Procédures légères

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 240 un niveau modéré. Elles sont soumises pendant trois à quatre semaines à des tâches de conditionnement opérant sous privation alimentaire, maintenues à 90 % de leur poids, et une partie subit une chirurgie du cerveau pour implanter des capteurs. Elles sont ensuite tuées par décapitation ou perfusion pour prélever le tissu cérébral. Le seul bénéfice annoncé est de comprendre comment le statut cérébral en acides gras influence la prise de décision, sans application décrite.

Objectifs

Le but de ce projet est de déterminer quelles sont les populations neuronales au sein du système cérébral de la récompense et de la prise de décision (système mésocorticolimbique) qui sont vulnérables à une déficience en acides gras polyinsaturés (AGPI) de type n-3. Pour cela, nous utiliserons une approche transgénique qui permettra de restaurer les taux d'AGPI dans des populations neuronales spécifiques en situation de carence générale en AGPI n-3. Nous testerons les processus de prise de décision en utilisant des tâches comportementales en conditionnement opérant.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment le statut cérébral en AGPI influence les processus de prise de décision.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire. Une partie des animaux subira des procédures chirurgicales (1 fois, durée de 1h à 1h30) afin d'exprimer des senseurs permettant d'enregistrer l'activité de systèmes neuronaux.

Impact sur les animaux

Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum). Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet, soit par décapitation soit pas perfusion intracardiaque afin de récupérer le tissu cérébral pour des analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Nous anticipons l'utilisation de 840 animaux. Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de tous les animaux de la descendance et comparerons les mâles et les femelles. Du fait de cette stratégie, tous les animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés.

Raffinement

Tous les efforts seront faits pour réduire la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés et les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille de scores. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera sacrifié dans les 48h.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations en AGPI sur le cerveau mature.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 10 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 30 un niveau modéré. Selon le modèle, elles subissent une chirurgie intracrânienne pour détériorer localement la myéline ou une induction d'encéphalomyélite provoquant une paralysie progressive des membres, avant des séances d'IRM sous anesthésie. Elles sont ensuite tuées à différents temps pour des analyses histologiques. Le porteur affirme que l'étude de la pathologie "ne peut actuellement pas être remplacée" par des systèmes in vitro et que l'animal vivant est "nécessaire" pour valider un biomarqueur avant la clinique.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d’évaluer et de mettre au point des mesures par imagerie de résonance magnétique, technique non invasive, à très haut champ magnétique (11,7T) pour le suivi des atteintes de la gaine protectrice des neurones (la myéline) telles celles que l’on observe chez les patients atteints de sclérose en plaques (maladie neurologique). Deux modèles de souris présentant des lésions dans la gaine de myéline seront utilisés: 1) le modèle LPC pour lequel la lésion est localisée 2) le modèle EAE pour lequel les lésions sont plus petites et réparties dans le cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet va contribuer à établir de nouvelles méthodes de mesure par imagerie pour le suivi de la dynamique de la détérioration/reconstitution de la gaine de myéline –protectrice des neurones- chez les sujets atteints de sclérose en plaques au cours de la maladie. Ces phénomènes doivent être davantage explorée, à un moment où des thérapies innovantes pour aider à la reconstitution de la gaine de myéline doivent être évaluées cliniquement. De plus, la mise au point de biomarqueurs d’imagerie non invasive réalisée dans ce projet représente un bénéfice pour les futures études thérapeutiques sur le petit animal puisque l’imagerie permettra le suivi du même animal et donc de réduire le nombre d’animaux.

Procédures

Chirurgie intracranienne pour détériorer localement la gaine de myéline des neurones pour mimer la sclérose en plaque. Une seule chirurgie sur l'animale. Pas de prélèvement sur animal vigile.

Impact sur les animaux

La démyélinisation focale au LPC nécessite une chirurgie (injection stéréotaxique, durée < 1h)et n’engendre pas de signes cliniques persistents. Seule la cicatrisation post-chirugie est à surveiller et seuls les animaux ayant complètement récupéré et cicatrisé seront éligibles au suivi par IRM haut-champ, réalisé sous anesthésie générale (4 sessions de 2 h maximum réalisées sur 3 mois). Pour le modèle EAE, un altération de l’état général de l’animal est attendu avec un score clinique maximal généralement entre 15 et 25 jours après l’induction de l’EAE, suivi d’unerémission partielle. Les animaux subissent un ensemble d’étapes de classe de gravité légère (injections i.v.) à moyenne (symptômes cliniques de l’EAE) et il existe une gradation des symptômes allant de la queue molle; au réflexe de redressement avec facultés affaiblies et parésie d'un membre à la paralysie des membres postérieurs et/ou antérieurs. La procédure complète est de classe de gravité moyenne. Il est nécessaire de préciser que la faiblesse ou la paralysie des membres n’entraîne pas de douleur en soi, mais plutôt une gêne pour l’animal dans ses déplacements, à l’instar de la pathologie humaine.

Devenir

Ils seront mis à mort à différents temps en vue de réaliser des mesures histologiques post-mortem.

Remplacement

À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables. Nous utiliserons des modèles de pathologies très bien décrits dans la littérature, ce qui permettra un suivi précis de la sévérité de la maladie. L’animal vivant est nécessaire pour valider un biomarqueur d’imagerie avant som implémentation en clinique, dans une démarche de recherche translationnelle

Réduction

Pour chacune des procédures expérimentales, le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et interprétables, en tenant compte de la variabilité biologiques des modèles animaux. Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet est de 40. Le suivi longitudinal effectué en imagerie permet d’obtenir jusqu’à 4 points de mesure par animal pour suivre les phases de démyénisation et remyélinisation sans mise à mort intermédiaire des groupes supplémentaires d’animaux.

Raffinement

Les points limites qui permettront d'arrêter le protocole sont les suivants: cicatrisation de la plaie crânienne, changement de poids corporel , apparence physique i.e. pelage, posture et comportement (vocalisations non sollicitées, automutilation, animal très agité ou immobile). L'arret des souffrances si elles sont constatées se fera par traitement antalgique ou par euthanasie des animaux concernés.

Choix des espèces

L’IRM haut champ ne peut accueillir que des petits animaux de type rongeur. Nous avons réalisé une première étude sur rat du fait d’un cerveau plus grand que la souris ce qui a facilité la mise en œuvre des techniques IRM avec des volumes à explorer plus gros. L’objectif étant d’étudier les pathologies cérébrales, les procédures de cette demande se feront chez la souris afin d’étudier notamment le modèle de sclérose en plaques EAE modèle pour lequel les protocoles expérimentaux sont bien établis et permettent de reproduire fidèlement les symptômes de la sclérose en plaques. Animaux adultes ayant un développement cérébral achevé (7-10 semaines).

230 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 30 un niveau modéré. Une partie subit une greffe de tumeur du pancréas sous anesthésie, puis des injections intraveineuses et des séances d'imagerie TEP et IRM, avant dissection après la mort, pour évaluer des nanoparticules servant d'agents de contraste. Le porteur qualifie lui-même le modèle de cancer pancréatique de sévère mais annonce le réserver à une seconde phase pour limiter le nombre d'animaux. Les retombées cliniques annoncées restent une simple opportunité, l'objectif immédiat étant de caractériser la biodistribution des nanoparticules.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est de valider l’utilisation de nouvelles familles innovantes d’agents de contraste, appelés Hybrid PolyIon Complex (HPIC) obtenus par une voie de synthèse/formulation simple et reproductible à une échelle industrielle. Ces agents sont issus de la complexation de polymères fonctionnels avec des ions métalliques utilisés en imagerie médicale (imagerie par résonance magnétique (IRM), Tomographie par Emission de Positons (TEP), SPECT (de l'anglais : Single Photon Emission Computed tomography)…), comme par exemple des ions Gadolinium, Gallium, Zirconium… avec des polymères . Leurs propriétés paramagnétiques et leur grande stabilité en milieu physiologique démontrent la grande potentialité de ses systèmes. Ainsi, en se basant sur cette nouvelle approche et grâce à un choix judicieux des composants de la formulation, des agents de contraste possédant des fonctionnalités variées (luminescence, propriétés de reconnaissance...) et utilisables dans différentes techniques d’imagerie peuvent être facilement accessibles et ouvrent de nouvelles opportunités cliniques. Dans ce projet, différentes stratégies d’optimisations des HPIC seront utilisées pour augmenter leur stabilité chimique et les composés les plus prometteurs seront évalués in vivo. Pour étendre le champ d'application, nous devons répondre à trois questions importantes : Comment assurer une grande stabilité chimique des HPIC pour les expériences in vivo ? Comment étendre le champ d'application de ces HPIC à des techniques d'imagerie autres que l'IRM, comme la TEP ? Comment avoir accès à des agents de contraste ayant des propriétés de ciblage ? Le cancer du pancréas est actuellement la quatrième cause de décès par cancer dans les pays occidentaux. La survie à cinq ans est de 3%. Le seul traitement curatif du cancer pancréatique est la résection chirurgicale, qui n’est malheureusement possible que dans 10 à 15 % des cas, avec un gain minimal de survie de 5% à 5 ans. Il est donc urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ce cancer. Pour cette raison, un modèle murin de cancer du pancréas sera mis en œuvre pour étudier les propriétés de ciblage des HPIC. Les modalités d’imagerie mises en œuvre dans ce projet permettront d’étudier in vivo ces propriétés de ciblage et de biodistribution. L’objectif serait d’utiliser ces nanoobjets comme vecteur d’adressage d’agents thérapeutiques qui pourraient être encapsulés à l’intérieur.

Bénéfices attendus

Les observations et quantification faites dans le cadre de ce projet d'imagerie multimodale ouvriront de nouvelles opportunités pour utiliser cette plateforme colloïdale comme nouveaux agents de contraste moléculaires ou de ciblage.

Procédures

5 types de procédures expérimentales sont mises en œuvre dans ce projet. La chirurgie pour induction des tumeurs pancréatiques a une durée moyenne de 20 minutes par souris. Les animaux sont placés sous anesthésie préalablement à l'acte chirurgical et un analgésique leur est administré avant chirurgie pour éviter toute souffrance. Les autres procédures sont des procédures d'imagerie in vivo, non invasives et atraumatiques. Les animaux subissent, sous anesthésie isoflurane, une injection par voie intraveineuse (veine caudale). Ce geste se fait en moins de 5 minutes généralement. Ces injections permettent de leur administrer soit un radiotraceur (procédures d’imagerie TEP, durée totale d’anesthésie 90 minutes maximum pour les acquisitions TEP) soit un agent de contraste non radioactif (procédure d’imagerie IRM, durée totale d’anesthésie 90 minutes maximum pour les acquisitions IRM). Les prélèvements sanguins sont effectués sur les animaux anesthésiés en moins de 5 secondes et les prélèvements d'organes sont faits post-mortem (15 minutes par souris).

Impact sur les animaux

Les modalités d'imagerie TEP et IRM n'engendreront aucune nuisance aux animaux puisqu'il s'agit de modalités d'imagerie non invasives et atraumatique utilisées en routine clinique. Le modèle de cancer pancréatique en revanche de classe sévère, c'est pourquoi il ne sera mis en œuvre qu'après une première phase de caractérisation de la distribution et sélection des HPIC présentant les meilleures caractéristiques pour réduire autant que possible le nombre d'animaux mis en œuvre. La douleur sera supprimée par administration d'analgésique immédiatement après la chirurgie et répétée si nécessaire.

Devenir

Tous les animaux sont sacrifiés en fin de procédures expérimentales. Les animaux ayant reçu injection de HPIC radiomarqués pourront être disséqués post-mortem pour comptage radioactif de leurs organes.

Remplacement

Les phases d'optimisation des HPIC (augmentation de la stabilité, quantification de la libération des ions métalliques) seront intégralement menées in vitro. Cependant, la validation des propriétés de distribution aux organes, d’élimination par voie urinaire et/ou hépatobiliaire tout comme les propriétés de ciblage tumoral ne peuvent se faire qu’en utilisant le petit animal. Les propriétés pharmacocinétiques des nanoparticules (HPIC) de distribution et élimination seront caractérisées chez l’animal sain avant de passer sur un modèle tumoral pour caractériser et mesurer leur capacité de ciblage des tumeurs.

Réduction

L'imagerie, par opposition aux biodistributions in vivo classiques, permet de réduire le nombre global d'animaux mis en oeuvre pour une procédure donnée car la même cohorte pourra être suivie au cours du temps ce qui permet de réduire la variabilité inter animal (chaque souris étant son propre contrôle). Les mêmes animaux pourront également subir plusieurs sessions d’imagerie (une session par semaine pour le suivi du développement tumoral). Les variables quantitatives issues de l'analyse des images obtenues en PET et en IRM seront analysées en utilisant des méthodes de statistique non paramétrique. En particulier le test de Kruskal-Wallis sera utilisé pour comparer les résultats obtenus avec les 5 HPIC prévus dans l'étude.

Raffinement

Les premières phases de caractérisation in vivo des HPIC (imagerie TEP et IRM) seront menées sur des souris saines (procédures classées légères) pour réduire autant que possible l’inclusion d’animaux porteur de cancer pancréatique (procédure d’induction du cancer classée modérée). Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Pour les animaux devant subir une chirurgie pour greffe de cellule tumorales pancréatiques l’analgésie est assurée par injection préalable, sous cutanée de Buprenorphine (0.05mg/kg) pour limiter la douleur. Les animaux sont conservés dans la salle de chirurgie sous une source de chaleur et leur respiration est observée jusqu’à leur réveil. En cas d’apparition de signes de douleur (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, déshydratation, yeux et abdomen creux, automutilation etc.), une nouvelle dose d’analgésique sera administrée une fois par jour jusqu’à disparition des signes.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme modèle d’étude selon plusieurs critères : -Il s’agit d’une espèce de petite taille facile à manipuler, son cycle de vie est court et son élevage facile et peu couteux. -leur petite taille facilite la manipulation en particulier pour l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans certaines caméras). Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (7 à 12 semaines environ) après atteinte de la maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ce stade est également optimal pour l'induction tumorale par transplantation de cellules cancéreuses pancréatiques.

1 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une inflammation de l'oeil leur est induite par injection d'une émulsion et d'une toxine, avec transfert de cellules immunitaires et suivi par imagerie de la rétine, pour tester le récepteur CD47 comme cible thérapeutique. Le porteur affirme que cette uvéite n'entraîne pas de douleur perceptible et que la perte de vision importe peu, la souris se déplaçant grâce à ses vibrisses. Il justifie l'effectif élevé par la forte variabilité du modèle et écarte le remplacement, les études in vitro ne montrant pas les signes cliniques.

Objectifs

Le projet vise à induire un modèle d'uvéite, l'Uvéite Autoimmune Expérimentale (EAU) chez des souris et d'évaluer le potentiel thérapeutique de différentes cibles en empêchant soit l'activation du système immunitaire soit le recrutement de cellules immunitaires dans l'œil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires. Nous allons donc induire une EAU chez des animaux n'exprimant pas ces récepteurs identifiés ou traiter des animaux qui développent une uvéite avec des agonistes ou antagonistes de ces récepteurs afin de déterminer l'effet potentiellement bénéfique de ces cibles pour inhiber la réponse immunitaire au cours de l'uvéite.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'évaluer le rôle du récepteur CD47 comme potentielle cible thérapeutique chez l'Homme en empêchant soit l'activation et/ou le recrutement du système immunitaire dans l'œil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires et déterminer quelles cellules immunitaires sont impliquées.

Procédures

Induction de l’Uvéite Auto-immune Expérimentale (EAU) par injection sous-cutanée (ISC) d’une émulsion protéique ou le transfert adoptif de cellules immunitaires par injection intraveineuse (IV). L’induction de l’EAU est un phénotype qui n’entraîne pas de douleur perceptible. Puis traitements par injections intrapéritonéale (IP) ou intra-vitréenne (IVT). Toutes les injections (ISC, IV, IP et IVT) sont rapides (moins d’une minute). Les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie, il n’y a donc pas de douleur attendue). Le suivi de l’évolution de la maladie (EAU) par des actes non invasifs (donc pas de douleur ou de détresse) : imagerie rétinienne (fond d’œil – 5 min) et OCT (tomographie en cohérence optique – 5 min). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie par méthode réglementaire de l’animal. Il n’y a pas de procédure chirurgicale engagée dans ce projet.

Impact sur les animaux

Induction d’EAU par injection sous-cutanée d’une émulsion de peptides et injection IP d’une toxine, transfert adoptif de cellules immunitaires par injection IV et suivi de l’évolution de la maladie (EAU) par des actes non invasifs (imagerie rétinienne (fond d’œil) et OCT (tomographie en cohérence optique) => phénotype modéré car nuisance visuelle (EAU) mais vision non indispensable à la souris pour se déplacer (utilisation de ses vibrisses). L’induction de l’EAU est un phénotype qui n’entraîne pas de douleur perceptible (pas de changement du comportement de la souris). Avec ce projet les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie, il n’y a donc pas de douleur attendue). L’évolution de la maladie est surveillée par des actes non invasifs qui n’engendrent donc pas de douleur ou de détresse.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Les études in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l'études des signes cliniques de la pathologie ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d'étude.

Réduction

Nous devons induire plusieurs expériences en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot. Certains ne développeront pas la maladie, d’autres la développeront à un stade plus avancé ou la sévérité de l’inflammation sera différente. Nous aurons donc besoin de 10 animaux par lots pour un total de 1450 souris. Le nombre de 10 animaux par groupe est basé sur les résultats de nos expériences dans notre laboratoire afin de permettre la réalisation des analyses statistiques adéquates pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

La seule anesthésie mise en oeuvre sera la gazeuse à base d'un mélange dioxygène/isofluorane. Les animaux sont hebergés en goupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Les animaux auront une période d'une semaine d'acclimatation avant l'expérimentation. Si nécessaire, et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux sont identifiés par bague numérotée ou tatoués. Les animaux sont génotypés par PCR après prélèvement par le personnel animalier compétent. Tous signes d’inconfort ou de détresse avant l’apparition des signes cliniques autres que ceux de l’EAU, tels que l'apparence (poil ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) et un comportement anormal (agressivité soudaine, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit), feront l’objet d’une surveillance accrue et d’un isolement en cas de besoin. Les critères absolus (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires) entraîneront l’euthanasie. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour l'EAU. En outre, il est relativement simple d'examiner le système visuel et d'autres tissus chez la souris, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développée le modèle d'invalidation génique conditionnelle et le modèle de uvéité, EAU. Les animaux seront utilisés entre 2 et 4 mois, âge auquel ils sont susceptibles de développer la pathologie.

1 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent de l'héparine et des anticorps par injections répétées, avec des prélèvements de sang quotidiens à la queue, pour modéliser une thrombopénie induite par l'héparine. Le porteur indique qu'une ablation de phalange sert au génotypage et peut être douloureuse et invalidante, et que les injections et prélèvements peuvent provoquer douleur et saignements, aggravés chez les souris thrombopéniques. Il conclut que ce processus complexe est difficile à reproduire in vitro et nécessite des souris modifiées.

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle majeur dans l’arrêt des saignements. Ce processus physiologique est finement régulé afin de permettre une réponse rapide, tout en prévenant le risque de thrombose (formation d'un caillot dans un vaisseau sanguin). L’héparine est un anticoagulant permettant de prévenir les thromboses, utilisé notamment lors de chirurgie. C’est l’un des anticoagulants les plus utilisés. Mais parmi les patients recevant de l’héparine, 1 à 3% vont développer une thrombopénie induite par l’héparine (HIT), une complication pouvant être potentiellement mortelle. Cette réaction provoque une thrombopénie (diminution anormale du nombre de plaquettes circulantes) suite à une activation anormale des plaquettes sanguines, pouvant également aboutir à une thrombose. L’objectif de ce projet est de cibler les récepteurs plaquettaires impliqués dans la régulation de l’activité des plaquettes sanguines. Le but étant de pouvoir empêcher ou prévenir des réactions telles que la HIT en ciblant ces récepteurs. Pour cela, nous voulons tester l’utilisation d‘anticorps qui permettent de cibler différents récepteurs : un récepteur inhibiteur de l’activité plaquettaire et les récepteurs activateurs impliqués dans la HIT. Notre hypothèse est que l’activation du récepteur inhibiteur va induire l’inhibition/inactivation du récepteur activateur, permettant ainsi de réduire ou prévenir le syndrome de HIT. Sur le long terme, cela pourrait permettre de développer une nouvelle stratégie thérapeutique dans le cadre d’une HIT ou d’autres syndromes impliquant une activation anormale des plaquettes sanguines.

Bénéfices attendus

Ce projet nous aidera à mieux comprendre le rôle de récepteurs plaquettaires dans l'activation des plaquettes et plus spécialement dans la réaction de HIT. A long terme, les différents anticorps que nous testons pourraient mener à de potentielles voies thérapeutiques afin de prévenir ou d'empécher par exemple la réaction de HIT.

Procédures

L'injection des traitements par voie intrapéritonéale (IP) ou d'héparine par voie sous-cutanée (SC) se feront sur souris vigiles. Chaque souris aura une injection IP au début de l'expérience (J0) et une injection SC quotidienne à partir de J1 pendant 4 jours. Ces procédures seront effectuées de manière rapide et efficace (moins d'une minute) afin de minimiser le stress induit par la préhension de l'animal. Un petit volume de sang sera prélevé à la queue de l'animal, après section ou retrait de la croute formée, de façon quotidienne pendant 5 jours (de J0 à J4) puis un dernier prélèvement aura lieu à J7 si nécessaire. Les anticorps à tester seront injectés par voie intraveineuse (IV) sous anesthésie, soit une fois au début de l'expérience (J0), soit quotidiennement pendant 3 jours (de J2 à J4) en fonction du protocole étudié. Pour le prélèvement de sang terminal, la durée de la procédure est inférieure à 10 minutes. Elle sera réalisée sous anesthésie et sera suivie de la mise à mort de l'animal avant son réveil.

Impact sur les animaux

La phalangectomie (PE1) utilisée à la fois pour le génotypage et l'identification des souris peut engendrer une douleur et peut avoir un potentiel caractère invalidant. Les injections intrapéritonéales ne présentent pas de douleur (PE2), hormis celle de l'insertion de l'aiguille. Pour les injections intraveineuses (PE2), les nuisances attendues sont une douleur et un risque de saignement suite à l’injection. Suite à la procédure, les animaux pourront présenter une thrombopénie. Les prélèvements à la queue peuvent engendrer une douleur et un saignement peut survenir après section de la queue, notamment chez les souris thrombopéniques.

Devenir

Les animaux seront injectés en intrapéritonéal et un prélèvement de sang à la queue sera réalisé, de manière quotidienne pendant 5 jours. A l'issue de cette procédure, le sang sera prélevé de manière terminale au niveau de l'aorte abdominale et tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

La thrombopénie induite par l’héparine est un processus complexe, impliquant une cascade de réactions qu’il est difficile de reproduire de façon complète in vitro. La compréhension de ces processus physiopathologiques est impossible chez l’homme : il est nécessaire de recourir à des modèles animaux qui permettent de reproduire au plus près les caractéristiques de la pathologie humaine. Pour induire une HIT et tester l’efficacité des différents anticorps, il est déterminant d’utiliser des souris génétiquement modifiées pour l’expression des facteurs et récepteurs impliqués dans ce processus.

Réduction

La stratégie du développement de la nouvelle lignée est conçue pour impliquer le moins d’animaux possibles. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, suffisant pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux utilisés pour cette étude est calculé afin d’obtenir suffisamment d’évènements informatifs et de permettre l’analyse de données statistiquement significatives. Un effectif de 3 expériences indépendantes est prévu afin de réaliser des tests statistiques permettant d’évaluer le rôle des récepteurs G6B dans la thrombopénie induite par l’héparine.

Raffinement

Le développement des bébés générés pour la nouvelle lignée sera observé attentivement afin de s’assurer que ces animaux ne présentent pas d’handicaps. Le phénotype de la lignée sera étudié et un passeport phénotypique sera réalisé. Les conditions d’environnement sont optimisées par l’enrichissement des cages avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Les animaux entre 2 et 5 par cage, ont un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. Quelques croquettes sont déposées dans le fond de la cage afin d’aiguiser le comportement de recherche de nourriture. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Une grille de points limites sera établie pour chaque procédure expérimentale afin de soustraire l’animal aux procédures si nécessaire et ainsi limiter la souffrance. Le stress et la douleur des animaux utilisés dans ce projet seront réduits au maximum. Pour cela, les injections intraveineuses ainsi que les prélèvements à la queue seront réalisés sous anesthésie générale et les souris seront maintenues sur une tablette chauffée à 37°C. Suite à l'injection intraveineuse, un anesthésique local sera appliqué pour éviter tout douleur. Pour le prélèvement de sang terminal, l'animal sera sous anesthésie générale et maintenu à 37°C. A la suite du prélèvement, l’animal sera sacrifié avant son réveil.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour notre étude car des travaux publiés montrent la génération de souris génétiquement modifiées permettant d’induire ce syndrome de HIT. Pour réaliser notre étude, nous allons remplacer dans cette lignée le récepteur inhibiteur murin par le récepteur humain que l’on souhaite étudier afin de réguler l’activité des plaquettes. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet, à partir de 8 semaines, âge à partir duquel la croissance se stabilise. L’âge des souris n’étant pas un critère de choix, nous réaliserons des groupes homogènes en âge.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection abdominale cinq jours de suite avant mise à mort et prélèvement de tissus cérébraux, pour étudier une protéine des cellules immunitaires du cerveau. Le porteur décrit un projet de recherche fondamentale dont les bénéfices annoncés relèvent de la connaissance générale et d'une "potentielle cible pharmacologique". Il indique avoir développé un modèle de culture cellulaire pour limiter le recours à la souris entière, tout en jugeant les expériences in vivo non modélisables.

Objectifs

Les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central façonnent les réseaux de neurones au cours du développement. Chez l’adulte elles participent à la surveillance et l’entretien du cerveaux en éliminant les cellules mortes ou inutiles. Dans le cerveau sain, les cellules immunitaires ont une morphologie complexe caractérisée par des prolongements ramifiés en perpétuelles mouvements. Ces mouvements sont importants car grâce à eux les cellules peuvent explorer le cerveau à la recherche de dysfonctionnements. Il se trouve que dans la plupart des pathologies du cerveau le mouvement de ces prolongements s’arrêtent et il est difficile de savoir si l’arrêt de ces mouvements est une cause ou une conséquence de la pathologie. De plus les mécanismes cellulaires contrôlant ces mouvements sont pour la plupart inconnus. Il est donc important de comprendre le fonctionnement de ces mouvements et leur rôle exact pour mieux comprendre leurs impacts sur les pathologies du cerveau. Nous avons identifié une molécule exprimée par ces cellules immunitaires qui pourrait être impliquées dans ces mouvements, nous proposons de la supprimer pour étudier les effets sur le fonctionnement des cellules et la réponse cellulaire lors d’une inflammation mimant une pathologie. Ce projet a deux objectifs principaux. 1) Caractériser le rôle de cette protéine dans la physiologie des cellules immunitaires du cerveau. 2) Etudier les répercussions de l’invalidation de la protéine sur la neuro-inflammation, et le fonctionnement du cerveau. Ces expériences nous permettront de mieux comprendre la fonction de cette protéine mais également de d’appréhender le rôle que jouent les cellules immunitaires aux cours des pathologies du système nerveux central.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un projet de recherche fondamentale dont les résultats bénéficieront à la connaissance générale du système nerveux central tant chez l’homme que l’animal, et permettront de mieux comprendre les interactions entre le système nerveux central et le système immunitaire. Les résultats attendus de cette recherche permettront de mieux comprendre les processus cellulaires conduisant aux pathologies neurodégénératives du système nerveux central et aux troubles engendrés par l’auto-immunité. Il permettra surtout de mieux comprendre les voies de signalisations associées à notre protéine d’intérêt et d’en faire une potentielle cible pharmacologique.

Procédures

Une Injection abdominale 5 jours consécutifs/ animal. Chaque injection se fait en 30 secondes max/animal. Prélèvement de tissus sur des animaux morts (432).

Impact sur les animaux

Inconfort lié à des injections répétées

Devenir

Mise à mort pour récolter les tissus et faire des analyses morphologique et transcriptomiques

Remplacement

Il s’agit d’un projet de recherche fondamental visant à étudier le rôle d’une protéine jusqu’alors inconnue. Les expériences réalisées dans ce projet ne peuvent donc pas être modélisées. Nous travaillons sur des cultures de cellules primaires provenant d’animaux nouveaux nés ou réaliserons des études histologiques sur des cerveaux de souris pour obtenir nos données.

Réduction

Les lots et procédures ont été élaborés de manière à optimiser les groupes contrôles et à éviter la redondance. Les effectifs ont été déterminés et les analyses réalisées avec des test statistiques appropriés. Il s’agit de travaux originaux jamais réalisés à notre connaissance dans la littérature.

Raffinement

Afin de limiter le nombre d’expériences et l’inconfort lié aux expériences in vivo, nous avons développé un modèle de culture dans lequel la morphologie de nos cellules d’intérêt est préservée. Ceci nous permettra de limiter l’utilisation de souris entière pour réaliser nos expériences. De façon générale le bien-être des animaux sera évalué de façon quotidienne. Les souris seront observées dans leurs cages pendant plusieurs minutes puis pesées. L’évaluation se fera selon un scorage établi (posture, poids, toilettage) de sorte à identifier les points limites.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle car couramment utilisée au laboratoire. Les souris permettent d’avoir recours à des animaux transgéniques. Il existe une abondante littérature sur le fonctionnement synaptique chez la souris ce qui évitera de reproduire certaines expériences pour valider notre modèle. Pour la culture cellulaire les animaux seront âgés de 2 à 5 jours lors des injections stomacales de tamoxifène et de 10 jours lors de la mise en culture. Cet âge permet d’obtenir une résistance suffisante aux conditions d’hypoxie et d’ischémie des cellules rencontrées lors de la mise en culture et une maturation suffisamment avancée pour obtenir des cellules ramifiées. Les expérimentations in vivo seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 6-10 semaines.

1 389 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sur des souris modèles d'Alzheimer, le porteur décrit une déplétion du microbiote par antibiotiques ou laxatif pouvant provoquer des diarrhées, des prélèvements de sang et de selles, et un conditionnement par la peur reposant sur trois chocs électriques. Il indique que les souris donneuses de microbiote sont tuées d'emblée et que les receveuses le sont après les tests, pour analyse du cerveau. Le remplacement est écarté au motif que l'étude des déficits de mémoire ne peut se faire in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'étudier le lien entre la dysbiose intestinale présente dans les souris 5xFAD, modèle transgénique de la maladie d'Alzheimer, et l'amplitude des déficits de mémoire de ces animaux. Nous souhaitons démontrer la causalité de la dysbiose intestinale sur les phénomènes mnésiques.

Bénéfices attendus

L'identification de souches causales et/ou protectrices de la pathologie constituera la base d'une prévention de la maladie d'Alzheimer basée sur la restauration d'un microbiote intestinal sain.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang (2 min) et de selles (1 min) : les fèces et environ 150μL de sang seront prélevés en sous-mandibulaire au démarrage de l'experimentation et à la fin de l'étude 60 jours plus tard.

Impact sur les animaux

La déplétion du microbiote endogène des animaux par antibiotiques ou laxatif peut induire des diarhhées qui seront toutefois temporaires car la réintroduction d'un microbiote intestinal complet traite immédiatement ces symptomes. Lors de la procedure de conditionnement par la peur, les 3 chocs électriques administrés aux animaux vont générer une douleur transitoire. Lors de la réexposition des animaux à l'environnement où ils auront reçu les chocs, un stress sera mesurable si leurs performances de mémoire ne sont pas altérées.

Devenir

A l'issue de la procédure 1, les animaux donneurs de microbiotes sont mis à mort et ne rentrent pas expérimentation. A l'issue des procédures 1 à 3, les animaux receveurs sont conservés jusqu'à la fin des traitements et des tests de comportement. A l'issue de la procédure 4 (dernier test expérimental), tous les animaux sont mis à mort pour analyse de la pathologie cérébrale.

Remplacement

L’étude des déficits de mémoire nécessite l’utilisation d’animaux, ceci ne pouvant se faire sur des modèles in vitro.

Réduction

Le plan expérimental a été optimisé en déterminant qu’un nombre réduit de 12 souris receveuses par groupe était suffisant pour d’obtenir des résultats reproductibles et analysables statistiquement. Taille minimale des groupes receveurs : le nombre d’individu varie entre 9 et 22 animaux en fonction du test comportemental. Nos expériences seront réalisées sur des groupes de 12 animaux/traitement et reproduites sur 2 à 3 lots d’animaux différents soit au total 24 à 48 animaux/groupe (logiciel G*power, erreur α de 5%, puissance (1-β err prob) de 80%). Plan d'analyses statistiques (logiciel Graphpad Prism7) -Vérification de normalité des données : test de D'Agostino-Pearson -Distribution Gaussienne => analyse de variance à un facteur (ANOVA) puis test de Dunnett pour correction des comparaisons multiples par rapport à la condition Véhicule -Distribution non Gaussienne => test de Kruskal-Wallis puis test correctif de Dunn's -Niveau de significativité à p=0,05. La réalisation de plusieurs tests de mémoire durant le protocole permettra une optimisation de l'utilisation des animaux, évitant de multiplier les séries expérimentales. •Stratégie de réduction La réalisation de plusieurs tests de mémoire durant le protocole permettra une optimisation de l'utilisation des animaux, évitant de multiplier les séries expérimentales. Le suivi longitudinal des performances mnésiques produira un recueil de données multiples pour un même animal. Le projet prévoit une multiplicité d'analyses post mortem sur un même animal.

Raffinement

•Suivi des animaux Inspection - 2 à 3 fois par semaine avec prise de poids 2 fois par semaine, avant chaque injection. Une grille d’évaluation de l’état général de chaque animal sera remplie (présentée en annexe 2) avec identification de points limites où une prise en charge adaptée sera effectuée. •Hébergement et raffinement - Hébergement en cage collective contenant de l'enrichissement environnemental (matériel pour la nidification). Les animaux seront tatoués afin de pouvoir les identifier dans la cage collective. •Procédure de conditionnement à la peur - Le plan expérimental a été optimisé en déterminant qu’un nombre réduit de 3 chocs d'une durée courte de 2 secondes est suffisant pour d’obtenir des résultats reproductibles et analysables statistiquement. L'intensité des chocs sera adaptée à la taille/poids de l'animal au moment de l'expérimentation.

Choix des espèces

Les souris C57Bl/6J, utilisées dans nos études, représentent des lignées classiques pour les études en neurobiologie, principalement pour l'étude de la mémoire. La lignée de souris transgénique 5xFAD (fond C57Bl/6J) est également une lignée très utilisée pour modéliser la maladie d'Alzheimer car elle récapitule l'ensemble de la neuropathologie à l'exception de la pathologie Tau. L'extrême rapidité d'apparition des symptômes fait de cette lignée transgénique le modèle le plus adapté pour étudier une modification de l'apparition des déficits de mémoire induite par des interventions sur la composition du microbiote intestinal. Les souris Swiss présentent une alternative aux souris C54BL/6J, étant également de très bons modèles d'étude des performances mnésiques. Les études seront réalisées sur des animaux adultes car les pathologies étudiées seront des pathologies se développant à l'âge adulte.