Procédures légères

354 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour 90 d'entre elles et modéré pour 264. Elles reçoivent une série d'injections, dont un virus EBV et des cellules humaines, pour développer un lymphome, puis un ligand testé contre les cancers liés au virus, avant d'être tuées par dislocation cervicale. Le suivi de la tumeur va jusqu'à un volume de 2 000 mm³ ou l'apparition de signes de douleur. Le porteur mentionne des organoïdes en développement mais affirme que seul le modèle murin permet de tester les deux phases du traitement.

Objectifs

Le virus Epstein-Barr (EBV) est associé à plusieurs cancers d’origine épithéliale ou lymphoïde. Ce virus infecte plus de 90% des humains et la mononucléose infectieuse est la manifestation commune de l’infection primaire. EBV établit ensuite une infection chronique dormante c'est à dire qui passe inaperçue, durant laquelle son potentiel oncogénique peut s’activer et conduire notamment à des cancers comme des carcinomes nasopharyngés et des lymphomes. La réplication du virus EBV entraine la lyse des cellules infectées (cycle lytique). La réactivation du virus dormant dans les cellules épithéliales et les lymphocytes B est par conséquent une piste explorée pour éliminer le réservoir viral et les cellules infectées prolifératives, avant ou après leur transformation en cellules cancéreuses. Si des progrès importants ont été réalisés dans la découverte d’inducteurs du cycle lytique, des molécules sures et spécifiques sont toujours attendues. Un récepteur cellulaire a été identifié comme étant une cible majeure impliquée dans la réactivation du cycle lytique d'EBV, et donc une cible pour développer des molécules antivirales contre EBV. S’appuyant sur de solides résultats, le projet qui sera developpé ici vise à tester des ligands de ces récepteurs cellulaires ayant les meilleures structures chimiques autorisant un transfert vers la clinique. Pour cela, des modèles murins précliniques permettant de reconstituer des lymphoproliférations humaines EBV positives à partir de souris immunodéficientes seront développés et permettront de tester l'efficacité de ces ligands in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet qui vise à tester de nouvelles molécules dans des modèles précliniques de tumeurs EBV+ devrait avoir un impact en santé humaine à moyen terme. En effet, si les molécules testées s'avèrent avoir un effet dans ces modèles précliniques, un essai clinique de phase I voire II pourrait être mis en place afin de tester ces molécules chez l'homme.

Procédures

1. Injection unique de Bulsulfan en intrapéritonéale (durée de quelques secondes). 2. Injection unique du virus EBV en intrapéritonéale (durée de quelques secondes). 3. Injection unique de cellules CD34+ humaines (durée de quelques secondes) en intraveineux après anesthésie gazeuse. 4. Injection répétée (1 fois par jour pendant 5 jours jusqu'au développement du lymphome) d'anticorps anti-CD3 humain (durée quelques secondes) en intraveineux après anesthésie gazeuse. 5. Injection répétée (toutes les 12h, pendant 2 semaines) du ligand du récepteur à l'histamine JNJ7777120 en intrapéritonéal (durée quelques secondes). 6. Prélèvement de sang par ponction submandibulaire, 1 fois par semaine jusqu'à reconstitution d'un système hématopoiétique humain, à l'aide d'une lancette (durée de quelques secondes). 7. Injection unique en sous-cutanée des cellules Daudi dans 100µl de Matrigel (durée de quelques secondes) après anesthésie gazeuse. 8. Injection en sous-cutanée d'un fragment de 1 à 2 mm3 de PDX T1 ou T2 dans100µl de PBS qui seront mélangés à 100µl de Matrigel (durée de quelques secondes).

Impact sur les animaux

1. Nuisances légères attendues liées aux injections en intrapéritonéale, durer que quelques secondes, temps requis pour effectuer l'injection. 2. Nuisances modérées attendues liées aux injections en intraveineux. Afin de limiter les nuisances de ces injections, les souris seront préalablement anesthésiées. 3. Nuisances modérées attendues liées aux prélèvementx de sang par ponction submandibulaire (limités à 2 gouttes soit 50µl). 4. Nuisances légères attendues suite à l'injection unique en sous-cutanée des cellules Daudi ou d'un fragment de PDX. Afin de limiter les nuisances de ces injections, les souris seront préalablement anesthésiées. 5. Nuisances modérées attendues liées au développement du lymphome. Afin de limiter au minimum les effets indésirables associés au développement du lymphome, les animaux seront observés 3 jours par semaine afin de mettre en évidence tous signes évoquant une éventuelle douleur (gonflement de l'abdomen, réduction de l’activité (prostration), poil hérissé et dos vouté). Si un de ces signes cliniques est observé, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale. Pour les lymphomes greffés en sous-cutané le suivi sera réalisé par mesure de la tumeur à l'aide d'un pied à coulisse et les souris seront mises à mort dès que la tumeur atteinsra un volume de 2000 mm3.

Devenir

A l’issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale afin de réaliser les prélèvements nécessaires pour analyser l'impact des molécules thérapeutiques sur le développement des tumeurs associées à EBV.

Remplacement

Des modèles d'organoïdes de tumeurs sont actuellement en cours de développement qui pourraient à terme remplacer une partie des expériences actuellement réalisées chez la souris. Il n'existe cependant pas de modèle de ce type permettant d'analyser à la fois l'effet des molécules testées dans ce projet directement sur les tumeurs et leur impact indirecte sur la réactivation du système immunitaire pour aider à détruire ces tumeurs. Seuls ces modèles murins précliniques permettent de tester les 2 phases potentielles de l'activité de ces traitements qui visent à réactiver le cycle lytique d'EBV.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons : - mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris. - effectuer une étude statistique descriptive (Test t) qui déterminera les différences qualitatives et quantitatives entre les groupes des souris. Cela permettra d’éviter la répétition de l’expérience et de réduire au minimum l’utilisation des animaux - optimiser le matériel issu des tumeurs pour production multiple (cellules des différents organes congelés en DMSO, extraction des acides nucléiques (ADN, ARN), et inclusion des organes pour histologie) et éviter ainsi la répétition de l’expérience. - quantifier la viabilité cellulaire des échantillons humains avant toute injection ou greffe pour limiter les échecs.

Raffinement

Les souris seront laissées en acclimatation en zone expérimentale pendant une semaine. Dans la procédure 2, les souris seront observées de façon journalière afin de mettre en évidence les points limites définis dans la procédure. Dans la procédure 3, avant injection des cellules en sous-cutanée, les souris seront anesthésiées. Lors du suivi des animaux, la prise tumorale sera évaluée par palpation jusqu'à apparition des signes cliniques. Dans la procédure 4, lors de l'humanisation des souris, celles-ci seront observées 2 fois par semaine jusqu'à reconstitution à hauteur de 40% de cellules humaines dans le sang des souris. A partir de l'infection par EBV, les animaux seront alors surveillés 3 fois par semaine afin de mettre en évidence le développement de lymphome qui se caractérisera par la mise en évidence des signes suivant : gonflement de l'abdomen, réduction de l’activité (prostration), poil hérissé et dos vouté. Si un de ces signes cliniques est observé, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale. Dans la procédure 5, les tumeurs qui se développeront en sous-cutanée seront mesurées 2 fois par semaine jusqu'à obtenir un point limite de 2000mm3 maximum, la souris sera également mise à mort si la tumeur nécrose ou si elle empêche un déplacement normal de la souris. Si l'un de ces points limites est atteint, la souris sera mise à mort par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Chez la souris, des modèles très immunodéficients tels que les souris NSG sont accessibles à la communauté scientifique. Ces souris représentent donc un modèle de choix pour reconstituer soit un système immunitaire proche de l'homme soit des pathologies humaines telles que des lymphomes. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines qui correspond à l'âge adulte de ces animaux.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour 56 d'entre elles et modéré pour 16. Elles sont infectées par nébulisation avec la mycobactérie M. avium, et 16 d'entre elles reçoivent en plus un gavage quotidien d'antibiotiques pendant un à deux mois. Le projet cherche à caler un modèle d'infection pulmonaire pour tester ensuite de nouveaux antibiotiques. Le porteur affirme qu'aucun autre modèle ne peut remplacer l'animal car l'infection touche plusieurs organes, et signale que le gavage peut être inconfortable.

Objectifs

Les infections à mycobactéries non tuberculeuses ont une prévalence en augmentation. Leur prise en charge est complexe et lourde, basée actuellement sur une association d’au moins trois antibiotiques pour une durée minimale de 12 mois après négativation des prélèvements respiratoires. M. avium (MAC) fait partie des espèces de mycobactérie les plus souvent responsables d’infections pulmonaires chez l’homme. Ces infections surviennent généralement chez des patients ayant des comorbidités respiratoires : mucoviscidose, bronchectasies, bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO). Pour améliorer la prise en charge de ces patients, il faut pouvoir évaluer, sur un modèle adapté, de nouvelles associations d’antibiotiques ainsi que de nouvelles molécules. L’objectif de cette étude est d’évaluer le meilleur modèle d’infection à M. avium en vue d’évaluer de nouvelles associations de traitement antibiotiques ou de nouvelles molécules.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont d’obtenir un modèle d’infection à mycobactérie proche de ce qui se passe sur l’homme afin de pouvoir l’utiliser pour tester de nouveaux antibiotiques (qui pourraient être plus efficace et/ou avec moins d’effets indésirables que les traitements actuellement utilisés). L'amélioration du modèle permettra aussi de réduire l'utilisation des animaux dans le cadre de ces études.

Procédures

Chaque souris subira une infection unique par nébulisation (geste non invasif, durée 30 minutes de nébulisation, avec une durée totale dans le nébuliseur de 1h30) de mycobactéries. 16 souris (8 souris de chaque espèce) sur les 72 infectées auront un gavage quotidien d'antibiotiques de 5 à 10 secondes par jour (5 jours sur 7) pendant 1 mois pour 8 d’entre elles (4 de chaque groupe) et pendant 2 mois pour les 8 autres (4 de chaque groupe). Les animaux seront hébergés jusque 3 mois après l'infection

Impact sur les animaux

La nébulisation de mycobactérie pourra induire un stress le temps de l’aérosol (durée totale de 1h30 de cette partie de la procédure). Aucune douleur n’est attendue. Sur l’ensemble des données disponibles sur le modèle murin d’infection à mycobactéries non tuberculeuses, il n’y a pas de perte de poids ou de mobilité après infection. Par précaution, les souris seront pesées de manière bi-hebdomadaire au minimum. Le gavage peut être inconfortable, surtout les premiers jours. Le nombre d'expérimentateur sera limité pour habituer les souris et améliorer la technicité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements et analyses

Remplacement

Le remplacement du modèle animal par un autre modèle n'est pas possible du fait que l'infection à myobactérie touche différents organes et différents types de cellules. Des premiers travaux peuvent être faits sur cellule, mais néanmoins pour évaluer complètement un nouvel antibiotique il faut ensuite vérifier son efficacité sur les différents organes, ce qui ne peut être reproduit in vitro.

Réduction

Ce modèle permet de mimer mieux l’infection telle qu’elle est chez l’homme et elle a l’avantage de produire une infection homogène au sein des souris, permettant ainsi de limiter le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats scientifiquement solides. Le nombre de souris a donc été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l'analyse statistique.

Raffinement

Les souris seront dans des hébergements en groupe. Il sera utilisé un enrichissement dans les cages pour permettre le jeu des souris. Le projet commencera au minimum 15 jours après leur arrivée dans l’animalerie pour permettre aux souris de s’habituer aux nouveaux locaux. Deux personnes seulement pratiqueront le gavage afin de permettre l’habituation des souris. les souris seront surveillées de manière quotidienne, avec une évaluation approfondie et une pesée bi-hebdomadaire au minimum. Des points limites ont été déterminés avec l'utilisation d'une grille de score.

Choix des espèces

Les souris possédent un système respiratoire proche de l'homme. Elles entreront dans l'étude au stade de jeunes adultes, soit 6 semaines (infection à mycobactéries principalement chez les adultes chez l'homme)

117 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour 81 d'entre elles et modéré pour 36. Elles sont irradiées puis reçoivent une greffe de cellules immunitaires par voie intraveineuse, suivie de prélèvements sanguins et d'injections intrapéritonéales répétées. Le projet étudie une protéine kinase dont l'inactivation provoque chez la souris un syndrome proche du lupus. Le porteur indique tuer les animaux pour analyses ou parce qu'ils ne portent pas le génotype recherché, et affirme que le modèle souris reste "indispensable" après une étape in vitro.

Objectifs

La réponse immunitaire résulte de l’action combinée des cellules de l’immunité innée comme les cellules dendritiques dont la mission est de patrouiller dans l’organisme à la recherche de cellules infectées ou tumorales, et des cellules de l’immunité adaptative comme les lymphocytes B et T qui reconnaissent de manière spécifique les pathogènes. L’interaction entre toutes les cellules de l'immunité est indispensable pour permettre une réponse immunitaire efficace et l’éradication des pathogènes. S’il doit nous protéger contre les agressions extérieures, le système immunitaire doit aussi apprendre à tolérer ses propres constituants, c’est-à-dire le « soi ». Cependant dans certains cas, une sur-activation des lymphocytes T et/ou un défaut de la régulation de la réponse immunitaire peuvent provoquer l’apparition de maladies auto-immunes. Dans ce cas, des lymphocytes T auto-réactifs vont s’attaquer spécifiquement à des tissus ou organes au lieu de les protéger comme dans le cas du syndrome du Lupus. Ce projet va porter sur l’étude du rôle d’une protéine importante pour l’activation du lymphocyte T et dont nous étudions le rôle in vitro et in vivo.

Bénéfices attendus

Une dérégulation du système immunitaire peut entrainer l’apparition de maladies auto-immunes chez l’homme. Nous avons identifié une protéine dont l’inactivation dans les lymphocytes T chez la souris entraine le développement d’un syndrome auto-immun ayant des caractéristiques du syndrome lupique chez l’homme. Caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires de cette molécule dans l’apparition des symptômes lupiques et plus généralement dans l’apparition de maladie auto-immune pourrait donc de la considérer comme une éventuelle cible thérapeutique de maladies auto-immunes.

Procédures

Dans une première procédure des souris vigiles seront irradiées. Quatre heures après l’irradiation, les animaux anesthésiés seront injectés par voie intraveineuse (durée de l’anesthésie < 5 minutes). Six semaines après l’injection, un prélèvement sanguin sera réalisé sur les animaux vigiles (durée du geste 10 secondes). Un second prélèvement sanguin pourra être réalisé sur certains animaux, deux semaines après le premier prélèvement (durée du geste 10 sec). Dans une seconde procédure, un prélèvement sanguin sur animal anesthésié (anesthésie

Impact sur les animaux

Intervention subie : Irradiation et greffe. L’irradiation des animaux entrainera une éradication des cellules de la moelle osseuse des animaux. L’irradiation et l’aplasie qui en découlent ne sont pas douloureux pour les animaux. Les animaux recevront 4 heures après l’irradiation, une injection intraveineuse de cellules immunitaires (=greffe) pour reconstituer leur système immunitaire. Les nuisances attendues suite à cette administration seront celles liées à l’injection d’un produit non douloureux par voie intraveineuse. Néanmoins dans le cas, où la greffe ne prendrait pas (cas rare), les animaux pourraient présenter une altération de l’état général (perte de poids/prostration) qui conduirait à la mise à mort des animaux concernés. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements dans l’abdomen seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques en intrapéritonéale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem ou parce qu'ils ne présentent pas le génotype d'intérêt.

Remplacement

Après des premières étapes d’analyse et de validation dans des lignées cellulaires in vitro, le projet a pour but maintenant d’étudier le rôle de notre molécule d’intérêt dans le système immunitaire d’un organisme vivant et intégré comme la souris. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est réduit au maximum afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'un outil statistique De plus les croisements des lignées de souris ont été optimisés afin d’obtenir le maximum d’animaux avec un phénotype utilisable dans nos expériences.

Raffinement

Les souris sont manipulées par des personnes entrainées aux injections. Les injections intraveineuses seront effectuées sous anesthésie gazeuse afin d’éviter tout stress et douleur chez la souris. L’état général des souris ayant été irradiées sera suivi quotidiennement pendant les 2 premières semaines afin de détecter le mal être dû à une éventuelle non-reconstitution. Des antibiotiques pourront le cas échéant être mis dans l’eau de boisson afin de prévenir les risques d’infection. Les animaux seront suivis quotidiennement grâce à une grille de score qui permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle de choix pour étudier les mécanismes de tolérance et le développement d’auto-immunité. Enfin, la connaissance complète du génome murin permet de disposer de souches murines parfaitement définies et de modèles génétiquement modifiés. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 12 semaines afin que leur système immunitaire soit mature.

98 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour 91 d'entre eux et modéré pour 7. Les brebis mères rejoignent le troupeau au tarissement, tandis que les agneaux sont abattus vers quinze mois pour des prélèvements post-mortem. Le projet trace des isotopes du carbone et du strontium par prises de sang et de fèces afin d'authentifier l'origine géographique de la viande d'agneau. Le porteur écrit avoir écarté le cheval, espèce visée, au profit d'ovins "classiquement abattus à la fin du cycle de production".

Objectifs

Le projet vise à fournir une compréhension sans précédent du rôle joué par les chevaux dans les interactions entre les communautés pastorales de Mongolie à l'âge du bronze tardif (LBA).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la cinétique d’incorporation des isotopes du C et Sr dans différents tissus, ce qui permettra d’évaluer le potentiel de ces éléments chimiques comme traceurs de l’origine géographique des animaux et de leur alimentation.

Procédures

Seuls les 7 animaux du lot 7 après le changement de régime seront concernés par les prises de sang et prélévements féces à J0, J3, J7 et J14, J21, J28.

Impact sur les animaux

Les variations de régimes alimentaires pourraient entrainer des désordres digestifs pour les animaux et les prélèvements du stress. Pour palier à cela, un certain nombre d'éléments seront mises en place. Les animaux seront logés et soignés dans les conditions traditionnelles ; de même les techniques de prélèvements (sang, féces, urine, laine) sont des pratiques couramment appliquées, aucune douleur n’est attendue mais un léger stress interviendra lors de ces procédures. La contention physique des animaux s’effectuera dans les conditions habituelles d’élevage par des personnes formées et habituées à ces manipulations. Lors des changements de régime, une période de transition sera effectuée avec l’incorporation progressive du régime suivant afin de permettre aux animaux de s’adapter et de ne pas créer de stress alimentaire. Pour le régime 2 (maïs + foin) un correcteur azoté sera incorporé afin de garantir l’équilibre alimentaire de la ration. Des pesées et des mesures de l’état corporel des animaux sont réalisées chaque mois afin de surveiller le bon état de santé des animaux.

Devenir

Les brebis, mères des agneaux réintegreront le reste du troupeau au tarissement. Les agneaux élevés pour la boucherie seront abattus vers l'âge de 15 mois, afin de pouvoir effectuer des prélèvements post-mortem. La pratique d’abattage est une pratique courante dans ce type de production.

Remplacement

Les animaux devant être abattus à la fin de l'expérimentation pour les besoins scientifiques, le modèle cheval n'a pas été retenu mais plutôt celui mobilisant des ovins de production Les résultats obtenus sur le modèle ovin pourront être adaptés au modèle équin modulo la connaissance a priori des paramètres de minéralisation de l’émail dentaire chez ces deux modèles. L’intérêt est également centré sur l’authentification de l’origine géographique et alimentaire de la viande d’agneau, ce qui justifie la nécessité d’utiliser des ovins (prélèvements de muscle à l’abattage). Ces résultats seront utiles pour d'autres applications en zooarchéologie.

Réduction

Le choix du nombre d’animaux par lot (7) repose sur i) les hypothèses de différences entre lots et la possible variabilité de la réponse animale, ii) la nécessité d’avoir suffisamment d’animaux par lot pour permettre un comportement normal chez cette espèce grégaire, iii) le prise en compte de possibles pertes animales dans cette expérience qui va durer 2 ans.

Raffinement

Les agneaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les personnels animaliers et d’une pesée et notation de leur état corporel tous les mois afin de vérifier le poids, la croissance et l’état corporel. Tout signe de souffrance, se manifestant par de l’abattement, un refus de s’alimenter, ou un comportement anormal (considérés comme points limites) sera signalé, consigné dans le cahier d’expérimentation et pourra entraîner l’arrêt des prélèvements et la fin de l’expérimentation pour un individu donné, voire l’euthanasie si nécessaire. Néanmoins, les prélèvements ne devraient pas induire de douleur car ils sont réalisés par du personnel expérimenté. De plus, ils seront réalisés à une fréquence limitée et sur un faible effectif d’animaux (prélèvements de sang, urines et fèces sur le lot 7 uniquement donc 7 agneaux). Durant, l'ensemble du projet, les animaux seront élevés en lot et l'ensemble des procédures seront réalisées dans cet environnement familier ce qui permettra de limiter le stress des animaux.

Choix des espèces

Le choix a été fait de remplacer le cheval (espèce cible), par des ovins de production (espèce modèle), car ces derniers sont classiquement abattus à la fin du cycle de production. D'autre part, l’intérêt est centré sur l’authentification de l’origine géographique et alimentaire de la viande d’agneau, ce qui justifie la pertinence d’utiliser des ovins. L'étude débute dès les premiers mois de gestation des brebis, jusqu’à l’abattage des agneaux (entre 8 et 15 mois).

330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour 270 d'entre elles et modéré pour 60. Un stress est infligé aux souriceaux entre le quatrième et le onzième jour de vie pour reproduire un état dépressif, puis les adultes subissent des injections de BrdU et une chirurgie cérébrale avec implantation de fibres optiques. Le porteur mesure ensuite l'anxiété, l'anhédonie et l'attrait pour les odeurs par des tests comportementaux, avant de tuer les animaux pour prélever leur cerveau. Il revendique des bénéfices fondamentaux et cliniques "évidents", jusqu'à l'idée de promouvoir le bien-être humain par les odeurs.

Objectifs

Des études chez l’Homme ont montré que des stress subis à l’enfance peuvent engendrer des troubles émotionnels à l’âge adulte. De plus, les patients dépressifs peuvent présenter des troubles olfactifs. Une altération de la perception des odeurs provoque des troubles de la prise alimentaire ou de l’humeur, impactant la qualité de vie et aggravant le syndrome dépressif. Les modèles animaux de dépression induite par le stress précoce sont répandus et ont une bonne validité étiologique. Nous avons mis en évidence un impact du stress précoce sur l’état émotionnel et la perception olfactive des souris mâles adultes. En effet, en ce qui concerne la perception olfactive, une diminution de l’attractivité des souris pour les odeurs plaisantes a été révélée. Concernant l’état émotionnel des souris, des manifestations d’anxiété et d’anhédonie ont également été mis en évidence. Il s’agit maintenant de comprendre les bases neurales qui sous-tendent ce phénomène, en étudiant l’activité des structures impliquées. En parallèle, nous essayerons de contrecarrer les effets néfastes du stress précoce avec des entrainements olfactifs quotidiens et un traitement antidépresseur dont nous analyserons les corrélats neuronaux. Ainsi, dans ce projet, il va s’agir de comprendre comment l’activité de différentes régions cérébrales est altérée après un stress précoce chez les souris mâles et femelles et d’analyser les bénéfices d’un entrainement olfactif versus d’un traitement antidépresseur sur le comportement et l’activité du cerveau après un stress précoce. La valeur ajoutée de ce projet repose sur le fait qu’il étudie les effets du stress précoce à deux temps différents de la vie des mêmes animaux, avant et après un entrainement olfactif ou traitement anti-dépresseur. Cette approche, permet un suivi par animal des conséquences du stress précoce et de leurs améliorations au regard de différentes stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Nous étudions les bases neuronales des effets du stress précoce sur la perception de la valeur hédonique des odeurs, l'anxiété et les comportements de types dépressifs. D’un point de vue fondamental, ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes de codage des odeurs et ses altérations lors de la pathologie. Il s’agit d’un pan entier de la physiologie olfactive dont les processus fondamentaux restent encore mal connus. Ce travail, d’un point de vu plus appliqué, devrait fournir de nouvelles pistes thérapeutiques pour promouvoir le bien-être par les odeurs. Ainsi, ce projet permet d’envisager des bénéfices fondamentaux et cliniques évidents.

Procédures

Les animaux suivront 2 interventions différentes. Ils seront soumis à des injections intrapéritonéales de BrdU, marquant les nouveaux neurones. Une telle injection dure environ 30-45 secondes par animal. Les animaux suivront également une procédure chirugicale. La procédure chirurgicale consiste en l'injection intracérébrale de virus et implantation de fibres optiques pour modulation de l'activité cérébrale par la lumière. L'intervention à elle seule, une fois l'animal anesthésié, dure environ 45 minutes. L'intervention chirrugicale est suivie par une phase de récupération d'environ 3 semaines.

Impact sur les animaux

Notre protocole de stress altère le comportement des animaux, l’étude de ces altérations étant l’objet du projet. Le stress précoce va donc altérer l’état émotionnel des souris à l’âge adulte et est également susceptible d’avoir des effets chez les mères. De plus, les animaux implantés (procédure chirurgicale) étant remis entre congénères (pour éviter l'isolement des animaux), des disputes ou des dégradations du matériel d’implantation et donc de la zone correspondante peuvent être engendrées. Les chirurgies peuvent également induire des effets secondaires indésirables (perte de poids, douleurs, stress, apathie, stéréotypie etc). Une surveillance adaptée sera mise en place.

Devenir

Tous les animaux utilisés selon cette procédure seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et contrôler les injections ou analyser l’activité neurale.

Remplacement

L’étude de processus physiologiques et plus particulièrement l’étude des bases neuronale du comportement nécessite l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur modèles strictement in vitro. Notre projet se focalise sur un modèle expérimental nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux (15 souris minimum par groupe), pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats. Ces prévisions sont basées sur les précédentes études de l’équipe et les données de la littérature. De plus, pour assurer de la fiabilité statistique nous randomiserons les animaux et les groupes, et afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous corrélerons (grâce à des statistiques adaptées) le comportement et les paramètres cellulaires sur les mêmes animaux et poursuivrons le développement d'un modèle bio-informatique.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée pour détecter les points limites de souffrance. Le poids et l’apparence physique seront vérifiés pendant toute la durée du protocole. Notre étude comportementale permettra l’analyse précise des effets du stress sur les animaux. L'impact du stress sur les animaux en hébergement sera également surveillé de près (absence de stéréotypie, signes physiques de stress). Tout animal présentant des signes non préalablement identifiés comme symptômes attendus du modèle de stress précoce sera pris en considération et sa participation au reste de la procédure sera évalué. Une perte de poids supérieure à 20% ou un signe révélateur de souffrances engendrera une évaluation et une surveillance supplémentaire jusqu’à euthanasie en cas de nécessité. Le comportement et la posture des souris seront également observés afin d’évaluer le degré de bien-être ou de douleur. Pour réduire le risque d’un impact physique et psychique, une semaine de repos sera effectuée à l’arrivée des animaux avant mise en reproduction. Une sciure avec copeaux longs sera utilisée pour permettre le nid (avec ajout de coton pour les mères et les petits). Les animaux seront maintenus en groupe (5 animaux par cage maximum). Les cages sont transparentes pour favoriser la communication. Concernant la procédure chirurgicale, les souris seront anesthésiées grâce à l’injection d’un mélange de Ketamine (100mg/kg) xylazine (10mg/kg) en ip. Un gel ophtalmique sera déposé sur les yeux et de la lidocaine sera appliquée localement avant incision et après suture. Une injection d’un antalgique (Ketoprofen ; 2mg/kg, ip) sera pratiquée avant et après chirurgie puis sera réitérée en fonction de l’état de l’animal (grille de score de douleur). En attendant un réveil partiel, les animaux seront placés sous une lampe chauffante. Le test de pli de peau sera pratiqué pour vérifier le niveau d’hydratation, en cas de déshydratation, une injection de NaCl sera faite. Les animaux seront transportés via des cages à couvercles filtrants jusqu’à une armoire ventilée en secteur conventionnel, pour y être placés dans une cage propre avec nourriture et eau à volonté. Leur poids sera contrôlé pendant 3 jours suivant la chirurgie. L’état général sera évalué régulièrement pendant la phase de récupération (3 semaines). L’injection du virus suivie de l’implantation des fibres optiques est un type de procédure déjà maitrisée dans l’équipe.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car son comportement et l’importance écologique de la fonction olfactive de cette espèce sont particulièrement adaptés à la question de recherche qui nous intéresse. De plus, l’ensemble des données antérieures a été obtenu chez cette espèce, elle est classiquement utilisée dans ce type d’étude et nos données pourront être comparées à celles de la littérature. Le stress précoce est réalisé chez des animaux entre P4 et P11 (j+4 après la naissance et j+11 après la naissance). Il sera donc nécessaire de réaliser la reproduction des animaux au laboratoire pour tester les effets du stress précoce sur la perception des odeurs ainsi que de l’enrichissement sur ce modèle de dépression. Les effets du stress seront ensuite évalués de façon comportementale chez l’animal adulte (âgé entre 2 et 4 mois : maturité sexuelle atteinte, qui se situe à 8 semaines chez les femelles et 10 chez les mâles). Les animaux y compris ceux utilisés pour la reproduction seront gardés jusqu’à l’âge maximum de 2 ans.

476 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles reçoivent par voie orale un mélange de contaminants alimentaires chaque jour pendant 90 à 120 jours, avec prélèvements sanguins et suivi échographique de la gestation, puis elles et leur descendance sont mises à mort à différents stades, du fœtus à neuf mois, pour prélever organes et tissus. Le projet vise à évaluer les effets de ces contaminants sur la santé de la mère et des enfants. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "indispensable" et qu'aucun modèle cellulaire ou informatique ne peut le remplacer.

Objectifs

La population générale est exposée à de nombreux contaminants alimentaires qui entrent dans la composition d’un grand nombre de produits de consommation courante. La population, dont les femmes enceintes, est exposée quotidiennement à ce mélange de substances par ingestion, inhalation et/ou voie cutanée. Or, cette exposition représente un risque élevé pour la santé de la mère et de sa descendance. Ce risque est mal caractérisé car les études prennent rarement en compte les effets d’une exposition multiple à plusieurs contaminants (effet cocktail). De plus, le pas de temps entre les générations humaines est trop long pour permettre d’identifier les risques de pathologies développés à l’âge adulte. Il apparait donc nécessaire d’utiliser un modèle animal pour explorer ces effets qui peuvent être spécifiques au sexe de la descendance. Les objectifs du projet sont d'évaluer les effets de l’ingestion maternelle d’un mélange de contaminants alimentaires, fréquemment retrouvé dans les prélèvements humains et suspecté d'affecter le poids placentaire et le poids du nouveau-né chez l’humain. Ces effets seront étudiés, chez des lapines, sur le développement et la croissance du fœtus au cours de la gestation, la fonction du placenta, la santé de la descendance en termes de maladies cardiovasculaires, d’obésité, de diabète et de troubles de la fertilité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension des effets d'un mélange de contaminants alimentaires sur la santé des mères et de leurs enfants en termes de maladies cardiovasculaires, d’obésité, de diabète et de troubles de la reproduction/fertilité. Les résultats obtenus aideront au suivi clinique des enfants dont les mères ont été exposées à ce cocktail de contaminants au cours de la conception, la grossesse et l’allaitement maternel. De plus, ce projet va générer des informations sur la toxicité de l'exposition des mères aux contaminants alimentaires et sur leurs effets sur la descendance, ce qui représente un défi pour les autorités publiques en termes de recommandations et d'évaluation des risques, pour les femmes enceintes, les nourrissons, les enfants et les adultes.

Procédures

1ère étape sur le lot N°1 de 24 animaux : Sur 10 animaux, collecte de sang pour évaluer le niveau de base des contaminants chez les animaux. 15 jours après, injection du mélange de contaminants alimentaires sous anesthésie locale (12 animaux) ou exposition orale aux contaminants alimentaires (12 animaux), prises de sang sous anesthésie locale de 3 min sur animaux vigiles (3 prélèvements maximum par animal). 2nde étape sur le lot N°2 de 40 animaux : exposition orale aux contaminants alimentaires (une fois par jour) pendant 90 jours, prises de sang de 3 min sur animaux vigiles (une fois sur 10 animaux contrôles et 10 exposées), suivi échographique de la gestation à 4 stades de gestation sur des animaux vigiles, 40 min maximum d’échographie par session, 4 sessions par animal à une semaine d’intervalle. 3ème étape sur le lot N°3: exposition orale aux contaminants alimentaires de 40 animaux, une exposition par jour pendant 120 jours. Sur les descendants, 20 mâles et 20 femelles par groupe : - prises de sang avec anesthésie locale sur animaux vigiles à 5 et 8 mois (durée 3 min par prélèvement) - mesure de la pression artèrielle à 5 et 8 mois sur animaux vigiles (durée totale par stade 30 min) - test de tolérance au glucose pour rechercher le développement d’un éventuel diabète sur animaux vigiles (prise de sang à 6 temps différents, durée quelques secondes car pose d’un cathéter pour une durée de 120 min pour ne pas avoir à réintroduire une aiguille) - mesure de la répartition de la masse maigre, masse grasse et densité osseuse à 7 mois (acquisition d’images sur animaux anesthésiés pendant 15 min) - collecte de sperme à 6, 7 et 8 mois Sur les descendants, 10 mâles et 10 femelles par groupe : Mise à la reproduction des descendants âgés de 9 mois, suivi échographique de la gestation à 4 stades de gestation sur des animaux vigiles, 40 min maximum d’échographie par session, 4 sessions par animal à une semaine d’intervalle.et évaluation des effets sur les ovaires et testicules de la seconde génération.

Impact sur les animaux

- Risques de stress liés à la manipulation pour l’exposition par voie orale ou à la contention pour les prélèvements de sang et les approches physiologiques - Le sevrage peut être une étape délicate chez le lapin car il peut parfois causer un risque de diarrhée - Une douleur peut apparaître au point de prélèvement de sang

Devenir

-Mise à mort des animaux adultes afin de collecter un important volume de sang, ce qui est nécessaire pour mettre les dosages des contaminants et de leurs dérivés -Mise à mort des femelles non gestantes et des femelles après sevrage des descendants. Etape nécessaire pour évaluer les effets des contaminants sur les différents tissus par des approches d’histologie et de biologie moléculaire. -Mise à mort des animaux en fin de gestation : cette étape est nécessaire pour déterminer le poids des organes et conditionner les tissus pour de l’histologie et des approches de biologie moléculaire permettant de caractériser les effets des contaminants et de rechercher déjà à cette étape des signatures prédictives de certaines maladies développées à l’âge adulte. -Mise à mort des descendants à différents stades (4 jours, sevrage, 3 mois, 9 mois) : nécessaire pour suivre le développement des ovaires et des testicules et/ou l’apparition de troubles métaboliques mais aussi corréler des effets physiologiques observés chez l’animal aux données histologiques, aux profils en lipides et aux approches de biologie moléculaire.

Remplacement

Le recours à l’animal est indispensable puisqu'il s'agit d’étudier les effets de l’exposition maternelle aux contaminants sur la vie fœtale et au stade adulte. Il n'est donc pas possible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou une simulation informatique.

Réduction

- Pour étudier la distribution des contaminants dans le sang et les urines, le nombre d’animaux a été défini selon un modèle de distribution des contaminants décrit dans la littérature scientifique et qui permet de limiter le nombre d’animaux à chaque temps de collecte de sang. -,Les animaux adultes seront exposés pendant une période de 90 jours qui inclut la période gestationnelle. Comme les contaminants sont connus pour affecter la fertilité, 40 lapines seront mises en protocole afin d’obtenir 12 lapines gestantes par groupe et 96 animaux dans le groupe témoin et 96 animaux dans le groupe exposé au stade fœtal. Ces effectifs ont été déterminés en nous basant sur nos précédents protocoles et publications scientifiques. - Pour le suivi de la descendance après la naissance, sur les 96 descendants attendus par groupe et de manière à prendre en compte les effets sexe et à avoir des résultats scientifiques robustes : 5 mâles et 5 femelles/groupe seront mise à mort à 4 jours afin d’évaluer les effets sur le développement des ovaires et des testicules ; 10 mâles et 10 femelles/groupe seront euthanasiés au sevrage et à 3 mois afin d’évaluer les effets sur le développement des ovaires et des testicules. Ces effectifs ont été calculés afin d’obtenir des résultats robustes en histologie et en biologie moléculaire. - Pour l’étude de la fréquence cardiaque, la pression sanguine, la composition corporelle (masse maigre, masse grasse et densité osseuse), la qualité du sperme et la recherche d’un diabète, 20 mâles et 20 femelles/groupe seront suivis afin d’obtenir des résultats robustes prenant en compte le sexe. Parmi ces animaux, 10 mâles et 10 femelles/groupe seront euthanasiés à 9 mois pour une exploration de la fonction hépatique et gonadique. -, Pour calculer le taux de reproduction, 10 mâles et 10 femelles/groupe issus de lapines exposées ou non aux contaminants pendant la gestation et la lactation seront mis à la reproduction, il s’agit d’un nombre nécessaire et suffisant pour évaluer ce paramètre. - Tous les tissus maternels et de la descendance seront collectés et stockés afin de pouvoir être utilisés dans le projet lui-même mais aussi ultérieurement dans d’autres projets collaboratifs.

Raffinement

- Les cages d’hébergement des animaux seront enrichies avec une chaînette, des mobiles suspendus, une plateforme et des blocs à ronger composés de foin compressé. De plus, pour le confort de l’animal, les cages disposent de repose-pattes. Les animaux seront en cage individuelle mais les cages sont positionnées les unes à côté des autres ce qui permet aux animaux d’être en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Au moment de la reproduction et de l’élevage, les salles d’hébergement disposent de blocs de phéromones maternelles qui diminuent les sources de stress et apaisent les animaux. - L'état de santé des animaux sera surveillé tous les jours et tout au long de l'expérience, incluant le niveau d’activité, le comportement, la posture au repos, l’apparence (pelage), l’alimentation, les mouvements à la sollicitation. Si un animal présentait une altération de ces critères alors une évaluation de la douleur serait réalisée avec la grille dédiée à l’établissement d’un score. Selon le score, une analgésie serait mise en place. Si la douleur persistait, après concertation avec le vétérinaire, l’euthanasie pourrait être envisagée. - Une phase d’habituation à la manipulation, à l’exposition par voie orale et à la contention sera mise en place 4 semaines avant l’entrée en protocole des animaux. - Avant la mise à mort, les lapines gestantes seront pré-médiquées avec un analgésique de type morphinique qui traverse la barrière placentaire et qui assurera l’analgésie de la mère et des fœtus.

Choix des espèces

Pour ce projet, l’espèce lapin a été choisie pour plusieurs raisons : i/ son type de placentation est plus proche de celle de l’humain que celle des rongeurs ii/ sa taille permet de réaliser un suivi de la gestation en utilisant des appareils d’échographie utilisés en clinique humaine iii/ il n’est pas nécessaire d’anesthésier les lapines pour réaliser les échographies iv/ cette espèce est pertinente pour étudier la toxicité sur le développement du fœtus et offre la possibilité d'évaluer les effets à long terme v/ le lapin est une espèce plus appropriée pour suivre la distribution des contaminants car, chez le lapin comme chez l’humain, l'élimination urinaire prédomine vi/ cette espèce est pertinente car la production d’hormones par les ovaires et testicules pendant la vie fœtale est similaire à celle de l'homme. Stades de développement choisi : - Animaux adultes : nécessaire à l’étude de la distribution des contaminants dans le sang et les urines mais également à l’exposition des femelles pour évaluer les effets sur la santé des descendants aux stades de développement décrits ci-dessous - Stade fœtal (28 jours de gestation) : nécessaire pour étudier les effets des contaminants sur la croissance et le développement fœto-placentaire, les paramètres biochimiques, la biologie moléculaire de différents tissus, dont le placenta, ceci afin de relier la santé des fœtus à la santé à l’âge adulte. - Stade de la naissance au sevrage et à l’âge de 3 mois : nécessaire à l’étude des effets de l’exposition sur le développement de l’ovaire et du testicule. - De l’âge de 5 à 9 mois : nécessaire pour évaluer si l’exposition des mères aux contaminants alimentaires au cours de la gestation et de la lactation altère la santé de la descendance et augmente le risque de troubles cardio-métaboliques (augmentation du risque d’obésité, de diabète, de maladies cardiovasculaires, composition corporelle) et de la fertilité.