelle épinière. Chaque année, environ 3 nouveaux cas pour 100 000 personnes sont touchés par la maladie. La maladie de Charcot débute généralement entre 50 et 70 ans par une faiblesse musculaire, évoluant rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire qui conduit au décès dans les 3 ans suivant l'apparition des symptômes. Malgré l'explosion des connaissances sur les processus pathologiques centrés autour du motoneurone, d’autres faisceaux d’évidences suggèrent que la maladie est multi-systémique et mettrait en jeu d’autres régions du système nerveux. Des études d’imagerie clinique chez les patients ont révélé des défauts de structure dans le cervelet. Cette structure cérébrale intègre les informations sensorielles et motrices provenant de la moelle épinière et différentes aires du cerveau pour réguler finement les commandes motrices. Curieusement, l’implication du cervelet a été largement sous-estimée dans la Maladie de Charcot alors que ses fonctions sont centrales dans les traits cardinaux de la maladie. Notre objectif est de comprendre le rôle du cervelet dans la pathologie et d’évaluer son potentiel comme cible thérapeutique. A cette fin, nous aborderons cette problématique par une description précise des défauts de connections entre le cervelet et les zones motrices dans deux modèles murins de la maladie. Nous compléterons cette étude neuroanatomique par une étude fonctionnelle pour mieux comprendre quels sont les défaut de communication électrique entre le cervelet et les zones motrices de la moelle épinière. Notre dernier objectif est d’évaluer par une approche de thérapie génique l’effet bénéfique de cibler le cervelet dans la maladie de Charcot. Le but de ce projet est donc de fournir un nouvel éclairage sur la maladie en identifiant un nouveau système de communication neuronal dont les défauts peuvent expliquer certains traits de la pathologie et donc offrir de nouvelles perspectives aussi bien diagnostics que thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’identification de nouveaux réseaux de communication neuronale qui participent aux dysfonctionnements moteurs dans la maladie de Charcot offre des possibilités pour améliorer le diagnostic et/ou le pronostic de la maladie chez l’homme. Cibler par imagerie ou conduire des tests fonctionnels chez les patients qui visent des liens entre le cervelet et les zones motrices affectées directement dans la maladie de Charcot permettra d’avoir un tableau plus complet de la maladie. Les bénéfices de cette étude présentent donc un potentiel clinique. Ce projet propose de faire progresser nos connaissances scientifiques sur cette pathologie qui se révèle particulièrement complexe. Notre connaissance encore incomplète de la pathologie explique pour une grande part les nombreux échecs thérapeutiques rencontrés chez le patient jusqu’à présent. Notre projet propose d’explorer un réseau neuronal jusque-là sous-estimé. Mieux comprendre la pathologie dans ses interactions à longue distance entre différentes zones cérébrales signifie également offrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre projet explore une approche de thérapie génique, qui a un fort potentiel clinique comme l’illustre l’efficacité de la thérapie génique appliquée à l’amyotrophie spinale, une maladie infantile du motoneurone. L’utilisation de deux modèles génétiques différents de la maladie est un point fort de cette étude en mimant l’hétérogénéité étiologique, histopathologique et clinique de la maladie de Chacot. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et potentielles applications dans deux contextes génétiques différents. Notre projet s’inscrit dans un consortium composé également de cliniciens qui mènent en parallèle une étude sur le cervelet chez les patients. La mise en commun des connaissances fondamentales et cliniques est un atout pour faire progresser dans les prochaines années les aspects diagnostics, pronostics et à plus long terme thérapeutiques. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et potentiellement un/des dépôts de brevet.
Procédures
Le projet propose de délivrer des informations thérapeutiques dans une zone du cerveau, le cervelet. Les procédures nécessitent une neurochirurgie qui permet de délivrer des agents thérapeutiques dans le cervelet. Nous délivrons alors des anesthésiques et analgésiques chimiques, ou encore une solution de réhydratation aux animaux. Pour cela des injections sont réalisées à l’aide d’une seringue et d’une aiguille, avec au préalable un traitement avec d’un analgésique cutané local. Ces procédures sont rapides et nécessitent de l’endormissement au réveil de l’animal entre 10 et 15 min. Afin de déterminer un effet thérapeutique du traitement, les capacités motrices des souris atteinte de la maladie de Charcot, sont suivies par des tests de comportements simples, non invasifs, non douloureux, ne nécessitant pas de privation de nourriture. Deux exercices moteurs seront ici réalisés pour définir les capacités à effectuer des activités motrices. Chaque test prend moins de 5 min par souris. Notre étudions dans notre approche l’état des réseaux de neurones qui contrôlent ces activités motrices. Nous avons besoin de réaliser des études de localisation des neurones. A cette fin, nous devons réaliser des prélèvements de tissus sur des animaux ayant au préalable reçu une dose léthale d’anesthésique/analgésique chimique. Cette procédure prend moins de 5 min par animal. Des souris pourront se trouver hébergées individuellement, dans un environnement enrichie amplifié pour une durée de 21 jours.
Impact sur les animaux
La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable dont l’issue est inexorablement fatale. Les modèles murins que nous utilisons ont été très bien caractérisés dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation de la règle des 3Rs. Le trait commun de la pathologie chez ces 3 lignées de souris modèles de la maladie est la diminution sélective des capacités motrices. Ces trois modèles présentent donc un phénotype avec une atteinte motrice variable. Les modèles de la maladie de Charcot ont été particulièrement bien décrits quant au tableau et à la chronologie clinique de la pathologie. Deux des modèles présentent une réduction progressive de la masse musculaire commençant par les membres inférieurs mais ont des débuts de la maladie différents. Cette amyotrophie se traduit par une perte de poids et des difficultés déambulatoires. Le troisième modèle a été également très bien phénotypé dans la littérature : ces souris perdent très lentement leur capacité à effectuer une tache motrice et présentent une posture anormale (dandinement) qui est stable pour suivre un déclin normal lié à l’âge et à la prise poids. Ce modèle présentent une atteinte motrice plus légère qui n’est pas associée à une espérance de vie plus courte. Les souris, comme les patients, ne présentent pas de signes de douleurs. Notre objectif est d’améliorer les symptômes moteurs par une approche de thérapie génique. Le choix du transfert par virus recombinants non-pathogènes est dicté le fait que les vecteurs viraux qui peuvent être administrés avec sécurité pour l’animal sans causer de dommages et complications. Les virus seront délivrés dans les régions d’intérêts du système nerveux des souris par des méthodes standardisées et maitrisées. Les animaux qui rentrent dans l’évaluation thérapeutique sont impliqués dans du comportement moteur consistant à évaluer de façon non-invasive, non-douloureuse, très peu contraignante et de courte durée la capacité à effectuer une activité motrice simple.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour répondre à deux nécessités du projet : 1) prélever des tissus afin d’étudier les défauts de connexion entre différentes aires du système nerveux central et déterminer les paramètres histologiques en liens avec des caractéristiques cliniques et un effet thérapeutique. L’autre nécessité est liée à la pathologie elle-même, qui est fatale chez l’homme et également dans un des modèles murins utilisé ici, et rentre dans le cadre de l’étude de l’approche thérapeutique sur l’espérance de vie des souris qui auront reçu ou non le traitement.
Remplacement
L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul moyen intégrant la complexité des communications entre différentes aires motrices du cerveau, du tronc cérébral et de la moelle épinière. L’existence de neurones dérivés de cellules souches ne peut pas reproduire la circuiterie complexe qui fait intervenir les neurones moteurs qui contrôlent la contraction musculaire, qui en retour informe une structure cérébrale appelé cervelet, qui est lui-même connecté à d’autres aires du cerveau. Une tel réseau d’information entre cerveau, moelle épinière et muscle ne peut donc pas être mimé in vitro dans une boite de pétri. Seuls les modèles expérimentaux mammifères présentent cette organisation complexe faite de contrôles réciproques permanents. Les modèles souris de la maladie de Charcot sont donc les seuls modèles qui permettent d’explorer les défauts de la circuiterie neuronale de longue distance. Notre objectif étant de développer une approche de thérapie génique ciblant cette circuiterie, l’utilisation des modèles animaux de la maladie de Charcot est également nécessaire. La validation d’une approche thérapeutique qui intervient dans la complexité de cette communication entre différentes aires du système nerveux requiert un modèle intégratif, physiologique complet que seul l’animal offre. Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour tout transfert thérapeutique potentiel vers la clinique.
Réduction
Nous avons donc déterminé pour une durée du projet de 4 années, un nombre total de 660 souris. Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Pour un premier modèle de la maladie de Charcot chaque cohorte est composée de 24 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histopathologiques. Pour le second modèle, chaque cohorte est composée de 14 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histopathologiques. Afin de minimiser le nombre d’animaux, un partage des tissus est systématiquement appliqué entre l’équipe spécialiste de la moelle épinière et l’autre spécialiste du cerveau. Notre projet inclus également des études d’enregistrement de l’activité neuronale sur des préparations ex vivo du système nerveux. Cette étude sur des tranches de moelle épinière permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les données sont analysées avec des tests statistiques paramétriques. Un test de normalité de Shapiro-Wilk suivi d'un test de variance sera effectué afin de conforter l'analyse de variance (ANOVA). Une ANOVA pour échantillons indépendants, mesures répétées (groupe par temps) est effectuée. Un test de comparaison multiple de Newmann-Keuls est ensuite utilisé pour comparer les différents groupes entre eux. Pour les études de survie, nous réaliserons un Log-Rank Test en utilisant, selon les recommandations publiées un seul point uniforme d’interruption.
Raffinement
Une connaissance extensive de ces deux modèles de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différentes étapes de la maladie et donc d’optimiser l’expérimentation. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, igloo, lanières de papier craft et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Les points limites sont définis par le suivi régulier du poids des souris et leur capacité à effectuer une tache motrice reflexe simple. Pour chaque modèle animal de la maladie de Charcot un arbre décisionnel spécifique est défini et suivi par les expérimentateurs associés au projet. De plus une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. Certains animaux peuvent avoir une anesthésie qui est systématiquement conduite en présence d’analgésique. Les animaux sont ensuite surveillés attentivement après leur réveil. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse ou de douleur est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. Une grille d’évaluation définit par la structure du bien-être animal nous permet de suivre les animaux ainsi identifiés et de prendre rapidement des mesures adaptées.
Choix des espèces
Les lignées transgéniques de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité des résultats: début précoce/tardif, progression lente/rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. L’exploration neuroanatomique des réseaux complexes de longue distance et le protocole thérapeutique pré-clinique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la maladie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie de transfert viral. La complexité du réseau de communication du système moteur, et en particulier le cervelet qui est un relai entre différentes aires du cerveau et de la moelle épinière des mammifères requiert le modèle souris. Afin de tracer de façon reproductible les voies neuronales, nos souris seront croisées avec des souris possédant un gène reporteur qui identifiera les neurones en rouge. Les modèles de la maladie de Charcot qui sont utilisés récapitulent les principales étapes de la maladie. Nous utiliserons 3 modèles différents qui permettent de représenter l’hétérogénéité clinique et génétique de la maladie. Afin des suivre la maladie nous utiliserons les lignées à trois stades significatifs de la pathologie. L’âge de chaque stade étant différent en fonction du modèle. Nous utiliserons les souris 1) au stade précédent les premiers signes moteurs, c’est le stade asymptomatique. 2) Le stade de début de la maladie ou les premiers signes moteurs sont quantifiables. 3) Un stade ou la maladie est installée, qui est le stade symptomatique. L’espérance de vie des souris est également étudiée dans une procédure thérapeutique.
Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie de produits vétérinaires chez le chat et le chien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Chiens : 200
Issus parfois de procédures antérieures de niveau léger ou modéré, 200 chats et 200 chiens, soit 400 animaux non-humains, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, aucune mise à mort n'étant déclarée. Ils reçoivent des produits vétérinaires en une ou plusieurs administrations, éveillés ou anesthésiés, et subissent prises de sang et recueils d'urine, de salive, de fèces ou de poils, avec un hébergement individuel et des mises à jeun que le porteur dit sources de stress, et de possibles vomissements. L'objet est de fixer la dose et la voie d'administration de futurs médicaments pour chats et chiens, avant les études réglementaires exigées pour leur autorisation de mise sur le marché. À l'issue, 150 seront adoptés et 250 réutilisés dans de futures procédures, dont 150 chats, le porteur précisant qu'un individu présentant une "anxiété importante" ou une maladie chronique ne sera pas adoptable.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer la pharmacocinétique et la pharmacodynamie de nouveaux produits vétérinaires destinés aux chats et aux chiens. Ce sont des informations nécessaires au choix de la posologie et de la voie d’administration du produit, préalable à la réalisation des études réglementaires d’efficacité et d’innocuité. Il pourra concerner toute sorte de produits vétérinaires présentant un bénéfice pour la santé des chiens ou des chats ou leur apportant un meilleur bien-être. Il pourra s’agir par exemple d’antiparasitaires, d’antibiotiques, d’antidiabétiques, d’antihypertenseurs, ou de produits destinés aux maladies dermatologiques, respiratoires, cardiaques, métaboliques, nerveuses ou oculaires.
Bénéfices attendus
La pharmacocinétique a pour but d'étudier le devenir d'une substance active contenue dans un médicament après son administration. La pharmacodynamie a pour but d’étudier l’action exercée par un ou plusieurs principes actifs sur l’organisme, en particulier les effets biochimiques et physiologiques des médicaments sur l'organisme. La pharmacocinétique et la pharmacodynamie contribuent à expliquer la relation entre la dose et la réponse, c'est-à-dire, l'effet du produit. Ce sont des informations nécessaires au choix de la posologie et de la voie d’administration du produit, préalable à la réalisation des études réglementaires d’efficacité et d’innocuité. Ces informations sont nécessaires à l’autorisation de mise sur le marché de nouveaux produits.
Procédures
Les administrations
Impact sur les animaux
On ne s’attend pas à des effets secondaires notables. En effet, la plupart des produits à l’étude ont déjà fait preuve de leur innocuité chez d’autres espèces. Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Stress dû à la contention - Douleur / inconfort suite aux injections ou aux prélèvements - Stress dû à l’hébergement individuel et/ou à la mise à jeun - Régurgitation / vomissements suite à l’administration
Devenir
Un animal présentant des troubles du comportement (ex: anxiété importante) et/ou une pathologie chronique ne sera pas adoptable.
Remplacement
Les modèles in silico et/ou in vitro/ex vivo permettent de sélectionner des molécules potentiellement efficaces. Après cette première étape, les études de pharmacocinétique ou pharmacodynamie nécessitent de travailler sur un organisme entier, mettant en jeu des interactions entre différents tissus/organes impliqués dans le métabolisme et le/les effets physiologiques et thérapeutiques d’un futur candidat médicament.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum lors des premières études exploratoires (3 ou 4 animaux par groupe). Il sera ensuite calculé pour les études suivantes selon la variabilité entre individus observée antérieurement et pourra atteindre jusqu’à 10 animaux. Lorsque le statut des animaux le permet les animaux utilisés peuvent être issus de procédures (légère ou modérée) antérieures et peuvent ensuite être réutilisés dans une future procédure. La réutilisation permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Seuls les animaux ayant retrouvé un état de santé et bien-être complet, attesté par le vétérinaire désigné, sont réutilisables.
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique dont la durée optimale est de 7 jours. Les animaux font l’objet d’un soin de qualité avec respect de leur bien-être. Les chats et les chiens ont à disposition des méthodes d’enrichissement afin de stimuler l’exercice physique et leurs activités cognitives. Un training est réalisé en renforcement positif (friandises, caresses), afin de limiter le stress lié aux actes techniques (contention, administrations, prélèvements) et aux conditions d’études (hébergement individuel, alimentation…). La durée de ce travail est indéterminée, il sera réalisé jusqu’à ce que les animaux ne montrent plus de signes de stress contre-indiquant leur entrée dans la procédure (le cas échéant). Pour réduire l’inconfort provoqué par l’administration et/ou les prélèvements, les opérateurs qualifiés réalisent une contention adaptée de l’animal et une anesthésie et/ou analgésie et/ou un changement du site peuvent être mis en place. Les animaux sont observés quotidiennement, ou plus si jugé nécessaire, ce qui permet de détecter tout signe comportemental anormal (spontané ou provoqué) et/ou toute anomalie physique non attendue. En cas de déviation de l'état normal d'un animal, le responsable de l’étude, le vétérinaire désigné ou le vétérinaire d'astreinte, décidera d'augmenter les fréquences d'observations, d'isoler l'animal et/ou d'envisager un traitement pour soulager l'animal. Des critères d'alertes spécifiques aux espèces chien, chat sont mises en place et appliquées. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge pour maximiser leur confort et leur bien-être. La SBEA garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Il s’agit des espèces cibles pour les produits. Des données concernant l’espèce doivent être fournies au dossier d’AMM. Les chats et chiens utilisés ont plus de 2 mois. L’âge dépend des besoins pour les études qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude, du produit testé et répondent à l’exigence expérimentale d’utilisation du produit mis sur le marché.
Création de lignées murines originales
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Mâles isolés tués au CO2 avant douze mois, femelles donneuses tuées par dislocation cervicale pour récolter leurs embryons, receveuses tuées au CO2 après un unique transfert : la création de lignées de souris génétiquement modifiées passe par la mise à mort de chaque catégorie d'adultes. 15 400 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère. 5 625 femelles impubères de quatre semaines reçoivent deux injections d'hormones pour une superovulation, 2 250 receveuses subissent sous anesthésie un transfert d'embryons dans l'oviducte, et 325 mâles, dont 200 vasectomisés, vivent isolés entre deux nuits d'accouplement, un isolement qui peut, selon le porteur, "générer de l'anxiété". Les 7 220 souriceaux nés de ces transferts sont suivis pour de possibles "phénotypes dommageables", et le résumé ne dit pas ce qu'il advient d'eux.
Objectifs
Les équipes des instituts utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez la souris, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées chez des patients , à évaluer des stratégies thérapeutiques adaptées en conséquence. Ce projet a pour objectif la génération de modèles murins transgéniques, via l'utilisation de nucléases spécifiques
Bénéfices attendus
L'utilisation de nucléases spécifiques sur l'embryon de souris permet l'obtention de souris d'intérêt génétiquement modifiées dans des délais courts, en utilisant peu d'animaux, et ce directement dans un fonds génétique d'intérêt donné.
Procédures
+ 200 mâles vasectomisés et 125 mâles reproducteurs seront herbergés en situation d'isolement sur 5 ans + 5625 femelles donneuses seront soumises à une stimulation hormonale (2 injections intra-péritonéales (durée inférieure à 5 secondes) à 48h d'intervalle) + 2250 femelles receveuses recevront des embryons par transfert d'embryons dans l'oviducte sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 40min) + 7220 souriceaux seront suivis pour de potentiels phénotypes dommageables
Impact sur les animaux
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs sont hébergés en situation d'isolement intermittent entre deux périodes d'accouplement, ces accouplements n'ayant lieu que sur des périodes courtes (une nuit) pour permettre le contrôle et la synchronisation de l'initiation des pseudo-gestations (dans le cas des mâles vasectomisés) ou pour permettre la production d'embryon un jour donné (dans le cas des mâles reproducteurs). L'isolement peut générer de l'anxiété, la souris étant un animal vivant en groupes sociaux. Les femelles pseudo-gestantes peuvent être sujettes à de la douleur post chirurgie, suite à la réimplantation des embryons. A propos des animaux dits "fondateurs" obtenus après réimplantation des embryons modifiés, ceux-ci peuvent potentiellement avoir un phénotype dommageable. Une fiche de suivi sera attribuée à chacun d'entre eux
Devenir
+ Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs en situation d'isolement seront mis à mort par inhalation de CO2 via un système dédié avant qu'ils aient 12 mois + les femelles donneuses sont mises à mort par dislocation cervicale afin de récolter les embryos post-mortem + les femelles receveuses ne peuvent pas être sujettes à un deuxième transfert d'embryons, elles sont donc mises à mort par inhalation de CO2 via un système dédié en fin de procédure
Remplacement
Il est impossible de remplacer l'utilisation de ces animaux, la génération de nouveaux modèles murins transgéniques impose l'utilisation d'animaux donneurs/receveurs d'embryons.
Réduction
La création de nouvelles lignées transgéniques sera limitée aux lignées qui ne sont pas disponibles, que ce soit sous forme respirante, d'embryons congelés, ou de semence congelée. Une seule série de production - électroporation/microinjection - réimplantation sera effectuée dans un premier temps par projet. La deuxième et éventuellement troisième série ne sera programmée qu'en cas d'absence d'un fondateur d'intérêt. Lors de ces éventuelles deuxièmes et troisièmes séries, plusieurs paramètres liés à l'efficacité du système Crispr/Cas9 seront modifiés (changement d'ARN guide, variation des concentratrion en ARN guide et Cas 9 etc) L'estimation des nombres maximum d'animaux à utiliser dans ce projet a été faite en se basant sur la litterature scientifique, notamment "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition" (Richard Berhringer and al.)
Raffinement
La technique chirurgicale de transfert d'embryons associe anesthésie générale et analgésie per et post opératoire, avec la mise en oeuvre de points limites opérationnels pour le monitoring du temps post opératoire. L'anesthésie est réalisée par injection intra-périonéale d'une combinaison de zoletil (40 mg/kg) et xylazine (5 mg/kg) sous un volume de 300 μl. L'analgésie per et post opératoire est réalisée par l'injection intrapéritonéale de buprenorphine 0,1 mg/kg sous un volume de 100 μl.
Choix des espèces
Pas d’autres possibilités que l’utilisation de souris pour la production de lignées de souris génétiquement modifiées. Les animaux utilisés sont des reproducteurs à l'âge adulte pour les femelles receveuses,les males vasectomisés et les mâles reproducteurs, aprés la puberté et avant tout vieillissement. Les femelles donneuses utilisées sont des femelles impubéres (4 semaines) pour faciliter l'efficacité du traitement de superovulation.