Procédures légères

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent deux injections hormonales pour surproduire des ovocytes puis sont euthanasiées après accouplement afin de prélever des embryons datés, tandis que les mâles reproducteurs, maintenus vivants entre les accouplements, sont mis à mort vers quinze à dix-huit mois. Le porteur indique qu'aucun animal n'est réutilisé et étudie la réactivation du chromosome X au cours du développement embryonnaire. Il affirme développer en parallèle des modèles cellulaires in vitro, mais soutient qu'aucun ne remplace aujourd'hui l'étude de l'embryon préimplantatoire chez la souris.

Objectifs

Chez les mammifères, le formation de l'embryon et des gamètes (précurseurs des ovules et spermatozoïdes= nécessite un changement radical d'expression des gènes et de marques épigénétiques dans les cellules. Dans les deux cas, cela implique un profond remodelage épigénétique, à travers des modifications telles que la méthylation de l'ADN et les marques des histones, ainsi que des spécificités en fonction du sexe de l'embryon. En effet, Il est, il existe de profondes disparités entre les sexes en termes de développement mais aussi de maladie et d'occurrence et mortalité des cancers. Pourtant très peu de données existent sur le chromosome X au cours du développement, ainsi que sur les spécificités de la reprogrammation épigénétique en fonction du sexe. Au cours du développement, cette reprogrammation est essentielle à l’obtention de cellules reproductives et à la perpétuation de l’espèce et elle est accompagnée par la réactivation du chromosome X inactif chez les femelles. Ce chromosome inactif représente un paradigme de contrôle épigénétique de l’expression des gènes à l’échelle d’un chromosome entier. Quand et comment a lieu la réactivation du chromosome X ? Quel est son impact sur la lignée germinale ? Une meilleure compréhension du contrôle de l'expression génique au cours de la reprogrammation développementale permettra également de comprendre les aberrations transcriptionnelles observées dans les cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

L'utilisant de nouveaux modèles murins apportera de nouvelles connaissances sur la lignée germinale, le développement pré-implantatoire, les différences entre les sexes et le contrôle épigénétique des gènes. Cela pourra avoir des implications futures en médecine régénérative et de la reproduction, nous permettra d’approfondir nos connaissances sur la transmission épigénétique entre les générations, et ouvrira de nouvelles avenues thérapeutiques pour le traitement des cancers en prenant en compte le sexe des patients. Cela est aujourd'hui considéré comme crucial, et par l'Union Européenne, et par le NIH aux Etats-Unis.

Procédures

Les femelles sont super-ovulées pour produire plus d'ovocytes ce qui nous permettra d'utiliser moins d'animaux. Ces femelles seront stimulées par deux injections d'hormones à 48h d'intervale , en intrapéritonéale. Ces injections sont utilisées en routine dans de nombreuses animaleries et n'entraînent pas d'effets indésirables pour les femelles. L’injection en intrapéritonéale dure en soit quelques secondes, et l’accouplement a lieu courant de la nuit suivant la 2nde injection. Le prélèvement des embryons a lieu entre le matin et le 3e jour après l’accouplement. Au total la stimulation hormonale de la première injection à l’euthanasie de la femelle est de 68 à 120h heures. Nous ne nous attendons pas à des effets secondaires suite à cette injection qui sera pratiquée uniquement par des personnes habilitées et formées et qui est une procédure standard dans l'animalerie. Les mâles reproducteurs resteront seuls dans leur cage, une fois l'accouplement ayant eu lieu, et avant le prochain accouplement. Nous nous assurerons d'une grande quantité d'enrichissement dans les cages pour éviter tout stress lié à l'isolement. Ces mâles seront remis en accouplement très régulièrement (plusieurs fois par mois) ce qui ne donnera pas lieu à des isolements prolongés (< 10 jours). Cet isolement est nécessaire pour éviter les bagarres entre animaux mâles après accouplement.

Impact sur les animaux

Pas d'effet indésirable attendu sur les mâles isolés car ces derniers seront régulièrement mis en accouplement (plusieurs fois par mois), ce qui ne devrait donc pas générer de stress important à l'animal. Les femelles superovulées seront manipulées au minimum, avec seulement deux injections intrapéritonéales nécessaires à 2 jours d'intervalle. Nous ne nous attendons pas à des effets secondaires suite à cette injection qui sera pratiquée uniquement par des personnes habilitées et formées et qui est une procédure standard dans l'animalerie. Si toutefois un animal présentait un stress important, un problème comportemental ou une apparition d'une blessure/tumeur de façon fortuite, nous euthanasierons l'animal dans les plus brefs délais pour éviter toute souffrance animale.

Devenir

Apres superovulation ou accouplement naturel, les femelles gestantes seront euthanasiées pour récupérer les embryons datés. Les mâles reproducteurs seront gardés en vie pour production d’autres embryons datés. Les mâles seront sacrifiés autour de 15-18 mois. Tous les animaux sont euthanasiés en fin de projet, aucun ne pourra être réutilisé.

Remplacement

Notre projet a été élaboré en conformité avec le principe des 3R. Remplacement: Notre travail se base sur des données produites en amont sur des modèles de culture cellulaire. L'inactivation du chromosome X n'existe que chez les mammifères et il n'existe pas de modèle cellulaire adéquat pour l'étude de l'embryon préimplantatoire. Le laboratoire développe actuellement de nouveaux modèles de cellules gamétiques in vitro pour remplacer dans le futur l'utilisation d'animaux. La validation de nos résultats in vitro par cette approche in vivo sur modèles murins nous confortera dans l’utilisation de ce nouveau modèle, pour l’étude du chromosome X.

Réduction

Réduction: En utilisant des technologies de pointe, sur très peu de cellules, voir sur la cellule unique, nous réduisons très fortement le nombre d’embryons nécessaires à nos études. Toutes ces technologies sont d'abord mises en place et testées sur des cellules en culture. Dans le cas d’embryons avant implantation, les femelles seront, au préalable, injectées deux fois avec des hormones (piqure intrapéritonéale) pour leur permettre une plus grande ovulation. Cela minimisera le nombre de femelles nécessaires pour l’obtention du nombre adéquat d’embryons.

Raffinement

Raffinement: nous prenons soin d'effectuer une manipulation minimale des animaux vivants. Nos expériences portent uniquement sur l’accouplement des animaux sauvages ou transgéniques dans le but d’obtenir des embryons datés et l’euthanasie des femelles au moment du prélèvement des embryons. Dans le cas d’embryons avant implantation, les femelles seront également injectées deux fois avec des hormones (piqure intrapéritonéale) à 48 heures d'écart. Nous porterons un soin particulier à l’enrichissement du milieu pour que les souris puissent se créer un nid. Cependant en cas de signes de souffrance et de détresse des animaux, des procédures d’euthanasie seront immédiatement mises en place.

Choix des espèces

L’inactivation du chromosome X est un phénomène conservé et spécifique des femelles de mammifères, impliquant que notre modèle soit la souris. Notre étude ne peut en aucun cas être menée sur d’autres modèles animaux non mammifères. De plus, il est connu que l’inactivation est un processus très dynamique pendant le développement, dépendante du stade gestationnel, de l’état de différentiation et de l’origine cellulaire. Il est donc important d’avoir recours à une étude développementale sur animaux vivants pour comprendre les mécanismes de réactivation. Nous proposons d’étudier l’expression des gènes par transcriptomique, et hybridation des ARN, et les marques épigénétiques, dans l’embryon préimplantatoire de souris entre la fécondation et l'implantation (1ère vague d'inactivation et réactivation du chromosome X) et dans les cellules germinales primordiales, qui sont présentes entre 7 et 13 jours de développement embryonnaire (dpc). Les embryons seront issus de croisements entre souris sauvages et transgéniques pour nous permettre d’isoler des embryons femelles avec une inactivation biaisée du chromosome X et des marqueurs fluorescents des cellules germinales et/ou du chromosome X. Les parents transgéniques ainsi que la descendance ne présentent aucun phénotype dommageable. Les embryons (femelles et mâles en contrôle) seront collectés entre 0.5 et 4.5 et entre 7.5 et 13.5 jours de développement embryonnaire. Les animaux transgéniques nécessaires sont déjà disponibles et nous possédons un grand jeu de données transcriptomiques sur le modèle souris dans le laboratoire.

250 souris et 50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des injections d'agents de contraste au gadolinium ou à l'oxyde de fer sous anesthésie, puis passent des séances d'IRM, non pour étudier une maladie mais pour régler les paramètres et séquences de l'appareil d'imagerie. Le porteur décrit des procédures non invasives et indolores, et prévoit de réutiliser certains animaux entre projets quand c'est possible, les autres étant mis à mort après les acquisitions. Il affirme que le recours aux rongeurs est "inévitable" car l'étude porte sur "l'organisme en entier".

Objectifs

Notre service d’exploration non invasive du petit animal est équipé depuis Juin 2017 d’un imageur par résonance magnétique (IRM) 7T dont le diamètre utile est de 72 mm permettant son utilisation pour les projets de recherche précliniques du petit animal (souris, rat, marmouset). L'IRM est basée sur la mesure des propriétés magnétiques des tissus biologiques, permettant d'obtenir des informations anatomiques, fonctionnelles et métaboliques in vivo et de manière non traumatisante chez le petit animal. Afin de garantir le maintien du statut sanitaire des animaux durant tout le processus expérimental (prise en charge, analyse IRM, renvoi vers les différents sites de zootechnie d'expérimentation), notre service s’est doté d’installations (salle de préparation aménagée, PSM) et d’équipements (cellules de confinements compatibles IRM) spécifiquement développés en partenariat avec un fabricant d’équipements vétérinaires. Il s’agit de la première installation nationale complète permettant le maintien du statut sanitaire des animaux (souris, rat, marmouset) pour l’analyse par IRM. La demande concerne l’autorisation d’utilisation d’animaux pour l’optimisation des paramètres et des méthodes permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle par IRM sur des rongeurs (souris, rats). Ainsi, nous pourrons optimiser des méthodes adaptées à la cardiologie, la vascularisation, la diffusion de molécules d'eau, l'IRM fonctionnelle (cerveau), la mesure de la consommation d’oxygène dans le cerveau et la caractérisation des lipides dans les tissus adipeux par spectroscopie par résonance magnétique. Ces optimisations sont un préalable récurrent pour l’utilisation des nouvelles séquences d’IRM afin d'assurer la reproductibilité et un meilleur compromis sur la qualité de l'image pour les différents projets de recherche dans un environnement confiné, c'est-à-dire réalisées avec nos systèmes de confinement adaptés pour les rongeurs (souris et rats) et la configuration IRM ad hoc (résonateurs, antennes de surface). Les optimisations peuvent aussi inclure le recours à des agents de contraste. Ces agents de contraste, paramagnétiques (gadolinium) ou superparamagnétiques (oxyde de fer), permettent de modifier les temps de relaxation des tissus (foie, muscle, cerveau, cœur, etc.) de manière sélective et ainsi de mieux différencier les tissus sains et malades et les différentes régions anatomo-fonctionnelles.

Bénéfices attendus

L’optimisation de séquences en IRM permettra de réduire le temps que les animaux passent dans l’IRM lors des acquisitions. Ces optimisations permettent aussi de s’assurer de la reproductibilité de nos mesures et de la correcte visualisation des phénomènes physiologiques et physico-chimiques sur les différents modèles animaux qui seront étudiés.

Procédures

Des injections des produits de contraste pourraient être faites par voie intraveineuse ou par intrapéritonéale chez les rongeurs, selon la demande des utilisateurs. Sur des souris ou rats de réforme, on les injectera seulement une fois par projet de faisabilité. Pour des animaux commandés à des fournisseurs externes, le nombre d'injections par semaine sera maximum de 3 (une seule injection pourra être faite par jour). Il est important de mentionner que ces injections n'entrainent aucune douleur ou stress chez les animaux car elles sont faites sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Il s’agit des procédures non invasives, sans douleur et sous anesthésie.

Devenir

Pour les animaux de réforme la mise à mort est réalisée après la séance d'IRM. Pour les animaux des fournisseurs "externes", à la fin des acquisitions IRM, les animaux sont remis dans leur cage de vie et monitorés régulièrement jusqu'au réveil. Toutefois, ces animaux des fournisseurs externes seront sacrifiés à la fin du projet de faisabilité méthodologique.

Remplacement

L’utilisation des rongeurs est inévitable car nous travaillons sur des mécanismes intégratifs et donc sur l’organisme en entier.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé de façon à permettre une validation statistique des résultats expérimentaux préliminaires, tout en tenant compte des exigences de réduction. Nous réutiliserons les animaux disponibles pour différents projets de recherche quand cela sera possible et selon les demandes des utilisateurs.

Raffinement

Les animaux sont surveillés quotidiennement et une procédure d’estimation et de suppression de la douleur est mise en place. Le point limite est fixé à 20% de perte du poids corporel (chez les adultes) avec repérage des signes de mal-être définis au préalable par notre vétérinaire référent. Les animaux provenant des fournisseurs externes auront une période d'acclimatation de 2 semaines au nouvel environnement avant de chaque procédure expérimentale à l'IRM.

Choix des espèces

Comme nous avons indiqué dans le point 3.4.11, nous n'utiliserons que des animaux âgés de plus de 10 semaines dans ce projet. La plupart des utilisateurs de notre service d’imagerie font leurs études sur des animaux âgés de plus de 10 semaines, basés sur la littérature scientifique et le modèle étudié. Du point de vue de l’IRM, l’âge des animaux n’a pas d’impact sur la qualité de l’image. Cependant, nous utilisons des animaux du même âge et taille pour mieux interpréter les données anatomo-fonctionnelles obtenues.

342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent trois injections d'immunisation puis des prélèvements de sang et de salive sous anesthésie, pour identifier un candidat vaccin contre les coxsackievirus B, soupçonnés de favoriser le diabète de type 1. Le porteur indique que l'infection ne provoque pas de signes cliniques visibles, la souris n'étant pas un hôte naturel de ces virus. Il affirme que cette étape sur l'animal est "indispensable" et ne peut être remplacée in vitro, les mécanismes en jeu n'étant selon lui pas modélisables.

Objectifs

Les infections entérovirales non poliomyélitiques, en particulier les coxsackievirus B (CVB) sont associés à l'initiation et/ou la progression du diabète de type 1. Une augmentation de l'incidence du diabète de type 1 est observée notamment chez les jeunes de moins de 5 ans. Cette maladie auto-immune qui se manifeste par la perte de fonction des cellules pancréatiques productrices d'insuline résulte d'interactions complexes entre une prédisposition génétique, le système immunitaire et des facteurs environnementaux notamment les CVB. Le but du projet est d'élaborer une stratégie vaccinale universelle contre les CVB et des pathologies qui en découlent telles que le diabète de type 1. Cette stratégie consiste d'abord à identifier la voie d'inoculation générant la réponse immunitaire la plus protectrice vis-à-vis des CVB, puis d'étudier le meilleur candidat vaccin parmi les 5 espèces des CVB.

Bénéfices attendus

La finalité du projet est de choisir le candidat vaccin le plus efficace contre les CVB. Le projet s'inscrit dans la lutte contre les entérovirus; sachant que ces virus ont une responsabilité reconnue dans l'apparition du diabète de type 1.

Procédures

Les interventions type inoculation seront réalisées sous anesthésie, de même que les prélèvements des fluides corporels. L'immunisation se fera au nombre de trois injections. Les prélèvements de sang se feront seulement en 2 fois, à J0 et à terme car des études antérieures du laboratoire ont mis en évidence que les prélèvements intermédiaires n'apportaient pas d'informations significatives pouvant justifier ces prélèvements. Les prélèvements de salive se feront au nombre de 3 prélèvements par souris.

Impact sur les animaux

L'infection aux CVB ne provoque pas de signes cliniques notifiés ou visibles, car la souris n'est pas un hôte naturel des entérovirus utilisés dans ce projet. Cependant, le déroulement de ce projet peut entrainer quelques désgréments chez l'animal au niveau des points d'injection (classe légère), mais toutes les précautions sont mises en place pour limiter la souffrance et le stress de l'animal.

Devenir

A la fin du protocole, une mise à mort de tous les animaux sera réalisée pour la récolte des échantillons nécessaires aux expériences.

Remplacement

Cette étude chez l'animal constitue la dernière étape du projet de recherche. Elle est indispensable pour la suite, et ne peut être réalisée par une méthode in vitro, car les mécanismes en jeu dans cette étude n'étant pas modélisables in vitro.

Réduction

Le choix des échantillons utilisés dans cette étude est la résultante de résultats d'études précédentes in vitro qui ont permis une réduction significative du nombre aussi bien de sérotypes (5 sur une centaine des sérotypes d'entérovirus) que de peptides (3 sur une dizaine de peptides possibles) et, par conséquent, le nombre d'animaux utilisables se retrouve significativement réduit. Le nombre d'animaux par groupe est également prévu pour avoir un effectif minimum permettant des bonnes pratiques d'expérimentation et une analyse statistique significative des résultats.

Raffinement

Les conditions d'hébergement seront étroitement surveillées (enrichissement, alimentation). Le protocole établi prend en compte un nombre limité d'inoculations afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. Les prélèvements de fluides se feront sous anesthésie pour éviter une souffrance inutile. De plus, les points limites (comportement agressif, altération de l'état général, diminution de la sociabilité), seront particulièrement surveillés et les animaux sacrifiés dès la constatation de ces signes afin d'abréger leur souffrance. L'évaluation de la souffrance sera effectuée en utilisant comme support la grille de score incluant comme paramètre le poids, l'état du pelage, le comportement interactif, le score grimace chez la souris et la réaction à la manipulation. Par exemple, suite à l'injection il peut y avoir l'apparition d'abcès qui sera évaluée niveau 3. Ces appréciations seront transcrites sous forme de notes de 0 à 3 (0=absence de douleur, 1=douleur légère, 2=douleur modérée, 3=douleur sévère). Le total sera calculé afin d'apprécier l'état général de l'animal en fontion du score total (de 1 à 5 douleur légère, de 6 à 10 douleur modérée, et de 11 à 18 douleur sévère). Ainsi, le point limite à ne pas dépasser est celui correspondant au score total de 11. Les prélèvements de sang se feront seulement en 2 fois, à J0 et à terme car des études antérieures du laboratoire ont mis en évidence que les prélèvements intermédiaires n'apportaient pas d'informations significatives pouvant justifier ces prélèvements.

Choix des espèces

Ce modèle animal représente l'un des rares modèles à être sensibles aux infections à CVB, ces derniers étant des virus humains. Les animaux seront utilisés à un âge entre 3 et 5 semaines. L'utilisation des animaux à un âge relativement précoce se justifie par le fait que la souris a une sensibilité très variable à l'infection par les entérovirus. Cette variation de sensibilité est surtout liée à l'âge de l'animal: la sensibilité à l'infection par les entérovirus est élevée avant l'âge de 6 semaines et baisse au-delà de cet âge.

2 macaques à longue queue vont être utilisés, tous deux tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par voie intraveineuse un mélange de vecteurs viraux puis subissent des prélèvements de sang répétés sur la veine fémorale sous anesthésie, avant une euthanasie quinze jours après l'injection pour prélever leurs organes. Le porteur affirme que l'administration de ces vecteurs n'a pas d'effet délétère notable et surveille la perte de poids jusqu'à un seuil de 20 %. Il juge le recours au macaque "indispensable" au motif que l'efficacité des vecteurs dépend de l'espèce et que les études in vitro ne suffiraient pas.

Objectifs

Les animaux recevront, sous anesthésie, une administration par voie intraveineuse (IV) lente, un mélange de nouveaux vecteurs thérapeutiques et de vecteurs contrôle (dont les propriétés, entre autres leur tropisme, biodistribution, sont connues), puis seront suivis 15±3 jours post-injection. Les candidats les plus performants seront comparés aux contrôles afin d’identifier ceux ayant un tropisme intéressant, permettant ainsi l’utilisation d’une quantité moindre de vecteur afin d’atteindre l’organe cible.

Bénéfices attendus

Les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV) sont largement utilisés pour traiter les maladies monogéniques car ils permettent un transfert de gènes sûr et large dans différents tissus et organes. Cependant, pour traiter certaines maladies, une grande quantité de vecteurs est nécessaire pour obtenir une distribution optimale aux organes ciblés. L'objectif principal ici est d'identifier de nouveaux candidats AAV intéressants pour des tissus/organes spécifiques tels que le cerveau, le muscle, le foie dans un mélange de vecteurs injectés par voie systémique chez des primates non humains (PNH). Le mélange a été conçu sur la base d'études murines et comprend à la fois les candidats à tester et des contrôles. Chez les primates non humains, la biodistribution des vecteurs AAV sera analysée quinze jours après leur administration et les meilleurs candidats seront comparés aux témoins inclus dans le mélange.

Procédures

Projet avec 2 macaques fascicularis comportant différentes étapes : - Plusieurs prélèvements de sang réguliers réalisés sur la veine fémorale en respectant le volume maximum prélevable / animal à raison de 7,5% du volume sanguin total (65ml/kg). Ces actes sont réalisés avec une anesthésie fixe dont la durée ne dépasse pas 15 minutes. On profite de chaque anesthésie pour effectuer un examen clinique complet de l’animal et s’assurer que tout aille bien pour lui. Ces prélèvements sont effectués tout au long du protocole, de D-15 à D+15 - Injection des anticorps neutralisants et du produit thérapeutique (vecteur rAAV) par injection intraveineuse lente. Durée de l’injection et des prélèvements de sang associés sur environ 2 heures. Surveillance constante des paramètres physiologiques de l’animal avec un monitoring adapté. L’animal est réchauffé pendant la durée de l’injection à l’aide d’une couverture chauffante. Pas d’effets secondaires attendus. - Euthanasie de fin de protocole 15 jours après l’injection du produit thérapeutique : La fin de l’étude nécessite de récupérer des prélèvements d’organes post-mortem qui vont permettre la réalisation de nombreuses analyses pour la biodistribution, l’immuno-histologie et l’histopathologie. L’animal sera analgésié et anesthésié de façon profonde. Un accès veineux via un cathéter sera posé et permettra l’injection d’un produit barbiturique. La mort de l’animal sera constatée par un vétérinaire compétent.

Impact sur les animaux

Injection systémique (intraveineuse) du mélange rAAVs / Contrôles ; d’IdeS et Antihistaminique en cas de design expérimentale n°2 ; et prises de sang : L’administration intraveineuse de vecteurs AAV chez le macaque n’a pas d’effet délétère notable sur l’état de santé général de l’animal (études menées par plusieurs équipes de recherche). L’aspect et le comportement général des animaux seront observés de façon biquotidienne par les animaliers. L’appétit, la consommation hydrique, la prise de poids et l'absence de douleur chez l’animal, constitueront les principaux éléments surveillés. Une surveillance rapprochée des zones d’injection/ de ponction sera mis en place dans les jours qui suivent les actes. Le protocole pourra être néanmoins arrêté de manière prématurée si : - l’animal ne parvient pas à se nourrir. - symptômes laissant penser à l’existence de douleurs chroniques et persistantes malgré des soins vétérinaires adaptés - l’animal présente une infection virale et/ou bactérienne qui affecte son état de santé général et provoque une perte de poids significative (de l'ordre de 20% du poids de référence). Les animaux seront pesés à chaque anesthésie. En dehors de ces timepoints, au moindre signe anormal lors de la surveillance biquotidienne, les animaliers en réfèreront au vétérinaire. Afin de suivre efficacement l'état de santé des animaux et mettre en place une action en cas de trouble (approche ou d’atteinte d’un point limite) une grille de score sera mise à disposition des animaliers

Devenir

Cette étude avec 2 macaques fascicularis nécessite une euthanasie de fin de protocole pour permettre de prélever de façon post-mortem des prélèvements d'organes afin de réaliser des analyses pour la mesurer la biodistribution, effectuer des analyses immuno-histologiques et d'histopathologie. L'ensemble des prélèvements permettra d'affiner les connaissances sur les produits thérapeutiques administrés et envisager des études cliniques chez l'homme.

Remplacement

Remplacer : les études réalisées chez le singe apportent les meilleures connaissances transposables à l’homme en termes de toxicité, d’efficacité et d’immunogénicité de l’AAV. La complexité des réactions en jeu ne permet pas le recours à des méthodes substitutives, telles que les études in vitro isolées et justifie notre recours à des animaux.

Réduction

Au cours de cette étude chez le primate, le nombre d'animaux (n=2) utilisé est réduit à son minimum tout en assurant une exploitation possible des résultats afin de répondre à la question principale, à savoir, quel tropisme pour chacun des vecteurs administrés. En effet, les différents AAVs d’intérêt ainsi que les vecteurs contrôles ont été préparés dans une seule solution de façon à injecter un mélange à l’animal. Ce qui évite une injection par AAV et par animal, réduisant ainsi le nombre total de macaques inclus dans le projet. L’injection simultanée d’AAVs dans un mélange est possible car un système de vecteurs à « code-barre » a été développé de façon à les discriminer lors des analyses moléculaires. Des études préliminaires réalisées chez la souris C57Bl/6 ont permis de démontrer la faisabilité et valider la stratégie consistant à injecter un mixte de vecteurs AAVs à « code_barre ». De plus, le mixte de vecteurs à « codebarre » qui sera utilisé dans cette étude a été préalablement testé et validé chez la souris. Une analyse statistique ne pourra être envisagée que pour les mesures où le nombre d’échantillons permettra d’avoir une puissance statistique suffisante telle que l’analyse des biopsies d’un organe, prélevées à différents endroits et pour lesquelles des mesures répétées pourront être effectuées. Cependant, si dans certains tissus une efficacité beaucoup plus importante est observée pour certains variants AAVs par rapport aux vecteurs contrôles, et ceci chez les 2 animaux, une analyse statistique pourrait être considérée. L'analyse statistique sera alors une analyse ANOVA.

Raffinement

L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement (techniciens animaliers et vétérinaire). Des protocoles anesthésiques seront mis en place selon la procédure à réaliser. Les administrations expérimentales (injections par voie IV de Polaramine®, d’IdeS et des vecteurs) se dérouleront sous anesthésie générale. Les prélèvements sanguins seront effectués sous protocole anesthésique permettant d'obtenir une anesthésie de courte durée (environ 10 min.). Ces actes étant peu douloureux, aucun protocole analgésique ne sera mis en place d'emblée pour ces 3 procédures. Pour favoriser les échanges sociaux entre animaux et favoriser leur bien-être, les macaques seront hébergés en cage en post-injection, et en volières dès que possible pour favoriser les déplacements verticaux.

Choix des espèces

La capacité des vecteurs AAV à pénétrer dans un organe/tissu et y faire exprimer un gène thérapeutique est dépendante de l'espèce. L’objectif principal de ce projet étant donc l’évaluation du tropisme de différents vecteurs rAAV, il est indispensable de choisir l’espèce en conséquence. Un vecteur peut être efficace chez le rongeur mais pas chez l'homme. Le macaque fascicularis représente l’espèce animale de choix dans le modèle pré-clinique de par sa morphologie, sa physiologie, sa proximité phylogénétique et sa similitude avec le système immunitaire de l’homme. 2 singes (Macaca fascicularis) mâles (2-3 ans, 2-4 kg) seront inclus dans l’étude. Il s'agit de jeunes adultes, matures sur le plan immunitaire notamment. De façon générale, les maladies génétiques pour lesquelles une solution par thérapie génique est recherchée se manifestent dès l'enfance.

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent quatre interventions provoquant une stéatose du foie ou des altérations du cœur, une injection intrapéritonéale et deux à quatre séances d'imagerie échographique sous anesthésie, avant une mise à mort pour analyser les tissus. Le porteur affirme que ces interventions n'entraînent qu'un faible niveau d'effets indésirables et pas de perte de poids, et qu'aucune approche de remplacement pertinente n'a été identifiée. Cette étude pilote cherche des marqueurs de la sénescence cellulaire, bénéfice présenté au conditionnel comme une amorce pour de futurs agents d'imagerie.

Objectifs

La sénescence cellulaire est impliquée dans de nombreuses pathologies chroniques liées au vieillissement, y compris un certain nombre de pathologies cardiométaboliques La sénescence cellulaire est impliquée dans de nombreuses maladies chroniques liées au vieillissement. Il n’existe pas de modalité d’imagerie permettant l’identification de la sénescence cellulaire in vivo, qui présente pourtant potentiellement un grand intérêt. L’objectif de ce projet est d’évaluer la présence de sénescence cellulaire dans plusieurs modèles précliniques de pathologies cardiométaboliques et d’identifier un ou plusieurs marqueurs de sénescence cellulaire communs à ces modèles.

Bénéfices attendus

Il est attendu qu’un ou plusieurs des modèles animaux testés révèlent la présence de cellules sénescentes et qu’au moins un marqueur de sénescence cellulaire, commun à ces modèles et pouvant être ciblé par imagerie moléculaire, soit identifié. Cette étude pilote devrait donc permettre d’amorcer le développement d’agents d'imagerie de la sénescence cellulaire, ciblant le marqueur identifié, et dans un même temps de valider la pertinence de modèles animaux pour tester ces agents d'imagerie après leur développement.

Procédures

Une partie des animaux sera soumis à des injections intrapéritonéales en début de protocole (une injection par animal). Les animaux seront soumis à des procédures d’imagerie par échographique, avant le début des interventions, à la fin de la durée d’intervention prévue et à des temps intermédiaires pour une partie des animaux, (entre 2 et 4 procédures d’imagerie par animal, sous anesthésie gazeuse et d’une durée approximative de 30 min par animal).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à quatre interventions menant au développement de pathologies cardiométaboliques. Deux de ces interventions mènent au développement de stéatose du foie. Deux autres interventions mènent à des altérations du cœur. Pour deux de ces interventions (une visant le foie et l’autre le cœur), la présence de cellules sénescentes a été décrite, alors que pour les deux autres interventions, l’implication de la sénescence cellulaire reste à confirmer, ce qui fait partie des objectifs de cette étude. L’efficacité de ces interventions sera validée par imagerie échographique. Ces interventions ont été décrites dans la littérature scientifique et n’entrainent qu’un faible niveau d’effets indésirables et notamment pas de perte de poids. Le protocole d’imagerie, quant à lui, n’entraine pas de douleur, souffrance ou angoisse chez les animaux.

Devenir

A l’issue de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser les altérations tissulaires des modèles pathologiques étudiés, y compris la présence de cellulaire sénescentes, et évaluer les marqueurs communs à ces cellules sénescentes.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant l’évaluation d’un phénomène apparaissant chez l’animal suite à des interventions métaboliques au long cours, y compris dans l’optique de valider ces interventions comme modèle pour une évaluation ultérieure in vivo par imagerie, aucune approche pertinente de remplacement n’a été identifiée.

Réduction

L’étude a été conçue pour limiter le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant un effectif suffisant pour une analyse statistique permettant de se prononcer sur l’efficacité des interventions évaluées. Ceci implique, notamment la limitation des doses de molécules actives utilisés et des points temporels ou l’étude sera réalisé sur les bases de résultats précédemment rapportées dans la littérature, et l’utilisation d’un groupe contrôle commun.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement du milieu de vie adapté à l’espèce. Une surveillance et des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie échographique sera réalisée sous anesthésie volatile.

Choix des espèces

Cette étude porte sur l’identification de cellules sénescentes dans des modèles animaux déjà établis (et d’un marqueur, commun à ces modèles, pertinent pour le développement d’agents d'imagerie). Les modèles identifiés comme potentiellement pertinents ont été établis chez la souris. Pour cette raison, des souris au même stade de développement (adultes) que décrit dans la littérature scientifique, présentant ces modèles déjà établis, vont être utilisés pour ces travaux sur un aspect peu ou pas étudié dans ces modèles animaux.

563 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Les souriceaux reçoivent trois injections de phencyclidine pendant leur deuxième semaine de vie, ce qui provoque des heures d'hyperactivité, une difficulté à se nourrir et un retard de prise de poids. Ils sont ensuite tués par décapitation après sédation ou par perfusion, pour prélever le cerveau et étudier les synapses du cervelet. Le porteur affirme qu'une telle étude "ne serait pas possible en culture cellulaire" et nécessite des animaux vivants.

Objectifs

Le cerveau est composé de différents types de neurones, qui établissent entre eux des contacts appelés synapses. Ces synapses peuvent être très différentes dans leur morphologie et/ou leur manière de fonctionner, chaque type de synapse ayant ainsi sa propre « identité synaptique ». Les synapses sont considérées comme des acteurs centraux des pathologies comme la schizophrénie. Cependant, la plupart des analyses ont été faites à l’échelle des structures cérébrales et peu d’études se sont penchées sur l’identité des synapses affectées. La schizophrénie est une pathologie neuropsychiatrique provoquant des symptômes psychotiques, émotionnels et des déficits cognitifs comme des problèmes de mémoire ou d’attention. Le cervelet est une structure intéressante à étudier dans la schizophrénie puisque certains patients présentent des déficits et une activité anormale dans cette structure du cerveau. De plus, son implication dans des processus cognitifs est de plus en plus fréquemment mise en évidence. Les neurones de ce réseau et leur architecture particulière sont très largement caractérisés, ce qui en fait un modèle de choix pour l’étude des déficits des synapses. Nous avons récemment étudié les altérations des synapses du cervelet dans un modèle murin connu pour mimer certaines composantes de la physiopathologie de la schizophrénie. Ce modèle murin consiste en l’injection de Phencyclidine (PCP) chez le souriceau à 7, 9 et 11 jours après la naissance, sachant que le PCP est connu pour induire des symptômes similaires à ceux induits par la schizophrénie chez l’humain. Cette première étude nous a permis de montrer que le PCP conduit à une augmentation de l’activité du réseau de neurones du cervelet et à des déficits au niveau d’un type de synapses qui semblent être liés à des changements transitoires de la quantité de molécules situées à la surface des neurones et qui seraient importantes pour former ces synapses. Le présent projet est la suite de cette étude et consiste à déterminer quels sont les neurones du réseau dont l’activité est modifiée par l’injection de PCP et quels sont les effets sur la composition moléculaire et la fonctionnalité de leurs synapses.

Bénéfices attendus

Les maladies mentales et neurologiques constituent un réel problème de santé publique puisqu’elles sont la première cause d’invalidité dans le monde. Parmi ces maladies, la schizophrénie touche 1% de la population. Les symptômes associés à cette maladie sont très variés et apparaissent à la fin de l’adolescence ou chez le jeune adulte. Les patients présentent des déficits cognitifs (problèmes de concentration, d’attention, de mémoire de travail…) qui apparaissent dans l’enfance et auraient pour origine des défauts dans le développement des neurones. Les traitements, qui restent pour l’heure purement symptomatiques, sont la plupart du temps peu efficaces. Il est donc crucial de comprendre l’origine de cette maladie, pour pouvoir ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Les synapses, connexions permettant aux neurones de communiquer entre eux, sont indispensables au bon fonctionnement du cerveau. Aujourd’hui, il est très bien établi que des déficits de connexion entre les neurones sont visibles dans le cortex cérébral chez des patients atteints de schizophrénie. En revanche, en dépit de la présence évidente de déficits dans la structure du cerveau appelée cervelet chez certains patients schizophrènes, son implication dans cette pathologie reste très mal étudiée. Nos résultats récents obtenus sur le modèle murin de schizophrénie, le modèle PCP, nous ont permis d’identifier des déficits au niveau de synapses du cervelet, suite à la modification de l’activité neuronale au cours du développement du cervelet. La présente étude nous aidera à mettre en évidence les molécules des synapses qui sont potentiellement modifiées en fonction de l’activité des neurones et qui pourraient provoquer l’apparition de certaines maladies du cerveau lorsqu’elles ne sont pas présentes en quantité normale.

Procédures

Nous injecterons le NaCl 0.9% (contrôle) ou la Phencyclidine (PCP) en sous-cutané, trois fois à 2 jours d’intervalle pendant la deuxième semaine de vie post-natale. Le poids des souriceaux sera déterminé avant chaque injection afin d'adapter la dose de PCP ou de NaCl 0.9% à injecter. Les animaux sont maintenus immobiles en réalisant un pli de peau au niveau du cou qui permet également l’insertion de l’aiguille la plus fine possible (29G) afin de limiter la douleur. Lors des injections, les souriceaux sont séparés seulement quelques minutes de leur mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Lorsque l'âge voulu est atteint, les souris recevront une injection d'anesthésique local afin de prévenir toute douleur qui pourrait être engendrée par l'injection de la dose léthale d'euthanasiant qui précède la perfusion intracardiaque.

Impact sur les animaux

Chez l’homme, le PCP à des effets psychotomimétiques tels que l’altération de l’image corporelle, des sentiments d’éloignement et de solitude. Lorsqu’il est injecté chez la souris en néonatal, des altérations cognitives sont visibles chez la souris adulte. Parmi elles, des déficits de mémoire spatiale et un déficit dans la capacité de reconnaissance de nouveaux objets sont observés. Après chaque injection, les souris présentent une période de quelques heures d’hyperactivité qui semble conduire à une difficulté à se nourrir pendant cette période, avec un retard de prise de poids que nous avons établi à moins de 4% par rapport aux contrôles dans notre précédent projet autorisé par le CEEA. Aucun autre effet indésirable n’a été observé sur ces animaux dans notre précédent projet.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédures. Après les injections de PCP ou NaCl 0.9%, les animaux resteront auprès de leur mère dans une cage enrichie (cotons et dôme en carton pour leur nid) jusqu’à l’âge du prélèvement. Pour toutes les études d’électrophysiologie ou protéiques, les animaux seront euthanasiés par décapitation après une sédation à l’isoflurane pour prélèvement du cerveau. Pour l'étude d'histologie, les animaux seront perfusés avec un agent fixateur des tissus pour pouvoir procéder à des analyses en immunohistochimie.

Remplacement

La souris est devenue un modèle de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. Elle permet l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elle permet également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. Il existe actuellement plusieurs modèles de souris pour la schizophrénie, dont le modèle pharmacologique qui nous intéresse : la souris PCP (Phencyclidine). Certaines études fonctionnelles ne peuvent pas être réalisées chez les patients. De plus, il est important d’étudier les réseaux cérébelleux dans le contexte du cerveau puisque le cervelet est connecté à d’autres régions du cerveau dont le cortex qui est déjà connu pour son implication, par exemple, dans la schizophrénie. Une telle étude ne serait donc pas possible en culture cellulaire et nécessite d’avoir recourt à des animaux vivants.

Réduction

Le projet est conçu pour limiter le nombre de souris au minimum dans la limite de ce qui est permis pour obtenir des résultats scientifiquement valides en prenant en compte la nécessité d’avoir plusieurs échantillons et de reproduire les résultats de manière indépendante pour éviter les différences dues à la variabilité biologique (sexe, caractéristiques génétiques…), à la variabilité environnementale (différence liée à la vie avec la mère). Afin de tenir compte de la perte potentielle de souriceaux qui peut aller jusqu’à 20% dans un élevage normal, nous estimons avoir besoin de 6 portées par expérience pour avoir de 15 à 21 souris par condition et par timepoint. Les expériences sont stoppées lorsque l’on atteint le nombre minimum, soit 15 animaux par condition. Après sevrage des souriceaux, les mères peuvent continuer à être utilisées pour de nouveaux accouplements dans notre animalerie.

Raffinement

Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Notamment, des compléments environnementaux (dômes en carton, cotons) sont ajoutés afin de permettre à la femelle de créer un meilleur nid et de diminuer tout stress éventuel. De même, les injections sous-cutanées chez le souriceau seront réalisées avec les aiguilles les plus fines possibles (29G) afin de minimiser la douleur. Lors de ces injections, les souriceaux sont séparés de la mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère afin d’éviter le rejet des souriceaux par la mère. Les animaux sont surveillés quotidiennement jusqu’à leur euthanasie. Si un souriceau présente des signes de souffrance ou de stress dans les jours qui suivent les injections (souriceau hors du nid, pas de lait dans l’estomac indiquant des problèmes importants pour se nourrir, posture anormale…) témoignant d’une altération du bien-être des animaux, l’expérimentateur pourra consulter le personnel compétant de l’animalerie ou le vétérinaire pour avis, afin de mettre en place une médication adaptée si cela est possible. En cas de souffrance ne pouvant être prise en charge, l’animal sera sorti du projet avec une euthanasie immédiate sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie si l’expérimentateur n’est pas joignable.

Choix des espèces

Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. En effet, elles permettent l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elles permettent également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. De plus, le court cycle de reproduction chez la souris et sa petite taille permettent leur maintien de manière relativement simple, tout en gardant une espèce relativement proche de l’homme en termes de développement. L’analyse sera faite à P7, P9, P11 pour les expériences 1 (immunohistologie), 2 (électrophysiologie par multi electrode array) et 3 (analyse de protéines synaptiques) afin de connaître en détail l’effet directe de chaque injection de PCP sur le réseau olivo-cérébelleux. Les analyses des expériences 1, 2 et 3 ainsi que de l’expérience 4 (électrophysiologie sur tranches de cervelet) se feront aussi à P30 qui correspond à l’âge où la connectivité du réseau olivo-cérébelleux est finalisée et commence sa maturation. Cette période chez la souris correspondrait ainsi au début de la période de déclanchement de la pathologie chez l’homme, à savoir à la fin de l’adolescence ou le jeune adulte. Le modèle PCP néonatal a été très largement décrit dans la littérature, et une injection chronique développementale à P7, P9 et P11 a montré des effets comportementaux légers à long terme, cohérents avec des déficits observés chez les sujets schizophrènes. De plus, la période d’induction du modèle est cohérente pour mimer les altérations neuronales produites par des stimulations pendant le troisième trimestre de la grossesse.