Procédures légères

150 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées vivantes pour poursuivre leur lactation. Elles font l'objet de prélèvements sanguins, urinaires et fécaux, réalisés en majorité par méthode naturelle et avec peu de contention, pour évaluer des stratégies nutritionnelles. Le porteur mentionne des risques de bagarres, de glissades et de boiteries lors des déplacements, et un recours au sondage urinaire ou à l'exploration rectale en cas d'échec de la méthode naturelle. Il justifie la démarche par des enjeux financiers, écologiques et de bien-être des animaux non-humains, et affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace ces prélèvements.

Objectifs

L’intérêt scientifique de ce projet est d’évaluer les besoins nutritionnels des vaches laitières, ainsi que d’étudier l’intérêt de nouveaux additifs ou matières premières dans leur alimentation. Avant de généraliser un programme alimentaire à un grand nombre d’élevages, il est nécessaire d’évaluer précisément ses impacts sur le bien-être et les performances des animaux. Les enjeux sont non seulement financiers (coût de formulation, performances des vaches laitières), mais aussi écologiques (émissions de gaz à effet de serre), et indirectement sociétaux puisque l’alimentation participe au bien-être des animaux. Au cours de ce projet, les mesures sont principalement d’ordre zootechnique : consommation d’aliments, production laitière, évolution du poids et suivi sanitaire. Cependant afin de mieux comprendre les besoins des vaches laitières, des prélèvements sanguins, urinaires et fécaux peuvent être réalisés pour évaluer l’impact de la nutrition sur plusieurs métabolismes (reproduction, santé, immunité, efficacité du métabolisme protéique,…). L’objectif de ce projet est d’évaluer les besoins nutritionnels des vaches laitières, ainsi que d’étudier l’intérêt de nouveaux additifs ou matières premières dans leur alimentation. Ce projet est mis au point par des scientifiques et validé par la direction du site.

Bénéfices attendus

Ces essais s’inscrivent dans la cadre de la recherche agricole, car les effets recherchés ciblent des problématiques d’élevage : amélioration de la valorisation ailmentaire des animaux, solutions nutritionnelles pour amléiorer et préserver le bien-être des animaux, solutions nutritionnelles visant à réduire l'impact environnementales des élevages bonvins lait. Afin d’apprécier l’effet des aliments testés, il est nécessaire d’élever les vaches laitières dans des conditions représentatives des conditions d’élevage.

Procédures

Pour ce projet trois procédures classe légère peuvent être réalisées : •Prélèvements sanguins: le volume prélevé est très faible pour les vaches (

Impact sur les animaux

Les effets indésirables ou nuisances attendues sont décrits dans les points limites. On peut mentionner les nuisances suivantes : bagarres/glissades lors des déplacements pouvant provoquer des boiteries, perte de sang/hémorragie au moment du prélèvement de sang (n'est jamais arrivé). Les prélèvements sanguins sont réalisés au niveau de la veine caudale. Les prélèvements urinaires et fécaux pourront être majoritairement réalisés par méthode naturelle non invasive. Si cette dernière échoue, les prélèvements urinaires sont réalisés par sondage urinaire et les prélèvements fécaux par exploration rectale, par contrôle d’une personne qualifiée. Les prélèvements sont réalisés par le personnel de l’établissement ayant reçu la formation expérimentale de niveau 2 : applicateur de procédures expérimentales. Par ailleurs, en plus de cette formation, le personnel maîtrise ces actes d’élevages grâce à leur formation initiale et à leur formation continue apportée par notre vétérinaire-conseil. Pour les 3 procédures, il n’y a pas ou très peu de contention des animaux, et seules 3 tentatives peuvent être réalisées. Durant les prélèvements, en présence de signes cliniques notables, les prélèvements sont arrêtés, le protocole de soins est appliqué et l’animal peut être sorti de l’essai et placé en zone de repos. Le bâtiment des vaches laitières est découpée en 4 zones de vies pouvant accueillir maximum 30 vaches. Chacune de ces zones de vie est dotée d’une zone de repos permettant d’y loger les vaches malades ou affaiblies, ou celles ayant besoin d’un suivi de reproduction particulier par exemple (surveillance après vêlage, IA, etc.). Les vaches connaissent bien cette zone et y sont habituées. Chaque zone de repos est équipée d’une zone de couchage libre (pas de logettes) confortable (matelas + sciure)..

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ces procédures sont gardés en vie et poursuivent leur lactation comme en élevage classique.

Remplacement

Les méthodes in-vitro actuelles ne sont aujourd'hui pas suffisantes pour caractériser les interactions complexes entre les métabolismes, les variabilités individuelles ou encore l’environnement. C’est pourquoi il n’existent pas de méthodes alternatives aux trois procédures décrites dans ce projet (prélèvements sanguins, urinaire et fécaux).

Réduction

A la fin de chaque essai, les vaches laitières continuent leur cycle d’élevage et de production classique. Ainsi les animaux peuvent participer à plusieurs essais nutritionnels faisant parti de ce projet de recherche. Aussi, le nombre de vache par essai est étudié pour limiter le nombre d’animaux tout en permettant une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les conditions de contention sont identiques à celles utilisées pour l’élevage, voir meilleures. Les animaux sont élevés en groupe dans des aires dotées de zones de couchages adaptées avec matelas souples, présence de brosse automatique, aucune compétition pour l’accès à l’eau et à l’alimentation. Les prises de sang sont des actes reconnus d’élevage et sont réalisées par un personnel qualifié et préalablement formé à la contention et manipulation des animaux, ainsi qu’aux prélèvements selon une procédure interne. Les animaux sont déplacées en groupe de 12 au moins dans des zones de contention jouxtant leur zone de vie, donc dans leur environnement familier dans le but de limiter leur stress. Cette zone de contention est inspirée d’une salle de traite par l’arrière, c’est-à-dire que les animaux sont alignés et contenues par l'avant, ce qui permet une sortie plus rapide. Les opérateurs se situent derrière les animaux. Cette zone de contention est également utilisée pour d’autre manipulation d’élevage (parage, suivi reproduction), les animaux ne l’associent pas seulement aux mesures expérimentales. Si au bout de trois tentatives, le prélèvement de sang échoue, le prélèvement est abandonné sans remplacement de l’animal. Cependant, 100% des prélèvements réussissent à minima dès la seconde tentative et la grande majorité dès la première. Cas de plusieurs prélèvements (bouses + sang + urine) à réaliser sur un même animal : Les prélèvements sont réalisés «en une seule fois » afin de ne pas déplacer plusieurs fois les animaux limitant ainsi le stress lié au déplacement. On profite aussi de la mise en zone de contention des animaux pour récolter les bouses faites pendant le déplacement des animaux. On débute par la prise de sang, en même temps un opérateur se charge de récolter les bouses faites naturellement ainsi que l’urine. On termine lorsqu’il y a besoin par les prélèvements par exploration rectale et sondage urinaire. Des points limites sont également définis à la fois pendant la réalisation du prélèvements mais aussi dans les jours qui suivent le prélèvement afin de s'assurer du bon état de santé des animaux prélevés.

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible. Les vaches étudiées seront en phase de lactation, afin de produire du lait, donc adulte, puisqu’il s’agit de la phase cible.

612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent un gavage et une injection intrapéritonéale unique, puis sont mises à mort pour le prélèvement de leurs testicules, afin d'étudier la synchronisation de la méiose. Le porteur indique que la contention lors du gavage et l'introduction de la pipette peuvent générer stress, petites blessures et douleur. Il affirme que la souris est le seul mammifère permettant cette étude génétique et reconnaît qu'un modèle organoïde en développement ne peut pas encore la remplacer.

Objectifs

Notre projet a pour but de mieux comprendre la division cellulaire de cellules germinales appelée méiose. En effet, cette division est une étape indispensable de la production d’ovocytes et de spermatozoïdes. Son bon fonctionnement est essentiel pour transmettre le matériel génétique à la génération suivante. De manière intéressante, lors de la première étape de la méiose, les chromosomes subissent de nombreuses cassures de la double hélice de l’ADN (CDB) qui doivent être réparées. Cette étape est nécessaire pour le bon fonctionnement de la méiose. Plus précisément, notre projet a pour but d’étudier le lien entre le mécanisme de recombinaison homologue, initié par la formation de ces cassures double brin de l’ADN, et les mécanismes de contrôle de la structure du chromosome lors de la de la méiose. Nous avons identifié plusieurs protéines nécessaires à la formation des CDB en méiose. Notre premier objectif est de déterminer les sites de fixation à l’ADN de ces protéines, à l’échelle du génome entier. Dans un second temps, nous souhaitons déterminer si les protéines contrôlant l’organisation structurale des chromosomes méiotiques, sont aussi impliquées dans le contrôle de la fixation des protéines nécessaires à la formation des cassures double brin de l'ADN et d'évaluer les dépendances génétiques. Ce projet nécessite le développement d’approche de biochimie, biologie moléculaire, génomique et microscopie à haute résolution. Le protocole proposé permettra d’enrichir in vivo les cellules dans lesquelles les protéines que nous étudions sont présentes afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires par expérience. Le protocole sera utilisé sur des souris portant des mutations dans les gènes qui codent pour les protéines impliquées dans la recombinaison en méiose ainsi que sur des souris portant des mutations dans les gènes qui codent pour des protéines qui contrôlent la structure du chromosome méiotique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de comprendre comment les protéines impliquées dans la formation des cassures double brin de l'ADN sont régulées par la structure des chromosomes et comment ces protéines peuvent à leur tour influencer la structure des chromosomes méiotiques. Cette régulation est une étape cruciale dans le bon déroulement de la transmission du matériel génétique intacte aux générations suivantes et permets d'éviter la transmission de matériel endommagé qui mène à des maladies génétiques, telles que la trisomie 21 ou à l'infertilité.

Procédures

Les animaux seront soumis à un Gavage et une injection unique intrapéritonéale .

Impact sur les animaux

Les modifications génétiques que nous étudions ne causent aucun phénotype dommageable en dehors de l’infertilité des animaux. Néanmoins la procédure expérimentale peut affecter leur bienêtre: La contention lors du gavage par pipette, peut générer du stress. De plus, l’introduction de la pointe de la pipette peut générer des petites blessures et donc engendrer de la douleur. L’injection intrapéritonéale peut générer de la douleur au point d’injection et du stress lié à la contention. Pour limiter ces effets indésirables, les animaux seront manipulés par du personnel expérimenté, le temps de manipulation sera réduit à minima, les points limites seront déterminés au préalable et respectés scrupuleusement.

Devenir

Les animaux devront être mis à mort pour le prélèvement de leurs testicules synchronisés

Remplacement

Notre projet propose l'utilisation de souris. Ce sont les seuls mammifères sur lesquels nous pouvons développer ces recherches. Le processus fondamental de la méiose est étudié dans d’autres espèces (invertébrés, plantes, unicellulaires) mais ces processus se sont différenciés au cours de l’évolution. Chez les mammifères, seule la souris permet d’approfondir l’étude de fonction de gènes par la génétique et la transgénèse. Il reste à noter qu’actuellement, dans le cadre d’une collaboration internationale, et avec un soutien financier fort, nous nous efforçons de mettre au point un modèle in vitro qui permettra de reproduire certaines étapes de la méiose, grâce à la mise en place d’organoïdes. A terme ce modèle nous permettra de tester le phénotype de certaines mutations dans le cadre d’expériences pilotes et évitera donc à générer des animaux inutilement. Pour l’instant, ce modèle n’est pas encore suffisamment au point pour y avoir recours et même au point, et il ne permettra pas non plus se substituer complètement à l’utilisation du modèle souris, car pour un grand nombre d’expériences le matériel généré par le modèle in vitro ne sera pas suffisamment important.

Réduction

L'optimisation des croisements pour réduire au maximum le nombre d’animaux élevés sera de rigueur. Les différentes expérimentation se feront doublon ou triplicate avec une analyse statistique appropriée

Raffinement

Tout au long de la procédure, les animaux seront observés. Des signes apparents, comportementaux et physiologiques de douleurs observés chez les animaux impliqués dans ce protocole expérimental seront rapportés dans le cahier d’expérimentation. Lors du gavage par voie orale les animaux seront pesées tous les jours, l’utilisation de grille de score et de points limites permettra de déterminer si un animal doit sortir de l’expérimentation et être ou mis à mort

Choix des espèces

Notre projet propose l'utilisation de souris. Ce sont les seuls mammifères sur lesquels nous pouvons développer ces recherches. En effet le processus fondamental de la méiose est étudié dans d’autres espèces (invertébrés, plantes, unicellulaires), mais ces processus se sont différenciés au cours de l’évolution. Pour l'instant, seule la souris permet d’approfondir l’étude de fonction de gènes par la génétique et la transgénèse chez le mammifère. Le protocole proposé permettra d’augmenter le nombre de cellules d’intérêt par expérience. Bien que dans le cadre d'une collaboration internationale nous nous efforçons de mettre au point un modèle organoïde pour les étapes précoces de la gamétogenèse, à l'heure actuelle, le recours aux animaux reste indispensable mais le protocole de la synchronisation de la méiose ici proposé permettra d’augmenter le nombre de cellules d’intérêt par expérience et ainsi drastiquement (allant jusqu'à un facteur 5) diminuer le nombre d'animaux utilisés.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris reçoit deux instillations nasales de suspensions bactériennes à dix-huit heures d'intervalle, puis est tuée vingt-quatre heures plus tard pour récupérer ses poumons ou réaliser des lavages, les groupes recevant Pseudomonas aeruginosa pouvant perdre du poids et devenir inactifs. Le porteur affirme ne pas pouvoir répondre à sa question avec des outils de culture cellulaire et choisit donc de conserver le modèle animal. Il retient la souris pour sa sensibilité permettant de provoquer une pneumonie sans mortalité trop importante.

Objectifs

Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Lors d’une étude précédente, l’analyse du microbiote respiratoire de patients atteints de mucoviscidose a permis de mettre en évidence un genre bactérien particulier : Porphyromonas. Ce genre bactérien et plus particulièrement Porphyromonas cationae (PC) semble être prédictif de l’infection à PA. Il a été montré chez ces patients, que ceux qui avaient moins de Porphyromonas dans les poumons, avaient plus de risque de se coloniser à PA. Par la suite, il a également été montré que la quantité de PC pulmonaire venait à diminuer, voire disparaître, préalablement à la colonisation à PA alors que PC restait stable chez les patients non colonisés. Précédemment, nous avons testé une souche clinique de Porphyromonas catoniae isolée de patients atteints de mucoviscidose qui semblerait plus efficaces in vivo. Nous avons réalisés 2 expérimentations indépendantes qui ont permis de valider l’effet bénéfique observée ; (réduction significative de la quantité de Pseudomonas aeruginosa à 24h post infection) avec la souche clinique de Porphyromonas catoniae. Nous souhaitons donc poursuivre ces expérimentations afin d’évaluer le mécanisme d’action de cette souche potentiellement bénéfique avec un modèle murin d’infection pulmonaire à PA avec ou sans prophylaxie à PC.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentiels bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines dont la mucoviscidose.

Procédures

Les animaux recevront deux suspensions bactériennes par instillation nasale à 18h d’écart. 24h plus tard, les animaux sont mis à mort avant récupération des poumons ou réalisation de lavages broncho alvéolaires.

Impact sur les animaux

Ce projet a été conçu pour minimiser les effets indésirables. Ce projet peut induire un stress chez les animaux. Un geste maitrisé par l’expérimentateur, une surveillance accrue (deux fois par jour minimum) des animaux avec une table de suivi de soins permettent également une diminution de ses effets. Les groupes recevant seulement Pseudomonas aeruginosa souche PAO1 ou Pseudomonas aeruginosa résitant à plusieurs antibiotiques (PA MDR) peuvent être sujets à une perte de poids, des douleurs, une mobilité réduite voire, une inactivité. Ces derniers seront gérés en accord avec la table de soins. Pour les groupes recevant du Porphyromonas, aucun effet indésirable n’est attendu au vu des expérimentations précédentes.

Devenir

Les 90 souris C57BL/6 mâles survivantes sont mis à mort à l’issu du protocole

Remplacement

Compte tenu des résultats obtenus in vitro montrant une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa (PAO1) en présence de Porphyromonas cliniques ainsi que les premiers résultats positifs in vivo pour la souche clinique, nous souhaitons poursuivre sur cette voie en confirmant la capacité protectrice de Porphyromonas, ainsi qu’évaluer son effet sur le système immunitaire. Nous ne pouvons pas répondre à cette question scientifique en utilisant des outils de culture cellulaire et tissulaire (culture in vitro et ex vivo), nous choisissons donc de conserver le modèle animal.

Réduction

Approche statistique : Le nombre de souris est déterminé de façon à mettre en évidence une différence de 1 log au niveau de la quantité de P. aeruginosa entre le groupe recevant uniquement du P. aeruginosa et celui recevant du Porphyromonas préalablement à l’instillation de P. aeruginosa. Nous avons choisi de suivre nos souris uniquement jusqu’à 24 h post-infection et non 7 jours pour limiter le nombre d’individus en nous basant sur l’expérience apportée par notre équipe lors de DAP précédentes. Nous nous limitons à une seule espèce de Porphyromonas (P. catoniae) alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon et une seule souche clinique parmi les 7 isolées par notre équipe.

Raffinement

Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés, une analgésie est mise en place en accord avec notre table de suivi de soins. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux

Choix des espèces

Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque paire de souris reçoit deux injections d'antigène dans la patte, à douze jours d'intervalle, puis est tuée par dislocation cervicale deux jours plus tard pour prélever les ganglions poplités et en extraire les lymphocytes. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour obtenir des anticorps monoclonaux de souris et que les méthodes de prédiction informatique ne sont pas prouvées pour des antigènes complexes. Il retient la souris plutôt que le rat ou le lapin au motif d'un coût plus faible.

Objectifs

Le but des travaux est d’obtenir des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre des protéines virales de polyomavirus et coronavirus. Ces travaux permettent d’obtenir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus et potentiellement de développer des immunothérapie. Après une semaine d’acclimatation, les souris (2 souris/ antigène) seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution contenant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées). Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration sera réalisée. Les souris seront mises à mort 2 jours après la seconde injection et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes. Les souris seront utilisées par paires en fonction des besoins, une paire de souris permettant de réaliser des anticorps monoclonaux pour un antigène. Ainsi, nous prevoyons un total de 40 souris pour 20 antigènes sur la periode de validité de la saisine (5 ans).

Bénéfices attendus

Le projet vise à produire des anticorps monoclonaux dans le but d'avoir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus. De plus, dans le cas ou ces anticorps sont neutralisants, ils pourront par la suite servir au développement de nouvelles immunothérapies dans des pathologies liées aux Polyomavirus et aux coronavirus.

Procédures

Après une semaine d'acclimatation, les souris seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution comportant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (Adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées) Cette intervention dure environ 1 minute. Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration et la même durée d'intervention sera réalisée. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale 2 jours après la seconde injection (duré d'intervention inférieur à 1 minute) et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes.

Impact sur les animaux

La seule douleur qui sera ressentie sera celle des inoculations par voie intrapodale (aiguilles 26G). L’adjuvant utilisé n’induit qu’une inflammation légère et le volume injecté n'est que de 50 μl/patte. Au vu de la durée de l'expérimentation et de sa nature, génération d'une réponse immunitaire, les animaux n'ont aucune raison rationnelle de developper un syndrome algique suite à l'injection, il n'existe donc pas de point limite strict liée à l'immunisation . Néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux (prostration, pelage hérissé) conduira à leur euthanasie au CO2.

Devenir

Les 40 souris (2/antigène) à J14 seront euthanasiées par dislocation cervicale et prélèvement des ganglions poplités.

Remplacement

Aucune méthode de remplacement n’existe pour l’obtention d’anticorps monoclonaux de souris, l’induction d’une réponse immunitaire in vivo est nécessaire pour l’obtention de ces réactifs. Les methodes informatiques par prédiction n'ont pas encore fait l'objet de preuve de concept pour des antigènes complexes comme des particules virales.

Réduction

Le nombre de souris utilisé (N=2/ antigène) est le nombre minimum de souris requis pour l’obtention d’anticorps monoclonaux, nombre suffisant de lymphocytes.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement physique des cages d'hébergement systématique (abris en plastique rouge transparent et papier absorbant) ainsi qu'un enrichissement social (2/cage)

Choix des espèces

La souris est actuellement l’espèce de référence pour la génération d’anticorps monoclonaux. Les autres espèces utilisables, rat et lapin, sont d’un coût plus élevé. 7 semaines (incluant semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance

20 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dix-neuf étant tués à l'issue et un réutilisé. Chaque lapin reçoit un produit immunogène pour lui faire produire des anticorps, subit des prélèvements sanguins répétés pendant trois à dix semaines, puis une prise de sang terminale sous anesthésie destinée à récolter le sérum. Le porteur revendique le lapin comme l'espèce de référence pour les anticorps polyclonaux et affirme que le recours à l'animal reste "indispensable" pour produire certains réactifs, faute d'alternative in vitro. Il justifie l'usage par le fait que ces réactifs servent ensuite à mettre au point des tests évitant d'autres recours in vivo.

Objectifs

La production de sérum polyclonal chez le lapin permet la production ou le renouvèlement de réactifs de laboratoire. Ceux-ci sont nécessaires pour la réalisation d’analyses dans le cadre d’études réglementaires. A l’heure actuelle il est impossible de les produire in vitro. Or ces réactifs sont indispensables pour développer des techniques analytiques fiables permettant de remplacer des tests in vivo.

Bénéfices attendus

Ces études permettent in fine d’obtenir des tests de laboratoires fiables.

Procédures

Le but de la procédure est d’administrer un produit immunogène au lapin qui va alors produire des anticorps dirigés contre le produit injecté. Les modalités d’administration sont fonction du produit étudié. Les lapins sont ensuite observés quotidiennement et un suivi clinique adapté est mis en place. Les paramètres mesurés lors de cette procédure sont de deux types : - Paramètres cliniques (liste non exhaustive) : examen clinique général - Paramètres biologiques (liste non exhaustive) : sérologie – immunologie Les prélèvements sanguins intermédiaires permettent le suivi de la réponse en anticorps au cours de l’immunisation pour ajuster le plan d’expérience de l’étude au besoin. La prise de sang terminale est réalisée sous anesthésie. La durée de cette procédure est comprise entre 3 et 10 semaines en fonction du produit administré et de la réponse immune induite.

Impact sur les animaux

Les dommages engendrés par la procédure peuvent être le stress et l’inconfort liés à l’administration de l’antigène, aux prélèvements, et réactions locales de courte durée pouvant survenir au point d’injection. Si l’opérateur le juge nécessaire, une anesthésie/analgésie ou d’autres mesures (dont adaptation de la vitesse d’injection du produit) peuvent être envisagées pour limiter les contraintes de l’animal. Les actes techniques sont réalisés par des opérateurs hautement qualifiés qui assurent une approche et une contention adaptées pour que le geste sur l’animal soit le moins douloureux et traumatisant pour ce dernier.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin d’étude pour la production de sérum. Dans des cas exceptionnels, les animaux peuvent être euthanasiés pendant l’étude lorsqu’un point limite est atteint.

Remplacement

Un recueil d’information, lorsqu’il est disponible, est apporté par la bibliographie pour rechercher des alternatives à l’utilisation animale. Néanmoins, le recours à l’animal est à l’heure actuelle indispensable pour la production de certains réactifs. De plus, certains tests analytiques à partir des réactifs produits sur lapins permettent de ne pas avoir recours à des tests in vivo.

Réduction

Les effectifs sont évalués au plus juste (anticipation des projets de Recherche et Développement et définition des besoins de laboratoires) de façon à limiter le nombre d’études.

Raffinement

Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie et analgésie de l’animal peuvent être envisagées lors de certains actes (administration de l’antigène, prélèvements). Une attention particulière est apportée au choix de l’adjuvant. Ce choix est basé sur une revue bibliographique et/ou les informations fournies par le fabricant afin de sélectionner un produit ne générant pas de réaction inflammatoire disproportionnée chez le lapin. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.

Choix des espèces

Dans la littérature, il s’agit de l’espèce de référence pour la production d’anticorps polyclonaux, répondant à une large variété d’antigènes et utilisée pour un grand nombre de sérums utilisés en laboratoire. Le lapin permet d’obtenir dans un délai très court une grande variété d’antigènes et d’épitopes. Outre les éléments qualitatifs mentionnés, le choix du lapin permet généralement de récolter des volumes de sérums répondant aux attentes de constitution de lots de réactifs, avec un nombre limité d’animaux. Les lapins utilisés ont entre 3 et 5 mois. A cet âge les lapins sont sevrés et ont atteint un poids qui permet de récolter une plus grande quantité de sérum.

96 rats vont être utilisés, tués au sevrage vers le vingt-et-unième jour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les ratons sont nourris à la pipette chaque jour de leur quatrième au vingt-et-unième jour de vie, puis reçoivent un gavage intragastrique de marqueurs suivi d'un prélèvement de sang à la queue. Le porteur reconnaît que le gavage peut induire de rares fausses routes et que la prise de sang provoque une douleur qu'il qualifie de légère. Il affirme que seul un modèle animal rend compte de la complexité des fonctions en jeu, les retombées visant les formulations infantiles.

Objectifs

Les gangliosides sont des composants majeurs des membranes plasmiques, notamment des cellules intestinales, dont la composition varie au cours du développement. Ils régulent leurs propriétés et divers évènements de signalisation. En particulier, ils servent de récepteurs aux virus, bactéries et toxines et sont ainsi impliqués dans la mise en place de l’immunité intestinale chez le jeune. Très peu de données concernent leur rôle dans la fonction absorptive. Seul un travail ex vivo semble indiquer que les gangliosides favoriseraient l’absorption intestinale des lipides (Birecki, 2006). Les gangliosides sont naturellement présents dans l’alimentation, en particulier le lait maternel dont les composants bioactifs sont connus pour influencer la maturation intestinale et la mise en place de la fonction absorptive. Parmi les nutriments dont l’absorption intestinale est particulièrement critique en période post-natale figurent les acides gras polyinsaturés oméga-3. La rétine est un tissu particulièrement sensible aux apports alimentaires en période périnatale, notamment en oméga-3 qui sont fondamentaux pour le bon développement des fonctions visuelles. Chez l’enfant, des études cliniques ont montré que la consommation de formulations infantiles pauvres en acide linoléique et dépourvues en acide docosahexanoique (DHA) du fait de l’origine végétale des lipides, conduisait à une baisse d’environ 40% des taux de DHA dans le système nerveux et les globules rouges associée à une baisse significative de l’acuité visuelle et un retard de maturation des photorécepteurs (cellules rétiniennes en charge de la conversion du signal lumineux en signal nerveux) et une baisse significative de l’acuité visuelle ont été montrés, en comparaison des nouveau-nés allaités. Nous formulons l’hypothèse que les gangliosides apportés en période postnatale pourraient jouer un rôle dans la maturation intestinale et moduler l’absorption lipidique, notamment des oméga-3, favorisant ainsi leur incorporation dans la rétine. L’objectif de ce projet est de déterminer l’impact des apports postnataux en gangliosides sur les capacités d’absorption intestinale des oméga-3 et les conséquences sur leur incorporation dans la rétine.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront de vérifier les impacts positifs potentiels des apports postnataux en gangliosides sur les capacités de la muqueuse intestinale à absorber efficacement les oméga-3, ainsi que sur l’incorporation rétinienne des oméga-3, connus pour leurs bénéfices dans ce tissu en période de développement. De plus, mâles et femelles seront étudiés de façon à documenter un éventuel effet du sexe. Ainsi, ce projet devrait permettre de soutenir l’importance des apports en gangliosides dans le développement post-natal et le fait que les gangliosides font partie des composants bioactifs du lait maternel à considérer dans les questions de nutrition infantile. Il pourrait ouvrir la voie à des travaux visant une prise en compte des gangliosides dans les formulations infantiles et des recommandations nutritionnelles destinées aux femmes enceintes et allaitantes, à l’instar de ce qui s’est mis en place auparavant pour les oméga-3.

Procédures

Les animaux seront "biberonnées" un fois par jour entre J4 et J21, à l'aide d'une pipette souple par des solutions nutritionnelles (volumes adaptés à leur âge). Un gavage intra-gastrique de marqueurs de perméabilité intestinale suivi par un prélèvement de sang à la queue (quelques gouttes, environ 60 uL) sont prévus une seule fois dans la vie des ratons (J19/J20).

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales de ce projet sont de classe légère. Des nuisances peuvent être attendues lors du gavage intra-gastrique de la solution permettant la mesure de la perméabilité intetsinale ion vivo ainsi qu'au moment du prélèvement d'une goutte de sang à la queue pour les dosages. Le gavage intra-gastrique peut induire des fausses routes mais c'est extrêmement rare chez les ratons de 20 jours et lorsque réalisé par du personnel compétent. Le prévèlement de sang à la queue peut induire une douleur qui reste légère car la zone est peu innervée.

Devenir

Les aniamaux sont gardés en vie à l'issu de chaque procédure et seront mis à mort à l'âge du sevrage à J21/22.

Remplacement

L’objectif de cette expérimentation est d’évaluer les effets d’une supplémentation nutritionnelle post-natale sur l’accrétion lipidique de la rétine. Seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité des différents fonctions physiologiques qui interviennent (digestion, absorption intestinale, distribution et incorporations tissulaires). L’expérimentation animale ne peut donc pas être remplacée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été estimé à 10 par groupe sur la base d’un calcul d’effectif à partir de données bibliographiques permettant d’estimer l’effet attendu (sur l’accrétion en oméga-3 dans la rétine mais également sur les voies mécanistiques explorées telles que la perméabilité intestinale et la mesure d’expression de transporteurs lipidiques), pour une puissance de test statistique de 90% et un risque d’erreur de 5%. Toutes les analyses seront réalisées à partir d’un seul animal. L’utilisation des mâles et des femelles dans les groupes expérimentaux valorise au maximum les animaux obtenus à la mise bas.

Raffinement

L’environnement des mères gestantes et allaitantes sera enrichi (matériau cellulosique pour le nid, tunnel, bâton à ronger). Les procédures prévues relèvent toutes de la classe de sévérité « légère » : biberonnage selon réflexe de tétée des nouveau-nés, administration orale de marqueurs de perméabilité intestinale. Les animaux seront suivis par un personnel compétent dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale. Les protocoles ne devraient pas entraîner de souffrance pour les animaux, cependant ils feront l’objet d’une visite quotidienne, y compris le week-end. Les points limites clairement définis conduiront à la mise à mort des animaux le cas échéant.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans notre laboratoire et bien adaptée à nos recherches. La taille des ratons facilite la manipulation et le biberonnage. Cette espèce, en particulier la souche choisie, possède également des qualités maternelles qui participeront de la réussite de l’expérimentation. La taille des organes d’intérêts des ratons au sevrage fournira un matériel suffisant pour réaliser nos analyses. Les mères seront commandées gestantes auprès du fournisseur (J1 de gestation) et 10 d’entre elles seront gardées pendant toute la période de lactation. Les petits seront utilisés de la naissance au sevrage (J21) puisque l’expérimentation vise à déterminer les effets de la supplémentation post-natale pendant la durée de la lactation.

1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des souris génétiquement modifiées reçoivent une ou deux injections péritonéales d'un agent immunisant, puis sont anesthésiées pour un prélèvement de sang intracardiaque terminal avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur décrit un stress bref lié à l'injection et affirme que le modèle de culture cellulaire utilisé auparavant n'imite que partiellement ce qui se déroule dans l'organisme vivant. Il présente cette recherche fondamentale comme une étape "indispensable" à la compréhension des immunodéficiences et des cancers.

Objectifs

Notre laboratoire s’intéresse aux lymphomes, des maladies qui se développent à partir des lymphocytes B : cellules du sang qui ont perdu leur capacité à devenir des cellules appelées plasmocytes et dont le rôle est de protéger l’organisme contre les infections par des agents extérieurs. Leur incidence est en constante augmentation et ces maladies restent incurables en dépit de nouvelles thérapeutiques. Notre projet de recherche vise à identifier les étapes critiques et les molécules clefs qui régissent le destin (la différenciation) du lymphocyte B jusqu’au plasmocyte et qui pourraient contribuer au développement ou au maintien de ces lymphomes. Les travaux du laboratoire ont démontré l’importance de molécules, l’interleukine 2 (IL-2) et l’IL-15, dans ce processus par des études menées hors de l’organisme (in vitro). Cependant cela ne permet pas de déterminer quand et comment ces molécules agissent au sein des organes lymphoïdes secondaire où se déroule la différenciation des lymphocytes B. A l’heure actuelle il n’existe pas d’étude menée chez l’animal démontrant leur rôle dans la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Notre objectif est d’étudier le rôle de l'IL-2 et l'IL-15 chez des souris modifiées dans lesquelles les lymphocytes B sont insensibles à ces molécules (souris déficientes pour le gène Il2rb). Pour cela nous immuniserons au maximum 1020 souris selon différents protocoles. Cela consiste à introduire dans l’organisme un agent (petites molécule, bactéries) dépourvues de pathogénicité (incapable de rendre malade) mais capable d’induire une réponse immunitaire en induisant la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes capables de produire des anticorps qui reconnaissent et neutralisent l’agent étranger. Cela nous permettra d’évaluer le rôle de l’IL-2 et IL-15 dans la différenciation des lymphocytes B.

Bénéfices attendus

Ce projet fera avancer les connaissances fondamentales sur la différenciation plasmocytaire normale, étape indispensable à la compréhension des mécanismes à l'origine d'immunodéficiences et de cancers.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 ou maximum 2 injections peritonéales de l'agent immunisant, distantes de 28 jours. Le geste est réalisé par une personne experimentée, ce geste rapide et précis ne durera pas plus de 2 minutes. En fin d'étude, les animaux recevront un traitement analgésique et seront anesthesiés pour prélèvement de sang intra-cardiaque (5 minutes maximum) puis euthanasiés selon une méthode reglementaire.

Impact sur les animaux

Nous immuniserons les souris selon différents protocoles. Cela consiste à introduire dans l’organisme un agent (petites molécule, bactéries) dépourvues de pathogénicité (incapable de rendre malade) mais capable d’induire une réponse immunitaire en induisant la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes capables de produire des anticorps qui reconnaissent et neutralisent l’agent étranger. Ces procédures n’entraineront pas de stress, en dehors du stress bref et modéré lie a l'injection péritonéale, sans forte douleur pour les souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de prelever les organes et réaliser les analyses sur les différents tissus.

Remplacement

Lors de nos précédents travaux, nous avons utilisé un modèle de culture de cellules. Ce modèle nous a permis de comprendre plus finement la biologie du lymphocyte B au cours de son activation, puis de sa différenciation pour produire des anticorps. Malgré tout, ce modèle n’imite que partiellement ce qui se déroule au sein de l'organisme vivant lors d’une infection et il devient nécessaire pour nous d’étudier ce phénomène dans l'animal. La souris est un modèle de choix pour l'étude des réponses immunitaires. C'est pourquoi nous allons utiliser des animaux transgéniques nous permettant d’invalider de manière contrôlé dans le temps l’expression du récepteur à l’interleukine-2 et 15 et de suivre les réponses immunes suite aux immunisations.

Réduction

Dans l’intérêt de réduire le nombre d’animaux utilisé, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible, en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, ganglions, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Enfin les protocoles d'immunisations seront réalisés successivement afin de définir les meilleures conditions expérimentales pour notre étude et uniquement si les résultats obtenus justifient de réaliser un autre type d'immunisation. Pour chaque étude, des groupes de 8 animaux par genotype (sauvage ou muté) nous permettra d'obtenir des statistiques fiables et publiables. Les statistiques seront réalisés à l'aide de tests non paramétriques, le test de Mann et Whitney sera appliqué pour deux échantillons et celui de Kruskal et Wallis pour un nombre quelconque d'échantillons.

Raffinement

Toutes les lignées de souris déjà existantes n'induisent pas de phenotype douloureux. La littérature décrit les protocoles d’immunisation spécifiques aux agents immunogènes qui seront appliqués dans cette étude. Les animaux seront surveillés après immunisation pour détecter l'apparition d'une éventuelle douleur et l'inconfort provoqué sera soulagé. De plus les animaux sont élevés dans des conditions adaptées: locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum, maximum 5 animaux/cage et aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage.

Choix des espèces

Le modèle animal murin est très utilisé en immunologie. Des protocoles d’immunisation standardisés et des protocoles d’analyses éprouvés sont disponibles. La possibilité d'invalider des gènes spécifiquement dans un type cellulaire et de manière temporelle est importante pour évaluer finement les évènements et les mécanismes impliqués. Les souris avec un potentiel conditionnel pour le gène IL2rb ont été générées. Elles ont été croisées en retour avec la lignée C57BL/6N sur 8 générations. Enfin le croisement avec la lignée CD19-Cre a permis d’inactiver la signalisation IL-2 et IL-15 spécifiquement dans les lymphocytes B. L’acquisition des cellules effectrices étant optimale à l’âge adulte, l’ensemble des études sera effectué sur des animaux adultes (8-12 semaines).