Procédures légères

165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Une partie subit une chirurgie cardiaque provoquant une insuffisance cardiaque, puis toutes reçoivent des injections intraveineuses, des examens d'imagerie par TEP scan et échographie et des prélèvements de sang sous anesthésie, pour suivre le devenir de vésicules extracellulaires censées réparer le cœur. Le porteur indique que la chirurgie et l'insuffisance cardiaque induite peuvent être sources de douleur et de souffrance, les autres actes étant présentés comme non douloureux. Les souris sont euthanasiées à l'issue de chaque procédure pour analyser la répartition des vésicules dans les organes.

Objectifs

L'infarctus du myocarde entraîne de graves lésions du muscle cardiaque et la formation de cicatrices, pouvant conduire à une insuffisance cardiaque. Des études précliniques récentes ont montré des améliorations de la fonction cardiaque chez des rongeurs ayant reçu une greffe de cellules cardiaques à la suite d’un infarctus. Cependant, Il a été montré que le principal mécanisme d'action de ces cellules n'est pas le remplacement des cellules cardiaques endommagées, mais plutôt la sécrétion de nanoparticules, les vésicules extracellulaires (VEs), permettant la réparation du muscle cardiaque. En vue d'une utilisation comme médicament, ces nanoparticules, ou VEs, possèdent des avantages par rapport aux cellules dont elles sont issues en termes de production et de sécurité biologique. Afin de reproduire l’efficacité thérapeutique de ces VEs observée in vitro, il est essentiel que les VEs injectées chez les patients soient distribuées au cœur. L'injection intraveineuse (IV) est une méthode peu invasive, qui permet de répéter l’administration de l’injection et ainsi augmenter le bénéfice durable du traitement sur le patient. Cependant les VEs injectées par IV se dirigent principalement vers les poumons, la rate, le foie, et très peu atteignent le cœur. Notre hypothèse de travail est basée sur le fait qu'en cas d'insuffisance cardiaque on observe une inflammation du myocarde. Dans cette zone d’inflammation du cœur, une molécule, l’E-sélectine, est fortement présente. L’idée du projet est d’améliorer le ciblage cardiaque des VEs en les modifiant afin qu'elles possèdent à leur surface des molécules leur permettant de se lier à l’E-sélectine et ainsi "s'attacher" dans le myocarde inflammé. Cette modification des VEs pourrait permettre d’augmenter leur concentration locale dans les zones de blessure, tout en diminuant leurs potentiels effets néfastes sur d’autres organes que le cœur. L'accumulation des VEs dans le cœur sera contrôlée par imagerie médicale non invasive. Ce projet a deux axes majeurs : 1) suivre le devenir des VEs injectées par IV chez des souris par imagerie médicale nucléaire (TEP scan) ; 2) mesurer l’efficacité thérapeutique des VEs dans le modèle murin d’insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait avoir trois impacts majeurs : 1) confirmer que la voie intraveineuse est efficace pour injecter des VEs thérapeutiques ; 2) fournir des preuves de l'adressage au myocarde des VEs et de leur effets thérapeutiques grâce à l’imagerie médicale ; 3) valider la modification des VEs comme un moyen efficace pour améliorer leur adressage cardiaque et leur efficacité. Ce dernier objectif pourrait être une découverte cliniquement pertinente étant donné que la modification que nous utiliserons a déjà été approuvée pour un autre usage clinique, et montrée comme efficace. Les données récoltées dans le cadre de ce projet seront utiles pour affiner le protocole d’un essai clinique chez l'homme en préparation visant à utiliser les VEs issues de cellules cardiaques chez des patients atteints d'insuffisance cardiaque. Les données récoltées grâce à ce projet pourraient, au-delà de l’application uniquement « cardiaque », bénéficier à l’utilisation de VEs par voie intraveineuse pour des maladies non cardiaques impliquant une inflammation.

Procédures

Les animaux modèles d'insuffisance cardiaque subiront une chirurgie cardiaque. Cette intervention est réalisée une seule fois sur chaque souris modèle et dure moins de 30 minutes. Les animaux des procédures 1 et 2 subiront un examen d'imagerie médicale non invasive (TEP scan) d'une durée totale d'une heure trente. Les animaux des procédures 2 et 3 subiront respectivement 1 ou 2 échocardiographies (20 minutes), et 3 prélèvements sanguins (5 minutes). Tous les animaux subiront des injections en IV. Toutes ces interventions seront réalisées sous anesthésie générale de l'animal.

Impact sur les animaux

Les souris modèles d'insuffisance cardiaque vont subir une chirurgie cardiaque. Cette chirurgie peut être une source de douleur pour la souris post-opération. L'insuffisance cardiaque engendrée par la chirurgie peut être également une source de souffrance pour la souris. Par contre, les injections en IV, l'échocardiographie ainsi que les examens TEP scan sont des méthodes non invasives, réalisées sous anesthésie générale uniquement pour éviter les mouvements de l'animal, et ne sont pas une source de douleur pour la souris. Tout au long du protocole, une administration d’analgésique pourra être réalisée en cas de signes de douleur.

Devenir

Les techniques d'imagerie médicale non invasive utilisées ne permettent pas de fournir des images de la distribution des VEs chez la souris une échelle plus fine que celle de l'organe dans sa globalité. Afin de pouvoir évaluer cette distribution dans le cœur et d’autres organes (foie, poumons, rate) à une échelle microscopique, ces tissus doivent être prélevés pour des analyses ex vivo, et les animaux seront donc euthanasiés à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Les VEs sont injectées chez l’animal qu’après avoir vérifié leur fonctionnalité à l'aide de tests d’efficacité in vitro sur cellules humaines. Les systèmes et protocoles d'imagerie sont maitrisés et déjà optimisés au sein de notre laboratoire. Ce projet ayant pour but d'étudier la distribution biologique et l'efficacité thérapeutique in vivo des VEs après injection dans la circulation sanguine il est nécessaire d'utiliser un modèle in vivo. La réalisation de ce projet constitue une des étapes précliniques indispensables avant l’application chez l’homme de ces approches thérapeutiques.

Réduction

Le nombre minimum d'animaux nécessaire a été évalué à l'aide d'un logiciel de statistique de façon à ce que les résultats obtenus soient statistiquement significatifs pour conclure sur l'efficacité de nos approches thérapeutiques et diagnostisques. Les méthodes d'imagerie étant non invasives et non douloureuses, les animaux pourront être suivis au cours du temps et les paramètres étudiés mesurés plusieurs semaines d'affilée chez le même animal.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux sont réalisées sous anesthésie générale. Les examens d'imageries médicales au centre du projet sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur (points limites évalués à l’aide d’une grille de scores), les procédures seront arrêtées et les animaux euthanasiés. Les souris étant des animaux grégaires, elles seront plusieurs par cage d'hébergement, afin d'éliminer un stress potentiel dû à un isolement.

Choix des espèces

L’évaluation de l’effet thérapeutique se fondant avant tout sur les performances fonctionnelles du coeur, le protocole nécessite l’utilisation d’animaux vivants. Les souris sont des mammifères ayant un système cardiovasculaire proche de l’humain. Les tests chez le rongeur adultes font partie des tests précliniques classiques pour évaluer l’effet thérapeutique d’un produit.

484 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Modèles génétiques de dystrophie des ceintures, elles reçoivent des molécules par gavage et par injection intrapéritonéale deux à cinq fois par semaine, des injections de vecteurs viraux et des prélèvements de sang répétés, avant évaluation de la force musculaire puis mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur affirme que les molécules testées sont toutes bénéfiques et sans toxicité aux doses utilisées, et que le modèle présente un phénotype moins marqué que la maladie humaine. Il conclut qu'aucun modèle sans animaux ne permet d'étudier la perte de locomotion, et renvoie l'effet thérapeutique espéré à un éventuel essai clinique.

Objectifs

Ce projet se place dans le domaine de la recherche de solutions thérapeutiques pour des maladies qui n’ont à ce jour aucun traitement. Les maladies ciblées dans ce projet sont une catégorie de maladies musculaires d’origine génétique appelées les dystrophies des ceintures. Ces maladies se caractérisent par une dégénérescence progressive du muscle conduisant à une perte des fonctions motrices telles que la marche. Elles peuvent aussi être associées à des atteintes cardiaques ou respiratoires qui peuvent conduire à un décès prématuré. Dans le cas des maladies génétiques, certaines mutations entrainent des anomalies de la structure de la protéine correspondante. De façon intéressante, il est possible d’aider par une approche utilisant des petites molécules à ce que les protéines mutées récupèrent une meilleure conformation, produisant ainsi un effet thérapeutique. Nous avons identifié des molécules ou des combinaisons de molécules ayant montré un effet positif sur des cellules déficientes dans le cas d’un groupe de dystrophies des ceintures appelées sarcoglycanopathies. L’objectif de ce projet va être de valider le potentiel thérapeutique de ces molécules et combinaisons sur un modèle animal de la maladie. Une validation sur ce modèle permettra d’envisager des essais cliniques afin d’aboutir à un traitement chez les patients. Les animaux utilisés sont des souris modèles et leurs contrôles normaux. Le nombre nécessaire pour cette étude est de 484 animaux. Les molécules seront administrées aux animaux soit par gavage, soit par administration intrapéritonéale sur une durée variable. L’évaluation de l’effet thérapeutique sera réalisée par des études de la fonction du muscle et, après sacrifice, par des études moléculaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Il vise à valider l’effet thérapeutique de molécules d’intérêt pour un groupe de maladies humaines sur un modèle murin de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie, et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour.

Procédures

Toutes les molécules pharmacologiques seront injectées entre 2 et 5 fois par semaine en fonction de leur demi-vie. Elles seront administrées soit par voie orale, soit par injection intra-péritonéale sur animaux vigiles. L’administration par voie orale se fait par gavage à l’aide d’une canule souple en plastique à bout arrondi afin de ne pas blesser l’animal. Les AAV seront injectés par voie intraveineuse une seule fois soit sur animaux vigile avec injection à la veine caudale, soit sur animaux anesthésiés au sinus rétro-orbital. Dans ce cas, l’anesthésie est une anesthésie gazeuse de courte durée. Les prélèvements de sang se font une fois par semaine sur animaux anesthésiés en gazeux de courte durée, voire au maximum à 2 jours d’intervalle en fin de protocole. L’injection de Bleu Evans sera réalisée par voie intra-péritonéale sur animaux vigiles. L’évaluation fonctionnelle avant le sacrifice sur le muscle TA semi-isolé sera pratiquée par l’administration 30 minutes avant l’acte d’un analgésique, sur animal anesthésié. L’état d’anesthésie sera évalué par différents critères : absence de réflexes, immobilité, relaxation musculaire, insensibilité à la douleur.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont liés en particulier à la nature des différents actes réalisés : * Piqûres en intrapéritonéal pour administration de molécule faites tous les jours ou tous les 3 jours allant de 100µl à 400µl/20g ou pour administration d’anesthésique (100µl/20g). Pour réduire les nuisances, les animaux seront traités 30 minutes avant avec un analgésique. * Administration per os quotidien à 200µl/20g. * Intraveineuse caudale 200µl/20g ou en retro-orbitale 150µl/20g. * Prélèvement de sang en rétro-orbital 100µl/20g au maximum une fois par semaine . * Possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies (utilisation d’OCRY-GEL® pour réduire cette nuisance). Les modèles utilisés, même s’ils portent une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire progressive chez l’homme, présentent un phénotype moins important que les patients. Dans cette étude, les animaux sont utilisés à un âge où aucune conséquence sur le comportement n’est observée. Ils ne présentent donc pas de phénotype délétère. Il n’y a pas de nuisances attendues dans ce projet par rapport à l’effet des traitements qui sont tous de nature bénéfique et utilisés à des doses non toxiques.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront sacrifiés par dislocation cervicale.

Remplacement

Un effort de remplacement a été réalisé en amont de ce projet. En effet, l’identification des molécules ayant un intérêt potentiel pour l’objectif thérapeutique de ce projet a été réalisée sur des modèles cellulaires soit individuellement, soit par criblage de chimiothèques (environ 3000 composés ont été criblés) en utilisant le critère de relocalisation du complexe des sarcoglycanes à la membrane. Un criblage combiné par des concentrations faibles d’un inhibiteur du protéasome a aussi été réalisé afin de faire ressortir des effets supplémentaires. Seules les molécules ou combinaisons ayant montré les meilleures activités in vitro seront testées dans ce projet. Afin de valider l’effet thérapeutique in vivo au préalable à une application chez l’homme, nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris), car aucun modèle in vitro ou de culture cellulaire ne nous permet d’étudier les symptômes de perte de la locomotion typiques des dystrophies musculaires.

Réduction

Au cours des 5 années du projet, nous avons prévu d’utiliser un total de 484 souris pour faire l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôle pour les différents modèles évalués. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Pour la PE1, le critère est l’adressage à la membrane de la fibre musculaire de la protéine d’intérêt. Le test utilisé est un test de comparaison des moyennes unilatéral et donne un N de 8 par groupe. Le critère pour les PE2 et PE3 est la mesure de la force musculaire. Le test utilisé est un test de comparaison des moyennes unilatéral et donne un N de 6 par groupe.

Raffinement

Le raffinement du projet inclut la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. De plus, le modèle de souris que nous avons développé correspond à une mutation retrouvée chez les patients. Le souci de raffinement est une préoccupation permanente tout au long de la vie des animaux et pendant les différentes étapes des protocoles expérimentaux. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient sacrifiés pour éviter toute souffrance. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi, ils sont observés quotidiennement pendant les jours ouvrés. Les souris étant des animaux sociaux, aucun animal n’est seul dans une cage, sauf si problème d’agressivité. Les souris sont anesthésiées lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Les animaux auront également eu au préalable un traitement analgésique. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes). Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures de sacrifice appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir la température corporelle stable lors de la phase de réveil et l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés dans ce projet sont des souris modèles représentatifs de la pathologie étudiée. Dans cette étude, les animaux seront utilisés au stade jeune adulte. A partir du sevrage, les animaux présentent une taille de muscle et des conditions physiques suffisantes pour évaluer la fonction musculaire.

415 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 110 femelles allaitantes reçoivent une injection de tamoxifène transmise aux petits puis sont tuées au sevrage, tandis que des souris immunodéprimées sont opérées pour implanter des lésions précancéreuses du pancréas et que d'autres sont mises à mort à différents âges. Le porteur décrit des lésions précancéreuses "asymptomatiques" et une perte de poids possible chez les témoins par mauvaise digestion. Il affirme que la complexité de ces lésions et de leur évolution vers le cancer empêche de remplacer l'étude sur la souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de générer un nouveau modèle de souris afin d’étudier les lésions pré-cancéreuses de cancer du pancréas, que sont les tumeurs intracanalaires papillaires et mucineuses du pancréas (TIPMP). Les TIPMPs sont un type de lésions précancéreuses du pancréas se développant à partir des canaux pancréatiques et prenant la forme de kyste. Les TIPMPs chez l’homme peuvent évoluer en cancer du pancréas. Les souris utilisées auront des mutations génétiques dans les canaux pancréatiques qui devraient former alors des TIPMPs.

Bénéfices attendus

De tels modèles animaux sont nécessaires pour comprendre les mécanismes moléculaires/les voies de signalisation qui conduisent à la formation des lésions précancéreuses du pancréas et leur progression en cancer du pancréas, ce qui a un impact direct pour le développement de stratégie de dépistage et de stratégie thérapeutique chez l’homme.

Procédures

On réalise -Une injection dans le ventre de souris femelles allaitantes (110 femelles allaitantes) d’un produit qui passe dans le lait afin que les souriceaux allaités reçoivent ce produit. Ce produit permet ainsi d'induire l’activation de la modification génétique des souriceaux transgéniques. Cette injection dure moins de 30 secondes. -10 souris auront une imagerie par résonnance magnétique à 1 mois de vie. Cette imagerie est réalisée sous anesthésie gazeuse pour diminuer le stress de la souris, elle dure 15 minutes et est sans douleur. -Une procédure chirurgicale chez 20 souris de laboratoire « immunodéprimées » (dont le système immunitaire est altéré de par sa nature) qui consiste à injecter des lésions précancéreuses dans leur pancréas. Cette intervention dure moins de 15 minutes sur des souris anesthésiées et sera suivie de l’administration systématique d’antalgiques afin que les souris ne souffrent pas. -10 autres souris « immunodéprimées » auront une injection veineuse de cellules de lésions précancéreuses dans la veine de la queue. Cette intervention dure moins de 5 minutes et est réalisée chez des souris anesthésiées.

Impact sur les animaux

Les souris permettant d’obtenir les souris étudiées (« souris d’intérêt » et « souris contrôles ») vivent normalement et sont mises en accouplement pour les générer. L’injection du produit aux femelles allaitantes n’est pas douloureuse. Il est attendu chez les souris d’intérêt la formation de lésions précancéreuses du cancer du pancréas. Ces lésions précancéreuses sont par définition asymptomatiques. Il n’est pas impossible que des lésions cancéreuses à un stade très précoce soient apparus chez les souris, mais ces lésions alors peu évoluées ne devraient pas entrainer de symptômes. Il est attendu chez certaines des souris « témoins » des lésions chroniques du pancréas, qui fonctionnera alors moins bien. Cela ne génèrera pas de douleurs mais entrainera vraisemblablement une perte de poids après six mois de vie des souris par moins bonne digestion des aliments. Concernant les souris immunodéprimées ayant une implantation des lésions précancéreuses dans l’abdomen : cette chirurgie sera réalisée avec les mesures nécessaires pour prévenir au maximum l’inconfort (anesthésie, administration d’antidouleurs). Il est attendu que les lésions précancéreuses évoluent par la suite dans l’abdomen à un niveau localisé sur un laps de temps court, et ne devrait donc pas engendrer de douleurs.

Devenir

Les 110 souris allaitantes seront sacrifiées au sevrage des souriceaux car elles ne peuvent pas être réutilisées une seconde fois pour une nouvelle portée. Les souris étudiées (souris d’intérêts et souris contrôle) seront euthanasiées aux différents stades de développement prédéterminés pour l’étude (1 mois selon le résultat de l’IRM, 3 mois, 6 mois et 12 mois). Il est nécessaire d’euthanasier les souris à différents stades de développement afin d’étudier l’initiation et la progression des lésions précancéreuses pancréatiques. Les 20 souris « immunodéprimées » qui auront été opérées pour implantation des lésions précancéreuses et les 10 souris « immunodéprimées » ayant reçu des cellules de lésions précancéreuses en injection intraveineuse seront sacrifiées au terme de l’expérience, 10 semaines après l’intervention afin d’étudier le potentiel invasif des lésions dans ces souris.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur la souris ne peuvent pas être actuellement obtenues par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité du développement des lésions précancéreuses du pancréas de type TIPMP et de leur progression vers le cancer du pancréas. Des études réalisées à l’échelle cellulaire et sur des données de radiologies sont prévus en complément sur la cancérisation des lésions précancéreuses du pancréas mais ne peuvent pas remplacer l’étude sur la souris. Les retombées de ce travail sont utiles en terme de prévention et de traitement à terme chez l'homme.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal de souris qui permet d’obtenir des résultats exploitables. Le nombre d’animaux est fixé de 5 à 10 par groupe de souris selon les analyses prévues. Pour étudier le développement des lésions précancéreuses, nous devons obtenir des lésions à des âges différents ; et au vu de précédentes études publiées, nous avons décidé d’étudier 4 âges différents chez la souris (1, 3, 6, 12 mois). Néanmoins, un examen non douloureux et non invasif sera réalisé à 1 mois des souris (une imagerie par IRM). Cet examen nous montrera si des lésions sont apparues sur le pancréas des souris et si ce n’est pas le cas, l’euthanasie des souris pourra être reporté à 3 mois, et ainsi moins d’animaux seront nécessaires à l’ensemble de l’étude.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des portoirs ventilés, 5 individus par cage. La température, l'hygrométrie, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec 1 bâtonnet en bois, des cotons et du kraft. Le suivi des caractéristiques précises renseignant sur le bien être ou la souffrance des souris (poids, pelage, activité…) sera réalisé quotidiennement et l’application de mesures adaptées pour limiter la souffrance sera alors faite (enrichissement, réévaluation précoce dans la journée, adaptation de la nourriture, administration d’antidouleurs, et le cas échéant euthanasie). Les souris ne souffrent pas du développement des lésions précancéreuses du pancréas car celles-ci sont asymptomatique. Après intervention chirurgicale et en cas de repérage de signes de douleurs grâce au suivi des souris et à la reconnaissance de signes d’inconfort et de souffrance, des médicaments antidouleur seront donnés aux souris.

Choix des espèces

Nous travaillons sur la souris car c’est le meilleur modèle animal connu pour étudier le développement de pathologies communes avec l’homme et dont la génétique est bien connue. Les souris sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes des pathologies humaines. L’objectif du projet est d’étudier le développement et l’évolutivité de lésions précancéreuses du pancréas grâce à un modèle de souris. Pour que les souris étudiées (souris d’intérêt et souris contrôles) puissent développer des lésions précancéreuses du pancréas, il faut qu’elles reçoivent un produit spécifique après la naissance. Le meilleur moyen, car ayant le moins de risque pour les souris, est qu’elles reçoivent le tamoxifène par le biais du lait de leurs mères. C’est pourquoi la procédure d’injection dans le ventre du tamoxifène est réalisé chez des souris allaitantes et non chez les souriceaux. Les femelles allaitantes auront au moins 60 jours à la mise en accouplement. Après la naissance des souriceaux, elles seront avec eux au moins 4 semaines jusqu’à leur sevrage. Les souris étudiées seront euthanasiées pour l’étude de leur pancréas et du développement des lésions de TIPMPs à différents âges de vie afin d’étudier ces lésions précancéreuses à différents moments de transformation. Compte tenu des données de précédentes études sur des lésions pré-cancéreuses chez la souris et pour avoir des résultats significatifs avec le moins d’animaux possible, il a été décidé d’étudier les souris à 1, 3, 6 et 12 mois. Afin d’étudier le développement de ces lésions précancéreuses, des souris immunodéprimées seront opérées pour implanter des lésions de TIPMPs. L’implantation sera réalisée chez 30 souris immunodéprimées adultes âgées de 6 à 7 semaines. Les souris immunodéprimées seront sacrifiées 10 semaines après l’intervention ou avant en cas de signes de souffrance (perte de poids, moins de mobilité, pelage hérissé en permanence…).

704 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des chirurgies, des jeûnes répétés, des injections de glucose ou d'édulcorants et de multiples prélèvements sanguins, avant une chirurgie terminale sous anesthésie sans réveil pour prélever des tissus de l'hypothalamus. Le projet cherche à comprendre comment les substituts de sucre non nutritifs perturbent le métabolisme du glucose et la prise alimentaire. Le porteur affirme qu'aucun modèle de substitution ne permet d'étudier ces mécanismes mettant en jeu des dialogues entre organes.

Objectifs

Consommés régulièrement des substituts de sucres non nutritifs (SNN) peuvent provoquer une augmentation de la prise alimentaire et par voie de conséquence une augmentation de la glycémie à long terme. De plus, il a été montré que la consommation de SNN sur une courte période pouvait diminuer la sensibilité à l’insuline en réponse à un test de tolérance au glucose réalisé chez des sujets sains. Ces changements métaboliques pourraient entrainer des dysfonctions physiologiques notamment par l’intermédiaire des récepteurs T1Rs au goût sucré. Ces récepteurs sont retrouvés sur la langue mais aussi dans tout l’organisme et en particulier sur les vaisseaux sanguins et l’hypothalamus. L’objectif de ce projet sera d’étudier l’effet (les effets) de substituts de sucre non nutritifs (SNN) à court mais aussi à long terme sur la (les) réponse(s) de l’hypothalamus, en particulier de déterminer les effets métaboliques (dont le contrôle nerveux de la sécrétion d’insuline) et sur la prise alimentaire.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations nous permettrons de mieux comprendre pourquoi et comment la consommation d’édulcorants entrainent un dysfonctionnement du métabolisme glucidique et du contrôle de la prise alimentaire en lien avec l’hypothalamus, et indépendamment de la perception gustative orale.

Procédures

Etude de l’effet chronique des édulcorants Par voie extraorale : Une partie des animaux subira une chirurgie de 30 à 45 minutes (procédure1), après 6 semaines, la moitié de ces rats opérés suivra la procédure 2 (reprise alimentaire après un jeûne) avec mise à jeun de 8 heures suivie d’une injection intrapéritonéale (IP) PBS ou IP glucose puis 3 prélèvements sanguins sur 4 heures. Ces animaux seront ensuite utilisés, une semaine après en procédure 4 avec chirurgie sans réveil. L’autre moitié subira la procédure 3 : soit un test de tolérance au glucose avec mise à jeun de 4 heures suivi d’une IP de glucose puis 6 prélèvements sanguins sur 2 heures soit une échoMRI, ils subiront la procédure 4 sans réveil après une semaine de repos. Par voie orale : Ces animaux auront les édulcorants pendant 8 semaines dans l’eau de boisson. Après 8 semaines, la moitié de ces rats suivra la procédure 2 avec mise à jeun de 8 heures suivie d’une IP PBS ou IP glucose puis 3 prélèvements sanguins sur 4 heures. Ces animaux seront ensuite utilisés une semaine après en procédure 4 avec chirurgie sans réveil. L’autre moitié subira la procédure 3 : soit un test de tolérance au glucose avec mise à jeun de 4 heures suivi d’une IP de glucose puis 6 prélèvements sanguins sur 2 heures soit une échoMRI, ils subiront la procédure 4 sans réveil après une semaine de repos. Pour l’étude de l’effet aigu : un groupe de rats subira la procédure 2 : avec un jeûne de 8 heures une IP de glucose, de PBS, ou de l’un des deux édulcorants étudiés et 3 prélèvements sanguins sur 4 heures. Après une semaine de repos ils subiront la procédure 4 sans réveil. Aucun animal n’aura plus d’une procédure avec prélèvement alors qu’il est éveillé.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable attendu est la perte de poids après chirurgie mais aussi chez les rats chroniques per os s’ils ne buvaient pas l’eau contenant l’un des 2 édulcorants (ou à l’inverse une prise de poids importante)

Devenir

Procédure 1 : Classée modérée : ces animaux seront gardés en vie : cette procédure permettra d'étudier le ou les effets des édulcorants diffusés de façon chronique par voie extraorale, ils seront utilisés dans d'autres procédures : 2 (ou 3) et 4. Procédure 2 : Classée légère, cette procédure permettra l'étude des effets des édulcorants (soit aigus soit chroniques : par voie orale ou par diffusion extraorale) sur la reprise alimentaire après un jêune, ces animaux seront gardés en vie et utilisés en procédure 4. Procédure 3 : Classée légère, cette procédure permettra l'étude des effets des édulcorants sur le métabolisme glucidique et la répartition des masses maigres et grasses après traitement ces animaux seront gardés en vie et utilisés en procédure 4. Procédure 4. Classée sans réveil : Etude de la réponse hypothalamique au glucose en fonction du traitement aux édulcorants (aigu ou chronique par voie orale ou par diffusion osmotique). Cette procédure prévoit le prélèvement de tissus gluco sensibles frais ainsi que des tissus fixés pour les études d'immunohistochimie. Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

L’étude des mécanismes biologiques à la base des comportements alimentaires nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. Il n’existe actuellement pas de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier les paramètres physiologiques d’intérêt dans nos études (prise alimentaire, dépense énergétique, thermogenèse, glycémie, adiposité, etc), car ces paramètres mettent en jeu des arcs-réflexes, des rétrocontrôles, et des dialogues entre organes.

Réduction

Les procédures décrites, ainsi que la stratégie expérimentale ont été optimisées, standardisées et validées dans des projets antérieurs, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle et d'éviter des études pilotes supplémentaires, et permet donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Nous utiliserons des tests statistiques afin de calculer le nombre minimum d’animaux permettant une représentation de la population et suffisant pour détecter des différences significatives.

Raffinement

Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux. Lors des expérimentations réalisées sous anesthésie générale, les animaux recevront une dose d’analgésique morphinique puis seront sédatés avant de recevoir l’anesthésique. Les doses et les produits utilisés le sont sur les conseils du vétérinaire désigné du laboratoire. Un suivi quotidien sera fait pour s’assurer du bien-être des animaux. Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle lumineux inversé permettant l’expression de comportements innés et favorisant la protection des animaux. Les expérimentations auront lieu durant la période d'activité des rats en leur laissant leur période de repos pendant le cycle de jour. Deux semaines seront nécessaires pour l'habituation à leur nouvel environnement et au personnel. Ce raffinement contribue au bien-être animal, ce qui réduit la variabilité inter-individuelle engendrée par le stress, et par conséquent limite le nombre d’individus nécessaires pour les études statistiques.

Choix des espèces

Le rat est une espèce très étudiée par la communauté scientifique, la bibliographie est abondante nous apportant des données d’intérêt dans notre projet, et permettant ainsi la réduction du nombre d’animaux utilisés Nous voulons que les animaux aient le même âge pour les études aigues et les études chroniques, sans pathologies dues à l'âge : Pour les études des effets aigus des édulcorants, les rats arriveront à l’âge de 12 semaines, en tenant compte des deux semaines d’habituation à leur nouvel environnement, ils auront 14 semaines au moment des expérimentations. Pour les études des effets chroniques des édulcorants consommés dans l’eau de biberon, les rats arriveront à l’âge de 4 semaines, en tenant compte des deux semaines d’habituation à leur nouvel environnement, ils auront 14 semaines au moment des expérimentations. Pour les études des effets chroniques des édulcorants injectés par voie carotidienne à l’aide des mini-pompes osmotiques (diffusion pendant 6 semaines maximum), les rats arriveront à l’âge de 6 semaines, ils auront 8 semaines au moment de la mise en place de la mini-pompe, 14 semaines au moment des expérimentations

1260 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tuées à l'issue et 60 reproducteurs réutilisés pour l'élevage. Immunodéprimées, elles reçoivent des greffes de cellules tumorales humaines sous la peau et jusqu'à quatre injections sous anesthésie, avec mesure régulière des tumeurs avant mise à mort et recherche de métastases. Le porteur signale une possible perte de poids, une altération de l'état général et une ulcération des tumeurs. Il affirme que la croissance tumorale et son micro-environnement ne peuvent être reproduits en culture cellulaire et retient la souris comme "modèle de référence" en cancérologie.

Objectifs

Actuellement, pour rétablir une réponse anti-tumorale efficace dans différents types de cancers dont les cancers urologiques, la thérapie privilégie le blocage par des anticorps des molécules, dites « de checkpoints », qui inhibent la réponse immunitaire anti-tumorale. La molécule de checkpoint HLA-G n'est pas exprimée dans la plupart des tissus adultes normaux mais est exprimée dans la plupart des cancers. Des travaux préliminaires chez la souris ont montré que l'utilisation d’anticorps anti-HLA-G permettait de restaurer la réponse anti-tumorale. Notre présent objectif est de démontrer qu'en cas de non-réponse aux thérapies « classiques », le checkpoint HLA-G constitue une meilleure cible thérapeutique très prometteuse dans certains cancers, dont les cancers urologiques. Dans le cadre de ce projet, les études sur des modèles animaux sont requises afin de répondre aux questions scientifiques suivantes : - Les cellules immunitaires présentes dans les tumeurs humaines de rein sont-elles anti-tumorales et donc potentiellement capables de détruire la tumeur ? - Des anticorps bloquant le checkpoint HLA-G sont-ils capables de restaurer l’action des cellules immunitaires ? - L’expression du checkpoint HLA-G sous diverses formes protéiques empêche-t-elle l’action des cellules immunitaires ? - L’expression du checkpoint HLA-G sous diverses formes protéiques contrôle-t-elle la dissémination et la vascularisation de la tumeur ?

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont tout d’abord de faire progresser et d’étoffer les connaissances scientifiques sur les cancers urologiques en démontrant, pour ces cancers ne répondant pas aux thérapies dirigées contre des checkpoints « classiques » et que le checkpoint HLA-G constitue une cible thérapeutique à privilégier. Dans le même temps, la caractérisation de différentes formes de la protéine HLA-G et son effet sur l’échappement de la tumeur au système immunitaire permettra aussi de mieux appréhender les différents mécanismes sous-jacents de nombreux cancers ainsi que les effets de ces formes sur les checkpoints immunitaires. A plus long terme, ce projet permettra la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces et plus spécifiques contre les cancers urologiques et probablement d’autres cancers impliquant les checkpoints immunitaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à un nombre différent d’injections. Au maximum, ils recevront 4 injections : des cellules tumorales par voie sous-cutanée, des cellules immunitaires et celles avec le traitement contenant des anticorps (x2) et un prélèvement sanguin. Ces souris seront anesthésiées avant chaque injection pour une durée d’environ 30 minutes. Cela correspond à un maximum de 2h d’anesthésie pour 4 injections (30 min / injection) + un prélèvement sanguin sur une période de 30 jours. De plus les animaux seront manipulés sans être anesthésiés au moins 3 fois par semaine pour réaliser des mesures des tumeurs au pied à coulisse et/ou des relevés de poids.

Impact sur les animaux

L’implantation de tumeurs chez la souris par injection d’iPSC et/ou de cellules tumorales est une technique éprouvée et publiée par de nombreux laboratoires depuis plusieurs années, ce qui nous permet d’avoir du recul sur les nuisances ou effets indésirables attendus. Il se peut que ces souris perdent du poids ou aient une altération de leur état général une à deux semaines après l’injection ou qu’elles présentent une ulcération au niveau de la tumeur deux à trois semaines après l’injection des cellules tumorales. Le développement de ces tumeurs et/ou l’apparition de métastases à un impact sur la santé de l’animal, dont les premiers signes sont un amaigrissement et des modifications comportementales. Il n’y a pas d’impact du développement des tumeurs primaires qui soit attendu sur les fonctions vitales de l’animal, en revanche la présence de métastases peut avoir des conséquences en fonction de leur emplacement.

Devenir

A l’exception des animaux reproducteurs (élevage et production des animaux pour les autres procédures), les animaux entrant dans les procédures seront euthanasiés afin de rechercher et scorer la présence de métastases dans les différents tissus. A cette occasion les tumeurs seront prélevées pour réaliser leurs études histologiques et biochimiques. Les animaux reproducteurs seront réutilisés tant qu’ils seront fertiles, toujours en tant qu’animaux reproducteurs pour d’autres projets ou le maintien de la lignée dans l’animalerie.

Remplacement

De nombreuses caractérisations ont déjà été effectuées en culture cellulaire, comme l’analyse des biomarqueurs ou l’activité des cellules immunitaires. Il s’agit maintenant de d’évaluer la croissance tumorale et son développement in vivo. Pour ce faire, le modèle animal est requis afin d’évaluer la croissance tumorale dans un environnement adéquat. En effet, les cellules cancéreuses ont besoin de multiples signaux pour croitre correctement, d’une interaction avec les différents tissus et en particulier avec le système vasculaire de l’hôte, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. De plus, nous nous intéressons ici au micro-environnement tumoral et en particulier aux cellules immunitaires présentes dans cet environnement. Pour évaluer toutes ces interactions avec les différents tissus et/ou types cellulaires, nous avons besoin d’utiliser un modèle animal.

Réduction

Dans la littérature spécialisée, les expérimentations « pilotes » se font sur des groupes de 5 à 15 souris immunodéficientes par expérience. Pour satisfaire aux conditions de répétabilité nécessaire dans la science, chacune d’elles doit être répétée au moins 1 fois et jusqu’à 2 fois si besoin pour obtenir des données statistiquement exploitables. Au cours d’études préliminaires et dans la littérature scientifique, les tailles des tumeurs présentent un coefficient de variation important (environ 20%). En considérant une variation de 20% et en recherchant un effet bénéfique de traitements avec une réduction de 30% de la taille des tumeurs, des groupes de 10 animaux nous permettront d’obtenir des données statistiquement significatives (dans les conditions classiques de risque). Des tests statistiques seront effectuées sur les données obtenues lors des expérimentations. Pour une expérience donnée, si les résultats statistiques se montrent significatifs après une répétition, la seconde et dernière répétition ne sera pas effectuée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe de 5, dans un environnement approprié à leur statut immunodéficitaire (litière et nourriture stérilisées, eau sur filtre antibactérien d’exclusion 0,22 µm, cages avec couvercle filtrant dans un local isolé) à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture seront fournies autant que nécessaire. Les animaux seront examinés quotidiennement par les zootechniciens, sous la supervision permanente du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal au niveau de l’équipe local de la SBEA. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Un environnement enrichi sera fourni aux animaux, selon nos procédures standards (tubes de carton, boules de coton…).

Choix des espèces

Le modèle souris est le modèle de référence dans le domaine de la cancérologie. Il s’agit du modèle le plus utilisé et le plus étudié dans la communauté scientifique et une bibliographie riche et abondante y est associée. Pour réaliser notre projet, nous nous appuyons sur les différentes données déjà publiées, comme l’évolution des cellules cancéreuses RCC7 chez les souris ou encore les effets des protéines HLA-G sur d’autres types de cancers. Ces données nous permettent de faire reposer ce projet sur des bases bibliographiques solides qui ne sont pas à répéter, ce qui va aussi dans la logique d’une réduction du nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des souris : de 6 à 8 semaines et de 20 à 25g. Il s’agit d’après la littérature scientifique du stade optimal pour l’injection de cellules tumorales chez la souris qui présente un système immunitaire mature.

Capturées à la main deux à trois fois par semaine et anesthésiées à chaque fois pour une prise de sang et un frottis vaginal, 6 femelles ouistitis et 6 femelles singes écureuils subissent ensuite l'ablation de l'utérus, avec un risque d'hémorragie interne, d'abcès ou d'éventration. Au total, 18 femelles primates, dont 6 femelles babouins soumises sous anesthésie à une biopsie par raclage, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes restent en vie dans leur groupe social d'origine. Le projet doit retracer l'évolution de la menstruation chez les primates, et le porteur écrit qu'il servira aussi à évaluer si l'utilisation de primates non-humains comme "modèles de recherche" pour l'endométriose "est pertinente". Les ouistitis et les singes écureuils ont été retenus, explique-t-il, parce qu'ils n'ont pas de menstruation, comme point de comparaison avec les babouins.

Objectifs

Les objectifs du projet sont la caractérisation au niveau cellulaire, génétique et fonctionnel de l’évolution de la menstruation chez les primates. Ce projet répond à une question cruciale mais sous-étudiée liée à l’évolution de l’espèce humaine, ayant des conséquences sérieuses au niveau médical.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser les réseaux moléculaires mis en jeu lors du cycle hormonal et de la menstruation à l'état sain chez les primates, et d'évaluer leur conservation entre espèces. La caractérisation de cet état sain est une base indispensable à la compréhension des mécanismes pathologiques, et pour évaluer si l'utilisation actuelle de primates non-humains comme modèles de recherche pour les maladies telles que l'endométriose est pertinente.

Procédures

Babouins : Le suivi des cycles des 6 femelles babouins se fait par observation (non-invasive) pendant 3 mois. Le jour de la biopsie par raclage les animaux seront capturés dans leurs enclos respectives à l’aide des tunnels de capture et transférés dans des cages à fond amovible pour être anesthésiés avant de suivre la biopsie. La durée de la capture peut prendre 30 minutes. La durée de la biopsie, 1 heure. Ouistitis et Singes écureuils : Le suivi des cycles des 6 femelles ouistitis et 6 femelles singes écureuils se fait par dosage sanguin de la progestérone et suivi de l’indice caryopyknotique de l’épithélium vaginal. Les animaux doivent être capturés entre 2 et 3 fois par semaine(les prélèvements pourront être plus espacés lors du suivi du 2ème et 3ème cycle selon la concordance aux valeurs de références) pour faire un prélèvement sanguin à faible volume et un frottis vaginal. Les animaux seront capturés manuellement. L’ensemble des prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. La durée normale de l’intervention est de 10 minutes (maximum 30 minutes). Les 6 ouistitis et singes 6 écureuils subiront une hystérectomie. Le temps d’anesthésie générale requis pour une hystérectomie chez une petite espèce comme le Singe écureuil ou le Ouistiti est de une heure maximum. (avec un temps de préparation de l’animal d’environ 30 minutes et environ 30 minutes d’acte chirurgical pur).

Impact sur les animaux

Babouins : Le suivi des cycles des femelles babouins se fait par observation (non-invasive). La biopsie par raclage est un acte bien maîtrisé et peu invasif et n’induira pas de douleur importante apparente. Dans ce genre d’intervention le risque d’hémorragie est minime. Cependant en cas d’hémorragie la manipulation sera directement arrêtée. L’animal sera pris en charge directement par l’équipe vétérinaire de l’établissement. Ouistitis et Singes écureuils : Le suivi des cycles des femelles ouistitis et singes écureuils se fait par dosage sanguin de la progestérone et suivi de l’indice caryopyknotique de l’épithélium vaginal. Les animaux doivent être capturés dans leurs enclos entre 2 et 3 fois par semaine (les prélèvements pourront être plus espacés lors du suivi du 2ème et 3ème cycle selon la concordance aux valeurs de références) pour faire un prélèvement sanguin à faible volume et un frottis vaginal. Les animaux seront capturés manuellement. Ce geste est très bien maîtrisé par l’établissement. À part de le stress lié à ce type de manipulation, aucun effet indésirable cumulatif n’est attendu sur ces animaux. L’ensemble des prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. Le protocole anesthésique est un protocole fiable et sûr car il est réalisé en routine dans l’établissement. Les prélèvements se feront sur la veine fémorale principalement mais d’autres veines pourraient être utilisées telles que les veines saphènes, jugulaire et céphalique pour éviter l’apparition d’hématomes importants. Les ouistitis et singes écureuils subiront une hystérectomie. Plusieurs complications post-chirurgicales peuvent survenir avec des degrés de gravités différents (hématomes, infections urinaires, surinfections de la plaie chirurgicale (abcès), hémorragies internes ou encore éventration). Les actes pré-opératoires, opératoires et post-opératoires sont réalisés de sorte à minimiser les risques de survenue de ces complications. Toutefois, en cas de complications septiques de plaies une antibiothérapie à large spectre sera initiée (Amoxicilline/Acide clavulanique 15 mg/kg BID PO ou 15 mg/kg IM tous les 2 jours). Dans le cas d’autre complications, l’animal sera immédiatement pris en charge par l’équipe vétérinaire de l’établissement. Dans tous les cas l’animal sera isolé et surveillé par l’équipe vétérinaire de l’établissement jusqu’à récupération complète.

Devenir

Tous les femelles seront gardées en vie et dans leurs groupes sociaux d’origine après chacune des procédures.

Remplacement

La menstruation est un phénomène tissulaire complexe qui ne peut pas être étudié fonctionnellement sur des cellules en culture. L’étude du transcriptome et des régions de régulation de la transcription nécessite l’utilisation d’échantillons de tissus prélevés directement sur les animaux avec un suivi strict du cycle hormonal. Il n’existe pas de banque de tissu pour cet organe en ces conditions.

Réduction

Pour chaque espèce nous utiliserons 6 individus (soit 18 animaux au total). 3 femelles seront prélevées dans la phase lutéale et 3 femelles en fin de cycle (menstruation ou phase équivalente pour les espèces non menstruantes). Ce nombre correspond au nombre minimum de réplications par espèce nécessaire à l'interprétation des résultats de l'étude.

Raffinement

Tous les prélèvements de tissu se feront sous anesthésie générale et couverture antalgique. Pour les babouins, la biopsie se fera par raclage en minimisant au maximum le stress pour l’animal et l’invasivité du prélèvement. Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par notre responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal.

Choix des espèces

La menstruation est présente seulement chez certains primates. Nous avons sélectionné pour l’étude cinq primates non-humains et l’Homme. Chez les Cercopithecinae, un clade proche phylogénétiquement de l’Homme, nous trouvons des espèces avec menstruation (e.g. babouin olive, macaque rhésus). Dans la super-famille Ceboidae, incluant des espèces plus éloignées phylogénétiquement, nous trouvons des espèces sans menstruation comme le Singe écureuil et le Ouistiti commun. Cette configuration nous permettra de mettre en évidence les différences fonctionnelles qui sous-tendent l’apparition des menstruations chez les primates en tenant compte de la structure de l’arbre phylogénétique. L'étude nécessitant des échantillons de tissu utérin à la fin du cycle menstruel, tous les animaux utilisés sont des adultes en âge de procréer.

1296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles de myopathies de Duchenne et centronucléaire, elles reçoivent des injections répétées de vecteurs viraux, parfois précédées d'une injection de cardiotoxine provoquant une nécrose musculaire, avant prélèvement des muscles. Le porteur rappelle que de fortes doses de ces vecteurs ont entraîné la mort de quatre enfants en essai clinique et estime la douleur induite chez la souris comparable à "une forte crampe". Il affirme que l'efficacité des vecteurs ne peut être évaluée durablement in vitro et que ces souris sont les plus petits modèles mammifères de ces maladies.

Objectifs

Les virus adéno-associés (AAV) sont utilisés pour véhiculer des molécules thérapeutiques pour les maladies neuromusculaires, comme la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) et la myopathie centronucléaire autosomique dominante (MCN-AD). Les AAV doivent atteindre le noyau céllulaire pour véhiculer efficacement le gène thérapeutique. Ils entrent dans la cellule puis sont transportés dans les vésicules intracellulaires jusqu’au noyau. Afin de s’exprimer les AAV doivent être débarrassés de leur capside dans ces vésicules. Très peu d'informations sont disponibles concernant le devenir des AAV dans les muscles DMD et MCN-AD. La MCN-AD est une forme rare de myopathie congénitale due à des mutations du gène codant la dynamine 2 (DNM2). La DNM2 est une protéine impliquée dans les processus de transport intracellulaire. Nous avons montré que l'injection intramusculaire d’un AAV thérapeutique permet de restaurer la structure et la fonction musculaires chez le modèle murin de la MCN KI-Dnm2 (KI-Dnm2R465W), le traitement s'est avéré moins efficace chez les souris de 6 mois qui présentent un phénotype musculaire plus prononcé. La DMD est la plus fréquente des maladies neuromusculaires chez l’enfant et due à des mutations dans le gène de la dystrophine. Elle est caractérisée par des atteintes du muscle squelettique et cardiaque graves mettant en jeu le pronostic vital. L’état du muscle s’accompagne de déstabilisation des vésicules de transport intracellulaires. Nous avons montré que l’expression d’AAV thérapeutiques était réduite dans le muscle des souris mdx, un modèle de souris de la DMD, par rapport aux souris de type sauvage. Notre projet a pour but d'étudier le devenir de l'AAV dans les muscles des souris KI-Dnm2R465W et mdx et d'évaluer des prétraitements pour améliorer l’efficacité de ces vecteurs dans ces muscles pathologiques.

Bénéfices attendus

Dans les thérapies des maladies neuromusculaires, les vecteurs AAV sont injectés à fortes doses pour qu’ils soient efficaces car le muscle est en mauvais état. En effet, des essais cliniques récents ont mis en évidence des effets secondaires graves à cause des fortes doses d’AAV administrées dans le cadre de la myopathie de Duchenne (DMD) mais aussi d’autres myopathies qui a engendré le décès de 4 enfants. Ainsi, l'utilisation clinique de l'AAV nécessite une optimisation afin d'atteindre un bénéfice thérapeutique maximal avec la plus faible dose de vecteur dans le muscle malade. Actuellement, il n'existe aucune information disponible concernant le devenir des AAV dans les muscles DMD et MCN-AD. Notre projet permettra d'identifier les étapes intracellulaires qui empêchent une thérapie AAV efficace dans ces muscles malades et de développer des stratégies pour optimiser ces thérapies. Ainsi, nous pourrons proposer des traitements qui améliorent l’état du muscle malade et qui permettraient de débloquer les étapes qui limitent la thérapie avec l’AAV.

Procédures

Pour les co-traitements, les souris mdx (phénotype non dommageable) et CNM (phénotype domageable) seront injectées en intrapéritonéal (IP) ou en intramusculaire (IM) avec des traitements qui améliorent l'état du muscle puis injectées en intramusculaire (IM) avec de l'AAV grâce à une seringue à insuline munie d‘une aiguille ultrafine. Chaque souris subira 2 injections (2 IM suscessives ou d’1 IP suivie d’ 1 IM) ou de plusieurs injections (Plusieurs IP espacées suivies d’1 IM). La durée de l’IM ou de l’IP est d’environ 15 secondes par souris. La mesure de force du Tibialis Antérieur chez les souris ayant subi les co-traitements thérapeutiques sera réalisée par le personnel expert et dure 20 mn par souris. Pour les injections IM et les mesures de force, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse dans un système adapté. La température corporelle des animaux est maintenue à 37°C à l’aide d’une plaque thermorégulée. Pour la procédure où nous étudions l'effet de la position des noyaux au centre des fibre sur l'efficacité de l'AAV, nous injectons en sous-cutané un analgésique avant (1 fois) et après (2 fois par jour pendant 5 jours) l'injection en IM de la cardiotoxine à des souris non malades (animaux sains) pour limiter la douleur liée à la nécrose. Tout au long de la procédure, les animaux sont hébergés 6 par cage maximum et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent. A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale conformément à l’annexe IV de l’arrêté relatif à l’agrément des établissements. A la fin de chaque procédure (avec meusre de force ou sans), le muscle est prélevé pour analyse biologique et histologiques.

Impact sur les animaux

L’utilisation de vecteurs viraux AAV n’entraine pas de douleurs et de mise en place de traitement particulier pour y palier. Dans cette procédure aucune pathologie ni phénotype n’est induit chez les animaux par le vecteur. Pour l'injection de cardiotoxine, notre expérience et celle de nos collègues n’a pas permis de déceler une souffrance animale. Dès le réveil (moins de trente minutes après le début de l'anesthésie), plus de 90% des souris opérées circulent dans la cage sans gêne décelable. En effet, la régénération du muscle Tibialis antérieur n'empêche pas la marche de la souris, car le muscle adjacent, Extensor Digitorum Longus, compense l'immobilisation. Ils estiment ainsi qu'elles subissent une douleur de degré 1 à 2, sans altération de l'état général. La douleur doit être comparable à une forte crampe de l'avant de la patte postérieure.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de protocole selon la réglementation en vigueur pour études moléculaires et analyses histologiques des muscles injectés.

Remplacement

Le but du projet est l’optimisation des approches thérapeutiques utilisant des AAV comme outil de transfert de molécules thérapeutiques dans le muscle pathologique. Des essais cliniques récents ont mis en évidence des effets secondaires graves à cause des fortes doses d’AAV administrées aux patients myopathie de Duchenne et une myopathie musculaire à noyaux centraux. Les modèles de souris que nous utilisons constituent à ce jour de très bons modèles pour optimiser les traitements AAV car nous avons montré que des doses élevées de vecteurs sont nécessaires pour atteindre une efficacité thérapeutique (comme démontré chez l’Homme) mais sans aucune toxicité de ces traitements. De plus, l’efficacité des vecteur AAV ne peut pas être évaluée à long terme dans les cellules musculaires en culture car elles se décollent au bout de quelques jours de culture. Enfin, certaines dérégulations retrouvées dans les muscles pathologiques in vivo, comme la position des noyaux au centre des fibres, ne peuvent être modélisée in vitro.

Réduction

Des études précédentes sur nos différents projets ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin d’évaluer de façon correcte les paramètres observés (6 souris par groupes expérimentaux). L’ensemble de ces axes de recherche nécessite l’utilisation de 1296 souris dans 5 procédures expérimentales pour les 5 ans du projet. Ceci implique le maintien de 2 lignées KI-Dnm2R465W (phénotype dommageable) et DMD (sans phénotype dommageable) afin de générer les souris nécessaires au projet pour les 5 ans du projet.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès à la nourriture. Les conditions de température, d'hygrométrie et d'éclairage sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont hébergés 6 par cage maximum et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’utilisation de vecteurs viraux AAV n’entraine pas de douleurs et de mise en place de traitement particulier pour y palier. Aucune pathologie n’est induite chez les animaux. Pour les souris saines commercialisée, une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début de toute procédure expérimentale. Pour l'injection de cardiotoxine, notre expérience et celle de nos collègues qui nous conseille sur ce projet, n’a pas permis de déceler une souffrance animale par un suivi très régulier. Dès le réveil (moins de trente minutes après le début de l'anesthésie), plus de 90% des souris traîtées circulent dans la cage sans gêne décelable. La régénération du muscle injecté n'empêche pas la marche de la souris, car le muscle adjacent compense l'immobilisation. On estime ainsi qu'elles subissent une douleur de degré 1 à 2, sans altération de l'état général. La douleur doit être comparable à une forte crampe de l'avant de la patte postérieure. L'administration d'analgésiques sera réalisée 30 minutes avant la procédure puis deux fois par période de 24h après l’injection de CTX pendant 5 jours afin d'atténuer la douleur due à la nécrose des myofibres. Les animaux seront observés toutes les 24 heures pendant les premiers jours. La température corporelle des animaux est maintenue à 37°C à l’aide d’une plaque thermorégulée pendant toute les durées des procédures. Des modifications importantes de comportement apparaissant à l’observation des animaux et laissant supposer une douleur excessive (retrait ou vocalisation excessive à la manipulation, prostration ou agitation anormale) seront considérées comme critères d’arrêt de l'expérimentation et conduira à l’euthanasie des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour l’optimisation du traitement AAV car la souris mdx et la souris KI-Dnm2R465W sont les plus petits modèles animaux mammifères de la myopathie de Duchenne et CNM-AD. Toutes les procédures seront donc réalisées sur animaux adultes entre 3-5 mois. Majoritairement les souris mdx jeunes adultes seront toutes du même âge pour chaque procédure. Les muscles des souris mdx subissent une phase importante de nécrose entre 3 et 10 semaines, c’est pourquoi nous utilisons ces souris après 3 mois. Les souris KI-Dnm2R465W développent un phénotype musculaire progressif dont les premiers signes apparaissent à 1 mois et s’amplifient jusqu’à environ 8 mois. Concernant la transduction virale nos études préliminaires montrent un défaut qui apparait à partir de 2 mois. Les souris âgées de 3 mois (phénotype intermédiaire) permettent de déterminer l’efficacité des co-traitements et à stopper le développement de la maladie chez ces souris qui sont déjà atteintes.