Procédures légères

564 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Ces souris modèles de la sclérose latérale amyotrophique reçoivent une molécule anti-inflammatoire dans un gel, sont suivies par des tests de force musculaire, agrippement à une grille et soutien du poids, et 80 d'entre elles subissent sous anesthésie une laminectomie et une dissection du nerf sciatique de huit heures avant d'être mises à mort. Le porteur fixe un point limite à un score de paralysie modérée. Il affirme que l'effet d'une maladie aussi complexe ne peut s'étudier que sur l'animal entier vivant, et renvoie les essais cliniques à une perspective conditionnelle.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative touchant les neurones moteurs. Elle se déclare à l’âge adulte, il n’existe à ce jour aucun traitement curatif et l'issue de la maladie est fatale. La découverte de causes génétiques chez certains patients a permis de développer des modèles murins de la SLA. Toutefois, les mécanismes conduisant à la dégénérescence des neurones moteurs restent mal connus à ce jour. Nous savons toutefois que l'étiologie de la SLA comprend une composante inflammatoire qui contribue fortement au développement des symptômes conduisant au décès des patients. Or, une molécule récemment découverte, que nous nommerons PY, inhibe puissament la voie Il23/Il17 de la réponse inflammatoire. Cette molécule a d'ores et déjà montré des effets bénéfiques sur des animaux modèles de maladies inflammatoires (goutte, polyarthrite rhumatoide). Comme PY franchit la barrière hémato-encéphalique, on peut espérer qu'elle ait aussi un effet bénéfique sur la SLA. Des expériences préliminaires ont produit des résultats encourageants, suggérant que PY ralentit le développement des symptômes, mais les effets dépendent du sexe de l'animal. Par ailleurs des travaux récents montrent que la réponse neuroimmunologique peut être différente aux stades présymptomatiques et symptomatiques ce qui suggère que l'effet de PY sur la SLA pourrait dépendre du temps auquel on commence le traitement. Dans ce projet, nous étudierons à quel moment l'administration de PY doit démarrer pour produire un effet sur l'apparition des symptomes et la survie, l'inflammation de la moelle épinière, et sur les marqueurs cellulaires et électrophysiologiques de la dégénérescence des neurones moteurs. Les expériences seront menées sur le modèle animal bien établi de la SLA: les souris SOD1 G93A. La molécule sera administrée par voie orale (molécule additionnée à une gelée alimentaire grignotée par les souris). Le traitement sera démarré à différents temps: dès la gestation des animaux (traitement administré à la mère), au sevrage 21 jours après la naissance, après l'apparition des symptômes chez les animaux témoins (80 jours après la naissance). On étudiera séparément les animaux des deux sexes pour tenir compte du fait que la maladie progresse plus vite chez les mâles que chez les femelles.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet apportera des preuves que PY ralentit l'évolution de la maladie sur un modèle animal standard de la SLA. Si c'était le cas, et compte tenu du caractère incurable à ce jour de cette maladie, nous proposerons alors aux centres SLA nationaux de procéder à des essais cliniques de phase I/II sur les patients (des contacts préliminaires en ce sens ont déjà été pris). S'il s'avérait que cette molécule permettait de ralentir l'évolution de la maladie chez les patients qui vivraient plus longtemps sans déficits moteurs, nous aurions grandement progressé dans la prise en charge clinique de cette maladie dramatique.

Procédures

Tous les animaux mangerons quotidiennement un gel alimentaire contenant ou pas la molécule d'intérêt dont nous testons les effets. La prise alimentaire dure cinq minutes environ dès que les animaux s'intéressent au gel. Tous les animaux seront pésés trois fois par semaine et leur score clinique sera établi par observation de leur locomotion et de leur réflexe lorsqu'ils sont soulevés par la queue. Pour chaque animal, la pesée dure une minute et l'observation de la locomotion et des réflexes dure cinq minutes. Chez 384 animaux, la force musculaire sera appréciée par un test d'agripement à une grille (une fois par semaine, durée totale vingt minutes par animal en comptant les temps de repos) et par un test de soutien de poids (une fois par semaine, durée totale dix minutes par animal en comptant les temps de repos). Ces tests seront effectués sur les animaux vigiles. Dans une des procédures, 100 animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque de PFA d'une durée de 15 minutes sous anesthésie générale et analgésie profonde pour examen post-mortem de leurs tissus (moelle épinière, muscles). Dans une autre procédure, une étude des pertubations électrophysiologiques des neurones moteurs sera effectuée sur 80 animaux pour étudier l'effet du traitement sur ces marqueurs fonctionnels. Cette procédure, réalisée sous anesthésie générale et analgésie profonde, implique une laminectomie des vertèbres lombaires et une dissection de branches du nerf sciatique. L'étude électrophysiologique dure huit heures au total pendant lesquelles les souris sont maintenues sous anesthésie générale et anesthésie profonde. Ces 80 animaux ne seront pas réveillés et seront mis à mort par un agent euthanasiant administré à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

La modalité d'administration de la molécule dans un gel alimentaire ne provoque en elle-même aucune nuisance ni effet indésirable. En ce qui concerne l'action de la molécule par elle-même, nos données préliminaires sur les souris SOD1 indique que cette molécule soulage le phénotype des animaux en ralentissant l'apparition des symptômes.

Devenir

Procédure 1: Mise à mort par dislocation cervicale ou inhalation de CO2. Procédure 2: Mise à mort par perfusion transcardiaque de PFA sous anesthésie et analgésie profonde. Procédure 3: Mise à mort par administration d'un agent euthanasiant (Exagon) sous anesthésie générale et analgésie profonde.

Remplacement

L'étude des cibles moléculaires de la molécule PY et de la voie de signalisation impliquée sera faite sur des systèmes de culture cellulaire, réduisant ainsi le nombre d'animaux vivants utilisés, et est hors champ de cette DAP. Toutefois, il reste à déterminer si la molécule a un effet sur l'évolution d'une maladie maladie aussi complexe que la SLA. Cette autre partie, qui constitue l'objet de la présente DAP, nécessite d'utiliser des animaux vivants. En effet, la SLA résulte d'interactions pathogènes entre les neurones moteurs, les autres constituants cellulaires de la moelle épinière (en particulier les cellules microgliales et les astrocytes, mais aussi les neurones supraspinaux et les interneurones spinaux), et les constituants périphériques (cellules de schwann, jonctions neuromusculaires, fibres musculaires). Les effets de la molécule d'intérêt PY sur la pathogénèse de la SLA ne peut donc s'étudier que sur l'animal entier vivant.

Réduction

Chaque procédure est conçue pour apporter le plus possible de résultats avec des lots dont les effectifs ont été réduits au minimum pour obtenir des résultats fiables. Dans chacune des procédures, la taille de chaque lot, a été établie par un calcul de puissance pour atteindre une valeur alpha 0,8. Les données obtenues dans chaque procédure seront soumises à des analyses multivariées de la variance (MANOVA) et à des ANOVA dans lesquelles l'âge du début du traitement, la dose de PY et le sexe seront des variables indépendantes, pour déterminer s'il existe une association significative avec au moins une des variables observées. Ces analyses seront suivies de tests post-hoc de comparaisons multiples pour déterminer l'influence des variables indépendantes sur les variables observées dans chacune des procédures.

Raffinement

Les expériences sont conçues pour apporter le moins d'inconfort possible aux animaux. A cette fin, une réflexion éthique a présidé au choix de la modalité d'administration de la molécule d'intérêt sur une période de temps longue (environ 120 jours). L'administration intrapéritonéale a été éliminée à cause du risque accru de péritonéite si ces injections étaient répétées quotidiennement pendant une période de temps aussi longue. La méthode du gavage ne parait pas acceptable non plus à cause du risque, non négligeable, de perforation de l'oesophage surtout si ce geste était répété quotidiennement pendant 120 jours. L'injection IP et le gavage présentent tous les deux un risque de mortalité que nous ne voulons pas prendre. Malheureusement, l'administration dans l'eau de boisson (qui serait la méthode la plus simple) n'est pas praticable car la molécule est très peu soluble dans l'eau. De plus, ce mode d'administration nécessiterait de grandes quantités de la molécule, or, pour des raisons logistiques et financières, nous ne pouvons avoir accès qu'à de petites quantités. De plus, l'administration dans l'eau de boisson ne nous permettrait pas de contrôler la prise quotidienne de chaque souris. Nous avons donc opté pour une administration de la molécule dans de petites portions d'une gelée grignotable, méthode que nous avons validée notre étude préalable. Il est important de noter que cette méthode n'induit aucune mortalité ni stress de l'animal. Il arrive toutefois que les souris ne mangent pas la totalité de la gelée. Mais ceci n'est pas un inconvénient car nous pouvons quantifier la proportion absorbée par examen de la gelée restante et tenir compte de cette variable dans nos statistiques pour faire ressortir un éventuel effet dose-réponse. Cette variabilité est prise en compte dans nos calculs de puissance pour définir la taille des groupes. Par ailleurs, toujours dans le souci de réduire l'inconfort des animaux au minimum, nous avons défini un point limite (neuroscore 3 sur une échelle de 4) où la paralysie est modérée et a peu d'impact sur la vie de l'animal. Toutefois, par souci de précaution, nous disposerons de l'hydrogel et des croquettes au fond de la cage dès que les souris atteindront le score clinique 2 afin de s'assurer qu'elles s'alimentent et boivent confortablement.

Choix des espèces

La découverte d’un lien génétique dans certains patients a permis de développer des modèles murins de la SLA. Nous utiliserons ici des souris dans lesquelles un gène humain muté SOD1 (G93A) a été inséré par transgénèse dans le génome des souris. Histologiquement, ces souris présentent une dégénérescence progressive des neurones moteurs spinaux et aussi des neurones corticospinaux moteurs, reproduisant l’atteinte spinale et corticale caractéristique de cette maladie. Il a par ailleurs été démontré dans ces souris une atteinte neuroinflammatoire (comme chez les patients humains) qui détermine le décours temporel de la maladie. Cette souris est un modèle de choix pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SLA et l'effet sur la maladie de molécules qui agissent sur l'axe inflammatoire. Les animaux seront utilisés à trois stades de leur développement pour étudier à quel stade PY doit être utilisé pour produire le meilleur effet protecteur. Les trois stades de démarrage du traitement sont les suivants: 1°) Dès la gestation: le traitement est administré à la mère (gelée à consommer oralement) pendant la gestation puis après la naissance jusqu'au sevrage des animaux de la portée. Les animaux sevrés consomment ensuite la gelée une fois par jour jusqu'à l'atteinte du score 3 qui survient chez l'adulte. 2°) A partir du sevrage 21 jours après la naissance jusqu'à l'atteinte du score 3 chez l'adulte. 3°) Chez l'adulte à partir du 80 ème jour jusqu'à l'atteinte du score 3.

156 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mésothéliome humain par voie intrapéritonéale, des injections hebdomadaires sous anesthésie pour suivre la tumeur, puis une injection de nanovecteurs, les prélèvements étant réalisés après euthanasie. Le projet vise à valider un nanovecteur censé mieux diriger un agent anticancéreux vers les tumeurs de la plèvre. Le porteur affirme que l'approche sur "organisme entier" est nécessaire pour évaluer la biodistribution réelle, non reproductible in vitro.

Objectifs

Notre projet a pour objectif de produire et de valider un nanovecteur biodégradable comportant un agent de ciblage tumoral et un agent thérapeutique pour la thérapie ciblée du mésothéliome pleural malin (MPM). Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons des nanoassemblages (NAs) aux propriétés d’imagerie multi-modales (fluorescence et magnétisme) afin de faciliter leur détection in vitro et in vivo. Nous avons déjà validé que ces NAs sont internalisés par les cellules tumorales et sont capables de transporter et libérer un composé thérapeutique dans des cellules. Le ciblage tumoral est assuré par le couplage à la surface des NAs d’un nanobody (fragment variable d’anticorps de lama) dirigé contre la mésothéline (MSLN), un antigène de tumeur surexprimé en particulier à la surface des cellules de MPM. La monomethyl auristatine E (MMAE) sera l’agent chimio-thérapeutique utilisé dans cette étude. Elle sera greffée à la surface des NAs grâce à un système de chimie clic, de la même façon que le nanobody. La première partie du projet a consisté à évaluer les NAs produits sur des lignées tumorales et des modèles de tumeurs humaines en 3 dimensions in vitro. Les résultats obtenus correspondant aux objectifs souhaités, une évaluation sur modèles animaux est à envisager afin de valider les effets observés dans un modèle complexe et vascularisé.

Bénéfices attendus

Les efforts réalisés pour comprendre la biologie des tumeurs ainsi que l’amélioration continuelle des traitements tels que la chimiothérapie, la radiothérapie, et plus récemment l’immunothérapie ont déjà permis d’augmenter la survie des patients atteints de cancers. Cependant, dans la plupart des cas ces traitements restent associés à d’importants effets secondaires et à une efficacité limitée en raison d’un manque de spécificité tumorale. De plus, de nombreuses molécules thérapeutiques telles que les drogues hydrophobes ou hautement cytotoxiques, les toxines, les radio-isotopes ou les acides nucléiques ne peuvent être injectés par voie systémique aux patients à cause de leur instabilité ou de l’induction d’une toxicité aspécifique. Il a été montré qu’une vectorisation appropriée des agents anti-cancéreux permet de diminuer la morbidité associée au traitement mais aussi d’en améliorer l’efficacité et de limiter l’établissement d’une résistance dans les cellules tumorales. Ce contexte a justifié l’émergence, depuis quelques dizaines d’années, de nanovecteurs d’abord issus de l’ingénierie chimique puis dérivés du monde du vivant. La vectorisation de composés thérapeutiques à l’aide de nanovecteurs permet notamment une augmentation de la solubilité et de la biodisponibilité des drogues vectorisées, une augmentation de la concentration locale en composé actif dans les tumeurs ainsi qu’une diminution des effets off-target. Les nanovecteurs apportent aussi la possibilité de combiner plusieurs molécules thérapeutiques au sein d’un même nanomédicament. Ainsi, bien que ce genre de design ajoute des degrés de complexité au développement pharmaceutique, une vectorisation efficace apparait aujourd’hui comme essentielle pour améliorer encore l’efficacité et la sureté des traitements contre le cancer. Cette volonté s’illustre par la mise sur le marché d’une dizaine de nanomédicaments anti-cancéreux à l’heure actuelle et par un grand nombre d’essais cliniques en cours utilisant une grande variété de nanovecteurs. Ce genre de stratégie thérapeutique est d’autant plus intéressant dans le cas de cancers très agressifs pour lesquels nous ne disposons pas encore d’options thérapeutiques satisfaisantes. C’est le cas du mésothéliome pleural malin (MPM), un cancer de la plèvre pour lequel la survie médiane, malgré le traitement de référence actuel, est approximativement d’un an.

Procédures

Les animaux porteurs de tumeurs seront tous soumis à une injection i.p de cellules tumorales. Ces animaux seront ensuite anesthésiés à l'isoflurane (induction à 3,5% / 1 L d'air par minute puis maintien à 1,5% / 1 L d'air par minute) puis recevront une injection i.p de coelenterazine une fois par semaine afin de monitorer la croissance tumorale. Enfin, les animaux recevront une injection de nanoparticules en i.v ou en i.p. Les prélèvements seront tous réalisés sur animaux préalablement euthanasiés.

Impact sur les animaux

Nous avons préalablement pu vérifier que l’injection des NAs à la dose prévue n’entraine pas de morbidité particulière ou de douleur chez les animaux. Cependant, chaque procédure nécessitera la réalisation d'injections i.v et/ou i.p qui peuvent être à l'origine d'une douleur légère et générer un stress modéré et ponctuel chez les animaux. Dans toutes les procédures l'établissement et la croissance des tumeurs pourra générer des douleurs qui seront détectées précocément grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure. De plus, les anesthésies à l'isoflurane peuvent également générer un stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes sphéroïdes, puces microfluidiques) qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. L'approche sur organisme entier nous permet cependant d’évaluer l’effet thérapeutique des NAs mais également les effets toxiques potentiels sur divers tissus tels que le compartiment hématopoïétique par exemple. Une telle complexité n’est malheureusement pas encore reproductible in vitro. Dans la mesure où nous souhaitons étudier le ciblage in vivo des cellules tumorales dans un environnement complexe après administration des NAs en intraveineux, comme c’est le cas en clinique, ces expériences nécessitent d’être réalisées sur l’animal. Nous avons déjà validé la spécificité de nos NAs sur un large panel de lignées cellulaires tumorales et saines, en 2D et en 3D. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de la biodistribution réelle des NAs une fois injectés dans un organisme.

Réduction

Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons (n

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe légère à modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en cas d’absence de réponse au traitement ou de d’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

L’objectif étant de cibler un antigène humain, l’utilisation de souris immuno-déficientes permettant l’implantation de cellules tumorales humaines est essentielle. Nous avons donc choisi de travailler sur des souris NSG. L’implantation intrapéritonéale des cellules tumorales se justifie pour reproduire le développement intra-cavitaire du mésothéliome chez l’homme (plèvre ou péritoine). Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines. Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes afin de se placer au plus près des conditions du développement tumoral chez l’humain.

Des chocs électriques "d'intensité modérée" apprennent aux souris à éviter un lieu, et cinq des six procédures comportent une chirurgie stéréotaxique du cerveau, certaines souris passant en outre deux semaines isolées. 646 souris adultes, mâles et femelles, issues de différentes lignées transgéniques, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, puis tuées par une dose létale d'anesthésique suivie d'une perfusion de fixateur par le cœur. Il s'agit de comprendre comment l'aire tegmentale ventrale du cerveau contrôle cet évitement, ce qui "pourrait" selon le porteur aider à identifier des cibles thérapeutiques contre l'évitement persistant du stress post-traumatique. Le porteur range la chirurgie parmi les "procédures douloureuses", sans préciser ce qu'elle implante ou injecte, ni le nombre de chocs, ni les tests réunis sous l'expression "validation comportementale".

Objectifs

Ce projet a pour objectif général d’identifier les circuits neuronaux impliqués dans l’évitement de place chez la souris. Ce projet se focalisera sur les neurones de l’aire tegmentale ventrale qui jouent un rôle clef dans le comportement de défense. Or, aucune étude à ce jour n’a cherché à comprendre comment l’aire tegmentale ventrale contrôle l’évitement de place chez la souris. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ce circuit.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce phénomène, autrement appelé persistance d’évitement est couramment observé dans le syndrôme de stress post traumatique. Cet évitement comportemental et cognitif excessif limite l’efficacité de la thérapie comportementale. Comprendre son corrélat neuronal pourrait donc permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’évitement persistant chez les patients atteints de stress post-traumatique.

Procédures

Ce projet implique 6 procédures expérimentales. La procédure 1 consiste en une série d’expériences de validation comportementale. Les procédures 2-6 comprennent toutes la chirurgie stéréotaxique pour étudier des circuits neuronaux impliqués dans le comportement d’évitement de place. A l’issue de ces expériences, les animaux sont mis à mort par perfusion intracardiaque.

Impact sur les animaux

Le comportement d’évitement de place engendre de l’inconfort pour l’animal puisque des chocs électriques d’intensité modérée sont administrés à l’animal. Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures douloureuses. L’isolement des souris pendant 2 semaines engendre de l’inconfort pour l’animal.

Devenir

Notre étude nécessite de fixer les tissus cérébraux afin d’y réaliser des marquages immunohistochimiques. Ce but expérimental nécessitant la mise en place d’une méthode de mise à mort de perfusion intracardiaque. A l’issue de chaque procédure, les souris recevront une dose létale d’anesthésique et perfusées avec une solution fixatrice (4% paraformaldéhyde). Ces souris ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.

Remplacement

Il est impossible de remplacer l’animal vivant pour l’étude du comportement d’évitement. La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 646 souris adultes (mâles et femelles) sur un période de 5 ans. Nous avons optimisé les protocoles afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. De plus, ce chiffre comprend le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires (pilotes), afin de 1) déterminer les conditions optimales lors des tâches comportementales de conditionnement et 2) mettre en place de nouvelles techniques, ce qui permettra de diminuer la quantité d’animaux utilisés à long terme. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra d'utiliser toutes les souris générées.

Raffinement

Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences ou les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes, sont proches les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri- opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.

Choix des espèces

L’évitement est un comportement extrêmement important pour la survie et est donc conservé chez les mammifères. Par ailleurs, ce projet requiert l’étude fine de populations de neurones accessibles uniquement via des modèles murins transgéniques. Les souris se reproduisent rapidement (une portée par mois) et leur système nerveux atteint son développement adulte en 12 semaines. Ainsi, la souris adulte représente un modèle de choix pour étudier les mécanismes neuronaux qui contrôlent le comportement d’évitement.

2 352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sourdes de naissance ou rendues sourdes selon le protocole, et utilisées pour certaines dès leurs premiers jours, elles subissent jusqu'à quatre tests auditifs sous anesthésie et une chirurgie de la cochlée, sous anesthésie, pour y injecter un vecteur viral, précédée pour une partie d'entre elles d'une à trois injections de tamoxifène dans l'abdomen. Le projet doit établir la "preuve de concept" de vecteurs de thérapie génique contre des surdités héréditaires ou liées à l'âge, et selon le porteur il "pourrait poser les bases d'un développement clinique" si les résultats sont probants. Le porteur dit ne s'attendre à aucun signe de souffrance ou d'inconfort lié à la surdité, y compris quand la chirurgie peut faire baisser ou perdre l'audition de l'oreille injectée, cette surdité étant "unilatérale".

Objectifs

Entendre, c’est pouvoir identifier et localiser les sources sonores dans l’espace, de jour comme de nuit ; l’audition contribue ainsi à la sécurité des individus. L’audition est devenue chez l’homme le sens prépondérant sur lequel repose la communication inter-individuelle. Or, l’importance de l’audition continue d’être fortement sous-estimée : le risque que la perte de l’audition fait peser sur les individus, risque qui inclut le déclin des fonctions cognitives, n’est ni compris, ni anticipé et les campagnes d’information et de prévention ont été jusqu’ici peu fructueuses. Par leur ampleur et leurs conséquences, les atteintes de l’audition constitueront, avant 2030, la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien, selon l’organisation mondiale de la santé. La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds. Il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitables par thérapie génique. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression de surdités génétiques. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif.

Bénéfices attendus

La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires ; elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds mais pas pour les déficits auditifs postnatales dont la presbyacousie. Cependant, il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitable par thérapie génique. De plus, il a récemment été mis en évidence l’existence de forme génétique de presbyacousie. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de certains vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression des surdités. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif. Si les résultats sont probants, ce projet pourrait poser les bases d’un développement clinique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tests auditifs au nombre de 1 à 4 avec un intervalle minimal d’au moins une semaine entre chaque tests. Le test complet correspond à une anesthésie fixe puis une mesure des amplitudes de la réponse auditive du tronc cérébral et suivie d’une mesure des produits de distorsion des otoémissions acoustiques. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. Des animaux seront soumis à des injections sur une semaine, 1 à 3 fois, par voie intrapéritonéale avec 100µL d'une solution de tamoxifène (une injection prendra quelques secondes). L’injection de vecteur de thérapie génique sera réalisée après l’injection du tamoxifène. Les animaux seront soumis à des injections de vecteur de thérapie génique qui sera réalisée une seule fois sous anesthésie gazeuse à l’Isoflurane L’ensemble de la chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les nuisances et effet indésirables attendus sur les animaux sont l’induction de la surdité (surdité congénitale ou acquise, profonde ou modérée, selon le modèle) et les suites de la chirurgie nécessaire à l’administration des vecteurs viraux dans la cochlée. Concernant l’induction de la surdité chez l’animal, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Nous ne nous attendons pas à ce que l’injection du tamoxifène puisse engendrer des effets secondaires. Nous nous attendons à ce que la chirurgie de la cochlée puisse entrainer des lésions et donc une baisse/perte d’audition de l’oreille injectée. La surdité potentielle étant unilatérale, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Concernant les suites chirurgicales, l’état général des souris sera régulièrement suivi après l’injection des vecteurs AAV afin de détecter les signes potentiels de souffrance ou d’inconfort (infection ou problème de cicatrisation du site d’injection, souriceau cyanosé ou délaissé par la mère, cachexie, expression faciale de souffrance (yeux plissés, oreilles couchées vers l’arrière), prostration, immobilité, poil non toiletté).

Devenir

Les animaux seront mis à mort car ne peuvent pas être réutilisés, replacés ou adoptés.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.

Réduction

Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 10%. Nous utilisons classiquement les tests de student, de Mann-Whitney, test du Xhi2, et ANOVA pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet. Nous avons établi des tests de criblage de capsides in vitro pour réduire le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire.

Raffinement

Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Un bâtonnet de coton sera ajouté dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification, ainsi qu’un igloo pour les femelles avec portée. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des animaux entre 8-21 jours après la naissance Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront surveillés tous les jours pendant une semaine après chirurgie puis deux fois par semaine minimum la semaine suivante pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans la grille d’évaluation fournie par la SBEA de l’Institut Pasteur.

Choix des espèces

Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de 10 jours après la naissance ; avant 8 jours après la naissance, le système auditif est immature, à 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, et à 30 jours après la naissance et au-delà, le système auditif est mature. En fonction des modèles de déficits auditifs (congénital ou induit), les animaux seront utilisés dès la naissance ou à l’âge adulte.

300 primates non-humains, ouistitis, macaques et singes vervets, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, puis transférés vivants vers d'autres laboratoires. Chez un fournisseur, chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie générale, jusqu'à deux heures, pour implanter des cathéters ou des dispositifs de télémétrie, avec douleur et inflammation à l'abdomen et aux membres et une mobilité réduite pendant sept jours. Le porteur présente cette préparation chirurgicale comme un "raffinement" bénéfique pour l'animal et le client, destiné à limiter les ponctions lors des études ultérieures. Les usages finaux, détaillés dans d'autres autorisations, ne figurent pas dans ce résumé.

Objectifs

La préparation des animaux chez le fournisseur en vue de l’utilisation chez les utilisateurs est une étape bénéfique pour l’animal et pour le client. Elle inclut l’équipement des animaux avec des dispositifs permettant de raffiner les études des utlisateurs. En effet, les dispositifs concernés permettront le suivi des paramètres physiologiques de manière non invasive ainsi que la réalisation d’administrations et/ou de prélèvements sanguins répétés en réduisant la douleur liée aux ponctions répétées.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de certaines études, le suivi des paramètres physiologiques (température, activité, ECG, pression artérielle…) est primordial non seulement en tant que variable de mesure mais également dans le cadre de l’application des points limites. L’implant de télémétrie permet de réaliser ce suivi de manière continue et non invasive sur un animal éveillé et libre de ses mouvements et représente ainsi un raffinement de l’étude. De la même manière, certaines études notament pharmacocinétiques peuvent nécessiter de nombreuses administrations ou prélèvements sanguins. L’implantation de cathéters à demeure avec chambre sous-cutanée permet de réaliser ces actes sur animal éveillé sans provoquer de douleur liée aux ponctions répétées. Ainsi, la fourniture de primates équipés permet de raffiner la réalisation d’études extérieures.

Procédures

Tous les animaux impliqués dans ce projet subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale pour l’implantation de matériel d’administration/prélèvement (durée maximum de la chirurgie: 2h) ou de monitoring des paramètres physiologiques (durée maxmimum de la chirugie 1h).

Impact sur les animaux

Stress dû à la contention et la capture, douleur et inflammation locale au niveau de l’abdomen liées à l’implantation du dispositif permettant de suivre les paramètres physiologiques de l’animal et douleur et inflammation locale au niveau des jambes liées à l’implantation des cathéters de prélèvement et d’injection. Durant 7 jours, l’animal peut présenter une réduction de la mobilité.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie après avis favorable d’un vétérinaire pour vérifier leur état de santé et autoriser le transfert des animaux chez le client réalisant l’étude.

Remplacement

Le primate est un modèle de choix pour l’étude de nombreuses pathologies, comme par exemple les fièvres hémorragiques ou encore le SIDA, mais également dans le cadre des études réglementaires de mise sur le marché de nouveaux candidats médicaments. Tous les projets des équipes partenaires dans lesquels les animaux issus du présent projet sont utilisés font l’objet d’une autre autorisation de projet où sont détaillées les raisons pour lesquelles l’utilisation des animaux et donc des primates non-humains ne peut pas être évitée.

Réduction

Le nombre d’animaux déclarés dans ce projet est seulement une estimation à la hausse mais dépendra de la demande. Notre expertise et nos compétences dans le domaine nous permettent de limiter les complications opératoires et donc le nombre d’animaux nécessaires. D'autre part, nous réutilisons des animaux issus de projets antérieurs.

Raffinement

Chaque chirurgie d’implantation est réalisée sous anesthésie générale et couverture antalgique appropriée et est supervisée par l’un des 3 vétérinaires du site. Ce projet ne nécessite pas l’isolement d’animaux, ils seront donc hébergés au minimum par paire. Un temps de récupération post-chirurgie de minimum 7 jours est laissé aux animaux avant tout transfert pendant lequel une surveillance accrue est mise en place pour vérifier l’absence de signes d’infection et de comportements anormaux évocateurs de douleur. Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires…), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises…). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal du site.

Choix des espèces

A ce jour, le primate est le modèle de choix pour de nombreuses études notament dans le domaine infectieux par exemple mais également dans le cadre des études réglementaires de mise sur le marché de nouveaux candidats médicaments. Le choix de l’espèce utilisée par les équipes partenaires dépend de leurs recherches et est dûment justifiée dans chaque autorisation de projet dont elles font l’objet. Animaux jeunes sevrés et adultes (soit entre 8 mois et 30 ans), dépendant des besoins des utilisateurs. Le choix du stade de développement des animaux utilisés par les équipes partenaires dépend de leurs recherches et est dûment justifié dans chaque autorisation de projet dont elles font l’objet. Nous apportons conseil et expertise au client pour un choix pertinent face à la question scientifique posée.

4 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Il s'agit d'élever et de faire se reproduire par fécondation in vitro une lignée porteuse d'une forme de nanisme, les femelles recevant des hormones de superovulation puis étant tuées pour prélever leurs ovocytes, les mâles étant tués pour leur sperme. Les animaux porteurs de la mutation expriment eux-mêmes un phénotype pathologique avant d'être sacrifiés. Le porteur affirme que le projet "ne peut pas se faire sans modèle animal" pour valider un futur traitement, et décrit le choix du rongeur par son faible coût de reproduction.

Objectifs

Le but de ce projet est de produire des lots par fécondation In Vitro (FIV), après maintien et superovulation d'un modèle murin de dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (lignée SEDc). la collagénopathie de type 2 la plus fréquente. Ces lots seront utilisés afin de développer un traitement contre cette maladie. La SEDc est une dysplasie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée phénotypiquement par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de la rétine et d’une perte d'audition. Cette pathologie est due à des mutations perte de fonction dans le gène du collagène de type 2.

Bénéfices attendus

Ce projet aura des bénéfices pour l’homme à plusieurs niveaux. Actuellement, il n’existe pas pour cette maladie de traitements qui restaurent une croissance osseuse et qui permette donc aux patients de grandir mais surtout qui élimine les complications dues à cette pathologie. Ce projet pourra donc offrir à long terme des solutions thérapeutiques pour soigner cette maladie. De plus, cette maladie étant encore peu connue, ce projet permettra à court terme de mieux comprendre sa physiopathologie grâce au modèle de souris malades.

Procédures

Les femelles seront injectées avec des hormones qui vont stimuler leurs production d’ovocytes. Ces femelles seront ensuite euthanasiées pour récupérer les ovocytes. Ils seront utilisés pour une FIV avec du sperme récolté à partir d'un mâle qu'il est nécessaire de mette à mort également.

Impact sur les animaux

Avant de réaliser les injections d'hormones et de sacrifier les animaux pour prélever les ovocytes et le sperme, les souris SEDc seront hébergés pendant une à deux semaines et pourront exprimés un phénotype plus ou moins modéré. Ensuite, les femelles de ce projet seront injectées avec des hormones puis seront euthanasiées afin de prélever les ovocytes qui serviront pour les FIV. Les mâles seront également sacrifiés pour prélever le sperme. Avant le prélèvement de sperme et d’ovocytes, une attention particulière sera apportée à chacun des animaux qui seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids selon une grille d’observation spécifique à ce projet.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés pour prélever les ovocytes et le sperme afin de réaliser des fécondations in vitro.

Remplacement

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de SEDc, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins finaux. Le nombre d’animaux est calculé selon les protocoles expérimentaux de manière à obtenir le minimum d’animaux par groupe permettant des résultats significatifs et homogènes. Des analyses statistiques ont pour cela été utilisées. De plus, et afin d'optimiser les rendements de la superovulation et des FIV, la dose optimale et l'âge des femelles ont préalablement étés définis pour chaque souche en effectuant des injections préliminaires dose-réponse et par expérience.

Raffinement

Les points limites sont observés pendant toute la durée du projet. Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modéle. Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant un enrichissement minimum (bâtons de bois et matériel de nidification).

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, relativement peu coûteux à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est largement bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de celui-ci un modèle de choix fiable pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats valables pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les demandes et les objectifs scientifiques du projet. Nous utiliserons pour ce projet des femelles âgées de minimum 3 semaines pour les donneuses d'ovocytes (idéalement de 3 à 6 semaines) et des mâles de plus de 10 semaines pour les donneurs de sperme.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent du lithium et diverses molécules par gavage, injection intrapéritonéale, croquettes enrichies ou minipompe implantée sous la peau, avec passages en cage à métabolisme et injection rétro-orbitaire, avant d'être tuées pour analyse des reins. Le projet cherche à comprendre la toxicité rénale du lithium, que le porteur qualifie de traitement "incontournable" du trouble bipolaire. Les atteintes possibles décrites vont de la soif intense à la douleur liée aux injections et aux implantations chirurgicales.

Objectifs

Le trouble bipolaire est une affection à la fois fréquente, touchant 1 à 4% de la population mondiale, et grave, puisque les accès maniaques et dépressifs engagent le pronostic vital en raison du risque suicidaire. Le traitement le plus efficace à ce jour est le Carbonate de Lithium. Cette efficacité incontestée est contrebalancée par des effets secondaires à long terme, et en particulier rénaux. Ceux-ci se manifestent d’abord par une incapacité à concentrer les urines et donc une soif intense, puis à plus long terme par une insuffisance rénale avec l'apparition de microkystes rénaux, pouvant évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. Le mécanisme impliquerait un type de cellules particulières du rein, les cellules principales du canal collecteur responsables de l'équilibre de l'eau et du sel, et donc du milieu intérieur, dans l'organisme. Les données de la littérature ont montré une prolifération de ces cellules suite à une exposition à doses thérapeutiques au lithium. Cette prolifération semble médiée par le GDF15, facteur de croissance précédemment connu du laboratoire pour son effet en situation d’acidose. Notre projet vise à déterminer in vitro (sur des cultures cellulaires, dont sphéroïdes 3D) et in vivo sur un modèle d’exposition à long terme (jusqu’à 6 mois) le rôle et les mécanismes de la prolifération de ces cellules dans la progression vers l’insuffisance rénale. L’objectif de ce projet est ainsi de mieux comprendre la toxicité rénale du lithium et de mettre en évidence des pistes thérapeutiques préventives et curatives sur un modèle expérimental avant le développement d’essais cliniques.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un projet original de recherche fondamentale dans le domaine de la physiopathologie. Il vise à élucider certains mécanismes qui sous-tendent la toxicité rénale d’un traitement incontournable de la maladie bipolaire et de proposer des traitements préventifs.

Procédures

Un groupe de 80 souris sera soumis à une mise en cage métabolique pendant une durée de 4heures, chez un animal vigile, à 15 jours, 1 mois, 3 mois et 6 mois du début de la procédure : soit 4 fois par souris. Ces mêmes souris seront soumises à une mesure de DFG : injection rétro-orbitaire de FITC-inuline sous anesthésie à l'isoflurane, puis prélèvements microcapillaires à la queue à 3, 7, 10, 15, 20, 40 et 60 minutes, qui seront réalisées à 1 mois, 3 mois et 6 mois, soit 3 fois par souris. Un groupe de 40 souris sera soumis à un gavage gastrique de mubritinib sur animal vigile quotidien pendant 4 semaines. Un groupe de 40 souris sera soumis à une injection intrapéritonéale de canertinib sur animal vigile quotidienne pendant 4 semaines. Enfin, un groupe de 80 souris sera soumis à une intervention chirurgicale consistant à la pose de minipompes osmotiques sous-cutanées sous anesthésie générale (réalisée par injection intrapéritonéale) : une pose par souris. Les minipompes seront laissées pendant une durée de 4 semaines. Enfin, 400 souris seront nourries par des croquettes enrichies en médicaments données au long cours aux humains (amiloride et lithium) sans autre intervention que le prélèvement d'urines par simple contention et la surveillance de la prise de boissons, d'aliments et du poids.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des interventions sont connus car déjà testés chez l'animal et utilisés chez l'homme. Le traitement par carbonate de lithium induit une augmentation de la consommation d'eau et de la diurèse ; le traitement par mubritinib peut être responsable d'un inconfort lié au gavage gastrique, il est par ailleurs bien toléré ; le traitement par canertinib peut entraîner du fait de sa voie d'administration des douleurs liées à l'injection intrapéritonéale, il est bien toléré par ailleurs. Le traitement par tolvaptan peut entraîner des douleurs liées à l'implantation sous-cutanée des minipompes. Il est responsable également d'une augmentation de la diurèse et d'une augmentation de la consommation d'eau. La mise en cages métaboliques peut entrainer un stress chez la souris. La mesure du débit de filtration glomérulaire peut entraîner des douleurs au point d'injection du produit.

Devenir

Les souris sont euthanasiées car les prélèvements et analyses sont nécessaires sur les tissus afin d'évaluer l'efficacité des traitements sur l'architecture des reins, la présence de microkystes et de fibrose, et ceci n'est pas possible avec le maintien en vie.

Remplacement

Le projet vise élucider des mécanismes responsables de l’homéostasie cellulaire du rein en réponse à des stimuli physiopathologiques. Ces stimuli sont transduits au niveau de différents tissus/organes en messages hormonaux, humoraux et/ou physiques qui sont perçus par le rein. La réponse rénale quant à elle intègre plusieurs types cellulaires, avec des interactions para et endocrines entre elles. L’analyse d’une telle complexité nécessite de travailler sur des organismes entiers.

Réduction

Pour toutes les procédures expérimentales qui seront mises en oeuvre, le nombre de souris par groupe sera de 10, avec un nombre total de 640 animaux. Ce chiffre correspond à la taille des effectifs établis grâce au calcul du nombre d'animaux nécessaires pour que les tests statistiques soient interprétables.

Raffinement

Afin de réduire au maximum la souffrance des animaux, nous prévoyons de mettre en place des critères d’interruption des procédures expérimentales basés sur des paramètres non invasifs représentatifs de l’évolution de la pathologie tels que la mesure de la variation du poids corporel (Perte de poids de plus de 10 % par rapport à la dernière pesée), la pression artérielle et la surveillance quotidienne du comportement des animaux (paralysie des membres postérieurs, epistaxis, animal prostré, ne bougeant plus). La procédure en cage métabolique concernant la plus faible proportion de souris possible, et sera réalisée après habituation des souris à la procédure sur une très courte période (6h). Enfin, pour limiter la douleur dans la procédure de mesure du débit de filtration glomérulaire (procédure 6), la sédation à l’isoflurane est privilégiée.

Choix des espèces

L’intérêt d’utiliser des souris pour cette procédure est que nous maîtrisons la transgénèse chez ces animaux, et que les modèles transgéniques sont déjà disponibles, sans nécessité de nouveaux élevages et croisement dans une autre espèce. Les expériences sont réalisées chez des souris adultes de 8 semaines pesant 25-30g au début de l’expérimentation. L’âge adulte est nécessaire pour que la néphrogénèse soit totalement terminée. Les animaux sont étudiés jeunes car une exposition longue (6 mois) est prévue dans un groupe d’étude.