Procédures légères
Evaluation de l’impact de traitements innovants d’effluents de station d’épuration et de micropolluants chez Xenopus laevis
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
9 460 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les adultes reçoivent des injections hormonales pour se reproduire puis retournent en aquarium et servent à nouveau, tandis que les larves et les œufs exposés sont tués par surdose d'anesthésique, pour évaluer l'écotoxicité d'effluents de station d'épuration. Le porteur indique recourir d'abord à un test sur daphnies pour réduire le nombre de vertébrés. Il présente le xénope comme un indicateur pertinent de la qualité des milieux.
Objectifs
De nombreux composés chimiques sont retrouvés en entrée de stations d'épuration de part les activités humaines et notre société de consommation. Les traitements actuels sont peu efficaces pour traiter ce genre de composés et une majorité d'entre eux (les micropolluants) sont retouvés dans l'environnement. Le présent projet est issu de 2 projets de recherche différents qui s'intéressent aux traitements des effluents d'origine humaine (station d'épuration, eaux résiduelles urbaines, effluents hospitaliers, etc.) dont l'objectif est de mettre en évidence l'absence d'écotoxicité des matrices (effluents, lixiviats de boues) traitées par les procédés de traitement mis en oeuvre et cela avant leur rejet dans le milieu naturel et de définir une stratégie de traitement d'effluents optimale qui fournit un effluent final adapté à la réutilisation, en se conformant à une qualité d'eau chimique et biologique sécûre. Les 2 projets ont été évalués par des organismes scientifiques français et européens et des financeurs publics. Les expérimentations porteront d'une part sur l'évaluation de l'effet de cocktails de micropolluants à des concentrations faibles couramment retrouvées dans l'environnement. D'autre part, les expérimentations auront pour but d'évaluer l'efficacité et l'innocuité de traitements innovants des eaux usées issues de stations d'épuration.
Bénéfices attendus
L'enjeu environnemental est important, avec à la clef un possible changement/amélioration des pratiques de traitement des eaux usées à l'issue des connaissances scientifiques qui seront acquises. Les bénéfices attendus sont donc des impacts sur la société et l'économie, en incitant l'industrie de l'eau et les gestionnaires à protéger l'environnement des rejets d'effluents contenant des contaminants tout en prenant en compte le concept sociétal du"One Health" (une seule santé).
Procédures
Les adultes xénopes s'accouplent naturellement après l’injection hormonale dans les sacs lymphatiques dorsaux (prise en main : tête dans paume de la main de l'utilisateur). L’injection est effectuée dans l’espace entre la peau et le plan musculaire sous-jacent, divisé en compartiments séparés par des parois conjonctives, rempli de liquide lymphatique et en communication avec le système lymphatique. Cette disposition anatomique favorise l’injection et la diffusion des hormones dans l’ensemble du corps de l’animal. Pour éviter un reflux, on pique l’aiguille dans le haut de la cuisse à travers le septum et on maintient appuyé au lieu d’injection pendant quelques secondes au moment de retirer l’aiguille. Les 20 adultes ne seront jamais mis à mort mais réintégrés à l’élevage. Les autres interventions sont réalisées sur les têtards après traitement au Tricaine Méthane Sulfonate. Ils seront exposés à différents types de mélanges en micropolluants organiques ou à des effluents traités pendant des durées variables (4-12-21 jours) et différents aspects biologiques seront étudiés : cassures de l'ADN, métamorphose, croissance, De plus, pour se rapprocher le plus possible du milieu naturel, des expérimentations seront menées en étudiant les effets au niveau de chaînes alimentaires recréées en laboratoire. Pour l'ensemble des procédures 9440 têtards seront utilisées. Le nombre total d'animaux impliqués sera donc égal à 9460 en considérant les têtards et les adultes. Du point de vue du raffinement, les conditions d'élevage et d'exposition seront strictement contrôlées en fonction des besoins physiologiques de chaque stade de développement pour réduire le stress et la souffrance au maximum (ex: période de repos après stimulation des reproducteurs). Afin de réduire le nombre d'animaux, une même ponte sera mutualisée pour plusieurs essais et procédures permettant de réduire considérablement le nombre de reproducteurs. De même, les expérimentations seront regroupées au maximum (les contröle seront mises en commun pour réduire le nombre de têtards). De plus, des essais préliminaires de toxicité chez les invertébrés daphnies seront utilisés pour cibler les concentrations d’exposition des larves par la suite, et éviter ainsi des mortalités aigües des têtards. Un même têtard sera utilisé pour mesurer de nombreux biomarqueurs évitant de multiplier le nombre de têtards avec le nombre de biomarqueurs. Enfin une anesthésie stricte est utilisée à chaque fois.
Impact sur les animaux
Les bénéfices attendus sont donc les impacts sur la société et l'économie, en incitant l'industrie de l'eau à protéger l'environnement des rejets d'effluents contenant des contaminants tout en prenant en compte le concept sociétal du"One Health" (une seule santé). On fait une évaluation écotoxicologique des effets des contaminants potentiels qu'on peut retrouver dans un effluent après traitement en comparaison avec avant traitement. L'analyse des biomarqueurs utilisés chez ces animaux exposés pourra renseigner notamment des nuisances et des effets indésirables. Afin de réduire le nombre d’adultes xénopes, les expérimentations seront regroupées au maximum sur les individus issus d'une même ponte et pour réduire le nombre de têtards, les conditions témoins seront mises en commun autant que possible. De plus, des essais préliminaires de toxicité chez les invertébrés daphnies seront utilisés pour cibler les concentrations d’expositions des larves de Xénope par la suite, et éviter ainsi des mortalités aigües des têtards.
Devenir
Les adultes réintègrent leurs aquariums. L'ensemble des larves et oeufs exposés sera euthanasié selon la méthode de mise à mort recommandée : surdose de l'anesthésique Tricaine methanesulfonate à 0,2 g/L (solution tamponnée au bicarbonate de sodium : pH 7.0).
Remplacement
Un test réglementaire de détermination de l'immobilisation chez les invertébrés daphnies (OCDE TG202) sera utilisé chaque fois que la toxicité aiguë d'un effluent ou d'un cocktail sera recherchée. Par conséquent, les gammes de concentration étudiés chez les xénopes seront établies en fonction des résultats de toxicité aiguë enregistrés chez la daphnie. Nous utilisons le test Daphnie, pour réduire le nombre de vertébrés utilisés et en l'absence de méthodes alternatives permettant d'étudier la toxicité de cocktails de polluants.
Réduction
Réduction du nombre d'animaux : - Les reproducteurs utilisés proviennent d'un élevage interne et les larves issues des pontes seront utilisées dans les différentes procédures ==> Pas d'importations supplémentaires de nouveaux géniteurs: réduction du nombre d'animaux utilisés. - Le nombre d'animaux utilisé dans chaque procédure est calculé selon un minimum requis pour pouvoir conclure statistiquement sur de potentiels effets délétères et les embryons ou larves témoins négatifs sont mutualisées autant que possible en fonction de la disponibilité des matrices à étudiers
Raffinement
Raffinement -Les reproducteurs qui sont injectés en vue de la reproduction servent au maximum 3 fois par an ==> période de récupération de 4 mois. Leur manipulation est douce et est réalisée par du personnel expérimenté. Par exemple, l'injection de gonadotropines sera réalisée uniquement par deux membres du projet qui sont parmi les plus expérimentés (25 ans d'expérience). Autre exemple, l'animal est saisi dans l'aquarium en mettant délicatement sa tête dans la paume de la main et la partie abdominale est légèrement massée avec le pouce (ces gestes exercent une action calmante sur l'animal). L'injection se réalise en immobilisant l'individu dans la main. Les solutions hormonales sont sorties du réfrigérateur puis mises à température ambiante pour ne pas être douloureuse à l'injection. -Dans le but de réduire le stress des reproducteurs, les conditions d'élevage et d'exposition seront strictement contrôlées en fonction des besoins physiologiques de chaque stade de développement pour réduire le stress et la souffrance au maximum (ex: période de repos après stimulation des reproducteurs).
Choix des espèces
Les amphibiens sont de bons modèles dans le cadre d'études écotoxicologiques et leur pertinence d'utilisation a été démontrée depuis plusieurs années : - Les stades larvaires sont particulièrement sensibles, ce qui en fait de bon indicateurs de la qualité des milieux. - Ce sont des animaux sédentaires qui sont de bon indicateurs des conditions locales. ==> Le xénope est pertinent dans le cadre de notre projet car il possède un taux d'éclosion élevé, une disponibilité tout au long de l'année après un traitement hormonal des reproducteurs, un développement larvaire rapide et l'alimentation des larves est facile. Les reproducteurs de X. laevis seront utilisés au stade adulte (sexuellement mâtures : nécessaire pour la reproduction). Les larves de xénope utilisées dans ce projet sont agées de 2 à 3 semaines. Elles sont utilisées à ces stades de développement précis pour différentes raisons. Les stades larvaires sont particulièrement sensibles à la présence de polluants, ainsi un nombre réduit d'animaux par rapport aux adultes est nécessaire pour détecter un éventuel effet délétère (réduction). Ces stades sont facilement repérables car ils correspondent à l'apparition du bourgeon de la pâte postérieure et l'anesthésie n'est donc pas nécessaire pour déterminer ce stade de développement (raffinement).
Impact du ciblage des cellules sénescentes sur la longévité et l’espérance de vie en bonne santé
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Laissées vieillir jusqu'à 18 à 24 mois, elles reçoivent un anticorps ou un composé sénolytique par injection ou gavage tous les quinze jours, avec prélèvements de sang et d'urine, pour étudier l'élimination des cellules sénescentes dans le vieillissement. Le porteur anticipe la mort d'environ 20 % des animaux avant la fin, et la mise à mort de ceux qui perdent 15 % de leur poids. Il justifie le recours à la souris par la nécessité d'étudier un "organisme entier".
Objectifs
Ce projet fait partie d'une étude plus globale de caractérisation du rôle de la surveillance immunitaire des cellules sénescentes dans le vieillissement, les maladies liées à l’âge et le cancer. Ce projet est basé sur les résultats obtenus au sein du laboratoire qui démontrent un lien entre la surexpression d’un glycolipide à la surface des cellules pulmonaires sénescentes et leur échappement au système immunitaire. L’objectif du projet est de déterminer l’effet du blocage de glycolipide par un anticorps sur la réponse immunitaire et le développement de maladies liées à la senescence chez la souris âgée. L’interaction et la communication entre les cellules sénescentes et les cellules immunitaires seront étudiées pour établir le mécanisme par lequel ces cellules exercent des pressions d’adaptation mutuelles observée in vitro. Le développement et l’avancement de diverses maladies liés à l’âge (Fibrose pulmonaire, fibrose rénale, fibrose hépatique, arthrose, ostéoporose, cancer) seront également suivis afin d’évaluer l’effet thérapeutique de l’anticorps comparé à un sénolytique connu (une combinaison de molécules éliminant les cellules sénescentes). Nous voulons évaluer si cette approche immunothérapeutique pourrait augmenter la durée de vie des souris ainsi que diminuer leur état de fragilité générale. La finalité de ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement des molécules de surfaces associées aux cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âges incluant le cancer. Les résultats de cette étude devraient nous permettre de mieux développer l’anticorps et d’envisager des essais cliniques de phase précoce chez l’homme.
Bénéfices attendus
Par cette étude on s’attend à avoir une meilleure compréhension mécanistique des interactions entre le système immunitaire et les cellules sénescentes au cours du vieillissement mais également de déterminer le rôle et l’importance des point de contrôles immunitaires associés à la sénescence dans l’élimination des cellules sénescentes. Nous nous attendons également à comprendre si une approche immunothérapeutique visant ce ganglioside pourrait être envisagée afin de traiter et prévenir les maladies liées à l’âge et la comparer à un traitement déjà connu.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Administration de l’anticorps ou le sénolytique de référence ou les solutions contrôles (PBS ou isotype contrôle) par injection intrapéritonéale ou par gavage, pour tous les animaux, une fois tous les 15 jours pour 6 injections/gavages; durée d'environ 3 minutes par animal par injection/gavage - Pesée (toutes les semaines pour tous les animaux; durée moins d'une minute par pesée - Prélèvement sanguin (200µl une fois par mois pour tous les animaux) ; durée d'environ 5 minutes de manipulation (dilatation de la queue puis incision etrécupération, coagulation par pensement coagulant) par animal par injection - Collecte d’urine (tous les mois pour tous les animaux) sur animal vigile; durée moins d'une minute par anaimal - Imagerie µCT sur animal anesthésié (5 par groupe), durée d'environ 7 minute par animal.
Impact sur les animaux
Le phénotype âgé est un phénotype dommageable car il peut induire l’apparition de nombreuses maladies. Entre 18 et 24 mois nous nous attendons à avoir 20% de perte d’animaux par mort « naturelle ». Une feuille de score adaptée au vieillissement sera faite pour suivre le bien-être des animaux. On notera que les souris seront systématiquement pesées chaque semaine. Une baisse de 15% du poids de la souris par rapport à la précédente pesée conduira à sa mise à mort.
Devenir
Pour les 2 procédures, nous voulons déterminer l’état physiologique de l’animal et sa durée de vie. Pour cela, nous devons analyser sa survie globale sans souffrance et mettre à mort tous les animaux qui ne seraient pas décédés de causes naturelles pour pouvoir prélever les organes et les analyser en histologie, cytométrie et RNAseq mais aussi de tester les capacités fonctionnelles des cellules ex vivo. L’analyse concernant les tissus ne peut se faire autrement que ex vivo. La mise à mort de l’animal est donc nécessaire afin de pouvoir prélever les organes. Un maximum de tissus seront récupérés afin que de tirer le plus d’information possible de cette expérience. Ainsi, l’objectif scientifique de ce projet nécessite la mise à mort (ou la mort naturelle) de tous les animaux.
Remplacement
La sénescence et le système immunitaire étant un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, ce projet nécessite une étude à l’échelle de l’organisme entier. Notre projet vise à étudier les mécanismes biologiques à l’origine du vieillissement et en particulier à l’origine du vieillissement pathologique. Nous voulons comprendre comment un organisme peut vieillir et déterminer si de nouvelles stratégies thérapeutiques peut empêcher le vieillissement pathologique et l’incidence de nombreuses maladies liées à l’âge. Ces mécanismes reposent sur de nombreuses interactions entre différentes cellules telles que les cellules âgées dites « sénescentes » ou les cellules immunitaires mais également sur la communication entre différents organes. À la vue de la complexité des mécanismes étudiés aucun modèle in vitro ou synthétique ne peut mimer le niveau de complexité de ces interactions ni remplacer l’étude sur l’animal. Seul l’analyse au niveau d’un organisme vivant pourra nous permettre de déterminer si le ciblage des cellules sénescentes par notre anticorps permet de limiter la présence des cellules sénescentes dans les tissus, d’évaluer l’état d’activation du système immunitaire, les conséquences sur l’incidence de maladies liées à l’âge, l’effet sur la longévité et sur l’espérance de vie en bonne santé. En revanche, lorsque les mécanismes principaux seront identifiés, leur étude mécanistique sera réalisée le plus possible par des méthodes de remplacement en réalisant des expériences in vitro de coculture.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre minimum de souris pour les 2 approches expérimentales (longévité globale et vieillissement en bonne santé). L’ensemble du projet a donc été conçu pour REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une puissance statistique robuste. Pour cela nous avons utilisé 3 approches complémentaires. - Tout d’abord une analyse complète des données de la littérature sur les agents sénolytiques pour connaitre la taille des effets biologiques et connaitre les nombres d’animaux et les effets statistiques déjà observés. - Ensuite, nous avons choisi de coupler nos analyses avec un suivi longitudinal des animaux par utilisation de l’imagerie par scanner (microCT ; technique équivalente au PET-Scan utilisé en clinique pour l’évaluation de la fibrose chez l’homme mais adaptée au petit animal). Ceci a pour effet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en procédant à un suivi individualisé de chaque souris. - Nous avons « croisés » les contrôles pour les 2 procédures. Ainsi, le groupe contrôle recevra 6 IP d’anticorps isotype contrôle et 6 gavages contrôles, le groupe expérimental D+Q recevra 6 gavages de D+Q et 6 IP d’isotype contrôle et enfin le groupe anti ganglioside recevra les 6 IP d’anticorps anti ganglioside et 6 gavages contrôles. Ceci est exactement identique pour les 2 procédures. Cette stratégie a permis de supprimer complètement un groupe contrôle et donc de réduire le nombre d’animaux utilisé. - Nous réaliserons les 2 procédures en parallèle puisque les animaux sont issus du même lot chez le fournisseur et seront stabulés initialement et traités exactement de façon identique. Ceci permettra de comparer les résultats entre les 2 procédures, d’utiliser les mêmes animaux contrôles de 18 mois (les 15 animaux t0) et donc de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés en évitant de reproduire des contrôles inutilement. - Enfin, nous avons calculé précisément la grandeur de l’effectif nécessaire pour notre étude grâce au logiciel Gpower avec un test ANOVA oneway de puissance statistique de 0.8 associé à un effet taille moyen calculé sur les données déjà publiées d’effet de sénolytique (0.5) pour p≤0.05.
Raffinement
Les procédures de ce projet comprennent les éléments de raffinement suivants : Suivi quotidien des animaux, à l’aide d’une fiche de suivi appuyée par une grille de score clinique comprenant des points limites précoces et adaptés. Les animaux sont hébergés dans des pièces spécifiquement dédiées aux expériences sur le vieillissement permettant d'exercer un suivi plus précis et de limiter le stress et les risques de contamination en réduisant le passage dans ces zones. La conservation d’une cohésion sociale durant la durée de vie de l’animal. L’ajout d’éléments supplémentaire d’enrichissements incluant des maisons à ronger et des twists pour modifier la nidification en complément de l’enrichissement standard incluant des maisons rouges solides et des cotons carrés. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs afin de les habituer et de limiter le stress lors des procédures. Les protocoles d’imagerie non invasive permettant un suivi longitudinal sont menés sous anesthésie gazeuse. L'ensemble de ces mesures de raffinement visent à assurer le bien-être des animaux et assurer des résultats scientifiques de qualité pour éviter toute reproduction expérimentale inutile.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix avec une physiologie proche de l’homme (squelette osseux, poumons) et un cycle de vie relativement court (animal âgé à 18 mois). Chez la souris, les mécanismes de réparation et de dérégulation de la physiologie des tissus sont très bien décrits. Ils permettent une analyse précise de l'ensemble des phases mises en jeu au cours de ces évènements biologiques. Le modèle murin choisi est le seul nous permettant une approche intégrative des processus impliqués dans les maladies liées à l’âge. En effet, il permet d’étudier de façon concomitante les cellules immunitaires, les cellules sénescentes, l’avancement des maladies et l’expression du ganglioside. La physiopathologie des tissus est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour en tirer des données exploitables. La souris est le seul modèle accessible pour ce genre d’étude afin de répondre au questionnement scientifique de ce projet. Des souris âgées de 18 mois au début des expérimentations seront utilisées. Voulant étudier un large panel de maladies liées à l’âge et à la sénescence, le modèle le plus pertinent est donc d’utiliser des souris en vieillissement, soit ici 18 mois d’âge équivalent à 60 ans chez l’Homme. Les deux procédures décrites ici utiliseront donc des animaux au même stade de développement. Les données de la littérature montrent que certains phénotypes liés à l’âge émergent à partir de 12 mois mais que leur incidence est significativement plus élevée à partir de 18 mois. Pour analyser les capacités thérapeutiques de l’anticorps anti ganglioside et les conséquences de celui-ci sur l’émergence de ces maladies liées à l’âge et la longévité des animaux, nous allons utiliser donc des souris adultes âgées de 18 mois. Ceci nous permettra d’étudier comment le traitement fonctionne dans un organisme déjà vieillissant. D’autre part, en démarrant l’étude avec des animaux issus des mêmes croisements et directement âgés, en provenance du même fournisseur et avec un statut sanitaire SOPF très contrôlé, nous limiterons les effets de variabilité expérimentale.
Rôle des anticorps IgG dirigés contre des bactéries commensales dans un modèle animal de colite (rat HLA-B27)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
373 rats transgéniques HLA-B27 vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Ils développent une colite spontanée et reçoivent des injections puis des prélèvements sanguins sous anesthésie tous les quinze jours, pour étudier le rôle d'anticorps dirigés contre le microbiote dans les maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur indique que ces rats développent aussi arthrite et uvéites, sans prévoir de surveillance spécifique de ces atteintes. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit ces maladies.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) regroupent 2 entités la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique dont l’étiologie et la physiopathologie restent mal connues. L’inflammation intestinale chronique serait le résultat d’une réponse immunitaire aberrante, dirigée contre des antigènes du microbiote intestinale, et survenant chez des individus génétiquement susceptibles. Parmi les anticorps couramment associés au développement des MICI ont été identifiés les anticorps anti oligomannane de Saccharomyces cerevisae (ASCA), les anti-flagelline (anti C-bir1), les anti-porine C d’Escherichia coli (anti-OmpC). A l’heure actuelle, ces anticorps sont considérés par les cliniciens comme de simples marqueurs biologiques. Toutefois des avancées récentes tendent à montrer qu’il existerait des interactions complexes entre la réponse immunoglobuline (Ig) G et le développement ou l’évolution des lésions intestinales dans les MICI. Les objectifs principaux de ce travail de recherche seront dans un premier temps d’étudier la présence, la nature et le rôle de la réponse humorale chez le rat HLA-B27, modèle classique de colite expérimentale puis dans un second temps de déterminer si la réponse humorale dirigée contre un antigène donné du microbiote a un rôle bénéfique, délétère ou neutre dans le développement et la progression des lésions de colite dans notre modèle de rat HLA-B27. Enfin, il sera essentiel de déterminer la participation de la réponse humorale dans l’évolution naturelle de la colite de nos animaux grâce à l’injection d’immunoglobulines polyvalentes qui rentreront en compétition avec les immunoglobulines des rats. Nous étudierons l’effet préventif et curatif de ces IVIG.
Bénéfices attendus
Ce modèle animal adapté à l’exploration des IgG spécifiques du microbiote est intéressant pour éclairer le mécanisme pathologique à l’œuvre dans les MICI humaines et éventuellement permettre d’aboutir à des thérapeutiques modulant la production ou l’action de ces anticorps.
Procédures
Procédure 1 : Les 320 rats recevront 3 injections de 300µl de composés (150µg/ml en NaCl 9‰) ou NaCl 9‰ (groupe contrôle) en intra-péritonéale à 5 ,7 et 9 semaines de vie (durée de l'injection 10 sec) . Ces injections se feront sur animaux vigiles. Ces mêmes animaux sous anesthésie générale auront tous les 15 jours, de la semaine 5 à 24, un prélèvement sanguin (durée de l'anesthésie 5 min). Une endoscopie sous anesthésie générale pendant 20 minutes pourra être réalisée à semaine 16 et 20 de vie. Procédure 2: Les 10 rats de l'expérience préliminaire recevront sous anesthésie de 5 minutes une série de 5 injections dans la veine caudale d'immunoglobulines polyvalentes (400mg/kg/ jour pendant 5 jours) à 6 semaines de vie puis ils auront tous les 15 jours jusqu'à 18 semaines de vie un prélèvement sanguin toujours sous anesthésie de 5 minutes. Pour la procédure dite préventive, les 24 rats recevront sous anesthésie (5 minutes) deux série d'injections intra-veineuses d'IVIG (400mg/kg/ jour pendant 5 jours) ou NaCl 9‰ à 6 et X semaines de vie (X déterminé par l'expérience préliminaire). A partir de la 6ème semaine, un prélèvement sanguin quinzomadaire aura lieu sous anesthésie générale de 5 minutes. Pour la procédure dite curative, 24 rats recevront sous anesthésie (5minutes) une série de 5 injections intra-veineuse d'IVIG (400mg/kg/ jour pendant 5 jours) ou NaCl 9‰ à 12 semaines de vie . A partir de la 12 ème semaine, un prélèvement sanguin quinzomadaire aura lieu sous anesthésie générale de 5minutes jusqu'au sacrifice à 24 semaines.
Impact sur les animaux
L'immunisation par des antigènes bactériens pourrait engendrer une colite plus sévère et donc une perte de poids plus importante ou anticipée chez ces rats. Des points limites veilleront à surveiller cette éventualité. De plus, les rats HLA-B27 développent d'autres pathologies inflammatoires telles l'arthrite, les uvéites. Dans notre animalerie et sur le fond génétique Fischer F344, ces pathologies se développent a minima. Aucune surveillance ou prévention spécifique (mesure épaisseur articulations)n'est donc prévue. Cependant, les animaux sont observés quotidiennement et si les points limites (identiques à ceux de la colite) sont atteints, les animaux seront euthanasiés. Dans le cas où il y aurait difficulté à s'alimenter, des croquettes et de l'eau gélifiée seraient disposés dans la cage afin d'en faciliter l'accès.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront sacrifiés et différents organes seront prélevés pour étudier la réponse immune muqueuse, et l'état inflammatoire de nos rats.
Remplacement
Il est nécessaire de travailler in vivo pour reproduire la physiopathologie complexe des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin: les interactions entre le microbiote, la barrière intestinale et le système immunitaire sont indispensables pour étudier la réponse humorale envers les bactéries commensales. Il n'existe pas d'autres méthodes capables de reproduire in vitro ce processus physiopathologique.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu par groupe est de n=8 sur la base de la puissance statistique des tests utilisés (intégrant la dispersion des valeurs individuelles, déterminés auprès de la littérature et suite à des expériences pilotes). Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non paramétriques pour petits échantillons (tests de Kruskal et Wallis, Wilcoxon Mann Whitney, corrélation de Spearman). Pour la deuxième procédure, une expérience préliminaire nous permettra de déterminer le meilleur timing d'injection afin de pouvoir analyser les données générées dans de bonnes conditions.
Raffinement
Les rats sont élevés sur place donc pas de transport et de changement d'environnement, uniquement changement de portoirs. Procédures classiques: minimum de bruits, enrichissement des cages et respect du nombre d'animaux par cages, manipulation calme et douce. Les animaux en phase expérimentale seront observés quotidiennement et pesés de façon bi-hebdomadaire avec une attention particulière aux points limites suivants: modifications du comportement (poils hérissés, prostration, cris, blessures) et perte de poids supérieure à 15%.
Choix des espèces
Le rat transgénique HLA-B27 est utilisé comme modèle expérimental de maladies inflammatoires dont les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Le modèle de colite spontanée chez ce rat s'inscrit dans le cadre d'une maladie systémique comme chez l'homme. Pour les 2 procédures, les animaux utilisés auront de 6 à 24 semaines de vie pour un suivi longitudinal de la réponse humorale.
Système nerveux central : Fonction cognitive
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2650
4 900 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils passent des tests cognitifs mêlant exploration, récompenses alimentaires et chocs électriques brefs (jusqu'à quatre secondes, répétables vingt fois par jour) et reçoivent des substances à tester pendant jusqu'à dix-huit semaines. Le croisement du champ structuré et de la narration indique que 980 animaux contrôles sont réutilisés et 3 920 tués à l'issue. Le porteur qualifie les chocs de "brefs et de faible intensité" sans blessure, et affirme que ces tests comportementaux ne peuvent être remplacés par des méthodes alternatives.
Objectifs
Les déficiences cognitives apparaissent souvent avec le vieillissement des personnes. Elles sont également présentes dans les maladies neurodégénératives telles Alzheimer ou Parkinson et des troubles neuropsychiatriques comme la schizophrénie. Les fonctions cognitives regroupent en particulier la mémoire , l'attention, le language, fonctions exécutives (logique, stratégie, planification, raisonnement) et fonctions visuo-spatiales (orientation). Ces déficiences affectent la qualité de vie des patients et de leur entourage et à ce jour, il n'existe pas de traitements efficaces de ces déficiences: Donepezil et memantine n'ont pas montré une réélle efficacité pour réduire les troubles cognitifs dans la maladie d'Alzheimer. De même, les antipsychotiques permettent le traitement des symptômes positifs et négatifs (sociabilité) de la schizophrenie mais pas les déficits cognitifs (en particualier flexibilité / adaptation). L'objectif du projet est donc permettre le développement de nouveaux modèles et l’utilisation de tests comportementaux pour étudier l'efficacité de nouveaux traitements afin d’atténuer ces troubles cognitifs. Ces tests peuvent également permettre d’établir le profil de sécurité au niveau des fonctions cognitives de nouvelles substances médicamenteuses avant leur passage chez l’homme, et ce dans le cadre des recommandations européennes, américaines ou japonaises en vue de l’obtention des autorisations de mise sur le marché.
Bénéfices attendus
L’absence de traitement totalement efficace chez l'Homme pour traiter les troubles cognitifs liés au vieillissement, maladie d'Alzheimer , de Parkinson, schizophrénie ou tout autre pathologie neurologique et/ou psychologiques rend nécessaires l’utilisation de modèles murins pour la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces. Ces études permettent également d’établir un profil de sécurité de nouveaux médicaments pour éviter de mettre sur le marché des traitements qui pourraient avoir de forts effets secondaires sur les fonctions cognitives.
Procédures
Les procédures utilisées sont basées sur 1) l'exploration d'environnements, d'objects, de congénères pour une durée maximum de 30 minutes), 2) des renforcements positifs (récompense alimentaire) 3) des renforcements négatifs (chocs électriques brefs max 4 sec). Ces procédures peuvent être répétées quotidiennement (20 fois maximum). Dans chacune des procédures, les animaux sont traités avec la substance d’essai en une ou plusieurs occasions, la voie et la durée du traitement étant adaptés aux besoins de l’étude (en général, maximum 18 semaines).
Impact sur les animaux
Les procédures utilisées sont principalment basées sur l'exploration de nouveaux environnements, objects, congénères..., des renforcements positifs (récompense alimentaire) ou négatifs (chocs électriques). Les enceintes d'exploration et objects sont conçu de sorte à ne pas engendrer de blessure (absence de bord tranchant...); les chocs électriques sont brefs et de faible intensité, n'induisant pas de blessure (brûlure) ou décès. Ces procédures n'engendrent pas de réelle souffrance mais selon les stimuli utilisés, leur durée et fréquence, elles peuvent engender un léger stress sont donc classées en légère ou modérée. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux molécules testées
Devenir
Tous les animaux contrôles peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire.
Remplacement
Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux face à différentes tâches permetttant l'évaluations des capacités cognitives (reconnaissance spaciale (visuelle). reconnaissance sociale (olfactive), mémoire associative (évitement d'un stimuli potentiellement aversif).
Réduction
La stratégie expérimentale consiste à comparer, les groupes recevant la substance à tester à un groupe contrôle déficitaires, l'objectif étant de réduire les déficits observés par le veillisement ou les agents pharmacologiques tentant de mimer les maladies telles Alzheimer (scopolamine) ou Schizophrenie (PCP ou MK-801). Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet ou plusieurs agents en comparaison par rapport à un groupe contrôle. Compte tenu de la variabilité inter-individuelle de ces mesures comportementales, 12 à 15 rongeurs minimum sont nécessaires pour disposer de la puissance statistique suffisante et nécessaire pour comparer les différents groupes expérimentaux. Une analyse de variance à un facteur ou plusieurs factuers sont utilisés pour comparer les groupes entre eux ainsi que des paired Student's t tests pour comparer les performences individuelles (intra group comparaison).
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant d'euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger, tunnel, présence de congénères. Les méthodes analytiques choisies sont suffisamment sensibles pour effectuer l'intégralité des mesures sur chaque animal et donc de limiter la répétition des études. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le comportement de rongeurs est prédictif de leur efficacité en clinique. Dans le cadre de démence ou pathologies liès au veillissement, des rongeurs âgés de 18 à 24 mois seront utilisés. Dans le cadre d'autres pathologies psychotiques ou les troubles cognitifs peuvent apparaitre dès l'adolescence, des rongeurs de 6 à 10 semaines seront utilisés.
Analyse des cascades moléculaires du développement de la crête neurale
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
200 xénopes femelles vont être utilisées, réutilisées et non tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une stimulation hormonale pour produire des ovocytes, jusqu'à trois fois par an sur une période reproductive de quinze ans, sans autre geste. Le porteur mentionne par ailleurs que les mâles sont tués pour prélever leurs testicules destinés à la fécondation in vitro, sans que ces mises à mort soient comptées dans le projet. Il affirme que l'usage d'animaux vivants revêt un caractère de "stricte nécessité" faute de lignée cellulaire et d'ovocytes commerciaux.
Objectifs
La crête neurale (CN) est une population cellulaire spécifique de l’embryon des Vertébrés, qui donne naissance à différentes structures telles que le système nerveux périphérique, les cellules pigmentaires, les os et cartilages de la face et du crâne. Des anomalies du développement ou de fonctionnement de la CN sont responsables d’un grand nombre de syndromes ou malformations néonataux. De même, certains cancers résultent de la transformation tumorale de cellules issues de la CN. L’étude des mécanismes qui contrôlent la formation de la CN et sa différenciation est donc cruciale pour en comprendre les dérégulations. De plus, précocement dans l’embryon, les cellules de la CN subissent un processus appelé « transition épithelio-mésenchymateuse (TEM) », qui leur permet de migrer à travers l’embryon vers de multiples organes ou tissus cibles, où elles se différencient en cellules spécifiques. La TEM est un mécanisme général complexe, permettant à des cellules migrer en petits groupes ou de devenir des cellules migrantes individuelles et c’est ce processus que l’on retrouve lors de la formation de métastases. La CN est donc un modèle de choix pour étudier le contrôle de la TEM, comprendre comment ce phénomène est activé et régulé dans l’embryon et comparer ces régulations aux phénomènes de TEM tumorale. Le projet proposé concerne l’analyse des molécules qui contrôlent le développement de la crête neurale et notamment la mise en place de la TEM. Ce programme tire parti d’outils moléculaires sophistiqués créés spécifiquement chez l’embryon d'amphibien. Le projet utilisera des embryons de Xenopus laevis.
Bénéfices attendus
Xenopus laevis, espèce tétrapode non mammifère, est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés en général car ces mécanismes sont fortement conservés évolutivement. De plus cette espèce est évolutivement plus proche des mammifères que le poisson téléostéen. Les études réalisées à partir de ce modèle permettent de mieux comprendre les processus développementaux des modèles tétrapodes mammaliens dont l’homme, comme ceux des autres vertébrés. En outre, l’analyse du génome de Xenopus montre d’importantes similitudes avec le génome humain, notamment 79% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont des orthologues chez Xenopus laevis et tropicalis. Notre projet permet donc d'identifier des mécanismes moléculaires, cellulaires et tissulaires qui éclairent les mécanismes d'induction et de diversification cellulaires au cours du développement et des cancers, ainsi que les migrations cellulaire normales et pathologiques (métastases, fibrose). Ces recherches éclairent directement la compréhension des malformations congénitales et des cancers ainsi que, à terme, les stratégies de diagnostique et de prise en charge des patients. Le modèle amphibien présente de nombreux avantages techniques tels que la facilité d’accès à ses ovocytes (ponte externe, conservation des femelles), l’accessibilité à l’expérimentation dans le milieu de culture des embryons et l’abondance du matériel d’expérimentation (milliers d'œufs par ponte). L’utilisation de cette espèce permet donc de réduire le nombre de femelles adultes utilisées et de remplacer l’emploi de femelles mammifères.
Procédures
Injection sous cutanée d’une substance non toxique et indolore en une seule administration sur animaux vigiles tous les 4 mois.
Impact sur les animaux
Les femelles seront utilisées uniquement pour la production d’ovocytes. En dehors de la stimulation hormonale, les animaux ne subiront aucun geste. Aucune nuisance n’est donc attendue ici.
Devenir
les femelles retournent en élevage dans les animaleries.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants revêt un caractère de stricte nécessité pour les raisons suivantes : - il n'existe pas de lignée cellulaire immortalisée de cellules de CN, nécessitant de préparer des cellules primaires issues d'embryons ; de plus les analyses en culture ne donnent que des réponses incomplètes des mécanismes in vivo - les analyses in vivo sont indispensable à l'analyse des signalisations endogènes et des migrations cellulaires - il n’existe pas de solution commerciale pour la fourniture d’ovocyte. - le but étant d'étudier le développement des cellules de la crête neurale et la TEM in vivo, il est nécessaire que cela se fasse à l'échelle de l'organisme
Réduction
Pour réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet, nous prenons en compte que : - Nos analyses fonctionnelles sont restreintes aux stades embryonnaires antérieurs à la forme larvaire autonome. - Les femelles ont une période reproductive longue (15 ans et plus), et peuvent donc être induites à pondre de nombreuses fois pendant cette période. Ceci permet donc de restreindre le nombre d'animaux utilisés. Par ailleurs, l’induction hormonale de la ponte constitue la seule méthode pour obtenir en grande quantité des embryons. De plus le recours à la fécondation in vitro permet d'obtenir le développement synchrone des embryons et des stades précis, en nombre suffisant pour satisfaire aux analyses statistiques (tests de conformité à un standard). Il s'agit de la seule façon d’obtenir des ovocytes matures de manière non invasive (sans chirurgie). - De plus, bien que le sacrifice d’animaux qui n’ont subi aucun geste expérimental et qui ne présentent pas de phénotype dommageable ne nécessite pas d’autorisation de projet, il est à noter que les testicules des mâles euthanasiés disséqués pour la fécondation in vitro sont utilisés pour plusieurs expériences et par plusieurs expérimentateurs minimisant ainsi le nombre de mâles sacrifiés.
Raffinement
Dans le but de réduire le plus possible toute douleur, souffrance ou stress, nous utilisons les femelles par roulement. Nous limitons les stimulations hormonales à 3 par an (une tous les 4 mois).
Choix des espèces
L'amphibien Xenopus laevis est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. Il occupe une place phylogénétique-clé (vertébré tétrapode non-mammifère). Le génome est séquencé. Nous disposons à présent des génomes pour deux espèces : X.tropicalis et X.laevis et l’analyse montre d’importantes similitudes avec le génome humain, notamment 79% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont des orthologues chez Xenopus laevis ou tropicalis. X.laevis est un modèle de choix en biologie du développement. En effet, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire. Les ovocytes sont récupérés par pontes externes (i.e. par une procédure non invasive) qui peuvent être obtenues toute l'année après stimulation hormonale. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses d’embryologie expérimentale dès la fécondation et une observation non-invasive à tous les stades. Tout comme le poisson zèbré, le xénope fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Il s’agit d’animaux adultes ayant atteint la maturité sexuelle pour qu’ils puissent se reproduire.
Suivi par imagerie de peptides pour le traitement de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sous anesthésie gazeuse, elles reçoivent une injection intraveineuse unique d'un peptide marqué par fluorescence, puis cinq séances d'imagerie, avant mise à mort et prélèvement du cerveau pour vérifier le passage de la barrière hémato-encéphalique. Le porteur limite les nuisances déclarées au stress de préhension lors des pesées et des anesthésies. Il indique avoir sélectionné les peptides par modélisation informatique et tests in vitro en amont, mais affirme que la confirmation du passage "impose" le recours à l'animal.
Objectifs
La Maladie de Parkinson (MP) fait partie des maladies neurodégénératives progressives qui affectent le système nerveux central (SNC) entraînant la mort des cellules nerveuses. Elle est la deuxième maladie neurodégénérative et sa prévalence augmente fortement avec l'âge. Elle est associée à la perte de neurones dans le cerveau et dans les neurones survivants, on observe la présence d’agrégats de protéines qui perturbent leurs fonctionnements. La plupart des thérapies actuelles n'atteignent pas leurs cibles car elles sont incapables de traverser la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE), elles procurent un soulagement temporaire des symptômes mais elles sont aussi accompagnées d’effets secondaires graves. Par conséquent, il existe un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'une des stratégies non invasives les plus prometteuses pour l'administration de médicaments au SNC est l'utilisation de peptides pénétrant les neurones mais capables de passer la BHE. Parmi les cibles potentielles, le gène LRRK2 appelé « Dardarine », du mot basque dardara signifiant « tremblement », a été identifié. Ce gène interagit avec une protéine (PP1), cette interaction entraine des mutations du gène LRRK2 identifiées dans la MP. Des peptides interférents (IP) ciblant l'interaction PP1/LRRK2ont été développés dans le cadre de ce projet ANR afin de disposer de nouveaux outils pour aider à comprendre cette interaction et sa signification biologique dans la MP. Ces molécules sont économiques, chimiquement polyvalentes et non immunogènes. Récemment, plusieurs peptides pour la délivrance cérébrale ont été décrits. Parmi les peptides synthétisés, six peptides ont été sélectionnés et associés à trois navettes pour générer des peptides bifonctionnels capables de traverser la BHE et de bloquer l'interaction PP1/LRRK2 dans les neurones du cerveau. Nos objectifs sont de suivre la distribution et la localisation des six peptides marqués avec le fluorochrome Cyanine 7 chez la souris et valider leur capacité à passer la BHE. A l'issue de cette évaluation, le meilleur peptide sera sélectionné et une étude de dose sera réalisée.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson est une pathologie neurodégénérative et un problème de santé publique. Il existe aujourd'hui des traitements symptomatiques mais ayant une efficacité limitée dans le temps. La recherche d’un traitement curatif efficace pour cette pathologie est donc une nécessité. Ce projet s’intègre dans une approche translationnelle pour permettre l’identification de peptides thérapeutiques pour traiter la MP, et prévenir l’apparition d’effets indésirables graves et fréquents. Ce projet permettra non seulement de confirmer que les peptides sont capables de traverser la BHE mais également, d’envisager leurs utilisations chez les patients atteints de la MP pour prévenir les troubles invalidants. Ces nouveaux traitements permettront d'avoir un bénéfice direct pour les patients et leurs entourages ainsi qu'un bénéfice pour la société en évitant des troubles comportementaux ayant d'importantes conséquences médico-sociaux-économiques.
Procédures
Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vigiles. Les souris seront soumises à 2 pesées (réalisées sur animal vigile), chaque pesée durera moins de 30 secondes. Afin d'éviter du stress et de l'inconfort aux animaux, l'injection intraveineuse unique de peptide sera réalisée sous analgésie locale couplée à une anesthésie gazeuse (l'anesthésie dure maximum 5 minutes). Les imageries de fluorescence, un total de 5 imageries de 5 minutes maximum par souris sur toute la durée de la procédure, seront réalisées sous anesthésie gazeuse. A la fin de la procédure, un prélèvement sanguin unique et terminal sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés, ce prélèvement dure maximum 5 minutes.
Impact sur les animaux
Du stress lié à la préhension des souris pourra être généré lors de la pesée des animaux, deux pesées de moins de 30 secondes seront réalisées. Du stress pourra également être généré au moment de la préhension de la souris pour l'analgésie oculaire (moins de 30 secondes) et lors de l'anesthésie gazeuse, cette dernière dure environ 5 minutes. Une seule injection intraveineuse rétro-orbitaires sur souris anesthésiée sera réalisée (moins de 30 secondes). Du stress pourra être généré lors des anesthésies gazeuses nécessaires pour réaliser les imageries sur les souris (5 imageries maximum/souris).
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de pouvoir prélever les cerveaux qui seront imagés par fluorescence afin de confirmer que le(s) peptide(s) ont passé la barrière hémato-encéphalique.
Remplacement
L'objectif étant de confirmer que des peptides ont la capacité de passer la barrière hémato-encéphalique (BHE), ceci impose d'avoir recours à des animaux pour atteindre l'objectif. Par contre, des études de modélisation informatiques ont permis de désigner des peptides d'intérêt. Une vingtaine de peptides générés vont être évalués in vitro sur un modèle mimant la BHE par une monoculture de cellules endothéliales capillaires cérébrales avec un milieu conditionné par des astrocytes dans un transwell système. Six candidats potentiels seront été retenus et seront évalués dans ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, seuls 6 peptides couplés à un fluorophore seront évalués. Nous avons également fait le choix de n'utiliser qu'une seule posologie (5mg/kg) pour chaque peptide afin de sélectionner le meilleur candidat et ce, dans le respect du principe de réduction. Le choix de la posologie s'est basé sur des données d'imagerie antérieures utilisant des peptides pour le traitement d'autres pathologies. En conséquence, le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre de souris par groupe, 4 souris par peptide afin d’obtenir des résultats exploitables et valides. Nous comparerons les moyennes de fluorescence cérébrale des différents peptides (loi normale par un test de Bartlett puis analyses des moyennes par un test ANOVA).
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant 4-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure qui a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Il s'agit d'une procédure de classe légère, du stress pourra être généré lors la préhension des animaux pour les pesées (durée de moins de 30 secondes par animal). Afin de limiter le stress et l'inconfort de l'animal, une analgésie oculaire sera mise en place par l'utilisation d'un collyre ophtalmique. Les souris seront ensuite endormies par anaesthésie gazeuse et les peptides seront injectés par voie intraveineuse (durée de moins de 30 secondes par animal). Les souris seront ensuite imagées à différents temps sous anesthésie gazeuse (5 imageries par animal d'une durée de 5 minutes chacune). Tout au long de la procédure, les souris seront suivies, le registre de soins complété en se rapportant à la grille de suivi de soins.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé pour l’étude par imagerie. De ce fait, nous utiliserons des souris, de la souche Swiss non consanguines, qui sont couramment utilisées pour les études de pharmacologie et de distribution. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 7 semaines, adultes et matures sexuellement, dont le poids varie entre 20-30 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors d'étude d'imagerie et de distribution de produits.
Immunomodulation sélective par des immunocytokines contenant des variants d’une cytokine immonomodulatrice
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
10 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie, dont le système immunitaire est reconstitué avec des cellules humaines, reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des traitements répétés, développant des tumeurs mesurées jusqu'à une "taille éthique" et des symptômes de perte de poids et de poils hérissés. Le porteur écrit que l'administration d'un anti-douleur "n'est pas pertinente" pour ces effets indésirables. Il conclut que cette étape chez la souris est "indispensable" pour tester ce type de traitement anticancéreux avant un passage chez l'humain.
Objectifs
Le système immunitaire est impliqué dans le contrôle des infections par des pathogènes viraux ou bactériens et également dans le contexte des cancers. La réponse immunitaire résulte notamment de l’activation de différents types de lymphocytes T dont certains ont une action plutôt positive (cellules T effectrices) et d’autres ont une action plutôt négative et inhibitrice des cellules T effectrices (cellules T régulatrices). Les cellules T inhibitrices sont néanmoins importantes pour limiter les pathologies auto-immunes c’est-à-dire éviter que la réponse immune se mette en place contre notre propre organisme. Il est donc important de développer des thérapies capables d’activer de façon distincte soit les réponses positives effectrices soit les réponses inhibitrices régulatrices. Notre projet consiste à évaluer l’une de ces approches thérapeutiques en utilisant une molécule naturellement produite par le système immunitaire que nous modifions pour lui donner la capacité d’agir plutôt sur les cellules T activatrices ou plutôt sur les cellules T inhibitrices. Cette molécule non modifiée a déjà été testée chez l’Homme et a montré des effets secondaires importants mais en nous appuyant sur nos résultats antérieurs et sur nos brevets, l'équipe a identifié des modifications de la molécule permettant des fonctions plus spécifiques et ainsi limiter les effets indésirables. Notre objectif principal est d'évaluer dans des essais précliniques l'efficacité de ces produits pour contrôler la croissance des tumeurs en utilisant des modèles de tumeurs transplantables chez l‘animal, et de les combiner à d’autres immunothérapies bloquant certaines voies inhibitrices de la réponse immune. Par ailleurs, ce projet permettra d’expliciter les mécanismes d’action des molécules testées afin d’optimiser les traitements et constitue une étape préalable aux essais cliniques chez les patients.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour but d’évaluer dans des essais précliniques des molécules modifiées pour agir sur le système immunitaire et permettre un meilleur contrôle de la croissance tumorale. Par ailleurs, cette étude permettra d’analyser les mécanismes d’action de ces molécules et leur éventuelle toxicité et ainsi faire progresser les connaissances scientifiques dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les résultats devraient conduire à une meilleure approche thérapeutique antitumorale, seule ou en combinaison avec d’autres thérapies antitumorales pour les essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
Dans une 1ere procédure qui vise à évaluer des immunothérapies dans des souris humanisées porteuses de tumeur, les souris vigiles sont injectées par voie intraveineuse avec des cellules immunes humaines, 1 fois par expérience. L’ensemble des animaux de cette procédure sont injectés vigiles par voie sous-cutanée avec des cellules tumorales, 1 fois par expérience. Ils reçoivent également des traitements par voie intra-peritonéale 1 à 2 fois par semaine. La reconstitution en cellules immunes humaines est suivie à l’aide de prélèvements de sang réalisés sur animal vigile ou anesthésié (durée de l'anesthésie
Impact sur les animaux
Les souris immunodeficientes reconstituées avec des cellules immunes sanguines humaines peuvent développer des symptômes de perte de poids ou de poils hérissés à partir de 3-4 semaines environ après l’injection des cellules humaines qui s’intensifient au cours du temps. Les souris immunodeficientes reconstituées avec des précurseurs hématopoïétiques humains peuvent développer également les symptômes décrits ci-dessus mais beaucoup plus tardivement (> 2 mois) et moins fortement. Les souris qui sont greffées avec des lignées tumorales (humaines ou murines) développent donc une tumeur qui est mesurée régulièrement et les souris seront euthanasiées si la taille éthique est atteinte. Aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’administration des traitements par voie intrapéritonéale.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour analyses post-mortem
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de cellules humaines de donneurs sains. Après des étapes in vitro pour caractériser et sélectionner des IL2V et ICK potentiellement thérapeutiques, et sachant que la tumeur interagit avec l'ensemble de son environnement in situ (vascularisation, stroma…) pour se développer, l'évaluation pré-clinique des traitements est nécessaire dans un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (culture et test fonctionnels in vitro, analyse de base de données de patients…), cette étape chez la souris est indispensable pour tester l'efficacité et le mécanisme d'action de ce type de traitement avant d'envisager une application clinique chez l'Homme en thérapie anti-cancéreuse
Réduction
Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans les conditions réglementaires et l'administration d'un anti-douleur n’est pas pertinente pour diminuer les effets indésirables potentiels . Les souris sont surveillées régulièrement et elles sont mises à mort lorsque les points limites sont atteints.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment car la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. En effet, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées ainsi que des modèles de tumeurs spontanées qui sont disponibles. Les souris C57BL/6, Balb/c et NSG seront utilisées à l'âge adulte à partir de 6 semaines afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. Les souris humanisées sont reconstituées à l’âge adulte et utilisées environ 18 à 24 semaines après la greffe des cellules CD34+.
Etudes chez la souris des altérations des fonctions cognitives résultant de mutations d’un gène associé à l’autisme
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
468 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Porteuses d'une mutation liée à l'autisme, elles sont soumises à des tests comportementaux d'apprentissage, de mémoire spatiale et de mémoire sociale, et des femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale pour injecter un marqueur fluorescent dans le cerveau des embryons. Les prélèvements se font après mise à mort, les animaux modifiés n'étant pas replacés pour éviter la dissémination de la mutation. Le porteur affirme que le développement du cortex ne peut être entièrement modélisé in vitro et exclut un modèle invertébré.
Objectifs
Les maladies neurodéveloppementales telles que les troubles de l’autisme, l’épilepsie, certains retards mentaux ou encore déficits cognitifs (ex : la mémoire) résultent de la perturbation du développement cérébral chez l’embryon et pendant la petite enfance. De récentes études ont révélé qu’un certain nombre de mutations sont impliquées dans le développement de ce type de pathologies. Ce projet a pour but d’étudier un gène qui joue un rôle central dans le développement des terminaisons des cellules nerveuses (les axones) dans le système nerveux central. Des mutations dans ce gène sont associées à la pathologie autistique. L’absence de ce gène chez la souris entraîne des anomalies du développement cérébral et du comportement (notamment des altérations de la mémoire sociale et des défauts de mémoire spatiale à long terme). Cependant les mutations de ce gène et retrouvées chez les patients autistes n’ont jamais été étudiées chez la souris. Ce projet est divisé en 3 procédures et se déroulera sur 3 ans : -La première procédure consistera à caractériser le nouveau modèle de souris possédant la mutation du gène d’intérêt identifiée chez l’homme. Cette caractérisation reposera sur la comparaison de souris contrôles (non mutées) et de souris porteuses de la mutation liée à l’autisme par une analyse systématique de la viabilité et de la croissance des premières portées. -La seconde procédure visera à analyser le développement des neurones et la formation des circuits du cortex cérébral grâce à une technique chirurgicale sur des femelles gestantes. Cette méthode permet de marquer des neurones pour observer les conséquences de la mutation dans le cortex cérébral de la souris. -La troisième procédure aura pour but de tester les conséquences des mutations du gène étudié sur les fonctions cognitives à l’aide d’une série de tests comportementaux en regardant notamment l’apprentissage, la mémoire spatiale et la mémoire à long terme. Nous aborderons, en plus des déficits cognitifs, d’autres symptômes associés aux troubles du spectre autistique, tels que les troubles de la communication et de la mémoire sociale.
Bénéfices attendus
Il est important de comprendre comment les gènes, lorsqu’ils sont mutés, entraînent des maladies, pour améliorer le diagnostic et le conseil aux familles, et imaginer des pistes thérapeutiques. La création d’un nouveau modèle de souris permet de suivre quelles étapes du développement embryonnaire sont affectées et conduisent à l’installation de la maladie. Ceci ne peux pas être réalisé chez l’homme car ces mutations sont détectées après le diagnostic, quand la maladie est déclarée. Ce projet étudiera donc un nouveau modèle murin qui mime mieux la pathologie humaine et permettra 1) de valider le caractère pathologique des mutations de ce gène dans les troubles du neurodéveloppement et plus largement 2) une meilleure connaissance des causes des pathologies neurodéveloppementales.
Procédures
L’essentiel des expériences seront observationnelles afin de caractériser la lignée. Les animaux seront de plus soumis à des tests d’exploration des fonctions comportementales, non invasifs, et non douloureux, mais qui nécessiteront de manipuler régulièrement les animaux. Pour pouvoir étudier les défauts de formation des réseaux de neurones liés à la mutation génétique, les animaux subiront une chirurgie avec réveil (procédure 2). Cette procédure chirurgicale est rapide et consiste à injecter un marqueur fluorescent dans le cerveau des embryons. La chirurgie sera réalisée chez les femelles gestantes, sous anesthésie gazeuse (isoflurane) et en respectant les règles d’analgésie et d’asepsie chirurgicale. La durée de la chirurgie n’excèdera par 30 minutes et sera réalisée une seule fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances les plus sévères qui aient jamais été observées pour le gène d'intérêt chez la souris sont un retard de croissance, des défauts modérés de connectivité cérébrale et une perturbation de la mémoire à long terme. Dans ce projet, nous nous attendons à des manifestations moins sévères car la mutation étudiée n’abolit qu’une partie des fonctions du gène. La procédure d'élevage nécessite l’identification et la biopsie des animaux en vue de la réalisation du génotypage, selon la procédure en vigueur dans l’établissement utilisateur. Des animaux reproducteurs pourront être hébergés isolément afin d’éviter les comportements d’agression tout particulièrement suite aux accouplements. Cet isolement sera dans la mesure du possible limité dans le temps. Une procédure chirurgicale (procédure 2) implique une ouvertude de la cavité abdominale. Cette procédure est bien maîtrisée par les expérimentateurs. Elle sera réalisée sous anesthésie générale avec analgésie péri- et post-opératoire, ainsi qu’un suivi post-opératoire adapté. Dans de très rares cas, cette technique peut entraîner une difficulté à la mise bas ou une mortalité intra-utérine d’embryons.
Devenir
Les animaux inclus dans ce projets sont des animaux génétiquement modifiés pour porter une mutation retrouvée chez des patients atteints de troubles autistiques. Il n'est pas envisageable de replacer les animaux à l'issue de ces procédures pour s'assurer que la mutation introduite ne dissémine pas hors du laboratoire. Par ailleurs ce projet nécessite la réalisation de prélèvements post-mortem pour atteindre ses objectifs scientifiques.
Remplacement
Ce projet a pour objectif de mieux caractériser les altérations comportementales dans un modèle murin possédant la mutation de novo d'un gène d'autisme et d’identifier des défauts dans les circuits neuronaux soulignant ces altérations cognitives. En préalable à ce projet, nous avons réalisé des expériences in vitro prouvant que la mutation étudiée altère la fonction du gène d'intérêt, ce qui nous permet de nous assurer que l’étude est pertinente. Néanmoins dans l’état actuel des connaissances scientifiques, les étapes de développement du cortex cérébral et la mise en place des circuits neuronaux ne peuvent être modélisés entièrement in vitro. L’approche in vivo est une nécessité afin d’aborder des troubles complexes de la cognition et du comportement. L’étude de circuits corticaux nécessite d’avoir recours à un animal possédant une structure corticale et par conséquent empêche le remplacement par un modèle invertébré.
Réduction
Les accouplements seront optimisés afin de produire strictement le nombre nécessaire d’animaux pour la caractérisation initiale du modèle (procédure 1). Une partie des animaux issus de la procédure 1 pourra être utilisés pour les tests comportementaux pour compléter les cohortes (procédure 3), nous évitant ainsi de générer de nouveaux individus. Le nombre d’animaux utilisés en procédure 3 est limité au minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats, ce qui sera analysée au moyen d'un test statistique adapté. Pour le test de sociabilité, utilisant en plus des congénères étrangers, nous aurons recours si possible à des animaux déjà présents dans l’animalerie, dans le but de ne pas commander d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Les animaux étant élevés et hébergés dans une animalerie agréée, les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins seront appropriées en fonction de leur âge et de leur sexe selon les procédures en vigueur à l’animalerie dans le respect du bien-être animal. La procédure chirurgicale (procédure 2) est bien maîtrisée par les expérimentateurs et sera réalisée uniquement par un chercheur expérimenté. Un recours à l’analgésie péri-opératoire, ainsi qu’à une analgésie post-opératoire (calibrée par rapport à une grille d’évaluation de la douleur) nous permettra de limiter le stress et la douleur subis par les mères. Concernant les évaluations comportementales (procédure 3), les animaux sujets aux tests de comportement seront acclimatés à la salle de test au préalable afin de réduire le stress causé par un nouvel environnement. Les différents tests seront réalisés les uns à la suite des autres, avec un temps de pause d’au moins une semaine entre chaque test pour limiter un stress éventuel des animaux. A noter que les tests de comportement ne sont pas invasifs et ne portent pas atteinte à l’intégrité de l’animal.
Choix des espèces
L'architecture du cerveau de la souris est très proche de l'architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales telles l'autisme et:ou les déficiences mentales. Par ailleurs, des études précédentes nous ont permis de décrire que le gène d'intérêt est associées à la pathologie autistique et que son inactivation perturbe le développement cérébral et le comportement chez la souris. Puisque ce projet vise à établir un nouveau modèle murin de trouble du neurodeveloppement/autisme, il est nécessaire de suivre les animaux depuis la naissance jusqu'à un stade adulte, afin de caractériser l'évolution des phénotypes chez la souris. Une procédure se déroulera sur des femelles gestantes car les perturbations du développement cérébral surviennent dès l'embryon.
Implication de la phospholipase D2 exosomale dans la métastase osseuse issue du cancer de la prostate
- Recherche fondamentale
- Oncologie
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Des exosomes puis des cellules de cancer de la prostate sont injectés dans leur tibia pour reproduire des métastases osseuses, connues pour provoquer douleurs et fractures chez l'humain, un suivi radiographique servant à anticiper le point limite de dégradation de l'os. Les souris sont ensuite tuées pour analyser la colonisation osseuse. Le porteur affirme que l'ancrage osseux des cellules cancéreuses ne peut être apprécié in vitro.
Objectifs
Le cancer de la prostate est une tumeur maligne qui peut se propager dans tout l'organisme : on dit alors que la tumeur a métastasé. Les cellules de cancer de la prostate atteignent préférentiellement l’os, ou elles vont être responsables d’une destruction massive de l’os. Ces métastases génèrent de grandes douleurs et des fractures pathologiques et pouvant même engager le pronostic vital des patients. A l’heure actuelle, les métastases osseuses sont incurables et les traitements sont donnés uniquement pour améliorer la qualité de vie des patients. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par le biais desquels les métastases osseuses dérivant d’un cancer de la prostate se forment afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les exosomes sont des petites vésicules produites par les cellules cancéreuses. Il a été observé récemment que les exosomes sont capables de préparer le terrain permettant un meilleur encrage des cellules cancéreuses dans le site métastatique. Cependant, le rôle de la protéine phospholipase D2 dans la formation des métastases osseuses n’est absolument pas connu. Notre projet vise à comprendre comment la présence de la phospholipase D2 dans les exosomes peut contribuer à la formation des métastases osseuses des cancers de la prostate.
Bénéfices attendus
A terme ce projet apportera des informations indispensables pour limiter la rechute métastatique à l’os des cancers de la prostate et d’améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Le projet comprend plusieurs étapes qui ne seront menées qu’après validation d’étapes précédentes. La prise en charge de la douleur sera appliquée de façon permanente avec les méthodes adaptées. Les animaux seront tout d’abord anesthésiés sous isoflurane pour une durée maximale de 10 minutes, maintenus à 37°C et un gel anesthésiant de lidocaïne sera placé sur leur dos. Au cours de cette période ils recevront une injection d’une suspension d’exosomes dans un vaisseau de la queue qui durera moins d’une minute. La durée totale de cette intervention sera de 1 jour. Cette étape a pour but de valider la dissémination à l’os d’une suspension d’exosomes provienant d’une lignée de cellules cancéreuses. Uniquement si cette intervention donne des résultats positifs une seconde intervention sera effectuée avec des suspensions d’exosomes d’origines différentes. Une intervention suivante se déroulera en deux étapes. Les animaux seront anesthésiés (anesthésie/analgésie chimique) par injection intra-péritonéale. Le geste d’injection durera moins d’une minute et la durée totale d’anesthésie durera au maximum de 30 minutes afin d'injecter une suspension de cellules tumorales directement dans le tibia dont le geste durera moins d’une minute. La durée totale de cette intervenrion sera de 28 jours. Uniquement si cette intervention donne des résultats positifs une seconde intervention sera réalisée. En début de cette intervention puis une fois par semaine pendant 4 semaines, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane pour une durée maximale de 10 minutes, maintenus à 37°C et un gel anesthésiant de lidocaïne sera placé sur leur dos. Au cours de cette période ils recevront une injection d’une suspension d’exosomes dans un vaisseau de la queue qui durera moins d’une minute. A l’issue de cette période de 4 semaines les animaux seront anesthésiés (anesthésie/analgésie chimique) par injection intra-péritonéale. Le geste d’injection durera moins d’une minute et la durée totale d’anesthésie durera au maximum de 30 minutes afin d'injecter les cellules tumorales directement dans le tibia dont le geste durera moins d’une minute. La durée totale de cette intervention sera de 56 jours. Dans ces deux dernières interventions les animaux seront anesthésiés pendant 10 minutes par anesthésie gazeuse 7 jours après l’injection des cellules cancéreuses puis chaque semaine pendant 4 semaines et en fin d’expérimentation afin de procéder à l’analyse non invasive du tissu osseux par radiographie
Impact sur les animaux
La formation de métastases osseuses a pour caractéristique chez l’homme d’induire des douleurs. On sait que ces douleurs sont dues à la dégradation de l’os. Dans le but de réduire la douleur des animaux les procédures 1 et 2 seront arrêtées 1 jour après l’injection des exosomes et pour les procédures 3 et 4, 28 jours après l’injection des cellules tumorales. La quantification des métastases osseuses sera suivie de façon hebdomadaire par radiographie afin d’anticiper le moment d’apparition du point limite de dégradation osseuse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de pouvoir évaluer post-mortem in vitro la colonisation osseuse des exosomes et le developpement tumoral osseux.
Remplacement
L’influence que peut avoir la phospholipase D2 des exosomes sur des phénomènes tumoraux tels que la colonisation et l’ancrage osseux des cellules cancéreuses lors de la formation des métastases ne peut pas être appréciée par des tests in vitro. L’utilisation d’une lignée cellulaire d’origine humaine de la prostate que nous avons préalablement testée in vitro pour sa capacité à être invasive nous permettra de reproduire chez la souris le plus fidèlement possible la situation pathologique du cancer de la prostate chez l’homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, le projet comprend plusieurs étapes dont certaines seront menées uniquement après validation de certaines étapes précédentes. Notamment, la procédure n°2 ne sera réalisée que si la procédure n°1 donne les résultats attendus. La procédure 4 ne sera réalisée que si à la fois la procédure 1 et la procédure 3 donnent les résultats attendus. La taille des groupes a été déterminée à l’aide d’une analyse de puissance réalisée avec le logiciel BiostaTGV. Sur les 4 ans de réalisation du projet, un nombre total de 120 souris sera nécessaire.
Raffinement
Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi (maison rouge, coton) renouvelé une fois par semaine. Afin de permettre l’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement, les souris seront placées en stabulation durant deux semaines au sein de l’animalerie d’accueil sous surveillance journalière. Tous les protocoles d’injection d’exosomes et de cellules tumorales seront réalisés sur des souris anesthésiées au moment des injections. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des principaux signes physiologiques, comportementaux et de l’apparence de l’animal. Les animaux seront pris en charge au premier signe d’inconfort.
Choix des espèces
La souris CB17 SCID est couramment utilisée en oncologie. Ces souris présentant une déficience du système immunitaire nos conditions d’hébergement dans un local à air contrôlé sont adaptées à cette spécificité des animaux. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 8 semaines. Nous utiliserons des souris mâles car notre étude porte sur le cancer de la prostate.
Effet d’un régime supplémenté par un extrait végétal standardisé dans la prévention des dérèglements métaboliques et inflammatoires associés à l’obésité chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Soumis à un régime obésogène, ils reçoivent un gavage quotidien d'extrait végétal pendant trois mois, avec prélèvements sanguins répétés et tests de tolérance au glucose, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le projet vise à tester un complément alimentaire destiné aux animaux de compagnie, le rat servant d'étape avant l'espèce cible, le chien. Le porteur affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne peut remplacer le rat, qui permet en outre de prélever des organes non accessibles chez le chien.
Objectifs
Notre étude cherche à montrer qu’un extrait végétal standardisé pourrait avoir des effets bénéfiques sur la santé notamment dans le cadre de troubles métaboliques liés à l'obésité. Ce projet s’inscrit dans le cadre de la thématique de notre unité de recherche dont un des objectifs est d’améliorer le bien-être des animaux de compagnie par des approches nutritionnelles basées sur l'usage des extraits botaniques. De nombreuses études ont révélé le rôle central de la dysbiose intestinale dans l’initiation et l’entretien du syndrome métabolique. Le premier objectif de ce projet sera d’explorer l’action prébiotique potentielle (modification de la diversité microbienne intestinale) d'un extrait végétal standardisé (versus son traceur de référence, un composant majeur de cet extrait). Il aura également pour but d'étudier l'impact de cet extrait végétal standardisé et de son traceur de référence sur le profil métabolique chez des rats exposés à un régime obésogène (hyperlipidique) par leur suivi clinique et biologique. Le deuxième volet de ce projet sera consacré à explorer les effets de l’extrait végétal standardisé (versus son traceur de référence, un composant majeur de cet extrait) sur l’expression et l’activité des facteurs susceptibles de participer aux dérèglements métaboliques, oxydants et inflammatoires.
Bénéfices attendus
Les protocoles mis en œuvre dans le cadre de ce projet devraient permettre de déterminer si l’extrait végétal standardisé testé (comparativement à son traceur) est apte à prévenir l’inflammation et les perturbations métaboliques associées à l'obésité. Notre hypothèse principale est que l’action synergique des composants majeurs (acides phénoliques, flavonoïdes, anthocyanes) de l’extrait végétal standardisé étudié augmente la diversité microbienne, renforce la barrière épithéliale intestinale et améliore le profil métabolique en prévenant l’accumulation notamment de la graisse viscérale. Par ailleurs, une des stratégies visant à limiter ou réduire le processus inflammatoire associé au surpoids/obésité est également l’utilisation de probiotiques ayant la capacité de supprimer la production de facteurs pro-inflammatoires ou favoriser la synthèse de métabolites anti-inflammatoires. Les composants de l'extrait étudié pourraient avoir une action synergique et/ou additive conférant une action anti-inflammatoire et régulatrice des métabolismes lipidiques et glucidiques plus efficace en impliquant notamment un rôle des sirtuines 1 et 3.
Procédures
5 interventions : 40 rats suivront un régime obésogène (hyperlipidique) et 48 rats auront des prélèvements sanguins, 4 fois sur une période de 3 mois ; auront des recueils de selles (4 fois) ; seront gavés oralement quotidiennement pendant 3 mois; feront des tests de tolérances au glucose (1 fois par mois pendant 3 mois) et seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
L'exposition des rats au régime obésogène peut induire des troubles métaboliques, les traitements du projet viseront à les prévenir/réduire. Les protocoles peuvent induire du stress, l'habituation des rats aux protocoles tels que le gavage ou encore le test de tolérance au glucose visera à atténuer ces effets indésirables.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Le remplacement des rats n’est pas possible pour répondre aux questions du projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in-silico et in-vitro). Les rats sont utilisés afin de valider les effets de l'extrait végétal étudié avant de passer sur l'espèce cible : le chien ; pour limiter le nombre d'expérimentations sur celui-ci. L'utilisation du rat nous permet aussi d'étudier des organes, non prélevables chez le chien.
Réduction
Nous utilisons 8 rats par groupes afin d'avoir un nombre suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélèvement étant répété sur chaque rat, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.
Raffinement
L'exposition des rats au régime hyperlipidique peut induire des troubles métaboliques, les traitements du projet viseront à les prévenir/réduire. L'hébergement respecte les recommandations en vigueurs chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (mise à disposition de carrés de coton, des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). Un suivi régulier des animaux est assuré par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). Les protocoles expérimentaux sont optimisés pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus. Nous utisons des points limites adaptés et des critères d'arrêt de souffrance détaillés à chaque procédure.
Choix des espèces
Les rats sont acclimatés à l'âge de 9 semaines avant de commencer l'étude à 12 semaines (cycle de 12h jour/nuit). Cela permet d'éviter des résultats faussés par le stress induit lors du changement d'environnement. L'exposition des rats Wistar à un régime obésogène (hyperlipidique) permettra d'étudier la capacité de l'extrait végétal standardisé étudié à prévenir le développement de troubles métaboliques associés à l'obésité. Les effets de cet extrait végétal ne peuvent être étudiés de manière pertinente sur des modèles in silico et in vitro. Nous utilisons le rat en prémice de l'espèce cible (chien) afin de compléter notre étude pour valider les effets de notre extrait végétal standardisé tout en poussant les analyses sur des organes spécifiques afin d'approfondir notre exploration (comme l'étude de la perméabilité et la réactivité intestinale qui requiert l'analyse de l'intestin en chambre de Ussing et en chambres d'organes isolés), non prélevables chez le chien.
Etude de biodistribution de vecteurs AAV (visant à traiter des dystrophies musculaires) chez le primate non-humain par injection systémique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
4 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par voie intraveineuse des vecteurs viraux de thérapie génique, subissent des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie, puis sont mis à mort pour prélever organes et tissus. Le projet vise à vérifier chez le primate si un vecteur efficace chez les rongeurs conserve ses propriétés avant un éventuel essai chez l'humain. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à une espèce proche de l'humain et décrit le macaque comme l'"espèce de choix" pour la biodistribution.
Objectifs
Les dystrophies musculaires englobent un groupe hétérogène de maladies neuromusculaires rares. Ce sont des maladies génétiques pour lesquelles plus de trente gènes ont été identifiés à ce jour. Les plus fréquentes sont la myopathie de Duchenne, la myopathie facio-scapulo-humérale et le groupe des dystrophies musculaires des ceintures. Elles se manifestent par une diminution progressive de la force des muscles qui va conduire dans la majorité des cas à la perte de la marche . Elles impactent donc fortement sur la qualité de la vie du patient. Dans certaines formes, l’atteinte des muscles cardio-respiratoires est une cause majeure de mortalité et de morbidité. Il n’existe pas de traitement à l’heure actuelle et uniquement la prévention des complications. Il existe donc un besoin médical important. Au vu du caractère génétique de ces maladies, des pistes de traitement possibles s’orientent vers la thérapie génique en utilisant des virus (vecteur) comme transporteur de gènes correcteurs. Etant donné que le muscle représente plus de la moitié de la masse corporelle, ces approches nécessitent des doses élevées de vecteur afin de pouvoir atteindre de façon efficace le tissu cible. Ces doses posent des questions de sécurité. Il est donc important d’améliorer l’efficacité des vecteurs. Ce projet se place dans cet objectif. Il vise à déterminer si un vecteur nouvellement développé avec une affinité plus grande pour le muscle squelettique chez les rongeurs va conserver cette propriété dans une espèce la plus proche possible de l’homme afin d’évaluer les perspectives d’utilisation de ce vecteur en essai clinique chez l’homme. Dans ce projet, nous voulons comparer la biodistribution d’un de ces nouveaux vecteurs par rapport à un vecteur déjà connu chez le macaque. Un système de « code-barres » a été développé pour pouvoir retrouver séparément les vecteurs lors des analyses moléculaires, les deux vecteurs peuvent donc être injecté dans les mêmes animaux. Cette stratégie a pour intérêt de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet.
Bénéfices attendus
Les bénéfices devant découler de ce projet concerne le domaine de la santé humaine. Il vise à valider un nouveau support de thérapie génique sous la forme d’un nouveau vecteur dérivé du virus associé à l’adéno-virus, Ce vecteur a été validé chez les rongeurs comme permettant un transfert de gène augmenté dans le muscle. L’objectif du projet est de valider que cette propriété se retrouve chez le macaque, espèce proche de l’homme. La validation de ce vecteur permettra des applications thérapeutiques chez l’homme dans le domaine des maladies musculaires qui n’ont pas de traitement disponibles à ce jour. Ce vecteur permettra une meilleure efficacité et une meilleure sécurité des stratégies de thérapie génique des maladies musculaires
Procédures
Le but de cette étude est d'injecter par voie intraveineuse (IV) les différents vecteurs AAV afin d’en déterminer la biodistribution . L’injection sera réalisée sur animal anesthésié en perfusion lente sur 30 min et au niveau de la veine saphène. Des prélèvements sanguins seront effectués juste avant l’injection du vecteur, mais aussi tout au long de l'étude sous anesthésie légère, pour permettre un suivi hématologique et biochimiques, et pour stock de sérum pour toute analyse ultérieure. Une détermination de la sérologie sera en outre réalisée en pré-injection ainsi qu’au sacrifice de l’animal. Des prélèvements post-mortem seront réalisés en fin de protocole.
Impact sur les animaux
A ce jour, l’administration intraveineuse de vecteurs AAV chez le macaque n’a pas d’effet délétère notable sur l’état de santé général de l’animal (études menées par plusieurs équipes de recherche). La majorité des gestes réalisés sur ces animaux seront non invasifs (injection du vecteur thérapeutiques par voie IV lente, et prélèvements sanguins par ponction veineuse). Ils seront réalisés sur animaux anesthésiés L’euthanasie sera également réalisé sous anesthésie, et une injection de morphine sera réalisée avant l’acte afin de garantir une analgésie. Si besoin, avec accord du vétérinaire de l’UE, un traitement analgésique (ex : Buprénorphine ou Perfalgan si douleur) pourra être mis en place dans les jours suivant la procédure. - Un suivi rapproché des paramètres cliniques (observations quotidiennes et examens cliniques) et des paramètres sanguins (hématologie et chimie clinique) des animaux sera mis en place afin de pouvoir détecter toute anomalie.
Devenir
A l'issu de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront sacrifiés afin d’obtenir des échantillons de tissus et d’organes et ainsi déterminer la biodistribution, vérifier l’absence de toxicité et l’expression du vecteur. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.
Remplacement
Notre projet s’inscrit dans une démarche translationnelle. Les études nécessitant le recours à l’animal, du rongeur au Primate Non-Humain (macaques fascicularis), correspondent aux étapes précliniques permettant potentiellement de passer aux études cliniques chez l’Homme. Afin d’estimer l’efficacité de nos approches expérimentales, il est nécessaire d’administrer les vecteurs dans un organisme entier capable de répondre physiologiquement aux traitements administrés. Ceci ne peut être obtenu in vitro, et justifie notre recours à des animaux.
Réduction
Quatre animaux seront inclus dans l’étude et seront injectés avec un mélange de vecteur marqué par un « code-barres » à une seule dose. Ce système permet d’injecter en même temps les deux vecteurs et ainsi de diviser par deux le nombre d’animaux nécessaires. Cela permet également la variabilité interindividuelle. Le nombre d'animaux (n=4 animaux) utilisé est donc réduit à son minimum pour une exploitation possible des résultats. Cette répartition permettra d’obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Une analyse statistique ne sera réalisée que pour les mesures où le nombre d’échantillons permettra d'avoir une puissance statistique suffisante. Afin de réduire le nombre d’animaux d’avantage, le groupe témoins injectés avec le véhicule sera celui du projet précédent.
Raffinement
L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement (techniciens animaliers et vétérinaire). Des protocoles anesthésiques seront mis en place selon la procédure à réaliser. Les administrations expérimentales se dérouleront sous anesthésie générale. Les prélèvements sanguins seront effectués sous protocole anesthésique permettant d'obtenir une anesthésie de courte durée (environ 10 min.). Ces actes étant peu douloureux, aucun protocole analgésique ne sera mis en place d'emblée pour ces procédures. Pour favoriser les échanges sociaux entre animaux et favoriser leur bien-être, les macaques seront hébergés en cage en post-injection, et en volières dès que possible pour favoriser les déplacements verticaux.
Choix des espèces
L’objectif principal de ce projet étant d’évaluer le tropisme et la biodistribution d’un nouveau vecteur, il est indispensable de choisir en conséquence l’espèce animale adaptée pour en déduire au plus près le comportement du vecteur chez l’homme. Les études chez le primate non-humain apportent les meilleures connaissances transposables à l’homme en terme de ciblage de tissus et de biodistribution du vecteur. Des études préalables ont été menées chez le rongeur avec ce même mélange de vecteurs. Aussi, la capacité de ces vecteurs viraux à pénétrer dans un organe/tissu et y faire exprimer un gène thérapeutique est dépendante de l'espèce. Un vecteur peut être efficace chez le rongeur mais pas chez l'homme. Le macaque fascicularis représente l’espèce animale de choix dans le modèle pré-clinique de par sa morphologie, sa physiologie, sa proximité phylogénétique et sa similitude avec le système immunitaire de l’homme. 4 singes (Macaca fascicularis) mâles (2-3 ans, 2-4 kg) seront inclus dans l’étude. Il s'agit donc de jeunes adultes, matures sur le plan immunitaire notamment. Les dystrophies musculaires des ceintures se manifestent généralement chez l’adulte jeune
Evaluation écotoxicologique de substances et d’effluents dans un contexte réglementaire
- Protection de l’environnement
Saumons : 752
Loups de mer : 1242
3374 poissons, poissons zèbres, truites et bars, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, la plupart tués à l'issue. Ils sont exposés en continu à une eau contaminée par des substances chimiques et des effluents industriels, de 96 heures à 30 jours, pour des tests réglementaires d'écotoxicologie. Les reproducteurs de poissons zèbres non exposés sont proposés à l'adoption et une partie des témoins réutilisée, mais les individus exposés sont tués en fin d'essai. Le porteur indique que les espèces et les méthodes sont imposées par les normes REACH et que les modèles alternatifs ne sont pas reconnus par les autorités.
Objectifs
Les évaluations des risques environnementaux sont basées sur l'étude de l'impact des composés anthropiques sur la survie et le développement de différents taxons représentatifs des écosystèmes. Pour être représentatives et exploitables ces évaluations des risques doivent inclure des organismes à différents niveaux d'organisation. Ainsi des études son classiquement menées sur des algues des crustacés et des poissons. Les tests réalisés au sein de ce projet sont des tests règlementaires qui suivent des normes d’essai nationales et internationales. Le but de ces essais est de générer des données qui entreront dans les dossiers d'évaluations des risques environnementaux, dans des dossiers d’homologation de produit ou dans des suivis industriels règlementaires. Les données générées par ces essais entreront dans des dossiers tels que demandés par la directive REACH, le CLP (étiquetage de produits), règlement phytosanitaires (dir. 91/414/EEC), la convention OSPAR (HOCNF), ainsi que les suivis industriels dans le cadre de la loi sur l'eau.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont la génération de données utilisées dans les évaluations des risques environnementaux. Ces évaluations des risques permettent de mieux gérer et utiliser les composés testés au regard de leur impact potentiel sur l'environnement.
Procédures
Les animaux (poissons) seront soumis à une exposition continue à un environnement contaminé via l'eau des aquariums sur des périodes de 96h à 30 jours. Les interventions réalisées sur animaux vivants seront du type observation.
Impact sur les animaux
Les effets attendus sur les animaux peuvent être une inhibition de la croissance, un mauvais développement larvaire, et des signes de stress et / ou de mauvais état de santé décrits dans l'annexe 1 "points limites".
Devenir
Procédure 1 relative à la production d'oeufs de Danio rerio : les animaux reproducteurs sont gardés en vie car ils n'ont pas été exposés à des produits toxiques et qu'ils ont été maintenus dans de très bonnes conditions favorisant la reproduction. Les individus non productifs sont écartés des reproducteurs dans un bac dit de "retraite" et sont ensuite proposés à l'adoption après approbation du vétérinaire référent. Procédures 2 relative aux tests de toxicité aiguë (mortalité) réalisés sur poissons juvéniles : les individus exposés aux produits testés sont euthanasiés en fin de procédure pour éviter toute souffrance à long terme. Les individus témoins (non exposés) sont réintroduits dans les bacs de réserve et réutilisés lors d'essais ultérieurs. Le nombre de poissons réutilisés dans ce cadre représente en moyenne 14% du contingent. Procédures 3 relative au test de toxicité chronique d'ihibition de la croissance des poissons juvéniles et procédure 4 relative au test de toxicité chronique aux premiers stades de la vie (impact sur le développement des larves de poissons) sur Danio : les individus témoins ne pouvant être réutilisés en raison des temps de tests l'ensemble des poissons utilisés dans ces procédures sont euthanasiés en fin d'essai.
Remplacement
Le modèle poisson fait partie intégrante des évaluations des risques et des demandes d’autorisation de mise sur le marché / étiquetage. Les modèles alternatifs ne sont pas reconnus par les autorités compétentes. Cependant les essais de mortalité sur œufs de poissons sont proposés en remplacement des essais sur poissons adultes. L’acceptation ou non du modèle alternatif (œuf) revient aux autorités compétentes.
Réduction
Les essais sur gamme complète (généralement 5 concentrations d’exposition) classiquement utilisés dans les évaluations des risques sont réduits à des essais limites (1 seule concentration seuil). Ce procédé permet de vérifier que les modèle poissons n'est sont pas plus sensibles que les autres organismes testés sur la matrice (crustacés, végétaux…). Cette façon de procéder permet de réduire d'un facteur 5 le nombre de poissons utilisés.
Raffinement
Les poissons maintenus au laboratoire font l’objet d’un suivi régulier de leur état de santé et des caractéristiques physicochimiques de leur eau d'aquarium. Ils sont maintenus dans des salles dédiées et uniquement fréquentées par le personnel habilité. Des enrichissements des milieux tels qu'un apport de nourriture vivante, des caches ou des systèmes de remous permettent également d'améliorer les conditions de stabulation.
Choix des espèces
Les espèces utilisées sont celles préconisées dans les normes imposées par les règlementations. Les procédures N° 2 relative aux tests de toxicité aiguë (mortalité) et 3 relative au test de toxicité chronique d'inhibition de la croissance des poissons sont réalisées sur truite et bars. Le stade requis pour ces tests est le stade juvénile. Les individus doivent mesurer entre 2 et 4 cm d’après les exigences des normes suivies (OCDE 203 et 215). Pour la procédure n°1 relative à la production d'oeufs de Danio rerio, le stade requis est les stade adulte (mature et reproductif) les individus commandés sont âgés de 4 mois. Pour la procédure n° 4 relative au test de toxicité chronique aux premiers stades de la vie (impact sur le développement des larves de poissons) sur Danio le stade d’exposition est les stade œuf.