Procédures légères

766 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie est maintenue plusieurs jours dans un air appauvri en oxygène pour reproduire une hypertension pulmonaire, d'autres reçoivent des injections répétées, avant une échographie cardiaque sous anesthésie. Le porteur décrit une gêne respiratoire qu'il classe modérée et renvoie les bénéfices, de futurs traitements plus efficaces, au long terme. Toutes sont tuées pour prélever les poumons et le cœur et mesurer l'inflammation et le remodelage du ventricule droit.

Objectifs

L’hypertension artérielle pulmonaire est une maladie rare et grave qui touche les vaisseaux sanguins des poumons. Ceux-ci se rétrécissent progressivement, ce qui augmente la pression sanguine dans les poumons et fatigue le cœur, pouvant conduire à une insuffisance cardiaque. Malgré les traitements actuels, cette maladie reste associée à une espérance de vie réduite. Des traitements récents ont montré des effets encourageants, mais leur mode d’action reste encore mal compris. Par ailleurs, l’inflammation semble jouer un rôle important dans l’apparition et l’aggravation de la maladie. Ce projet vise à mieux comprendre comment l’inflammation contribue aux lésions des vaisseaux pulmonaires et à déterminer comment de nouveaux traitements pourraient agir sur ces mécanismes. Pour cela, des modèles murins seront utilisés afin d’étudier le rôle de certaines voies biologiques identifiées comme importantes dans la maladie. Les objectifs sont : • mieux comprendre le rôle de l’inflammation dans la maladie ; • identifier les mécanismes biologiques impliqués dans l’atteinte des vaisseaux pulmonaires ; • évaluer l’effet de nouveaux traitements et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’inflammation contribue à l’apparition et à l’aggravation de l’hypertension artérielle pulmonaire, une maladie grave caractérisée par une altération progressive des vaisseaux sanguins des poumons et une surcharge du cœur droit. Les résultats attendus aideront à préciser le rôle de certaines cellules immunitaires présentes dans les poumons et leurs interactions avec les cellules des vaisseaux sanguins. L’étude des phases précoces et tardives de la maladie permettra d’identifier les mécanismes impliqués dans l’initiation de l’inflammation puis dans le remodelage des artères pulmonaires. Les bénéfices attendus sont multiples : • mieux comprendre les étapes clés menant au développement de la maladie ; • identifier des mécanismes biologiques pouvant servir de cibles thérapeutiques ; • repérer des indicateurs précoces utiles pour le diagnostic ou le suivi ; • contribuer au développement futur de traitements plus efficaces et personnalisés. À plus long terme, ces connaissances pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de cette maladie sévère.

Procédures

Dans ce projet, une partie des animaux sera maintenue dans un environnement appauvri en oxygène pendant 4 à 21 jours afin de reproduire certaines caractéristiques de la maladie étudiée. Selon les groupes expérimentaux, certains animaux recevront une ou plusieurs injections au cours de l’étude, d’autres recevront des administrations quotidiennes pendant une semaine, et certains recevront des traitements répétés sur plusieurs semaines. En fin d’étude, certains animaux feront l’objet d’une échographie cardiaque sous anesthésie de courte durée afin d’évaluer la fonction cardiaque.

Impact sur les animaux

L’exposition à un environnement appauvri en oxygène peut entraîner une adaptation progressive de l’organisme, se traduisant par une diminution d’activité et une gêne respiratoire modérée. Cette nuisance est classée comme modérée. Les manipulations répétées nécessaires aux injections ou aux administrations peuvent provoquer un stress bref lié à la contention ainsi qu’un inconfort transitoire au site d’administration. Ces effets sont classés comme légers. L’anesthésie de courte durée utilisée pour l’échographie peut entraîner un stress lors de l’induction gazeuse ; la nuisance associée est faible.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés conformément aux modalités décrites dans la demande, afin de permettre la collecte standardisée des organes nécessaires aux analyses. Les poumons seront prélevés afin de caractériser de manière précise l’impact des différentes interventions sur la réponse inflammatoire induite par l’hypoxie. Ces tissus permettront d’évaluer la composition et l’activation des populations immunitaires pulmonaires (cytométrie en flux, histologie, immunomarquages), d’analyser la polarisation macrophagique et d’étudier l’expression de marqueurs moléculaires associés aux voies inflammatoires. Le cœur sera également collecté afin de documenter le remodelage du ventricule droit dans un contexte d’hypertension pulmonaire. L’ensemble de ces analyses post-mortem est indispensable pour relier les mécanismes inflammatoires précoces aux altérations vasculaires et fonctionnelles observées, et pour définir avec précision l’effet biologique des interventions évaluées dans ce projet.

Remplacement

Ce projet s’appuie sur des résultats déjà obtenus à partir d’échantillons humains et d’études in vitro sur des cultures cellulaires, qui ont mis en évidence un rôle potentiel des macrophages de type 2 ainsi que des voies de signalisation dans l’inflammation pulmonaire et le remodelage vasculaire associés à l’HTAP. Ces approches in vitro ont permis de caractériser les altérations de polarisation macrophagique, les interactions précoces avec les cellules endothéliales et les effets de ces voies sur la réponse inflammatoire. Cependant, elles ne permettent pas de reproduire la dynamique spatio-temporelle complexe de l’HTAP, notamment l’évolution de l’inflammation (Jour 4), l’apparition progressive du remodelage vasculaire (Jour 21) et l’implication coordonnée de plusieurs populations cellulaires au sein du microenvironnement pulmonaire. Pour valider le rôle exact des macrophages de type 2 et de voies de signalisation dans ces processus, des modèles animaux restent indispensables. Le modèle d’hypoxie chronique chez la souris est un modèle préclinique largement validé, permettant de reproduire une HTAP modérée et réversible et d’étudier de manière intégrée les interactions entre macrophages, cellules vasculaires, cœur et poumons. Il constitue l’unique approche permettant d’évaluer l’impact réel de ces mécanismes dans un organisme entier, dans un contexte hémodynamique, vasculaire et immunitaire pertinent, et de distinguer les effets précoces de l’inflammation des altérations structurales responsables de l’HTAP.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité en s’appuyant sur des calculs de puissance statistique (GPower) réalisés à partir de nos données préliminaires et des valeurs de référence issues de la littérature sur le modèle d’hypoxie chronique. Les effectifs ont été déterminés pour obtenir une puissance suffisante sur les paramètres majeurs de l’HTAP (pression ventriculaire droite, remodelage vasculaire, infiltration inflammatoire), ce qui évite d’inclure un nombre d’animaux supérieur au nécessaire. Bien que les fonds génétiques distincts ne permettent pas de mutualiser les groupes témoins, chaque animal contribuera à plusieurs analyses complémentaires (hémodynamiques, histologiques et moléculaires), maximisant ainsi l’information obtenue par individu et limitant le recours à des cohortes additionnelles. De plus, les procédures J4 et J21 sont conçues pour analyser deux phases distinctes (inflammation précoce et remodelage vasculaire) au sein d’un même schéma expérimental, ce qui évite de multiplier les modèles. Les analyses en cytométrie, histologie et expression génique seront réalisées sur les mêmes prélèvements, permettant de regrouper les mesures et de réduire fortement le nombre d’animaux par expérience. Enfin, les données produites seront systématiquement exploitées pour les procédures connexes, afin d’éviter la redondance expérimentale et de limiter au strict nécessaire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec des matériaux adaptés tels que du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, leur permettant de réaliser des comportements naturels. Ils seront toujours hébergés en groupes pour éviter l’isolement, et une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début des procédures. Pour garantir leur bien-être, un score de points limites sera appliqué afin de surveiller de près leur état de santé et d'intervenir rapidement si nécessaire. De plus, l’utilisation de crème anesthésiante à la lidocaïne avant chaque injection sous-cutanée ou intra péritonéale permettra de réduire toute gêne potentielle associée aux administrations. Nous appliquerons également cette crème avant la réalisation des mesures hémodynamiques sur le site d’ouverture. L’ensemble des procédures sera réalisé dans le strict respect des principes éthiques, afin d’assurer des conditions optimales pour les animaux tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Les souris sont des modèles standards d’étude des maladies cardiovasculaires et de l’hypertension pulmonaire. Le modèle d’hypoxie chronique, bien qu’il ne reproduise qu’une partie des aspects de l’HTAP humaine, mime fidèlement l’inflammation pulmonaire précoce, la polarisation macrophagique, le remodelage vasculaire et les altérations hémodynamiques. Cette espèce offre un accès privilégié à des outils génétiques, permettant la manipulation ciblée de gènes impliqués dans les réponses immunitaires et de voies de signalisation, tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Afin de garantir la comparabilité des résultats avec les travaux publiés dans le domaine de l’hypertension artérielle pulmonaire expérimentale, des souris adultes jeunes (5 à 6 semaines d’âge, pesant environ 18–22 g) seront utilisées. À ce stade de développement, leur système immunitaire et cardiovasculaire est mature, ce qui permet d’évaluer de manière fiable la réponse inflammatoire, la polarisation macrophagique et le remodelage vasculaire induits par l’hypoxie chronique. L’utilisation de souris jeunes adultes assure également une homogénéité des effets des traitements expérimentaux, tout en limitant la variabilité liée à la croissance ou à l’âge avancé. Ce choix correspond aux standards internationaux pour les modèles murins d’HTAP et permet l’interprétation des résultats dans un cadre comparable à la littérature scientifique.

6 240 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. On leur administre des bactéries ou des molécules, puis on déclenche une colite, par un produit dans l'eau de boisson ou par voie rectale sous anesthésie, ce qui peut provoquer perte de poids, selles molles et parfois saignements. Le projet teste si les effets anti-inflammatoires d'une bactérie intestinale passent par un récepteur de l'immunité, piste évoquée pour la maladie de Crohn. Le porteur justifie l'effectif de plus de six mille souris par quinze ans d'expérience et par la répétition des expériences pour leur "robustesse".

Objectifs

La maladie de Crohn (MC), un des sous-types les plus courants de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), se caractérise par une inflammation chronique et récidivante du tractus gastro-intestinal. L'étiologie précise de la MC reste incertaine, mais l'hypothèse la plus largement admise implique une activation inappropriée du système immunitaire due à la présence d'un microbiote intestinal altéré chez un patient génétiquement prédisposé. En effet, des études génétiques ont révélé que de nombreux patients atteints de MC sont porteurs d’une mutation perte de fonction d’un récepteur de l’immunité innée. Celui-ci reconnait un composant de la paroi des bactéries. De plus, la MC est associée à une modification du microbiote intestinal, caractérisée par une diminution de certaines bactéries anti-inflammatoires. La diminution d’une espèce bactérienne en particulier est (i) l'un des signes les plus forts des altérations du microbiote associées à la MC et chez les patients atteints de MC avec atteinte iléale et (ii) un facteur pronostique suggéré pour la rechute et la réponse aux traitements. L'objectif du projet est donc d'évaluer si les effets anti-inflammatoires de cette espèce bactérienne dépendent de la reconnaissance de sa paroi par le récepteur de l’immunité en utilisant des modèles de colite induite chez la souris. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de l’espèce bactérienne et pourra permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur ces propriétés anti-inflammatoires.

Bénéfices attendus

Ce projet fait partie d’un programme de recherche complet et ciblé sur le rôle de l’interaction entre une bactérie et un récepteur de l’immunité dans la maladie de Crohn. En France, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) concernent aujourd’hui près de 300 000 personnes (données 2021). Ce projet multidisciplinaire intègre plusieurs facettes de l’immunité et de la microbiologie. Les études décrites dans le projet permettront d’améliorer notre compréhension des mécanismes délétères impliqués dans la maladie de Crohn tout en identifiant une nouvelle stratégie thérapeutique utilisable chez les patients atteints de maladie de Crohn.

Procédures

Les souris seront traitées avec des bactéries ou des molécules : i) Par voie orale à raison d’une administration quotidienne durant 10 jours sur animal vigile (moins de 10 secondes par animal) ; ii) Par injection unique sur animal vigile (moins de 10 secondes par animal). Les souris seront ensuite soumises à l’un des deux modèles de colites induites expérimentalement : i) Par ajout d’une molécule dans l’eau de boisson durant 7 jours suivi de 5 jours sous eau standard (prise volontaire des animaux) ; ii) Par administration unique par voie rectale d’une molécule sous anesthésie générale (5 minutes). Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraiches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état inflammatoire des souris, les animaux subiront un prélèvent de sang de faible volume sur animal vigile par simple contention par une personne formée avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris transgéniques utilisés ne présente pas de phénotype altéré. Néanmoins, ce modèle peut présenter une sensibilité accrue à la colite impliquant des adaptations (dose/durée) par rapport aux protocoles validés. Les bactéries et molécules à tester seront administrées par voie orale ou par injection pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. La répétition des administrations orales peut induire des irritations ou des microlésions. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables liée à l’inflammation intestinale : perte de poids, selles molles, déshydratation voir des saignements dans les cas les plus graves (rare). Dans un cas, la colite sera induite via une molécule dans l’eau de boisson. Ce changement dans l’eau peut induire une légère baisse transitoire de la consommation hydrique des animaux de courte durée. Dans l’autre cas, la colite sera induite par administration locale d’une molécule sous anesthésie. La principale contrainte sera alors les risques associés à une anesthésie générale : hypo-tension, hypo-thermie ou encore dans de rare cas un arrêt cardio-respiratoire. Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraiches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient pas induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons un prélèvement sanguin pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.

Remplacement

Nous avons réalisé de nombreuses expériences in vitro, suggérant toutes que les effets anti-inflammatoires de la bactérie sont dépendants du récepteur d’intérêt. Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. A l’heure actuelle, il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait indispensable.

Réduction

Ce projet impliquera un maximum de 6240 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Les productions d’animaux seront adaptées en fonction des expériences à mener et des capacités de traitement par les personnels concernés afin d’éviter toute surproduction. Les expériences seront menées de manière séquentielle pour permettre de réduire le nombre de conditions expérimentales en sélectionnant systématiquement les conditions de traitement les plus intéressantes avec des résultats significatifs en utilisant le moins d’animaux. Si cela est possible, nous mutualiserons les conditions contrôles permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux impliqués. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que si la puissance statistique n’est pas encore atteinte. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. La principale contrainte dans le cadre de ce projet est liée à la colite induite expérimentalement et aux signes cliniques qui y sont associés. Néanmoins, nous disposons d’une très grande expérience de ce type de modèle et assurons un suivi quotidien associé à une évaluation de la sévérité de la colite permettant une prise de décision immédiate en cas d’aggravation des symptômes. La colite dans ce projet est estimée à modérée compte-tenu des points limites mis en œuvre. De plus, les animaux sont hébergés dans des conditions exemptes d’organisme pathogène spécifique permettant de réduire également les risques d’inflammation supplémentaires. Pour les administrations, nous utilisons du matériel adapté (petite taille) afin de réduire aux maximum la contrainte. L’ensemble des actes sont parfaitement maitrisés et sont effectuées par un personnel formé et autorisé.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en nutrition, infectiologie et immunologie qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées afin de mettre au point des modèles de colite qui nous permettront par la suite de mieux comprendre les mécanismes d’action d’une bactérie intestinale anti-inflammatoire. Justification des stades : Les animaux seront traités entre 6 et 12 semaines de vie. Cet âge est couramment utilisé dans la littérature pour les modèles de colites, nous souhaitons utiliser des conditions qui permettent une reproductibilité et une comparaison avec les études précédemment publiées.

Rendues diabétiques, plus de 1 500 souris subissent une transplantation chirurgicale d'îlots pancréatiques, sur un total de 1 844 animaux utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Elles reçoivent aussi des injections quotidiennes et des prélèvements de sang hebdomadaires. Le projet cherche des cibles pour rendre les îlots plus résistants en vue d'une greffe. Le porteur affirme que la culture cellulaire "n'est pas appropriée" et que transplanter chez l'animal est "le seul moyen" d'étudier la fonction des cellules à long terme.

Objectifs

Certains récepteurs sont des modulateurs du métabolisme et de l'inflammation notamment des cellules du pancréas. Leurs actions ciblent la viabilité et de la fonction des cellules pancréatiques. Notre hypothèse est qu'en modulant leur activité respective dans les cellules du pancréas produisant l'insuline, on pourrait prévenir les processus inflammatoires qui se produisent lors du diabète de type 1 et entrainerait une sécrétion d'hormone défaillante. Leur possible modulation pourrait donc jouer un role majeur. Le projet sera mené dans deux établissements-utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les résultats escomptés sont l'identification de cibles spécifiques dans la création d'ilots pancréatiques résilients capables de survie et d'adaptation à long terme. De plus, il pourra montré l'intérêt de certaines molécules anti-diabètiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1/ des injections quotidiennes au maximum en respectant les volumes maximum (280 animaux en EU1 et 60 animaux dans EU2), 2/ ainsi qu'à des prélèvements sanguins hebdomadaires en respectant les volumes (1784 animaux dans EU 1) , 3/ une unique transplantation d'ilots pancréatiques pour certains animaux (1504 animaux au sein de EU 1).

Impact sur les animaux

Les nuisances induites dans ce projet seront de plusieurs types : Nous utiliserons des modèles de souris diabétiques (induits ou génétiques) qui créera un inconfort pour les animaux (palié par la gestion de leur environnement). Certains animaux subiront une transplantation de cellules qui sera faite par voie chirurgicale qui induit une ouverture des parois cutanée et musculaire qui engendrera une douleur modérée (paliée par traitements associés). Des traitements avec des molécules seront faits par injection intrapéritonéale (douleur légère très transitoire) ou intravasculaire sous anesthésie. Les molécules utilisées n'ont pas d'effets néfastes connus. Les virus utilisés sont sans impact direct sur le phénotype et bien-être murin. Les prélèvements sanguins faits à la queue lors notamment des tests au glucose engendreront une douleur légère paliée par les anti-douleurs locaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever les tissus et les étudier ensuite (histologie).

Remplacement

Le diabète est un maladie qui affecte tous les organes. Aussi les expériences de culture cellulaire et études ex vivo ne sont pas appropriées dans ce contexte. La nécessité de l'étude de la réponse auto-immune nécessite l'usage des animaux. A l"heure actuelle, il n'existe pas de méthode alternative à l'usage des animaux pour étudier la fonction des cellules au long court. Le seul moyen est de les transplanter chez l'animal.

Réduction

1844 animaux sont inclus dans ce protocole. Nous avons estimé un nombre moyen de 3 à 10 souris par groupe pour avoir des résulatsts statistiquement satisfaisants (confiance 95% et puissance 80%). Aprés étude, l'analyse statistique se fera par test Two way anova.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés en portoir ventilé, en cage de 5 maximum. Les animaux diabètiques seront changés plus régulièrement que les congénères sains. Ils seront traités avec soin avec visite quotidienne; enrichissement de l'environnement et traitement anti-douleur le cas échéant. Pour les animaux subissant une chirurgie, des granulés de nourriture seront disposés au sol, avec une portion de nourriture gélifiée pour une meilleure récupération post-opératoire. Le bien-être animal sera observé au quotidien et un arbre décisionnel permettra de guider le personnel quant à la démarche de soin pour éviter d'atteindre un point-limite non réversible. Les animaux immunodéficients seront hébergés dans des portoirs ventilés clos afin de préserver leur environnement. Le transport des naimaux d'un EU à l'autre se fera dans des cages spécifiques comportant de la litière, de l'eau gélifiée, des croquettes et de l'enrichissement (cocon et tunnel) dans un véhicule à température adéquate (22 +/_ 2 °C).

Choix des espèces

Nous disposons de l'ensemble des outils adaptés aux modèles "souris". De plus, sa petite taille permet un hébergement aisé. Pour ce projet, nous utiliserons des souris adultes (maturité sexuelle atteinte). Des souris avec une immunité affaiblie seront utilisées pour permettre la greffe de cellules humaines et ainsi éviter le rejet.

Tuées pour l'essentiel à l'issue, environ 224 d'entre elles réutilisées dans d'autres protocoles, 2 610 souris et rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Leur cornée est désensibilisée par application de capsaïcine, parfois doublée d'un grattage de l'épithélium, pour reproduire une atteinte des nerfs de l'œil pouvant mener à la cécité chez l'humain. Le projet teste des composés censés préserver ou restaurer la sensibilité de la cornée. Le porteur décrit l'application de capsaïcine comme douloureuse sur animal vigile et prévoit une anesthésie pendant l'induction.

Objectifs

Notre objectif est de mettre en place un modèle de dénervation cornéenne chimique chez le rongeur. La cornée possède une innervation abondante provenant du ganglion trijumeau qui est impliquée dans la régulation de la sensibilité cornéenne, la sécrétion des larmes, le réflexe de clignement des paupières, et la cicatrisation. Des dysfonctionnements de ces nerfs afférents peuvent survenir à la suite de dommages du ganglion trijumeau, d’herpes oculaire, de diabète ou d’intervention chirurgicale et peuvent entrainer une dénervation cornéenne partielle ou complète. Chez l’homme la maladie est rare mais elle conduit à une altération sévère de la cornée si elle n’est pas diagnostiquée rapidement avec un risque de cécité. Les premiers signes sont une perte de la sensibilité cornéenne : hypoesthésie ou anesthésie, puis des altérations de l’épithélium de la cornée, couche de cellules la plus externe. Le processus naturel de cicatrisation n’étant plus assuré correctement, ces altérations évoluent en ulcères plus ou moins profond, qui peuvent s'accompagner d’un envahissement anormal de néovaisseaux alors que la cornée est un tissu complètement transparent. La diminution des clignements de paupières et de la sécrétion de larmes amplifie le processus. La désensibilisation chimique permettra d’étudier la contribution des fibres afférentes à la trophicité de la cornée, et les conséquences sur la cicatrisation, mais aussi de tester des composés agissant sur la préservation des fibres nerveuses et la restauration de la sensibilité cornéenne.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est la mise au point de modèles expérimentaux robustes permettant d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques visant à préserver ou restaurer la sensibilité et l’intégrité cornéenne après une dénervation.

Procédures

L'induction de la dénervation se fera par application d'un composé issu d'un piment la capsaïcine, connu pour insensibiliser les fibres nerveuses. Cette intervention a lieu une fois en début de l'étude, ou selon le protocole, deux fois à un jour d'intervalle, avec une concentration plus faible de produit. Dans le cas où le but sera d'étudier le retard de cicatrisation, un grattage de l'épithélium cornéen sera également pratiqué le jour de l'induction. Les examens ophtalmologiques ne sont pas invasifs et sont réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie ou sur l’animal en clinique vétérinaire. Pour notre projet, ces examens se feront pour une partie sur animaux vigiles (lampe à fente, mesure de la sensibilité cornéenne, ou mesure de production de larme) 4 fois par semaine sur une semaine. Certains examens nécessitant l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ils ne dureront que quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par injection au niveau de l'œil, soit par administration orale, par injection sous cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale ou intramusculaire (pour les anesthésies chez le rat). Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (en moyenne 4 fois 8 fois). Les injections de produit au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont limitées, une à deux fois par semaine. Elles sont un peu plus longues (environ 5min) et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Si le traitement est administré par voie orale ou intrapéritonéale, il peut être au maximum quotidien, par voie intraveineuse : au maximum 3 fois par semaine, par voie sous-cutanée : au maximum de 2 fois par jours. La durée d’une étude est 1 semaine. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

L’administration de capsaïcine est douloureuse sur un animal vigile, mais dans le projet l’animal sera anesthésié pendant la phase d’induction, pendant environ 30 min, une analgésie sera mise en place. Après cette phase de douleur, la capsaïcine induit une insensibilisation prolongée des fibres nerveuses pendant laquelle l’animal ne ressentira pas de douleur. Des traitements à base de capsaïcine existent chez l’homme pour traiter la douleur des névralgies. Si l’étude inclut l’étape d’étude la cicatrisation cornéenne le grattage de l’épithélium cornéen se fera sous anesthésie et analgésie. Les examens et administrations nécessitent une contention brève, pouvant induire un stress ponctuel de quelques minutes. Des mesures spécifiques (habituation, manipulation douce, environnement calme) seront mises en place pour limiter cet impact. Les procédures plus invasives, telles que les injections péri-oculaires ou les examens nécessitant une immobilisation prolongée, seront réalisées sous anesthésie légère afin de garantir le confort de l’animal. Ces anesthésies peuvent occasionner une gêne transitoire mais ne présentent pas de risque significatif à long terme.

Devenir

À l’issue de la procédure expérimentale, tous les animaux ayant suivi l’intégralité du protocole seront euthanasiés de manière éthique et réglementée, pour réaliser des analyses ex vivo nécessaires à la validation des résultats (analyses histologiques, dosages biochimiques, études moléculaires, etc.). Cependant, les animaux n’ayant pas été inclus dans la totalité de la procédure — estimés à environ 10 %, hors exclusions liées aux points limites — pourront être réutilisés dans d’autres protocoles expérimentaux compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Ces animaux sont généralement exclus en raison d’un défaut anatomique ou physiologique détecté lors des examens de baseline, notamment au niveau de l’œil, avant le début de l’induction de la pathologie. Ces individus n’auront reçu ni induction de la kératopathie, ni administration de traitement, mais auront uniquement été soumis à des examens non invalidants, parfois réalisés sous anesthésie légère. Leur réutilisation, lorsqu’elle est possible, s’inscrit dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R, tout en garantissant le respect du bien-être animal et des exigences scientifiques.

Remplacement

L’œil est un organe sensoriel d’une grande complexité, composé de structures anatomiques et physiologiques très diverses (cornée, cristallin, rétine, nerf optique...), interagissant de manière dynamique avec leur environnement local et systémique. Il est soumis à des variations mécaniques, physicochimiques et biologiques constantes, qui influencent directement sa fonction et sa réponse aux traitements. Bien que des méthodes alternatives aient été développées ces dernières années, telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modélisations in silico, ces approches, bien qu’utiles, ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions fonctionnelles et pharmacocinétiques observées dans un œil vivant. En particulier, elles ne permettent pas de simuler de manière fiable les effets de la dénervation sensitive, les altérations de la cicatrisation cornéenne. Dans ce contexte, le recours à un modèle animal reste actuellement indispensable pour reproduire les conditions pathologiques de dénervation cornéenne, et étudier l’efficacité et la tolérance de nouvelles approches thérapeutiques dans un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques liés à l’expérimentation animale, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour permettre une analyse fiable et reproductible des résultats. Une analyse réalisée en amont de chaque série expérimentale, afin de déterminer l’effectif optimal nécessaire à la détection d’un effet significatif. Ce calcul permettra, le cas échéant, d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs stratégies seront mises en œuvre. L’utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie, telles que l’imagerie cornéenne en temps réel (microscopie confocale), permettra de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, évitant ainsi la nécessité de sacrifices à chaque point d’analyse. Lorsque cela est scientifiquement pertinent, les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, l’optimisation des protocoles expérimentaux (standardisation des conditions d’induction de la dénervation, contrôle rigoureux des paramètres environnementaux et biologiques) contribuera à limiter la variabilité interindividuelle et à maximiser la robustesse des résultats.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec accès libre à la nourriture et à l’eau (ad libitum) dans des cages incluant des abris et des objets à ronger. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. L’application de capsaïcine se fera sous anesthésie, et un traitement analgésique est prévu en complément. De même si le retard de cicatrisation de l’épithélium cornéen est envisagé, les animaux seront anesthésiés et une analgésie est prévue. Si l’immobilité est requise pour un examen (confocal) une anesthésié une anesthésie légère et courte pourra être administrée pour assurer le confort et limiter le stress. Après chaque anesthésie, les animaux seront sous environnement chauffant pour prévenir l’hypothermie. Une hydratation locale sera réalisée sur les cornées jusqu’au réveil afin d’éviter les complications oculaires. Les animaux seront ensuite replacés dans leur environnement habituel pour réduire le stress post-manipulation.

Choix des espèces

Les espèces sélectionnées pour ce projet, le rat et la souris, présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques bien documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, notamment dans le contexte des pathologies cornéennes avec altération des fibres nerveuse. Ces deux espèces sont couramment utilisées dans les modèles expérimentaux validés de dénervation cornéenne et de régénération nerveuse, et leur emploi repose sur une expérience étendue au sein de la communauté scientifique. Leur utilisation permet une grande flexibilité expérimentale, notamment en termes de suivi longitudinal, d’imagerie cornéenne et de quantification des marqueurs moléculaires. Les animaux utilisés dans ce projet seront des jeunes adultes, âgés d’au minimum 6 semaines pour les rats et d’environ 5 à 6 semaines pour les souris, correspondant à une maturité fonctionnelle et physiologique des structures cornéennes et nerveuses Ce stade de développement garantit une réponse cohérente aux protocoles d’induction de la pathologie, ainsi qu’une meilleure reproductibilité des résultats. Le choix de cette tranche d’âge permet également d’éviter les biais liés à la croissance ou à la sénescence, tout en assurant une bonne tolérance aux procédures expérimentales.

Pour étudier comment un récepteur plaquettaire favorise la formation de métastases, 668 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des injections, un prélèvement de sang et, pour une partie, une chirurgie de trois heures trente avec pose d'un cathéter et injection de cellules tumorales. Le porteur signale des saignements possibles liés aux molécules antiplaquettaires testées et une perte de poids due aux métastases. Le bénéfice espéré, un traitement réduisant les métastases, reste formulé au conditionnel.

Objectifs

Les plaquettes sanguines ont un rôle primordial dans l’arrêt des saignements. Elles sont également impliquées dans diverses pathologies, notamment la thrombose artérielle, les processus inflammatoires et les cancers. Il est connu que les plaquettes favorisent le développement de métastases. Malgré l’implication des plaquettes, les traitements anti-plaquettaires actuels ne peuvent pas être utilisés en clinique chez des patients présentant un cancer en raison du risque de saignement qui y est associé. Le récepteur plaquettaire GPIb assure l’interaction entre les plaquettes et le facteur Willebrand conduisant à l’arrêt du saignement. Il est également une cible antithrombotique connue de par son rôle important dans la croissance du caillot. Nous avons généré 2 agents ciblant ce récepteur et bloquant son interaction avec le facteur Willebrand. Leur effet sur la thrombose a préalablement été validé, tout comme l’absence d’induction de saignement. Il a été montré dans la littérature que la GPIb plaquettaire serait impliquée dans la formation de métastases. Dans ce projet, nous souhaitons étudier le rôle de la GPIb dans la formation de métastases afin d’identifier une nouvelle cible pour réduire les interactions plaquettes – cellules tumorales et potentiellement réduire le développement de métastases dans le cadre de cancers du poumon, du sein et de la peau.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont l’éventuelle observation d’une réduction de l’interaction des cellules tumorales avec les plaquettes lorsque le récepteur GPIb est inactif. Un effet attendu serait également une réduction de la formation des métastases. L’identification d’un tel effet pourrait mener au développement d’un nouveau traitement permettant de réduire la formation de métastases et donc mener à une meilleure prise en charge des patients atteints de cancer.

Procédures

Pour la première procédure, les animaux sont soumis à une injection sur animal vigile et une injection sur animal anesthésié (moins d’une minute chacune). Un prélèvement de sang sur animal anesthésié est réalisé (maximum 20 min). Pour la seconde procédure, les animaux sont soumis à une injection sur animal vigile et 3 injections sur animal anesthésié (moins d’une minute chacune). Un cathéter intraveineux est mis en place et une procédure chirurgicale est réalisée (maximum 3h30, observation au microscope comprises). AJOUT Pour la troisième procédure les animaux sont soumis à une injection sur animal vigile et une injection sur animal anesthésié (moins d’une minute chacune). Un prélèvement de sang sur animal anesthésié est réalisé (maximum 20 min).

Impact sur les animaux

Une des nuisances attendue est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). On pourra également observer une douleur localisée de courte durée après les injections. On pourra observer d’éventuels saignements dus à la nature antiplaquettaire des molécules injectées. Un gonflement au site d’injection pourra être observé. Une perte de poids, due à la formation de métastases, pourra également être observée.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux sont mis à mort car la quantité de sang prélevée n’est pas compatible avec un maintien en vie des animaux. De même, l’injection de cellules tumorales ne permet pas un maintien en vie des animaux pour réutilisation dans une procédure ultérieure.

Remplacement

Le processus de formation de métastases étant particulièrement complexe et faisant intervenir plusieurs types de cellules (plaquettes, globules blancs, cellules endothéliales, cellules tumorales etc), l’environnement de la tumeur ainsi que les conditions de flux sanguin (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. Nous disposons néamoins de modèles in vitro qui permettront d’étudier au préalable ce processus avec des plaquettes et des cellules tumorales humaines.

Réduction

Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum. Ces effectifs permettent l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Une habituation est prévue 5 jours avant le début de l’expérimentation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: •Par l’hébergement en groupes sociaux. •Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures. •Par l’injection d’antalgique et d’analgésiant aux site d’incisions et application d’anesthésique local sur l’oeil •Contre la déshydratation, une injection de sérum physiologique est réalisée avant la procédure. •Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant la procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles de cancer. Les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant un récepteur humain permettant d’étudier l’effet de nouveaux traitements ciblant ce récepteur. De même, cela a permis la génération de souris déficientes pour ce récepteur. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois pour toutes les procédures. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.