Procédures légères

2 400 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sous anesthésie, elles reçoivent des facteurs de coagulation par le nez ou par un patch collé sur la langue, puis subissent un prélèvement sanguin terminal ou une section de la queue pour mesurer le temps de saignement, sans être réveillées. Le porteur indique que leur maladie prédispose à des hémorragies parfois mortelles en cas de bagarre, d'où une surveillance quotidienne, week-ends compris. Il affirme que la souris hémophile est, après le chien, le seul modèle permettant de mesurer l'activité de ces médicaments et que son statut hémophile est "indispensable".

Objectifs

L’hémophilie est une maladie hémorragique grave caractérisée par un déficit en agents de la coagulation, appelés facteurs de coagulation, sans lesquels la coagulation (formation du caillot de sang permettant de tarir l’hémorragie lors d’un traumatisme) est impossible. Un déficit en facteur numéro VIII aboutit à l’hémophilie de type A et un déficit en facteur numéro IX aboutit à l’hémophilie de type B. Le traitement actuel de cette maladie, qui consiste en l’administration régulière au long cours des facteurs de coagulation par voie intraveineuse, est efficace pour prévenir ou traiter l’apparition d’un saignement mais altèrent fortement la qualité de vie des patients. Le développement de voies d’administration, autres qu’intraveineuse, pour le traitement de l’hémophilie, permettrait donc d’améliorer la qualité de vie des patients. En pratique courante, il existe des médicaments qui peuvent être administrés au travers des muqueuses de la bouche ou du nez. Le nez a déjà montré son efficacité pour le passage de médicaments et de vaccins en dehors de l’hémophilie. La bouche présente elle l’avantage d’éviter le tube digestif (pas de dégradation du médicament, ni de réaction de défense de l’organisme) et d’avoir une muqueuse très fine facilitant la traversée des médicaments. Parmi les éléments impliqués dans la biodisponibilité muqueuse, un récepteur semble jouer un rôle majeur dans la capture des médicaments, qui s’appelle le FcRn. Ce récepteur joue ainsi un rôle de transporteur permettant le passage d’actifs à travers la barrière muqueuse. L’objectif de ce projet est ainsi de comparer deux voies d’administration muqueuses (voie nasale et voie buccale) de facteurs anti-hémophiliques dans un modèle de souris (souris sauvages ou modifiés génétiquement). Ce modèle permettra d’identifier les paramètres d’efficacité et de toxicité associé à ces deux nouvelles voies d’administrations non invasives. Cinq médicaments seront testés : les facteurs VIII et IX non modifiés, 2 dérivés du facteur IX et 1 dérivé du facteur VIII, modifiés pour améliorer leur disponibilité dans le sang leur liaison au récepteur FcRn. Après chaque traitement, des études de coagulation seront effectuées, nécessitant 2400 souris sur une durée de 5 ans afin d’atteindre une puissance statistique nécessaire à l’interprétation des données.

Bénéfices attendus

Le développement de voies d’administration non invasives pour les facteurs anti-hémophiliques pour le traitement de l’hémophilie A et B seraient bénéfiques pour les patients : - Améliorer l’adhésion au traitement - Améliorer l’observance (la prise régulière des médicaments à visée préventive) - Améliorer la qualité de vie en réduisant les contraintes liées aux injections répétées - Eviter des réactions de défenses de l’organisme en évitant le tube digestif (comprimé) et la circulation sanguine (administration par voie intraveineuse)

Procédures

Pour la procédure 1, seulement un poiçon d'oreille sera réalisée pour pouvoir bien contrôler la qualité génétique de la lignée, Ce geste de quelques secondes sera réalisée par un zootechnicien entrainé et une légère compression (quelques secondes) sera réalisée si besoin. Pour les procédures 2 à 5, l’administration des médicaments se fera sur des animaux anesthésiés pour pouvoir évaluer l’efficacité de deux nouvelles voies d’administrations au travers de la muqueuse, la voie nasale (gouttes nasales) et la voie buccale (application d’un patch). Le patch, composé de sucres et des facteurs de coagulation, mesure 6mmx2mm et est placé sur la face ventrale de la langue. Il est mucoadhésif, biocompatible et se dégrade dans la salive en environ 20 min. Seulement une voie d’administration sera testée pour chaque souris. Il s’agit d’un inconfort de niveau léger et de très courte durée (temps d’administration inférieur à 1min dans les 2 cas (nasale et buccale) et prélèvement au maximum 24 heures après l’administration). De plus, cette administration sera exécutée après une anesthésie générale gazeuse. Il y aura 2 tests d’efficacités, un prélèvement sanguin et une section de la queue pour observer la coagulation, un seul réalisé pour chaque souris. Dans les deux cas, les gestes seront réalisés sous anesthésie générale et suivi d’une mise à mort alors que la souris sera toujours sous anesthésie générale. Ces tests seront réalisés au maximum 24 heures après l’administration nasale ou buccale. Durant le projet, tout sera mis en œuvre pour répondre au mieux aux critères de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).

Impact sur les animaux

Un inconfort léger après administration nasale ou buccale est attendu pour une durée de quelques minutes. Puis les animaux seront tous mis à mort au maximum dans les 24h après l'administration des facteurs de la coagulation pour prélever le sang et pouvoir doser les facteurs de coagulation qui sont passés de la muqueuse à la circulation sanguine. Concernant le test de coagulation par section de la queue, il sera intégralement réalisé sous anesthésie générale avec mise à mort en fin d’expérimentation donc aucun effet indésirable n'est attendu. En raison du phénotype dommageable (l’hémophilie prédispose à des saignements), même si ces souris présentent très peu de signes cliniques tels qu’observés chez l’homme (hémorragies internes spontanées), en cas d’agressivité et de combats dans la cage, une hémorragie peut survenir et elle peut être mortelle. Une surveillance quotidienne de ces lignées est donc prévue (weekends et jours fériés inclus). En cas d’hémorragie, les souris seront mises à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure : - pour la procédure 1 : après 6 mois de reproduction les souris seront mise à mort pour le remplacement des géniteurs. - pour les procédures 2 et 3 : le prélèvement sanguin est terminal car un important volume de plasma (partie du sang contenant les facteurs de coagulation) est nécessaire. Les souris seront mises à mort en fin de prélèvement alors qu’elles sont encore sous anesthésie générale. - pour les procédures 4 et 5 : l’efficacité clinique des facteurs anti hémophiliques, c’est-à-dire leur capacité à arrêter un saignement, ne peut se démontrer qu’à l’aide d’un test de coagulation réalisé en conditions réelles de blessures. Ce test de référence est la section d’un petit morceau de queue et une observation du temps de saignement (au maximum pendant 10minutes) chez une souris sous anesthésie générale. Les souris ne seront pas réveillées à l’issu du test, et elles seront mises à mort. - pour toute les procédures de 1 à 5, si un point limite est atteint, les animaux seront tous mis à mort.

Remplacement

Des analyses préliminaires sur modèle murin sont nécessaires avant de commencer les essais cliniques chez l’homme. Premièrement, des études préliminaires de toxicité de ces médicaments sur les muqueuses ont été effectuées in vitro, mais bien que satisfaisante, la toxicité n’a pas été étudié in vivo et donc le recours à l’homme n’est pas possible. Deuxièmement, le recours à l’animal vivant est justifié car il n’existe pas d’autres modèle permettant l’analyse des effets doses et effets temps après que des médicaments aient été administrés par voie nasale ou buccale. De la même façon, seul un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire est nécessaire pour des études sur la coagulation sanguine (test de saignement). Enfin, des études chez l’homme ne peuvent pas être réalisées car cela mettrait le pronostic vital de patients hémophiles en jeu et le volume sanguin requis serait trop important dans un délai trop court.

Réduction

Dans la procédure 1, le nombre minimal de reproducteurs a été sélectionné. Dans les procédures 2 à 5, le groupe contrôle est commun à l’analyse des facteurs VIII et IX ce qui réduit le nombre d’animaux. Dans les procédures 4 et 5, seulement 2 temps d’analyse seront étudiés car les résultats des procédures 2 et 3 seront utilisés pour réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, des souris mâles et femelles seront utilisées de façon indifférente car aucune différence n’est attendue entre espèces pour les paramètres étudiés. Ainsi, toutes les naissances d’animaux seront concernées par les procédures, sans mise à mort sélective d’un des deux sexes. Ainsi, le principe de réduction du nombre d’animaux est appliqué au sein des 5 procédures.

Raffinement

Pour veiller au bien-être de l’animal, les conditions d’élevage, d’hébergement, des soins et des méthodes utilisées pour chaque étape de l’expérimentation seront optimisées pour minimiser douleurs, souffrance et angoisse, tel que l’enrichissement du milieu (copeau de bois, coton et dôme de cellulose). Un suivi quotidien des animaux sera effectué, cela permettra d’augmenter la surveillance (contrôle à 1h et antalgique dans l’eau de boisson) en cas d’altération du comportement (présence d’une courbure du dos) et d’identifier rapidement si un animal a atteint un des points limites définis ; auquel cas il sera profondément anesthésié puis mis à mort. L’administration par voie buccale ou nasale (inconfort de niveau léger et de très courte durée) sera exécutée sous contention légère après anesthésie gazeuse. Le prélèvement sanguin et le test in vivo de coagulation par section de la queue seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie (anti-douleur).

Choix des espèces

La souris hémophile est la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de la coagulation. En effet, le dosage de l’activité coagulante des facteurs anti-hémophiliques humains ne peut être effectué qu’en l’absence des protéines analogues du modèle. Le statut hémophile est donc indispensable. C’est pourquoi l’utilisation de souris pour cette étude se justifie car uniquement deux modèles d’animaux hémophiles sont disponibles : le chien et la souris. Les deux modèles murins hémophiles (hémophilie A et hémophilie B) servant de base à tout protocole préclinique concernant l’activité coagulante des facteurs sont très bien caractérisées. Ils permettent de mettre en évidence la capacité coagulante des molécules générées après l’administration de molécules thérapeutiques. L’absence des facteurs anti-hémophiliques murins proches de nos facteurs anti-hémophiliques humains est un prérequis pour la mesure de l’activité du produit. En plus d'être un modèle pertinent en hématologie et en immunologie, la souris est un animal de petite taille, facilement manipulable et génétiquement bien caractérisé. Ce protocole sera effectué sur des souris sevrées depuis 3-4 semaines (le sevrage se fait entre 3 et 4 semaines de vie selon la taille des souriceaux). Ces souris (entre 6 et 12 semaines) seront pesées quotidiennement à partir de la 3ème semaine de sevrage pour vérifier qu’elles ont le poids idéal (soit au moins 20-25g), pour recevoir un maximum de 10µl de matériels à tester par voie nasale et un patch de 10mm². En effet, ces jeunes individus présentent des parois vasculaires plus propices à une bonne efficacité des molécules à tester nous permettant de nous rapprocher des conditions chez l’homme. Ainsi, les modèles animaux seront bien représentatifs du profil hémorragique observé dans l’hémophilie. Des individus plus âgés ont un profil de coagulation différent des individus plus jeunes. Les expérimentateurs sont formés aux gestes impliquant un contact avec la souris, et à l'observation des signes cliniques fondamentaux, coagulation inclus.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendues obèses par un régime gras et hébergées seules, elles reçoivent chaque jour un composé par gavage, des pesées, des prélèvements de sang à la queue et un test de tolérance au glucose précédé de plusieurs heures de jeûne. Le porteur précise que l'étude est menée pour le compte d'un "client" en vue d'un dossier d'autorisation de mise sur le marché, et que le diabète sévère et le traitement peuvent entraîner une perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids et le métabolisme.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Dans ce contexte, notre client souhaite évaluer l'effet des nouveaux composés sur les symptômes liés à l'obésité chez les souris obèses (induites par une alimentation enrichie en graisses). Dans ce contexte, notre entreprise mènera, au nom de notre client, une étude in vivo visant à évaluer les effets des composés clients sur la prise alimentaire, le poids corporel et le métabolisme du glucose chez les souris obèses (induites par une alimentation enrichie en graisses). L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement de composés d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment l'obésité. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ces composés induisent une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire chez des souris obèses. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ces composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris soumises à une alimentation enrichie en graisses (HFD; 60% de l'énergie fournie par les lipides).

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - obésité des animaux de part leur phénotype - un hébergement individuel sur toute l'étude - une administration orale quotidienne à partir de D-11 - une pesée quotidienne de D-18 à D-1 - un prélèvement sanguin à la queue à D-3 et D29 - une prise alimentaire et une pesée trois fois par semaine à partir de D1 - une mise à jeûn de 4h - un test oral de tolérance au glucose (OGTT) à D28 [Mise à jeun pendant 8h, Prélèvements sanguins (1 goutte) 30min avant et à 0, 5, 20 et 60min aprés administration du glucose] De plus, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance.

Impact sur les animaux

La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance. D'autre part, des prélèvements sanguins à D-3 et D29, une administration quotidienne per os à partir de D-11, un test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 8h), une mise à jeûn de 4h avant euthanasie sont prévus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), test de tolérance au glucose (glycémie et aire sous la courbe), glycémie à jeun, insulinémie, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas) et les poids des différents organes.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserverons des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos et de matériels de nidification. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Afin d'éviter toute angoisse ou souffrance des animaux, lors de l'euthanasie, les animaux seront préalablement anesthésiés (Procédure 1 : Euthasol en surdose/Procédure 2 : mélange de kétamine/xylazine) avant la dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

478 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, presque toutes tuées à l'issue et quatre gardées pour l'entraînement du personnel. Elles reçoivent une infection grippale, jusqu'à 26 gavages de microorganismes, des prélèvements de sang et de fèces et des séances d'imagerie sous anesthésie, avant le prélèvement des poumons et du tube digestif. Le porteur teste des probiotiques censés réduire les symptômes grippaux et évoque un objectif commercial. Il affirme que les interactions virus-hôte ne peuvent pas être reconstituées en culture cellulaire.

Objectifs

Les virus influenza A sont responsables de milliers d’infections chaque année et constituent de ce fait un problème de santé publique. Le modèle d'infection grippale par le virus influenza que nous utilisons chez la souris reproduit très bien ces mécanismes inflammatoires et son emploi permet d'étudier en détail la réponse immunitaire développée en réponse à l'infection. Dans ce modèle infectieux, le virus grippal induit une pathologie marquée. Ce modèle pathologique permet de tester des stratégies antivirales (drogues, probiotiques, vaccins) en développement afin de valider leurs effets contre ce type de virus. En outre, des virus modifiés permettent le suivi de la réplication virale in vivo grâce à un système d’imagerie intra-vitale. L’imagerie intra-vitale consiste à observer des processus biologiques et à quantifier des signaux lumineux provenant de l’animal vivant sans devoir l’euthanasier, de façon non-invasive. Ce système permet de visualiser in vivo l’importance de la réplication virale la réponse de l’hôte. L'emploi du modèle souris pour étudier les mécanismes pathologiques liés aux virus influenza est extrêmement puissant car il permet de comprendre la dynamique de l'inflammation pulmonaire et de suivre l'afflux de cellules immunitaires au niveau des voies respiratoires. Il permet ainsi de caractériser finement des éléments clés de la réponse de l'hôte qui peuvent être de futures cibles thérapeutiques. Par ailleurs, certaines souches de microorganismes ont été étudiées pour leurs effets positifs sur ces infections virales En effet, il a été démontré que les produits contenant des probiotiques ont un effet immunomodulateur et un effet protecteur contre les infections virales respiratoires chez les souris et l’Homme Plusieurs études, incluant des essais cliniques chez l’homme, démontrent que certains microorganismes peuvent réduire les symptômes pseudo-grippaux (fièvre, écoulement nasal, incidence de la toux et durée de la prescription d'antibiotiques). Ainsi leur emploi comme agents préventifs et thérapeutiques dans les infections respiratoires communes constitue une piste sérieuse pour la réduction de la sévérité de ces infections dans la population générale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus à court terme : Certains microorganismes sont déjà inclus dans des produits destinés à la consommation humaine. Si des effets bénéfiques sont confirmés par ces essais, les microorganismes testés au cours du projet pourraient également être inclus dans des études cliniques humaines ciblant les pathologies grippales. Il pourrait amener à un positionnement nouveau pour ce produit et bénéficier à la population générale en terme de bien-être (réduction de symptômes grippaux). Par ailleurs, des bénéfices en termes de connaissance sur l’interaction hôte-microorganisme, et plus particulièrement l’interaction microbiote intestinal/santé pulmonaire devraient pouvoir être obtenus en cours de projet. Il s’agit pour notre équipe de l’intérêt principal. Par quelle(s) voie(s) les microorganismes utilisés peuvent-ils stimuler les réactions de défense de l’hôte ? Dans cet objectif d’acquisition de connaissances sur le mode d’action de microorganismes et le rôle du microbiote intestinal dans des pathologies respiratoires, nous inclurons également un groupe test avec de l’acetate. L’acetate est un acide gras à chaine courte (AGCC) produit et consommé par le microbiote intestinal. Il peut notamment être consommé par certaines espèces bactériennes pour produire un autre AGCC, le butyrate, doté de propriétés anti-inflammatoires. Dans la littérature, une administration d’acetate à des souris dans un modèle comprenant une infection grippale suivie d’une infection bactérienne a permis d’amoindrir les effets de ces agents pathogènes. Nous voudrions voir si une protection peut être conférée dans le cas d’une infection grippale seule. Cela pourrait orienter les futures sélections de souches bactériennes, en retenant des bactéries capables de produire des quantités importantes d’acetate. A plus long terme : Pour les microorganismes nouveaux, n’étant actuellement pas commercialisés, leur mise à disposition sur le marché sera forcément plus longue mais constituent un objectif également à la fois commercial et de bien-être (réduction de symptômes grippaux).

Procédures

Prélèvement de feces : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 prélèvement = maximum 10 minutes dans un pot transparent, 4 prélèvements prévus pour chaque animal sur la durée de la procédure Gavage : sur animal vigile, 478 animaux concernés, 1 gavage = 5-10 secondes avec insertion d’une sonde de gavage dans l’œsophage et injection de 200µl de liquide, 26 gavages prévus pour chaque animal (1 par jour) Contention pour le gavage, sur animal vigile, 478 animaux concernés, 1 contention = 10 secondes où l’animal est immobilisé par une main de personnel compétent / empêche mouvement pour permettre gavage, 26 contentions prévues pourr chaque animal (1 par jour)? Administration intra-nasale : sur animal anesthésié, 474 animaux concernés, 1 administration = 20 secondes, 1 seule par animal pendant la procédure Anesthésie générale pour administration intra-nasale : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 anesthésie = 1 piqûre en voie intra-péritonéale avec injection de 150µl, 1 seule par animal pendant la procédure Anesthésie gazeuse générale pour imagerie : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 anesthésie = faire respirer du gaz isoflurane dans une boite hermétique jusqu’à endormissement puis déplacement des animaux dans l’imageur, prise de clichés et remise en cage pour réveil, durée totale = 5 minutes, 3 sessions d’imagerie Prélèvement de sang : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 prélèvement = une incision à la veine submandibulaire pour recueillir environ 300µl de sang, durée totale = 30 secondes, 1 seule fois par animal pendant la procédure

Impact sur les animaux

L’aspect dommageable de ce protocole réside dans l’infection virale elle-même. Le virus utilisé génére des symptômes très légers à très sévères, en fonction de la dose utilisée lors de l’infection. Dans le cadre de ce projet, aucune mortalité consécutive à l’infection n’est attendue car nous souhaitons utiliser des doses faibles de virus qui ne génèrent pas de symptômes trop importants. Le suivi quotidien est néanmoins indispensable afin d’effectuer un contrôle des signes cliniques. Les dommages principaux liés à l’infection peuvent se manifester par une perte de poids, une détresse respiratoire (sifflement respiratoire, bronchoconstriction) ou une hypothermie. Des signes cliniques peuvent également être relevés : pelage hérissé, posture voûtée, yeux clos ou mi-clos.

Devenir

A l’exception des animaux destinés à l’entrainement pour la contention et les gavages, les autres animaux subiront un prélèvement d’organes post-mortem (poumons, tractus digestif) incompatible avec une survie.

Remplacement

Les rongeurs sont couramment utilisés pour les études des interactions virus-hôte. De telles expériences ne peuvent être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes. De plus, les paramètres respiratoires : fréquences respiratoires, volumes respiratoires, bronchoconstrictions; ainsi que les paramètres sanguins : pression partielle en oxygène, hypoxie; malgré de gros progrès réalisés dans le développement d'organoïdes respiratoires, ne peuvent encore aujourd'hui être quantifiés que sur l'animal.

Réduction

Comment mentionné dans les objectifs, certains microorganismes sont issus d’un programme de criblage in vitro au préalable. A partir d’une collection contenant plusieurs dizaines de souches de microorganismes, des essais in vitro sont effectués. Ils ont pour but d’identifier des microorganismes potentiellement intéressants. Ainsi seuls des microorganismes les plus prometteurs sont envisagés pour un test in vivo. Alternativement, d’autres microorganismes ont déjà fait preuve d’une efficacité contre une autre pathologie et sont étudiés dans ce projet en repositionnement. Ce sont des candidats avec de bonne chances de succès, également. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Dans notre cas, des données acquises les années précédentes nous ont permis de calculer les tailles de groupes suivants avec des paramètres classiques (risques α=0,05 et 1-β=0,9) : Pour les pertes de poids, nous avons mesuré un écart-type de 5.33 et nous aimerions distinguer des groupes différents par 5% de perte de poids. Les tables indiquent dans ce cas 25 animaux nécessaires. Pour les analyses en plethysmographie, nous avons un écart-type de 0.8 sur l’indicateur PenH et nous aimerions distinguer des groupes différents par 0.6 unités de cet indicateur. Les tables indiquent dans ce cas 38 animaux nécessaires. Nous pensons qu’un compromis de 30 animaux par groupe reste raisonnable : il nous permettra de mettre en évidence des différences de poids et nous donnera de bonnes opportunités de voir une différence en détresse respiratoire également. Nous effectuerons des ANOVA non paramétriques (Kruskal-Wallis) suivies de test de Dunnet. D’autres types de tests pourront également être menés, notamment pour les analyses de microbiotes où des procédures dédiées existent.

Raffinement

Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés et pesés quotidiennement. A partir du moment où la phase infectieuse débute, la température des animaux est également prise chaque jour, et un score clinique individuel est établi. Toutes ces mesures représentent une surveillance accrue nécessaire à cette phase. Par ailleurs, les animaux sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas exposer ces animaux sociaux à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très faible (5-10minutes, environ une fois par semaine) et ne sont pas considérées comme dommageables. Des anesthésies sont prévues lors des phases qui pourraient être stressantes pour l’animal (administrations intra-nasales). L’anesthésie est également requise pour l’imagerie, afin que l’animal ne bouge pas. Nous veillons toujours à ce que les durées d’anesthésie soient limitées au minimum nécessaire (quelques minutes pour l’imagerie, 30 minutes maximum pour l’administration intra nasale). Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à dechiqueter et permettant la création de nids, bâtons à ronger et maisonnettes en carton (sans encre). Le matériel que nous utilisons (sonde rectale pour la prise de température, sonde de gavage) est évidemment adapté à nos animaux. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée (4cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Des points limites sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Enfin, toutes les personnes manipulant les animaux sont formées et compétentes pour ce type d’expérimentation.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence très largement utilisé dans le cadre de l'étude de la réponse développée en réponse aux infections respiratoires virales. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d'un système immunitaire mature.

290 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Ils servent de support à des étudiants qui s'entraînent aux injections intrapéritonéales, intramusculaires, intraveineuses et au gavage sur animaux vigiles, un même rat pouvant être réutilisé entre la formation et l'évaluation, avant d'être tué puis disséqué. Le porteur justifie l'usage du rat par une formation réglementaire à l'expérimentation animale de niveau praticien. Il affirme la "nécessité" de manipuler des animaux vigiles pour maîtriser ces gestes.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la formation réglementaire à l'expérimentation animale (niveau praticien), que nous proposons à des étudiants de Licence Professionnelle ou de Bachelor Universitaire de Technologie. Ce projet consiste à former des étudiants d'un point de vue pratique sur les procédures faiblement invasives chez le rat (procédures régulièrement utilisées en expérimentation animale), puis de contrôler leurs connaissances pratiques afin de valider la formation réglementaire. Ce TP permettra à certains étudiants de pratiquer ces procédures pour la première fois de façon individuelle. Notre expérience nous montre qu'il est préférable dans une formation réglementaire de niveau praticien que les étudiants aient l’occasion de manipuler des animaux vigiles et d'acquir de l’autonomie. Le rat est une des espèces les plus utilisées en expérimentation animale. Dans la formation de la licence professionnelle ou du Bachelor Universitaire de Technologie, les étudiants réalisent un TP sur la souris leur permettant d’acquérir les gestes de base sur cette espèce. Ainsi dans un souci de réduction des animaux utilisés, nous avons fait le choix de n’inclure que des rats dans le TP dédié à notre formation praticien.

Bénéfices attendus

Ce TP permettra une validation pratique de la formation à l’expérimentation animale niveau praticien dispensée dans notre établissement. En effet, la réalisation de ce TP (partie apprentissage et partie évaluation) est incluse dans le dossier de validation de notre formation praticien. Etant donné que cette formation à l'expérimentation animale niveau praticien donne aux étudiants, l'ayant validée, la possibilité de travailler avec des animaux de laboratoire dès leur sortie de formation, il nous semble nécessaire de leur donner des bases pratiques et de les évaluer pour s'assurer qu'ils sont bien capables de travailler avec des animaux dans les meilleures conditions pour le bien-être de ces derniers. En outre, le retour des employeurs sur notre formation praticien est très positif, car ils trouvent que nos étudiants sont rapidement autonomes après une prise de poste et que leur maîtrise des gestes techniques leur permetttent d'assurer un travail respectueux de l'animal.

Procédures

Les animaux seront répartis en 3 lots qui seront soumis à des protocoles différents faisant appel à la réalisation de procédures faiblement invasives : - Lot 1 : une administration intrapéritonéale (IP)/un prélèvement sanguin (TP formation) et une administration intramusculaire (IM) (TP évalutation). Les rats recevront par voie IP du sérum physiologique, un produit neutre. Le prélèvement sanguin par voie intraveineuse (IV) dans la veine de la queue sera réalisé sur animal vigile à l'aide d'un tube de contention adapté à son poids. Le volume prélevé sera faible (

Impact sur les animaux

Les procédures réalisées dans ces TP sont faiblement invasives. Les produits adminsitrés sont neutres (sérum physiologiques, eau distillée). Les administrations de produits se feront sous le strict contrôle de l’équipe enseignante, y compris lors de l’évaluation pratique. Ainsi les seules nuisances attendues pour les animaux seront liées au stress de la manipulation mais, afin de diminuer ce stress, les animaux seront préalablement habitués à la manipulation par l'équipe technique.

Devenir

A la fin des protocoles, les animaux seront mis à mort. Ils seront ensuite réutilisés pour les TP de dissection réalisés en 1ère année dans notre formation.

Remplacement

Afin de valider la formation réglementaire à l'expérimentation animale (niveau praticien), il est nécessaire que les étudiants pratiquent les techniques les plus usuelles et les moins invasives (IM, IP, IV et VO) sur animal vigile pour les maîtriser et ceci en complément des autres supports utilisés (vidéos, démonstrations...).

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été calculé de manière à prendre en compte le degré de stress et/ou de douleur potentiellement occasionné chez l'animal, tout en permettant une bonne formation pratique des étudiants. L'administration par voie orale sera réalisée une fois par rat et par un étudiant, l'injection par voie IP et le prélèvement de sang par voie IV seront réalisés une seule fois par rat et par un étudiant et enfin l'injection IM sera réalisée par 2 étudiants alternativement sur le même rat (une IM par cuisse). Un enseignant réalisera une démonstration de chaque procédure en utilisant 3 rats. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, l'ensemble des rats sera réutilisé pour le contrôle pratique, mais au minimum 4 jours après la formation pratique pour un meilleur confort de l'animal. Au total, 58 rats maximum seront utilisés par an pour 20 étudiants, soit un total de 290 rats pour 5 ans. Ce chiffre sera bien entendu revu à la baisse si le nombre d'inscrits à la formation est inférieur à 20. Enfin, certains animaux pourront provenir d'un précédent protocole classé hors champ, dans lequel les rats femelles auront eu 2 frottis vaginaux, ou d'un TP de pharmacologie dans lequel, les rats mâles et femelles auront reçu une administration IP unique d'une molécule pharmacologique à action rapide (anxiolytique, antidépresseur, véhicule des molécules...), suivi de tests comportementaux simples. Ceci permettra de réduire encore le nombre d'animaux que nous faisons nâitre dans notre établissement pour ce TP formation praticien.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés, par groupe socialement harmonieux, en présence de deux éléments d'enrichissement (tunnel en plastique et bâton de bois à ronger ou noix). Les animaux auront été habitués à la préhension / contention avec le personnel de l’animalerie, afin qu'ils soient moins stressés lors des procédures réalisées par les étudiants. Avant toute intervention sur l'animal, les étudiants auront visionné les différentes procédures à exécuter sur des vidéos et/ou images et également en démonstration par les enseignants. La pratique des étudiants sur l'animal ne sera réalisée que sous contrôle rigoureux des enseignants. Une attention particulière sera portée sur la nécessité de travailler dans le calme afin d'éviter tout stress inutile chez l'animal. De plus, les rats seront récompensés à la fin de chaque manipulation à l'aide d'un aliment appétent sucré (type pop corn, biscuit sec...), ce qui permettra de diminuer leur stress tout en sensibilisant les étudiants à l'importance du renforcement positif. Enfin une même procédure ne sera pas réalisée deux fois sur un même animal. Ainsi lors du contrôle, la procédure effectuée sur chaque rat sera différente de celle réalisée pendant la formation pratique. A noter qu'avant les séances de TP, les étudiants auront suivis plusieurs enseignements théoriques de la formation à l'expérimentation animale et seront donc particulièrement sensibilisés au respect des procédures.

Choix des espèces

Cette formation à l'expérimentation animale (niveau praticien) aura pour spécialisation d'espèces animales : les rongeurs rats et souris. Dans le cadre du programme de la Licence Professionnelle et du Bachelor Universitaire de Technologie, un TP est réalisé chez la souris, pendant lequel les étudiants réalisent certaines procédures faiblement invasives (IP, SC). Dans la LP et dans le BUT, les étudiants réaliseront également un TP sur le rat, dans lequel ils pourront réaliser une IP et/ou une VO, mais pas de façon systématique en individuel. Cet unique TP ne permettant pas de former suffisamment à l'utilisation du rat en expérimentation animale nous avons choisi de conserver notre TP de formation à l'expérimentation animale sur le rat, afin de former nos étudiants à d'autres procédures faiblement invasives (IM, prélèvement sanguin) mais également de consolider leur apprentissage de l'IP et de la VO (procédures les plus utilisées en expérimentation animale). Les animaux seront âgés de 8-12 semaines et pèseront entre 250 et 350 g en fonction du sexe, poids qui permettront une contention aisée pour des étudiants qui se forment à l'expérimentation animale.

36 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, gardées vivantes à l'issue. Elles reçoivent trois à cinq gavages d'antibiotiques et quatre prélèvements sanguins sur 21 jours pour éliminer leur microbiote intestinal, avec un risque de déshydratation et de perte de poids. Le porteur indique qu'après vérification les souris rejoindront un programme de "maintien des compétences" du personnel. Il affirme que l'effet du microbiote sur la production d'anticorps ne peut pas être étudié hors d'un animal vivant.

Objectifs

L'objectif de notre étude est d'identifier l'origine de l'allergie, notre hypothèse est que le microbiote est l’élément déclencheur de la production d'anticorps dits "non protecteurs" qui pourraient jouer un rôle dans certaines pathologies, comme ici, l'allergie. Le but de cette étude est d'éliminer le microbiote grâce à des antibiotiques. Des dosages seront réalisés pour vérifier l'absence d'anticorps spécifiques et la durée de leur absence.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de choisir le meilleur protocole d'élimination du microbiote et de déterminer la durée de l'absence d'anticorps spécifiques. Nous souhaitons grâce à cette étude identifier le bon moment pour effectuer une transplantation du microbiote enrichi en protéines dites "protectrices", cela fera l'objet d'une seconde demande.

Procédures

Les souris vigiles subiront deux types d'intervention dans cette étude de 21 jours : 3 à 5 gavages d'une solution d'antibiotiques et 4 prélèvements sanguins à la veine mandibulaire. Les souris subiront également d'autres procédures non invasives : elles seront pesées 3 fois par semaine et leur niveau d'hydratation (léger pincement de la peau au niveau des omoplates) sera évalué 3 fois par semaine également.

Impact sur les animaux

Il y a risque de déshydratation des souris dans les groupes où les antibiotiques sont dans l'eau de boisson. L'administration d'antibiotiques peut également engendrer une perte de poids chez les souris.

Devenir

A la fin de ce protocole, les souris auront retrouvé un microbiote normal. Après vérification de leur état, ces souris pourront être inclues dans un programme de maintien des compétences du personnel (pas plus de 2 gestes par semaine, maximum 3 répétitions).

Remplacement

Nous souhaitons voir l'impact du microbiote sur la production d'anticorps spécifiques, cela ne peut pas être réalisé hors d'un animal.

Réduction

Le nombre de souris a été déterminé pour être nécessaire et suffisant pour répondre à notre hypothèse. Des groupes de 10 souris seront utiles pour identifier une différence entre les groupes tests, le groupe contrôle sera composé de 6 souris, nombre nécessaire et suffisant pour mettre en évidence une différence avec les groupes tests.

Raffinement

Les gestes effectués sur les souris (gavages et prélèvements sanguins) seront effectués par du personnel entrainé et tout sera mis en oeuvre pour assurer le bien-être des animaux. Les souris seront par groupe de 6 ou 10 dans des cages adaptées et leur bien-être sera évalué tous les jours. La température et l'hygrométrie ambiantes seront également suivies quotidiennement et maintenues respectivement entre 20 et 24°C et entre 35 et 75%. Leur milieu sera enrichi avec des objets en plastique rouge transparent et avec des bâtons de coton pour créer leur nid. Selon la bibliographie, il est possible que les animaux perdent du poids et se déshydratent, surtout dans les groupes où le cocktail d'antibiotiques est mis dans l'eau de boisson. L'eau de boisson devient moins appétente et les souris boivent moins, c'est pourquoi, il est conseillé d'ajouter des arômes de fruits dans l'eau de boisson. Le poids des souris sera vérifié 3 fois par semaine. En cas de perte de poids supérieure à 15% entre deux mesures, la souris sera sortie de l'étude, remise en cage avec une eau de boisson dépourvue d'antibiotiques. La bonne hydratation des souris sera également vérifiée. Si la souris semble faible, si sa fourrure est terne ou si sa peau met du temps à se remettre en place ou colle lorsqu'on la pince doucement entre les omoplates, la souris sera immédiatement sortie de l’étude. Un pack d’hydrogel sera mis à sa disposition dans une nouvelle cage, lui évitant ainsi l'effort d'aller boire au biberon qui se trouve en hauteur. Son poids sera suivi 3 fois par semaine et si son état ne s'améliore pas la souris sera mise à mort. Si son état s'améliore, la souris ne sera pas réintroduite dans cette étude mais pourra servir au maintien des compétences de notre personnel (programme détaillé en paragraphe 4.2.1).

Choix des espèces

Souris femelles adultes, agées de 6 semaines

336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Adolescentes, elles sont exposées à des solutions sucrées puis soumises à des tests comportementaux censés révéler des profils dépressifs ou anxieux, certaines subissant en amont une chirurgie cérébrale pour stimuler ou inhiber des structures du cerveau, avant le prélèvement du cerveau. Le porteur décrit ces tests comme sans douleur mais ne précise pas lesquels. Il affirme qu'un syndrome dépressif ne peut pas être modélisé in vitro.

Objectifs

Nos sociétés abondantes en aliments très palatables, car riches en sucre et en graisse, favorisent la prévalence de mauvaises habitudes alimentaires dès l’enfance ou l’adolescence. Ces comportements précoces peuvent affecter durablement les choix alimentaires adultes. Il a été montré que l’adolescence est une fenêtre critique de vulnérabilité au cours du développement cérébral, caractérisée par des comportements spécifiques et une sensibilité accrue aux récompenses. Des données chez le rat indiquent qu’une surconsommation de sucre pendant l’adolescence altère durablement la sensibilité et la motivation à consommer des aliments palatables (dont la qualité gustative et la texture sont agréables au palais) à l’âge adulte, et fait émerger un profil comportemental spécifique rappelant la dépression, pouvant être reversé par un antidépresseur. De même, il a été mis en évidence qu'une alimentation hautement palatable à l'adolescence pouvait altérer la maturation des circuits cérébraux du plaisir alimentaire, encore en cours de développement, modifiant ainsi durablement l’impact hédonique des aliments et impactant le comportement alimentaire à l'âge adulte. Des processus neurobiologiques affectant la perception sensorielle plaisante ou non des aliments ont ainsi pu être mis en évidence et il apparaît qu'une modification du plaisir alimentaire et de la sensibilité des systèmes de récompense pourrait être l’un des déterminants clés des dérèglements du comportement alimentaire. Ce projet consiste à vérifier chez la souris des données obtenues chez le rat afin de pouvoir aborder les substrats neurobiologiques de façon beaucoup plus précises. En effet, l'existence chez la souris (et non chez le rat) de lignées de souris génétiquement modifiées rend possible l'activation de sous-population de neurones SPECIFIQUES dans des structures SPECIFIQUES. Ces données pourront nous permettre de comprendre en quoi l’adolescence est une fenêtre critique de vulnérabilité des effets à long terme de la surconsommation de récompenses sur le fonctionnement cérébral, et par là-même sur les désordres comportementaux. Ces données seront particulièrement pertinentes au regard des épidémies d'obésité et de dépression des sociétés modernes où le sucre est largement surconsommé par les populations jeunes.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à tester l’hypothèse selon laquelle une expérience précoce avec des aliments hautement palatables altérerait la maturation des circuits cérébraux du plaisir alimentaire encore en cours de développement et modifierait durablement l’impact hédonique des aliments. La souris est un modèle permettant d'obtenir facilement des animaux génétiquement modifiés, facilitant ainsi l'étude et l'implication de certains processus neuronaux. Si ce modèle permet de retrouver des résultats comportementaux similaires à ceux obtenus chez le rat , nous pourrons alors utiliser des souris modifiées génétiquement afin de tester l'implication du système de récompense via une approche neurobiologique. Plus précisemment nous étudierons les processus impliqués dans le système de récompense par l'utilisation d'outils viraux permettant l'activation ou l'inactivation de certaines voies neuronales d'intérêt.

Procédures

Les animaux seront exposés à des solutions sucrées durant leur adolescence (pour une durée allant de 2 à 8 semaines) avant de suivre divers tests comportementaux permettant de caractériser l'apparition de phénotypes dépressifs ou anxieux, tels que retrouvés chez l'homme. La durée des tests varie entre 5 et 30 min par jour, certains n'étant réalisé qu'une seule et unique fois. Pour certains tests, une procédure chirurgicale, n'excédant pas 1h,devra être mise en place en amont afin de pouvoir stimuler ou inhiber des structures cérébrales spécifiques, impliquées dans le traitement des récompenses.

Impact sur les animaux

L'exposition aux solutions sucrées et les différents tests comportementaux sont sans douleur sur l'animal et n'engendre pas de nuisances ou d'effets néfastes. Les procédures chirurgicales peuvent être source de douleurs post-opératoires pour lesquels des traitements anatalgiques et un suivi post-opératoire sont mis en place.

Devenir

A la fin des expérimentations tous les animaux seront euthanasiés et perfusés afin de pouvoir effectuer des mesures histologiques sur cerveaux.

Remplacement

Il n'est pas possible de modéliser ou d'utiliser des modèles in vitro permettant de reproduire certaines pathologies humaines. Les nombreuses similitudes entre les humains et les animaux en termes de développement, de symptomatologie comportementale ainsi que certaines caractéristiques neuronales et hormonales permettent de justifier l’utilisation du modèle animal rongeur comme outil dans de nombreuses études. En effet, il est impossible de modéliser ces pathologies et ces caractéristiques, et par là-même d’étudier un syndrôme dépressif, chez un modèle in vitro. Le modèle animal, et plus particulièrement le modèle rongeur, est pour cela le modèle le plus adapté.

Réduction

Afin d'obtenir des résultats statistiquement fiable, et réduire au maximum le nombre d'animaux nécessaires, nous avons pu déterminer selon notre expérience qu'un effectif de 16 animaux par groupes (16 animaux contrôle, 16 animaux exposés au sucrose) est nécessaire pour la partie comportementale et pour nos analyses statistiques (le plus couramment ANOVAs à 1, 2 ou 3 facteurs) afin de s'abstenir de la variabilité interindividuelle. Un effectif de 20 animaux par groupe est nécessaire pour la partie neurobiologique afin de tenir compte du pourcentage d'animaux pour lesquels les injections intracérébrales ne seraient pas correctes.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cages collectives (2 souris par cage) dans un milieu enrichi (carrés de cellulose et papier ouaté) et dans des conditions optimales de température et d'humidité. La surveillance des animaux est réalisée de façon quotidienne. Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable de projet qui décident de la conduite à tenir en fonction de points limites strictes. Des mesures compensatoires sont mises en oeuvre en amont afin de palier à tout problème de santé éventuel. En cas de non amélioration de l'état général de l'animal, le reponsable du projet sera averti et prendra la décision si nécessaire d'euthanasie de l'animal, ceci dans les délais les plus brefs.

Choix des espèces

Notre projet de recherche implique une expérimentation chez la souris génétiquement modifiée qui constitue pour les neurobiologistes un support indispensable à l'étude de l'organisation et du fonctionnement du système nerveux central en situation normale mais également, et surtout, en situations expérimentales ou pathologiques. L'ensemble de nos travaux considère l'animal in vivo, et met à profit différents protocoles comportementaux développés et codifiés depuis de nombreuses années chez ces espèces, et irréalisables matériellement et/ou scientifiquement sur d'autres espèces. L'organisation du cerveau de souris est proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus dans ces conditions permettent de proposer des hypothèses de fonctionnement du cerveau humain dans le cadre de surconsommation de récompenses. Les animaux débuteront les expérimentations à l'âge de 26 jours, ce qui correspond à l'entrée dans la phase d'adolescence

24 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, la plupart tués à l'issue et deux gardés vivants s'ils perdent leur implant. Chaque animal subit une demi-journée de chirurgie pour poser un dispositif intestinal abritant des probiotiques, puis des prélèvements sanguins répétés jusqu'à 168 ml par cinétique sur deux mois de régime gras. Le porteur vise à terme une application chez l'humain contre le diabète de type II et l'obésité, mais l'objectif immédiat reste d'évaluer la tolérance du dispositif. Sur le remplacement, il affirme que la biodisponibilité des nutriments ne peut pas être reproduite in vitro et retient le mini-porc pour son système digestif proche de celui de l'humain.

Objectifs

Le dispositif "Symbiote" testé dans le projet pourrait avoir de nombreuses applications chez l’Homme, en particulier une contribution à la prise en charge du diabète de type II et des obésités : dans ces situations, il est admis que l’élimination d’un pourcentage significatif de la ration calorique présente un intérêt médical. De nombreuses approches thérapeutiques (inhibiteurs de l’alpha-Glucosidase pour diminuer l’absorption des sucres, médicaments diminuant le seuil de réabsorption du glucose, pour éliminer une partie du glucose sanguin dans l’urine) ont été proposées pour cela. Malgré leur intérêt thérapeutique, leurs indications sont limitées par leurs effets secondaires non négligeables. Notre dispositif "Symbiote" pourrait représenter une alternative à ces méthodes. En effet, les bactéries abritées dans le « réacteur » pourront représenter une masse biologique significative, consommant pour leur propre compte des nutriments qui auraient normalement été absorbés (d’autant que le « réacteur » est positionné dans une zone de l’intestin où la concentration en bactéries est relativement faible). Les bactéries seront choisies ou bien parce qu’elles sont déjà naturellement présentes dans l’organisme (par exemple divers types de Lactobacillus normalement présents dans l’organisme, dont Lactobacillus salivarius), ou bien parce qu’elles ont démontré un potentiel probiotique intéressant (E. Coli Nissle, par exemple, qui présentent le double intérêt d’avoir démontré un intérêt anti-inflammatoire et d’être relativement facilement accessible au génie génétique, ce qui permettra dans le futur d’envisager d’utiliser ces bactéries pour produire des molécules d’intérêt, par exemple des vitamines). Avant d’envisager une étude chez l’homme, l’objectif de cette étude pré-clinique sur du long terme chez le mini-porc est d’évaluer les effets du dispositif implanté sur la physiologie digestive de l’hôte, et sur son potentiel d’action dans le contrôle du métabolisme dans des situations de perte d’homéostasie (obésité et diabète de type II, mais potentiellement à terme également les pathologies liées à un dysfonctionnement du microbiote). L’ensemble des dispositions prises dans ce projet répond aux principes fondamentaux des 3Rs (réduction, raffinement, remplacement) dans le cadre de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont la contribution au traitement des pathologies induites par un microbiote inadapté : de nombreuses études ont mis en évidence le lien entre microbiote et diverses pathologies (dont obésité, certains cancers, etc). Les études cliniques qui deviendront possibles après cette expérimentation animale permettront d’explorer ce qui pourrait être une méthode originale de modulation du microbiote intestinal. Un tel dispositif a toute ces chances pour être bien toléré chez l’homme, car dans de nombreuses situations cliniques des sondes duodéno-jéjunales sont installées, et l’expérience montre qu’elles sont très bien tolérées.

Procédures

Des prélèvements de sang seront réalisés à 0, 15 et 60 jours après la mise en régime des animaux. Pour chacune des journées de prélèvements, 8 ml de sang seront prélevés sur chaque cathéter selon la cinétique suivante -0.5, 0, 0.5, 1, 2, 5 et 7h après le repas. Ce qui représente un volume total de 168 ml par cinétique (8 mL x 3 cathéters x 7 temps), ce qui est acceptable pour des animaux de plus de 25 kg. Des prélèvements de sang artériels seront effectués tous les 15 jours sur tous les animaux. Ces prélèvements uniquement sur du sang artériel seront réalisés à jeun pour permettre un suivi du statut physiologique des animaux pendant toute la durée de l’expérimentation. Chaque animal subira une demi-journée d’intervention chirurgicale. Les prélèvements de sang réalisés à J0, J15 et J60 après la mise en régime des animaux, s’effectueront pour chaque animal sur 3 demi- journée de cinétique de prélèvement de sang, cumulé sur 60 jours.

Impact sur les animaux

La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Elle peut se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Les critères d’arrêt concernent essentiellement la période de récupération post-opératoire. Si l’alimentation et le transit digestif ne sont pas normalisés au bout de 10 jours, malgré les soins apportés pour soulager la douleur à l'aide d'un analgésique et stimuler la motricité intestinale et/ou si une perte de poids supérieure à 20% du poids avant l’apparition des premiers signes cliniques d’altération de l’état physiologique est observée, Les animaliers et les responsables de l’étude effectueront une observation plus poussée de l’animal et renseigneront le tableau d’observation des points limites. Si 3 points limites notables ou 1 point limite grave sont observés, nous discusterons avec le personnel de l’animalerie, afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié.

Devenir

Les animaux de la procédure 1 seront mis à mort à la fin de la période expérimentale après 2 mois d’un régime HF-HF, sauf si le point limite est atteint avant. Les animaux expérimentaux sont mis à mort en fin d’expérience pour : 1) vérifier le bon positionnement des cathéters sanguins et du tænia artificiel 2) réaliser des prélèvements tissulaires pour des études métaboliques. Tous les animaux de la procédure 2 seront mis à mort pour vérifier le positionnement et l’état de l’ancrage du dispositif implanté. Dans le cas ou l’animal perde son dispositif et qu’il se retrouve dans les fèces, celui-ci sera gardé en vie et pourra être réutilisé à des fins pédagogiques au sein de la structure.

Remplacement

La biodisponibilité des nutriments fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro. Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études biomédicales. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments.

Réduction

L'effectif prévu dans le schéma expérimental de la phase 1 est réduit au minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré, estimée à partir de nos précédentes études sur la biodisponibilité des nutriments réalisées avec un design expérimental similaire. Après analyse de la fonction de répartition de la loi de Chi2, un nombre minimal de 6 animaux/lot est nécessaire pour obtenir une différence significative à 5% entre les lots sur le critère principal (biodisponibilité du fructose). 2 mini-porcs supplémentaires sont également prévus pour faire face aux aléas (mauvaise récupération chirurgicale des mini-porcs, perte précoce de perméabilité des cathéters, ...). Ils seront alloués aux différents groupes (si c’est le cas) en fonction des besoins. L’effectif prévu pour la phase 2 est le minimum requis pour un test de faisabilité d’implantation et de pérennité de l’ancrage du dispositif dans l’intestin par la voie endoscopique. 14 animaux seront utilisés pour la première phase du projet (procédure 1). Ils seront distribués en 2 lots : un lot témoin (dispositif implanté sans probiotique) et un lot expérimental (dispositif implanté avec probiotique greffé). 10 animaux seront utilisés pour la phase 2 du projet pour tester la fiabilité de la technique d’ancrage du dispositif par endoscopie. (procédure 2). L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Les animaux recevront pendant 6 jours un traitement analgésique et spamolytique, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle.

Raffinement

La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Elle peut se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Les critères d’arrêt concernent essentiellement la période de récupération post-opératoire. Si l’alimentation et le transit digestif ne sont pas normalisés au bout de 10 jours, malgré les soins apportés pour soulager la douleur et stimuler la motricité intestinale et/ou si une perte de poids supérieure à 20% du poids avant l’apparition des premiers signes cliniques d’altération de l’état physiologique est observée, nous discuterons avec le personnel de l’animalerie, afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié. Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages au sol de taille réglementaire avec des copeaux de bois comme litière leur permettant de réaliser une activité de fouissage, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et intéragir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide d’une chaîne en métal fixée sur les parois et de ballons. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.

Choix des espèces

Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études biomédicales. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments.