Procédures légères

2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles de la maladie de Parkinson, elles subissent une lésion cérébrale par injection stéréotaxique, des tests comportementaux nommés Catwalk, cylinder test, cliff hanging et VDS, des injections quotidiennes de pramipexole pendant quatre semaines et une restriction alimentaire ramenant leur poids à 85 %. Le porteur indique que les animaux récupèrent difficilement après la lésion et perdent souvent plus de 10 % de leur poids. Il affirme que ces comportements moteurs et impulsifs ne peuvent être reproduits ni par des modèles cellulaires ni par des invertébrés.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative avec symptômes moteurs et comportementaux. Des mutations du gène Parkin (PRKN) ont été rapportées comme responsables de certaines formes génétiques. Parmi ceux-ci, des troubles des conduites impulsives (TCI) secondaires aux traitements par agonistes dopaminergiques ont été rapportés chez les patients Parkinsonien, et en particulier plus fréquemment chez les patients porteurs de la mutation du gène Parkin (PRKN). Malgré les consequences négatives, les comportements impulsifs et compulsifs, sont poursuivis sans contrôle, impactant négativement la vie des patients et leurs aidants. Des facteurs de risques ont été identifiés, principalement pharmacologique dus aux agonistes dopaminergiques, de façon dose- et durée dépendante; également retrouvé dans les modèles murins. La physiopathologie des TCI est encore imparfaitement connue et ce projet a pour but d’en étudier les substrats biologiques. L’objectif général de ce projet est porté en 3 points : • caractériser les troubles des conduites impulsives chez deux modèles murins de la maladie de Parkinson : avec lésion par la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) et porteurs de la mutation du gène Parkin (PRKN) • analyser l’effet dose et durée-dépendant d’un agoniste dopaminergique sur la sévérité de ces troubles (pramipexole (PPX) dans le cas de l’étude) • identifier les causes d’apparition de ces troubles d’un point de vue biologique

Bénéfices attendus

Ce projet s’intègre dans une approche translationnelle et permettra l’identification de cibles thérapeutiques pour améliorer les traitements de la maladie de Parkinson, et prévenir l’apparition d’effets indésirables graves et fréquents, que sont les troubles des conduites impulsives liés au traitement par agonistes dopaminergiques dans la maladie de Parkinson. Après avoir établi les modifications comportementales dans les modèles murins de Parkinson dans ce projet, nous étudierons les modifications biochimiques et épigénétiques en rapport. Ce projet permettra donc : - de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à l'apparition d'un effet indésirable grave chez les patients parkinsoniens traités par traitements dopaminergiques - de développer ultérieurement des nouveaux traitements ciblés permettant de prévenir ces troubles invalidants, ayant un bénéfice direct chez chaque patient et leur entourage, et un bénéfice pour la société en évitant des troubles comportementaux (déviances sexuelles, dépenses inconsidérées, alimentation compulsive, etc...) ayant d'importantes conséquences médico-sociaux-économiques.

Procédures

Les souris effectueront une habituation préalable aux tests comportementaux d'environ 20 min pour l'ensemble des tests avec simple exploration des dispositifs expérimentaux, et 4 sessions d'entrainement au VDS d'une durée de 30 min chacune réparties sur 2 journées. Les souris sont évaluées sur une série de 4 tests comportementaux (2 pour l’évaluation motrice (Catwalk et cylinder test) et 2 pour l’impulsivité (cliff hanging et VDS) réalisés le même jour et dont la durée totale n'excèdera pas 1h30 par souris pour l'ensemble des tests. Ceci est répété 6 fois maximum au cours de la vie de l'animal. Les animuax recevront une injection sous-cutanée quotidienne lors de la phase de traitement par le pramipexole (PPX) sur une durée de 4 semaines. Une unique procédure chirurgicale est prévue pour certains des animaux : l’opération chirurgicale aura lieu dans la pièce de chirurgie. Elle durera 30 min environ pour une micro-injection dans une structure cérébrale. Les animaux se réveilleront 1 minute après l’injection en cas d’anesthésie gazeuse à l’isoflurane, 30 à 45 min après en cas d’anesthesie par injection de Kétamine Xylazine.

Impact sur les animaux

Les injections stéréotaxiques pourraient potentiellement introduire un stress ainsi que de la douleur chez certains animaux dans les heures ou les jours suivants après la chirurgie. Les animaux ont souvent du mal à récupérer après la lésion unilatérale des neurones dopaminergiques. Il est courant que les animaux présentent des difficultés à manger et boire dans les jours qui suivent l’opération, perdant plus de 10% de leur poids pendant cette période. Les injections répétées du traitement et le test comportemental répété à plusieurs reprise peuvent également être des nuisances. Le traitement par PPX devrait diminuer les symptômes parkinsoniens.

Devenir

A la fin des deux procédures, les animaux seront euthanasiés. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Nous étudions des comportements moteurs et impulsifs, il est donc impossible de remplacer les animaux par un modèle cellulaire pour les tests comportementaux. Les études in vitro et sur les invertébrés ne permettent pas l'étude de comportements tels que les mouvements anormaux et leurs conséquences

Réduction

Le nombre total d’animaux impliqués est de maximum 2016 pour l'ensemble des procédures. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats

Raffinement

Concernant le raffinement, pour toute cette étude, les conditions d’hébergement et les protocoles expérimentaux utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur et d’inconfort possible. Les animaux seront hébergés en groupe de 2 à 5 animaux, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne- nocturne de 12h. L’eau, la nourriture seront fournies ad libitum en phase post opératoire et rendues plus accessibles, le temps pour l'animal de récupérer, puis en quantité suffisante pour maintenir un poids à 90% du poids corporel habituel. Un carré de coton pour nidifier est également placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux un enrichissement. Ils feront l’objet d’un contrôle biquotidien car suite à la chirurgie nous renforcerons les observations pour surveiller les animaux dans la période critique où ils perdent du poids pour s'assurer qu'ils s'alimentent, ne montrent pas de signes de douleur, etc... L'accès à l'eau et alimentation sera facilité (hydrogel, croquettes au sol, poudre, ré-hydratation sous-cutanée). En restriction alimentaire pour atteinde 85% du poids initial, ils seront isolés en cage seul afin de pouvoir quantifier les apports alimentaires et se prémunir des risques de dominance empêchant l'animal de s'alimenter en cage d'hébergement multiples en cage. Ils seront observés 1x/j, pesés à J1,J4,J7 et de façon supplémentaire en cas de signe de déshydratation/faiblesse. En cas de dépassement

Choix des espèces

Ce projet s’intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des troubles moteurs et comportementaux de la maladie de parkinson, une pathologie neurodégénérative touchant l’adulte, exprimés dans un organisme mature, à l’âge adulte, en prenant en compte la variabilité individuelle et le sexe. Afin de ne pas interagir avec les phénomènes développementaux, nous utiliserons donc uniquement des animaux adultes (âgés de plus de 7 semaines). Notre projet propose de mieux comprendre le déclenchement des troubles conduites impulsives (TCI) induits par le traitement des agonistes dopaminergiques. Ces comportements ne peuvent être reproduits ni modélisés par des modèles in vitro ou computationnels. Le projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, nécessitant des souris transgéniques et ne peut se faire qu’à l’aide d’études comportementales au niveau de l’animal. Une fois les acteurs pharmacologiques et moléculaires déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles cellulaires lorsque cela est possible pour limiter le nombre d’animaux utilisés.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des molécules par gavage une à deux fois par jour, cinq jours par semaine pendant deux mois, avec des prélèvements de sang à la queue et des photographies de la peau sous anesthésie. Le porteur affirme que les neurofibromes cutanés ne sont pas douloureux et qu'aucune des procédures n'est douloureuse. Il indique qu'à sa connaissance aucun autre modèle animal ni système in vitro ne reproduit le développement de ces tumeurs liées à la neurofibromatose de type 1.

Objectifs

Le but de ce projet est d’utiliser la lignée NF1-KO,et d'identifier de nouvelles molécules qui régressent le développement des neurofibromes cutanés (NFc) dans la neurofibromatose de type 1. La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie génétique due à des mutations du gène NF1 codant pour la neurofibromine, régulateur négatif des fonctions cellulaires importantes telles que la prolifération, la différenciation, la survie et le métabolisme des cellules. Tous les patients NF1 développent des NFc, tumeurs bénignes au niveau des terminaisons nerveuses dont le nombre peut atteindre des milliers. A part leur exérèse chirurgicale, ce qui n’est pas possible quand leur nombre est élevé, il n’existe aucun traitement permettant de prévenir ou faire régresser leur développement. Nous avons développé le modèle de souris (NF1-KO), dans leque le gène NF1 est inactivé et qui récapitule le développement des NFc et qui est à l’origine des découvertes de premier plan concernant les mécanismes responsables de leur développement. Ce modèle vient d’être utilisé par notre équipe avec succès pour réaliser des essais précliniques des molécules candidates afin de prévenir/régresser le développement des NFc. Recemment nous avons développé deux versions du modèle, appelées curatif et préventif. Le modèle curatif consiste à traiter les animaux NF1-KO présentant des nombreux NFc afin d’identifier les molécules capables de régresser/bloquer leur développement. Le modèle préventif consiste à traiter les animaux mutants juste avant l’apparition des tumeurs afin d’éliminer les cellules à l’origine des NFc et de prévenir leur développement. Dans cette étude, c'est le modèle curatif qui sera utilisé.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de : (i) valider le protocole d'analyse qualitative et quantitative de l'efficacité des nouvelles molécules à regresser le développement des NFc. Ce protocole sera par la suite proposé à la communauté scientifique afin de tester les nouvelles molécules dans les mêmes conditions pour pouvoir comparer les résultats, (ii) définir l'efficacité des molécules testées seules ou en combinaison à regresser le développement des NFc (iii) identifier des éventuels effets secondaires liés au traitement.

Procédures

Administration (1 à 2 x/jour, 5 jours/semaine pendant 2 mois) des molécules par gavage sur animaux NF1-KO. Cette procédure ne nécessite pas l'anesthésie des animaux et sera réalisé par le personnel expérimenté. Il faut environ 1 min de contention de l'animal pour l'adminstration par gavage. La prélévement de sang se fera au niveau de la queue sur animaux non anesthésiés. La peau du dos des animaux sera photographiée sous une loupe à épifluorescence et sous anesthésie générale (AG). L'AG est de moins de 5min par souris ( rasage, epilation et prise de photos)

Impact sur les animaux

Récemment, deux études similaires ont été réalisées par notre équipe sans pour autant d'observer des effets indésirables pendant et à la fin du traitement. Les NFc ne sont pas douloureux et aucun effet indésirable n'a été observé liée à leur présence sur plus de 500 animaux NF1-KO. L'administration des nouvelles molécules peut provoquer des effets indésirables. Toutefois, les molécules testées dans ce projet ont déjà fait objet des études toxicologiques et ont été, ou sont, testés dans la cadre des études cliniques. Pour définir la gamme des concentrations des molécules nous nous sommes basées sur des données disponibles chez l'homme. Toutefois, en cas de présence d’effets nuisibles, le traitement sera modifié ou suspendu et si l’effet persiste, l’animal sera mis a mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la fin de la procédure 2 & 3. La peau des animaux sera prélevée puis analyser afin d'evaluer l'efficacité des molécules testées.

Remplacement

A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc.

Réduction

Nous avons récemment réalisé une étude similaire d’administration systémique et topique d’un autre inhibiteur, qui a permis d'optimiser le protocole de traitement des souris et d’analyse des résultats. Ce travail nous a également permis de définir le nombre minimum d’animaux à traiter afin de réaliser les analyses décrites dans les procédures 2 et 3 et d’obtenir des résultats statistiquement valides. Enfin, la présence des nombreux neurofibromes dans 100% des animaux mutants cela permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Aucune des procédures utilisées pour administration des molécules et suivi des animaux n’est douloureuse et ne nécessite l’utilisation des traitements anti-douleurs. Lors de précédente étude (1 mois de traitement) nous n’avons observé aucun effet indésirable sur la perte du poids et le comportement des animaux. Le gavage sera effectué par le personnel expérimenté, qui a déjà réalisé ce type de traitements.

Choix des espèces

A notre conaissance, Il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc. Nous utiliseront les souris NF1-KO males agés d'environ 4 moiscar dans notre modèle les NFc se developpent autour de 4 mois uniquement chez des males.

430 bovins à l'engraissement vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avant d'être envoyés à l'abattoir pour la vente commerciale des carcasses. Ils subissent un écornage, des prises de sang répétées, deux biopsies de tissu adipeux et un séjour en cases de digestibilité pouvant durer treize jours. Le porteur mentionne un faible risque de troubles digestifs et des risques modérés liés à la manipulation. Il affirme que le recours aux bovins est obligatoire, le projet visant à prédire l'efficience alimentaire et la qualité de la viande selon les régimes.

Objectifs

L'agriculture est depuis toujours en constante évolution. Pour l'aider dans cette mutation la recherche agronomique a initié de nombreux programmes de recherche, auparavant orientée vers l'augmentation des performances et de l'amélioration de la productivité des espèces animales élevées et destinées à produire du lait et/ou de la viande. Aujourd'hui, elle s'orienterait plutôt à maintenir le niveau de production des animaux (ovins, bovins...) tout en prenant plus en compte les contraintes du milieu, les risques environnementaux (production des gaz à effet de serre, polution des sols...) ou attentes sociétales (bien être animal, qualité des produits, traçabilité de l'alimentation...). Pour répondre à une partie de ces enjeux, notre établissement utilisateur a un besoin constant d'animaux. Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants , les animaux modèles utilisés sont ici des bovins issus du troupeau allaitant.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à acquérir des références techniques sur les pratiques en élevage pour engraisser les bovins avec le maximum d’herbe et de fournir des repères sur la qualité des viandes ainsi produites. Ces pratiques seront mises en perspective avec les coûts de production et d’opportunité que leur application engendre. Il s’agira aussi d’identifier au sein de la filière des solutions pour mieux valoriser la qualité des viandes issues d’une finition maximisant l’herbe et porteuses d’une meilleure répartition de la valeur ajoutée.

Procédures

Ecornage : 1 fois /animal en début d'expérimentation et d'une durée de quelques minutes. prises de sang : 4 fois /animal durant l''expérimentation (intervalle entre chaque prélèvement minimum une semaine) et d'une durée de moins d'une minute à chaque fois. Prélèvement de féces : 2 fois /animal en début et milieu d'expérimentation et d'une durée de moins d'une minute à chaque fois. Biopsie de tissu adipeux : 2 fois /animal en début et milieu d'expérimentation et d'une durée d'une dizaine minutes à chaque fois. Digestibilité : 1 fois /animal en milieu d'expérimentation et de maximum 13 jours.

Impact sur les animaux

Faible risque de troubles digestifs (acidose). Risques modérés liés à la manipulation des animaux lors des interventions (accident de pesée etc..)

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issu de toutes les procèdures mais seront destinés à l'abattage pour vente commerciale des carcasses à la fin des expérimentations.

Remplacement

Le contexte du projet est l'élevage de ruminants où l'animal est, par conséquent, au centre des préoccupations. Le projet a pour objectif la recherche d’indicateurs peu on non invasifs capables de traduire la variabilité observée chez l’animal en croissance/engraissement. De fait avoir recours à des bovins (animal cible) est obligatoire.

Réduction

Les procédures pour réduire le nombre d'animaux seront mises en oeuvre dès que possible et serviront à limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés et la sévérité des procédures appliquées, l'approche en carré latin est aussi largement utilisée pour réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour raffiner les procédures expérimentales, les conditions d'hébergement et l'utilisation des animaux par exemple en limitant la durée d'hébergement en stalles de digestibilité, en ayant des temps de repos suffisant entre procédures pour les animaux. De plus les animaux seront suivis quotidiennement pour s'assurer de la bonne santé des animaux.

Choix des espèces

Le contexte du projet est la prédiction de l’efficience et de la qualité des carcasses en fonction des régimes alimentaires en phase d'engraissement, d’où l’intérêt à travailler avec des bovins en croissance/engraissement.

Une irradiation destinée à "tuer toutes les cellules de la moelle osseuse", une greffe de moelle porteuse de mutations, puis jusqu'à deux ans de prises de sang toutes les deux semaines, chaque semaine si la maladie s'aggrave : c'est le parcours prévu pour 1 140 des 1 320 souris du projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'objectif est de reproduire chez elles la leucémie myélomonocytaire chronique, un cancer du sang du sujet âgé, et de tester sur elles un composé chimique. 654 souris reçoivent aussi des injections dans l'abdomen deux fois par semaine pendant un mois pour induire une inflammation chronique. Dans les deux semaines qui suivent la greffe, les souris greffées peuvent souffrir d'infections, d'anémie, d'apathie et de perte de poids, selon le porteur. Il décrit le devenir des 1 140 receveuses, tuées pour prélever leurs organes, et ne dit rien du sort des 180 autres souris de l'effectif, ni de celui des souris donneuses de moelle.

Objectifs

Les leucémies sont des cancers du sang c’est-à-dire qui affectent la production normale des cellules sanguines. Les cellules du sang sont renouvelées quotidiennement à partir de cellules souches qui se trouvent dans la meolle osseuse : les cellules souches hématopoïétiques. Ces cellules sont douées d’auto-renouvèlement et sont donc responsables de la production des toutes les cellules du sang (les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes) tout au long de la vie. Il est donc tout à fait crucial de préserver leurs fonctions. Quand ces fonctions sont altérées, par exemple par exemple par des stress environnementaux (radiations) induisant des changements dans l’expression de certains gènes, cela conduit au développement de leucémies. La leucémie myélomonocytaire chronique est une leucémie caractérisée par l’accumulation de monocytes, un type des globules blancs circulants dans le sang. Cette maladie touche le sujet âgé. Elle est peu fréquente mais grave, avec une survie inférieure à 3 ans. L’âge avancé des patients ne permet pas d’utiliser la greffe de moelle osseuse et il n’existe actuellement aucun traitement curateur. De nouvelles approches thérapeutiques sont donc nécessaires. Il n'est pas possible de modéliser les fonctions des cellules souches hématopoïétiques, base du cancer, in vitro. De même, le processus de développement d’une leucémie requiert l’environnement de la moelle osseuse impossible à reproduire dans une boite de pétri. Il est donc indispensable de développer des modèles murins mimant le plus fidèlement possible le développement de la maladie pour tester des molécules d’intérêt thérapeutique et en découvrir de nouvelles. Notre projet a pour but de : 1/ Développer des modèles de leucémie myélomonocytaire chronique chez la souris ressemblant au plus près à la maladie humaine et qui s’adapteraient à une étude clinique. Comprendre les mécanismes d’aggravation de la maladie. (2) Etudier le rôle d’une inflammation chronique sur le développement de la leucémie. Au cours de la vie nous subissons de nombreuses infections bactériennes ou virales qui mettent en jeu le système immunitaire et la production de monocytes dans le sang et créent une inflammation chronique. (3) Etudier les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie et analyser les mécanismes de la naissance du cancer pour découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. (4) Tester un composant chimique sur le développement et la guérison de la maladie.

Bénéfices attendus

Il n'existe pas de traitement curatif spécifique de cette leucémie qui reste donc une maladie très sévère, induisant la mort des patients dans les 30 mois après le diagnostic. Il n’existe pas non plus de bons modèles de souris mimant cette pathologie humaine. En développant de tels modèles, notre projet permettra de tester de nouveaux traitements spécifiquement adaptées à cette leucémie incurable et sera à terme très bénéfique pour les patients. Au niveau plus fondamental, notre projet permettra de comprendre comment la maladie survient, quel est le rôle de l’inflammation chronique qui survient avec l’âge sur son développement ou son accélération.

Procédures

Pour étudier le développement de cette leucémie, nous utiliserons la transplantation de moelle osseuse. Les transplantations sont réalisées par injection par voie veineuse, sous anesthésie, de cellules de moelle osseuse de souris donneuses, portant des mutations dans des gènes, dans des souris receveuses préalablement irradiées. L’irradiation a pour but de tuer toutes les cellules de la moelle osseuse et de libérer ainsi de la place pour les cellules transplantées qui vont venir s’y greffer. La prise de greffe est analysée un mois après la transplantation par la présence de cellules donneuses dans le sang des animaux, par une prise de sang à la veine faciale, effectuée sous anesthésie. Nous suivrons ensuite le développement de la maladie au cours du temps, jusqu’à 2 ans, par prise de sang régulières (toutes les deux semaines ou toutes les semaines si la maladie s’aggrave) et analyse des différentes cellules sanguines. Toutes les souris receveuses (1140) seront soumises à ces injections et prélèvements sanguins. Pour induire une inflammation chronique, des injections intra-péritonéales seront réalisées 2 fois par semaine pendant un mois 654 souris seront traitées ainsi. Une anesthésie locale avec de la lidocaïne sera utilisée pour ces injections. Nous envisageons avoir besoin de 1320 animaux pour la totalité du projet.

Impact sur les animaux

Malgré la greffe de d’un nombre important de cellules de moelle qui permet aux cellules du sang de se reformer rapidement après l’irradiation, il se peut que dans les 2 semaines suivant la transplantation, les animaux souffrent : 1/ d’infections opportunistes, les cellules de l’intestin pouvant être aussi étant affectées par l’irradiation. 2/ d’une mauvaise prise de greffe et des difficultés à récupérer un taux normale de cellules dans le sang qui pourrait engendrer une diminution des globules rouges (anémie), fatigue, apathie, perte de poids, et perte de l’alimentation et dégradation de l’état général.

Devenir

Les animaux sont les animaux receveurs de cellules de moelle osseuse lors des transplantations dans nos procédures. Ils seront mis à mort et leurs organes prélevés pour étudier le phénotype et les mécansimes de la maladie.

Remplacement

Il n’est pas possible in vitro d’étudier les fonctions des cellules souches hématopoïétiques qui se trouvent dans la moelle osseuse, les mécanismes de production des cellules du sang et le développement de leucémies in vitro. Le développement de ces maladies requiert l’environnement de la moelle osseuse impossible à reproduire in vitro. Enfin, la prolifération in vitro de cellules cancéreuses est limitée et ne reflète pas ce qui se passe dans un individu. Il est donc indispensable de développer des modèles de souris mimant le plus fidèlement possible le développement de la maladie leucémique pour tester et sélectionner de nouvelles thérapies.

Réduction

La maladie évolue avec l’âge donnant des variations importantes d’un animal à l’autre. Pour avoir un pouvoir statistique suffisant nous pourrions être obligés d’étendre l’élevage pour avoir un nombre suffisant d’animaux du même âge au temps de l’expérience. Pour pallier cela (réduction), nous utiliserons la transplantation qui consiste en une greffe de moelle osseuse provenant d’une même souris donneuse à plusieurs souris receveuses qui développeront alors chacune une maladie identique à elle-même. Nous pouvons utiliser moins d’animaux pour tester rapidement plusieurs conditions avec un pouvoir statistique important. Cette approche permet aussi de réduire considérablement les élevages et d’avoir des groupes de souris greffées à traiter du même âge. Nous pouvons greffer 10 souris à partir d’une souris donneuse. Ces modèles de leucémie sont nouveaux. Le rythme de développement de la maladie n’est donc pas encore connu. En conséquence, nous avons calculé le nombre de souris nécessaires par groupe de greffe à 30 en nous fondant sur les données du laboratoire et de la littérature pour des pathologies similaires.

Raffinement

Immédiatement après irradiation, une observation des animaux sera réalisée 2 à 3 fois par semaine, afin de s’assurer que l’animal ne présente pas de complications directement liées à l’irradiation. Afin de favoriser le bien-être des animaux, l’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux et la nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu (coton de nidification, cabanes) sera mis en place dans chaque cage. Les procédures seront réalisées par un personnel expérimenté et sous anesthésie pour tous les gestes techniques. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Des points limites généraux sont établis. Les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi en tout temps. Du DietGel Energy sera ajouté dans les cages après transplantation ou en cas de diminution de la prise alimentaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour étudier l’hématopoïèse et les cancers du sang car elle possède un système hématopoïétique et immunitaire proche de celui de l’Homme. Les souches des animaux sont bien caractérisées ce qui permet d’effectuer des greffes de moelle osseuse en évitant les problèmes liés au rejet de greffe. Enfin, il s’agit d’espèces faciles à élever qui permettent l’obtention relativement rapide de résultats du fait de leur temps de génération réduit. Nous utiliserons des souris de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adultes. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte pour être dotées d’un système immunitaire fonctionnel.

342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées via leur mère au maneb, un pesticide contenant du manganèse, puis pour certaines à un régime gras et sucré, elles subissent perçage des oreilles, gavages d'huile, injections de glucose ou d'insuline et prélèvements de sang à la queue, avant un prélèvement terminal à l'œil. Le porteur affirme que ces actes ne développent pas d'anxiété chez l'animal. Il revendique l'étude sur l'"animal entier" et présente le projet comme apportant des preuves pour réduire l'usage des pesticides.

Objectifs

L’exposition des travailleurs agricoles aux fongicides utilisés pour lutter contre la présence des champignons parasites des fruits et légumes a des effets négatifs en santé humaine. Ainsi, des études préliminaires indirectes suggèrent que le foie et la moelle osseuse (site de production des cellules du sang) sont des tissus cibles en particulier des fongicides contenant du manganèse comme le maneb à des doses compatibles avec une exposition environnementale. Or, en fin de vie fœtale, le foie qui est initialement un organe hématopoïétique (site de fabrication des globules rouges) va acquérir les fonctions retrouvées à l’âge adulte comme des fonctions nutritionnelles (régulations du métabolisme des glucides, des lipides) et antitoxiques (polluants, médicaments). Ces fonctions sont essentielles à la vie. Elles permettent la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang), la détoxification des polluants et médicaments et elles s’opposent au stockage de lipides appelé stéatose hépatique. Les objectifs sont de démontrer par des preuves directes sur l’animal entier (1) si le foie est une cible du maneb tout au long du développement depuis la vie fœtale jusqu’au stade adulte ; (2) si une exposition à doses faibles pendant la vie fœtale va modifier la fonction hématopoïétique du foie fœtal et l’acquisition des fonctions dites « adultes »; (3) si une exposition au maneb prédispose à la prise de poids et aggrave la stéatose hépatique lorsque les souris sont nourries avec un régime riche en graisses et en sucre à l’âge adulte pour mimer le régime appelé « Western-diet »; (4) Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles afin de déterminer s’il existe des effets dépendants du sexe. Un total de 342 souris seront nécessaires pour ce projet. Chaque souris sera suivie individuellement afin de collecter un maximum de données biologiques et limiter la quantité totale de souris pour l’obtention de données statistiques fiables et interprétables.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier si l’obésité, les maladies hépatiques liées à l’obésité ou si certaines maladies du sang pourraient être la conséquence d’une exposition au maneb en particulier pendant la vie fœtale. En effet, les doses utilisées dans ce projet sont compatibles avec une exposition environnementale. La réalisation de ce projet pourra avoir de fortes implications en termes de recommandations notamment pour les femmes en âge de procréer et pour la sécurité des marchés alimentaires. Ce projet fournira des arguments et des preuves scientifiques aux autorités politiques pour soutenir la réduction de l'utilisation massive des pesticides contenant du manganèse comme le maneb, dans le monde, et notamment dans les mélanges extemporanés de pesticides appelés « bouillies » qui font l’objet d’une règlementation.

Procédures

Les interventions sont nutritionnelles (exposition au maneb par l’alimentation et exposition à un régime riche en graisses et en sucres, classiquement appelé Western diet). Les interventions incluent des prélèvements sur des animaux vigiles (éveillés) après une mise à jeun de courte durée (6 heures). Il s’agit de prélèvements de sang à la queue et du prélèvement terminal à l’œil (après dépôt d’un analgésique). Cela permet de suivre l’état métabolique de la souris comme le taux de sucre dans le sang ou d’insuline ou des lipides en réponse à une injection soit de glucose (sucre), d’insuline ou un gavage d’huile alimentaire ait été réalisé. La durée totale des tests est de moins de 90 minutes (5 prélèvements pour dosage de la glycémie ou du taux d’insuline) et de moins de 4 heures (4 prélèvements pour dosage des lipides). Chaque prélèvement en lui-même dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont de classe légère (procédure 3) ou modérée (procédures 1 et 2). La présence de maneb dans le régime alimentaire est très faible et ne devrait pas perturber la prise alimentaire. La quantité de nourriture contaminée proposée aux souris correspond à la dose sans effet toxique. De même, le régime riche en graisses et en sucres est bien accepté des souris. La souris étant un animal nocturne, la mise à jeun (limitée à 6 heures entre 7h30 et 1 3h30) n’a pas de conséquence sur l'état général, les biberons d’eau n’étant pas enlevés. Les autres nuisances incluent le perçage des oreilles, les gavages d’huile, les injections de glucose ou d’insuline et l'incision très fine au niveau de la queue à l’aide d’un scalpel, ou le prélèvement rétro-orbital après dépôt d’un analgésique. Enfin, les animaux sont anesthésiés avant la mise à mort. Ces actes sont pratiqués par du personnel compétent et ne développent pas d’anxiété chez l’animal.

Devenir

Tous mis à mort en raison des prélèvements d’organes réalisés sur tous les animaux expérimentés

Remplacement

La réalisation de ce projet vise à étudier les conséquences d’une exposition maternelle au fongicide maneb sur le développement des souris jusqu’à l’âge adulte. Ce projet vise aussi à étudier l’effet aggravant d’une exposition maternelle au maneb sur le développement des maladies liées à l’obésité. Enfin, ce projet vise à étudier la transition fonctionnelle du foie dans le fœtus exposé via la mère au maneb en comparaison de fœtus issus de mères non exposées. En conséquence, ce projet implique trop de mécanismes susceptibles d’interagir en même temps, les conséquences sont très nombreuses et ne peuvent donc pas être étudiées autrement que sur l’animal entier. Enfin, la dépendance avec le sexe est un paramètre également difficilement analysable autrement que sur l’animal entier.

Réduction

Le projet est original au sens où il n’a encore jamais été mené. Le nombre de souris est calculé au plus juste pour obtenir des résultats exploitables et tirer des conclusions qui puissent faire poids auprès des évaluateurs du risque pour diminuer l’utilisation des pesticides en France et en dehors de la France. Au total sur les 5 années, le nombre d’animaux sera de 342 animaux

Raffinement

Pendant toute la durée des études, les souris sont surveillées individuellement 3 fois par semaine pour les souris adultes et au moins 5 fois lissés sur la semaine entière au moment de la gestation, la mise-bas et l’allaitement. Du coton est déposé dans la cage pour que la femelle puisse faire son nid et maintenir au chaud sa portée. Les études sont réalisées dans une pièce au calme. Une surveillance accrue sera réalisée chez les mères allaitantes n’ayant pas développé un comportement maternel. Dans ce cas, les petits de la cage seront déplacés dans des cages d’adoption après les avoir mouillés avec de l’urine des petits de la cage naturelle pour qu’ils soient acceptés par la mère d’adoption. Le test métabolique de sensibilité à l’insuline consiste à vérifier que le taux de sucre dans le sang diminue bien après une injection d'insuline; sinon , on parle de résistance à l'insuline. Lors de la réalisation de ce test, il peut arriver qu’une souris soit en hypoglycémie (baisse trop importante du taux de sucre dans le sang). Dans ces conditions, une injection de glucose est immédiatement réalisée et la souris est installée dans du coton supplémentaire pour éviter l’hypothermie (froid). Un analgésique (anti-douleur) est utilisé pour permettre le prélèvement sanguin à l’œil sans souffrance et les animaux sont anesthésiés avant la mise à mort.

Choix des espèces

La souris a de nombreuses caractéristiques « proches » de celles de l’homme. Le projet vise à étudier les effets nocifs liés à l’exposition au maneb dans un modèle souris, en particulier lorsque l’exposition a lieu pendant la période maternelle, une période de haute sensibilité aux polluants. Cela nécessite d’étudier à la fois les fœtus en réponse précoce à l’exposition et les individus une fois devenus adultes, à la fois les mâles et les femelles. Les souris utilisées répondent très bien aux régimes dits obésogènes qui sont riches en graisses et en sucres au sens où les souris vont prendre du poids en les consommant et présenter un certain nombre de désordres métaboliques retrouvés chez l’homme et liés à l’obésité comme le stockage de lipides dans le foie (stéatose hépatique). Or, obésité et stéatose touchent aujourd’hui 20% de la population en France (plus de 35% aux US) ; ce qui en fait aujourd’hui des problèmes majeurs de Santé Publique.

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque semaine, un prélèvement d'urine les isole une nuit de 14 à 16 heures dans une cage sans litière ni enrichissement, situation que le porteur décrit lui-même comme probablement aversive. Après six semaines de régime cétogène, ils sont anesthésiés pour un prélèvement de liquide céphalorachidien et d'organes ou pour un enregistrement intracérébral de 4 à 6 heures, sans réveil. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de recourir à l'animal vivant, le remplacement in vitro étant selon lui impossible actuellement.

Objectifs

Le métabolisme cérébral s’adapte à la nutrition, ce qui peut avoir des conséquences considérables sur la santé mentale et les maladies neurologiques. Par exemple, les effets bénéfiques du jeûne ont été reconnus dès l’antiquité, notamment sur l’épilepsie. Le jeûne peut être remplacé par des régimes moins contraignants comme le régime cétogène, riche en graisses et appauvri en protéines et en sucres. Ce régime est caractérisé par un apport calorique diminué et une augmentation plasmatique de corps cétoniques, un état interne appelé cétose. Les effets bénéfiques de la cétose s’étendent au-delà de l’épilepsie, à un large ensemble de problématiques comme un meilleur vieillissement, une augmentation de l’espérance de vie et une protection contre les maladies neuro-dégénératives comme les maladies de Parkinson ou d’Alzheimer. Ce projet testera l’hypothèse selon laquelle l’administration de corps cétonique chez des patients ou chez des animaux pourrait constituer une stratégie neuroprotectrice, notamment après un accident vasculaire cérébral ou un traumatisme crânien. Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer l’effet neuroprotecteur du régime cétogène. D’abord, une modulation de la fonction mitochondriale combinée à une augmentation d’enzymes antioxydantes qui pourraient diminuer le stress oxydant des neurones et des cellules gliales. Ensuite un changement de l’équilibre entre neurotransmetteurs excitateurs et inhibiteurs en faveur de l’inhibition pourrait expliquer une diminution de l’excitabilité des réseaux neuronaux et une amélioration de la fréquence et de la sévérité des crises d’épilepsie.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ce projet permettra de mieux comprendre les effets métaboliques du régime cétogène à la fois sous l’angle des concentrations basales de métabolites, et de façon dynamique, au cours d’une épreuve métabolique modélisée par une dépolarisation corticale envahissante. Cette approche permettra de comprendre dans quelle mesure le régime cétogène affecte le fonctionnement basal du cerveau ainsi que sa capacité à répondre à une stimulation. Elle permettra aussi de tester pour la première fois in vivo l’hypothèse selon laquelle le régime cétogène diminue la disponibilité des neurotransmetteurs excitateurs comme le glutamate et le stress oxydant, représenté ici par le monoxyde d’azote. L’ensemble des connaissances obtenues au cours de ce projet permettra de d’évaluer si le régime cétogène ou la cétose en général peut représenter un état neuroprotecteur et dans quelle mesure induire cet état chez des patients cérébrolésés peut améliorer leur évolution clinique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements d'urine une fois par semaine pendant sept semaines. Ce prélèvement dure une nuit au cours de laquelle l'animal est isolé sans enrichissement. A la fin des six semaines de régime alimentaire contrôlé, les animaux seront anesthésiés pour prélèvement de liquide céphalorachidien et d'organes ou pour une expérience de monitorage intracérébral durant entre 4h et 6h.

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à six semaines de régime cétogène. Ce régime permet d’induire un état de cétose sans restreindre l’accès à la nourriture et ses effets indésirables sont limités. Toutes les semaines, un prélèvement d’urine sera réalisé. Pour cela, les animaux seront placés seuls dans une cage à métabolisme. Ce dispositif ne comporte pas de litière ni d’enrichissement et permet de récupérer l’urine par un système de gouttière. Le recueil d’urine se fera au cours de la nuit, ce qui représente une période d’isolement de 14-16h qui sera probablement perçue par l’animal comme une situation aversive. A la fin des six semaines de régime cétogène, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane après administration de buprénorphine pour l’analgésie dans le but de prélever le liquide céphalorachidien ou pour effectuer une expérience de monitorage intracérébral pendant 4h à 6h. Les animaux n’étant pas réveillés, les effets indésirables des expériences sont minimes.

Devenir

La survie de l'animal n'est pas compatible avec le prélèvement d'organes ou avec les enregistrements intracérébraux sous anesthésie prévus dans le projet.

Remplacement

Le régime cétogène induit des adaptations lentes du métabolisme au cours des six semaines suivant le changement de régime alimentaire. Ces adaptations impliquent l’ensemble de l’organisme : intestins, foies, pancreas, circulation sanguine, reins, cerveau. Il est donc nécessaire d’avoir recours à l’animal vivant pour étudier ce phénomène. Le remplacement par des approches in vitro n’est pas possible actuellement.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour permettre des analyses statistiques fiables. Au cours de ce projet, les analyses statistiques consisteront à comparer les données obtenues dans le groupe d’animaux soumis au régime cétogène à celles obtenues chez des animaux nourris normalement. Des tests de t de Student seront appliqués après une analyse de normalité par le test de shapiro-Wilk. Dans le cas d’échantillons de données non normales, des tests de Mann-Whitney seront pratiqués. Les effectifs sont calculés sur la base de 8 animaux par groupe. Pour les expériences de monitoring intracérébral, des analyses statistiques seront pratiqués dès que six animaux auront été enregistrés. S’ils sont significatifs ou si des calculs de taille d’échantillon par des test beta révèlent qu’aucune différence claire n’apparaît, les expériences seront interrompues sans utiliser l’effectif annoncé au départ, ce qui peut réduire l’effectif.

Raffinement

Tout au long de ce projet, les animaux seront hébergés par paires dans des cages enrichies avec des matériaux de nidification et des baguettes de bois à ronger, afin d’améliorer leur bien-être général. La période d’isolement nécessaire aux prélèvements d’urine est restreinte à une nuit par semaine pendant six semaines et une nuit d’habituation, ce qui minimisera l’inconfort lié à la procédure. De plus, les animaux auront été entrainés à rester dans les cages à métabolisme une fois avant le début du régime cétogène. Toute la phase de prélèvement et d’enregistrements intracérébraux est prévue sous anesthésie après analgésie par la buprénorphine, ce qui réduit le stress ou la douleur à un niveau minimal. Tout au long du projet, l'état général de l'animal sera évalué grâce à une grille de score et des interactions régulières avec la cellule bien-être et la vétérinaire référente permettront éventuellement d’intégrer des mesures supplémentaires permettant d’améliorer le confort des animaux, par exemple l'administration d'analgésique (carprofène, ou Rimadyl 5 mg/kg) en cas de douleur avérée, ou adminsitration de nourriture ramollie en cas de perte de poids.

Choix des espèces

La plupart des études sur les effets du régime cétogène ont été effectuées chez le rongeur, qui représente le modèle animal de prédilection dans ce domaine. Par rapport à la souris, le rat présente une taille plus importante et un volume cérébral plus grand. Les volumes de liquide céphalorachidien et d'urine seront plus facilement récoltés chez le rat que chez la souris.