Procédures légères

Sectionnés d'un fragment de nageoire caudale pour le génotypage puis soumis à un prélèvement de sperme, 900 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. La lignée mutante créée sert à vérifier si l'inactivation d'un site de fixation d'un microARN réduit la fertilité, comme observé chez le médaka. La plupart sont tués après deux générations pour l'analyse des organes, 75 individus hétérozygotes étant réutilisés pour entretenir la lignée dans un autre projet. Le porteur reconnaît qu'une lignée déjà présente au laboratoire, où ce microARN est désactivé, ne montre aucun effet délétère, ce qui interroge l'ampleur des atteintes attendues ici.

Objectifs

Les microARN sont de petits régulateurs qui contrôlent l’expression de certains gènes seulement. Comme ils sont très conservés au cours de l’évolution, on pense que leurs gènes cibles le sont aussi. Dans les testicules, un microARN est fortement et spécifiquement exprimé. Quand on l’inactive chez le male médaka et la femelle zebrafish, on observe le même type de défaut de reproduction : moins de spermatozoïdes et moins fécondant. Chez le médaka, un des gènes responsables de la baisse de la capacité de reproduction du male a déjà été identifié comme cible de ce microARN. Le projet consiste à supprimer, chez le zebrafish, uniquement le site de fixation de ce microARN sur ce gène, pour empêcher leur interaction. Si les males mutants ont aussi une baisse la qualité et de la quantité spermatique, cela montrera que la cible du microARN est conservée au cours de l’évolution. En parallèle, des analyses d’histologie et de biologie moléculaire permettront de décrire plus finement les conséquences de cette mutation sur la reproduction.

Bénéfices attendus

Les miARN, dont celui de l'étude, sont très bien conservés au cours de l’évolution, et il est généralement admis que leurs cibles le sont également. Pourtant, à ce jour, aucun modèle expérimental n’a permis de démontrer clairement une conservation évolutive des cibles de ces microARN, ni une conservation des phénotypes associés à la régulation d’un miARN sur un gène cible. Dans notre cas, le miARN travaillé, chez le médaka et le zebrafish, un impact similaire sur les phénotypes de reproduction, la mise en évidence d’une conservation évolutive des phénotypes et de leurs cibles chez le zebrafish pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies d’étude des défauts de fertilité humaine.

Procédures

Ce projet concerne la création d'une lignée mutante. Pour valider une lignée mutante un génotypage par fin clip (section d'un fragment de nageoire caudale) sera réalisé sur des animaux anesthésiés. Cette procédure est très rapide : moins de 2 minutes par animal, anesthésie et récupération incluses. Les animaux de première génération seront isolés jusqu’à 8 jours maximum, le temps de recevoir les résultats de séquençage du prestataire. Afin d'identifier les poissons, ceux-ci resteront dans des bacs individuels à paroi transparente, permettant un contact visuel avec leurs congénères. Les animaux mutants et sauvages de troisième génération subiront un prélèvement de sperme sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système reproducteur, car ce microARN est surtout exprimé dans les gonades. Le gène cible sera modifié pour empêcher la fixation du microARN et donc sa régulation. Nous anticipons principalement une diminution de la fertilité. Dans une lignée déjà présente au laboratoire où le microARN est désactivé, aucun phénotype délétère n’a été observé, nous ne nous attendons donc pas à des effets graves. Cependant, chez le médaka, un blocage des pontes peut survenir (arrêt de ponte par manque de stimulation mâle), caractérisé par l’absence d’œufs et un gonflement abdominal de la femelle, d’où un suivi spécifique des femelles zébrafish. Le génotypage est invasif (petit fragment de nageoire) mais réalisé sous anesthésie pour minimiser les nuisances, pouvant causer une réduction temporaire de l’activité locomotrice. La récolte de sperme est bien maîtrisée et n’entraîne pas d’inconfort notable. Les anesthésies pour prélèvements peuvent modifier temporairement le comportement alimentaire le jour même.

Devenir

Ce projet vise à étudier le fonctionnement des capacités de reproduction après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes. De cette même génération 75 poissons hétérozygotes (c’est-à-dire présentant une version du gène altéré et une « normale ») seront réutilisés afin de faire un maintien de la lignée (procédure faisant l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet).

Remplacement

L’objet du projet est d’étudier le rôle précis de l’interaction entre un micro ARN et un gène sur la fonction ovarienne et les phénotypes de reproduction. À ce jour, aucune méthode ne permet de reproduire fidèlement la complexité de la régulation génique et des interactions cellule–cellule recourir à l’animal entier. Le poisson‑zèbre a été choisi car il s’agit d’un modèle vertébré bien établi en biologie du développement et de la reproduction, présentant un système de reproduction fonctionnel, une proximité avec le modèle médaka déjà étudié pour le microARN et des outils génétiques disponibles et maîtrisés.

Réduction

In fine, il s’agit de réaliser des prélèvements post-mortem sur au moins 12 individus mutants (animaux homozygotes pour la mutation obtenus en 2ème génération) et au moins 12 individus de génotype sauvage (non mutés) soit 48 animaux de 2 génotypes différents. Par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus fondateurs porteurs de mutations intéressantes. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygote en 1ère génération lorsque les individus fondateurs sont croisés avec des animaux de génotype sauvage. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes (+/-) de la 1ère génération produira une 2ème génération homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif de cette 2ème génération ). Nous produirons donc le nombre d’individus strictement nécessaires assurant la réalisation de l’analyse des testis d’au moins 24 animaux.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau,densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums de 10 litres avec la densité de 30 animaux maximum/aquarium. Le génotypage ainsi que la récolte de sperme se feront sous anesthésie. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à la mutation) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier).

Choix des espèces

Le poisson-zèbre est particulièrement pertinent pour ce projet car il appartient à la même famille phylogénétique que le médaka, un téléostéen, permettant de tester directement la conservation évolutive de l'interaction entre gène/inhibiteur d’expression et des phénotypes reproducteurs associés. Il présente un système reproducteur bien caractérisé avec des phénotypes de fertilité facilement mesurables (nombre d'œufs pondus, taux de fécondation, dynamique folliculaire). Les outils d'édition génomique y sont parfaitement maîtrisés et efficaces, il présente un fort taux de fécondité (200-300 œufs par ponte) et un développement rapide (maturité sexuelle à 3 mois), permettant une production rapide de lignées mutantes. Le testicule est accessible à l'analyse histologique et l’analyse de l’expression des gènes. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, les testicules permettant une étude au stade de maturité de développement de l’organe.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Nourries huit semaines d'un régime gras et sucré à des horaires décalés, elles passent des tests métaboliques et cognitifs, avec un prélèvement de sang derrière l'œil sous anesthésie locale. Le projet veut montrer qu'un désalignement des rythmes jour-nuit dérègle le métabolisme et la mémoire. Cette "preuve de concept" reste annoncée au conditionnel, quand les prélèvements et le régime imposé sont, eux, bien réels.

Objectifs

Les mammifères présentent un rythme circadien de 24 heures, permettant de synchroniser les fonctions biologiques aux variations environnementales, notamment l’alternance jour/nuit. Cette synchronisation repose sur l’interaction entre l’horloge centrale et les horloges périphériques, et est principalement régulée par la lumière. La régulation du métabolisme est fortement dépendante de cette coordination pour maintenir l’homéostasie énergétique. Cependant, la pollution lumineuse et/ou des rythmes alimentaires irréguliers peuvent perturber cette synchronisation, induisant un désalignement entre horloges centrale et périphériques. La lumière artificielle nocturne inhibe la sécrétion de mélatonine, perturbant le rythme veille/sommeil et les horloges métaboliques (foie, muscles). Ces désynchronisations augmentent le risque de troubles métaboliques, surtout lorsqu’elles sont combinées à une prise alimentaire durant la phase de repos. L’axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien (HHT), régulateur des hormones thyroïdiennes (HT), joue un rôle central dans le fonctionnement du cerveau, le métabolisme et les rythmes circadiens. Les HT influencent la neurogenèse, le métabolisme énergétique et interagissent avec les horloges biologiques. Leur production est essentielle pour maintenir la rythmicité des horloges métaboliques. Des dérèglements métaboliques peuvent entraîner une inflammation chronique favorisant la neuroinflammation. Celle-ci altère la plasticité neuronale, affecte les fonctions cognitives et augmente le risque de neurodégénérescence. La flexibilité métabolique apparaît comme un facteur clé de prévention des déséquilibres métaboliques. Elle dépend des horloges circadiennes, qui optimisent les processus métaboliques selon le cycle jour/nuit. La flexibilité métabolique pourrait être améliorée en synchronisant la prise alimentaire avec le rythme circadien naturel d’utilisation des nutriments. Ainsi, des approches comme le Time-Restricted Feeding (TRF), ou alimentation à horaires restreints, limitant la prise alimentaire à certaines plages horaires, ont montré des effets bénéfiques sur la régulation métabolique, bien que les mécanismes impliqués restent à élucider. Grâce au TRF, nous étudierons à l’aide d’une souche de souris sensible à l’obésité induite, les effets métaboliques, neuroinflammatoires et cognitifs d’une désynchronisation, ainsi que le potentiel de la resynchronisation alimentaire avec le cycle jour/nuit à restaurer l’équilibre métabolique et cognitif.

Bénéfices attendus

Notre projet pourrait apporter la preuve de concept des effets néfastes des perturbations circadiennes sur la régulation du métabolisme et de leurs conséquences sur la cognition. La désynchronisation devrait exacerber les perturbations métaboliques et promouvoir la prise de poids et une augmentation de la neuroinflammation, associée à une diminution de la neurogenèse, pouvant conduire à des altérations cognitives. Toutefois, ces effets devraient être réversibles grâce à la resynchronisation. Ces résultats devraient appuyer l’hypothèse selon laquelle les désalignements circadiens affectent à la fois le métabolisme et la santé cérébrale, augmentant les risques de vieillissement précoce et de neurodégénérescence.

Procédures

Les animaux ne seront soumis qu’à une seule procédure, qui sera constituée de 4 actes : - alimentation riche en gras et en sucre (45 % des calories apportées par la graisse et 17% des calories apportées par du sucrose) restreinte dans le temps (soit à volonté, soit durant le jour, soit durant la nuit) pendant 8 semaines - caractérisation métabolique : prise de poids hebdomadaire, test de tolérance au glucose avec mesure de la glycémie après gavage à partir d'une goutte de sang prise à la queue+prise de sang pour dosages hormonaux, mesure de composition corporelle par bioimpédance, mesure de la production de chaleur par caméra thermique - évaluation de capacités cognitives avec différents tests de comportements - prélèvement sanguin avant euthanasie

Impact sur les animaux

Les animaux ne devraient pas subir d’effets indésirables majeurs, le régime HFHS étant équivalent à une nourriture occidentale. On attend une prise de poids variable entre les individus, mais qui selon notre expérience ne devrait pas dépasser un gain de poids supérieur à 7% par rapport au poids initial.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de procéder aux prélèvements des différents tissus nécessaires à nos analyses.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer le recours aux animaux car les études physiologiques portant sur des influences métaboliques ne peuvent être réalisées que chez des animaux vivants, dans un système intégré. Par conséquent, l’impact du régime HFHS et de la synchronisation/désynchronisation de la prise alimentaire avec le cycle circadien de l’animal sur ses capacités cognitives ne sera observable qu’en réalisant des tests de mémoire sur animaux vivants. De même, nous ne pouvons pas mimer la flexibilité métabolique in vitro ou ex vivo, il est donc nécessaire d’utiliser l’animal entier.

Réduction

Dix animaux par groupe seront utilisés (6 pour les prélèvements de tissus et 4 pour les analyses immunohistochimiques), un nombre estimé à partir de nos expériences passées avec ce type d’analyses et qui est le minimum pour garantir une exploitation et une puissance statistique des résultats obtenus. Un nombre d'animaux plus faible serait dommageable dans l'exploitation de nos données et contribuerait à utiliser des animaux inutilement. Ainsi, nous évaluons le nombre d’animaux à 30 souris pour ce projet. Pour ne pas perdre en puissance statistique, l’analyse des résultats obtenus sera effectuée à l’aide d’un test non paramétrique avec permutation qui utilise une méthode de calcul exact avec une estimation par Monte Carlo

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (gel lidocaïne (gel ophtalmique à 2 %) pour anesthésie locale pendant la prise de sang en rétro-orbital). Les animaux disposent de nourriture selon le rythme décrit (mais leur permettant d’avoir l’apport calorique nécessaire sur 24h) et de l’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de nid en plastique. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de celles-ci grâce à une surveillance attentive (points limites, énoncés ci-après) et des soins adaptés. Même si nous n’attendons pas d’effets délétères marqués suite à notre procédure qui est légère, les indicateurs habituels comme la prostration, détectée par les animaliers ou par l’expérimentateur, l’absence d’alimentation (la diminution des quantités de nourriture disponible entre deux nourrissages est vérifiée par pesée), des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, grattement, léchage) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, agitation anormale ou hyperréactivité) seront particulièrement suivis. Dans le cas où un ou plusieurs des symptômes cités varient de manière significative, l’animal sera dans un premier temps sorti de la procédure, et/ou euthanasié dans les cas les plus extrêmes. Une bonne maîtrise de la procédure et un suivi assidu des groupes expérimentaux doit prémunir de la survenue d’incidents de ce type. Tout signe d'atteinte du système nerveux central (inclinaison de la tête, spasmes, convulsions, troubles de l'équilibre) entraînera systématiquement le retrait de l'animal de la procédure et son euthanasie.

Choix des espèces

Le modèle biologique choisi est la souris. Les connaissances accumulées par la communauté scientifique sur les souris, et particulièrement sur les C57Bl6/J dans les modèles d’obésité, ont permis d’identifier de nombreux mécanismes physiologiques impliqués dans le maintien de la balance énergétique et de valider des tests comportementaux permettant de mesurer les capacités mnésiques des souris. Tous les protocoles utilisés dans ce projet de recherche ont été optimisés et validés pour la souris, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. Nous utiliserons des animaux adultes (âgés de plus de 8 semaines au début de l’expérience), afin que les résultats ne soient pas faussés par la prise de poids induite par la croissance des animaux s’ils sont trop jeunes.

Soumis à la ligature d'une veine jugulaire et à une injection d'un candidat médicament sous anesthésie, 440 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance déclaré léger, sans réveil. Le test, dit de Wessler, cherche à voir si un caillot se forme dans un segment de veine isolé. Aucun animal n'est réveillé, tous sont tués en fin de test. Le porteur présente cette étude comme une étape réglementaire "indispensable" au dossier d'essai clinique de produits dérivés du sang.

Objectifs

Ce projet a pour objectif la réalisation d’études de pharmacologie de sécurité sur coagulation, en accord avec les Bonnes Pratiques de Laboratoire, et les directives des agences pharmaceutiques et médicales européennes. Grâce au test de thrombose veineuse (ou test de Wessler) les effets de candidats médicaments sur la coagulation sont évalués. La conduite de ces études conduira à la production d’un rapport, requis par la réglementation, qui fera partie intégrante de la demande d’essai clinique. Le test de Wessler est un modèle de test pharmacologie recommandé pour l’évaluation des risques de thromboses induits par des produits sanguins dérivés (comme les protéines du sang humain) ou ayant un effet sur la coagulation en imitant les stases ou lésions veineuses de thrombose similaire aux conditions cliniques humanisées de thrombose. Il permet de caractériser un effet anticoagulant (effet thérapeutique) ou un effet thrombotique (effets indésirables). Le principe de ce test consiste à détecter la formation ou non d’un caillot au niveau d’un sac veineux. La thrombose veineuse profonde est une maladie relativement fréquente et son incidence s'accroit avec l’âge pour atteindre un taux de 3 nouveaux cas par an et pour 1000 personnes chez les octogénaires. Le développement de médicaments doit donc prendre en compte ce risque. Le lapin est l’espèce régulièrement utilisée dans la littérature scientifique pour l'étude de nouveaux candidats médicaments sur la thrombose veineuse car sa coagulation sanguine est proche de celle de l’humain.

Bénéfices attendus

Avant la mise sur le marché d’un nouveau médicament, l’évaluation d’un risque de formation de caillots dans les vaisseaux sanguins (thrombus) est indispensable afin de vérifier que le xénobiotique n’a pas d’effet favorisant la formation de caillot sanguin. Ce modèle est utilisé essentiellement à des fins de recherche exploratoire et de développement préclinique, afin d’évaluer l’efficacité ou la sécurité des médicaments issus de produits sanguins dérivés.

Procédures

Les animaux peuvent être soumis à une prise de sang, vigile, de quelques minutes, pendant la phase préparatoire du test. Le test est ensuite réalisé sous anesthésie pendant environ 90 minutes, au cours desquelles une petite procédure chirurgicale est effectuée pour isolé les veines jugulaires et en ligaturer une, ainsi qu'une injection intraveineuse du candidat médicament. L'animal n'est pas réveillé en fin de test.

Impact sur les animaux

Le test de Wessler est une procédure relativement courte effectuée sous anesthésie et sans réveil. Un stress à l'induction de l'anesthésie, ainsi que les complications per anesthésiques (hémorragie, dépressions cardiorespiratoires) peuvent survenir, ainsi que des potentiels effets pharmacologiques du candidat médicament testé (formation d'un caillot, ou anticoagulation).

Devenir

Le test de Wessler est une procédure sans réveil : tous les animaux testés sont euthanasiés en fin de test, sans réveil (procédure n°1).

Remplacement

Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ce test. Un seul test in vitro est approuvé par une agence règlementaire américaine (FDA), et uniquement pour les dispositifs médicaux. Concernant les produits sanguins dérivés, seule l’utilisation de modèles animaux est acceptée dans le cadre d’études de pharmacologie de sécurité, en phase préclinique du développement de médicaments. Par rapport aux tests in vitro (ex : flow-loop, vein-on-chip) les modèles in vivo permettent de simuler une stase veineuse, d’évaluer l’impact systémique de l’administration et la circulation sanguin physiologique, et sont donc, pour le moment, les plus complets.

Réduction

Le test de Wessler est limité aux produits sanguins dérivés (comme les protéines du sang humain) ou aux candidats médicaments ayant un effet sur la coagulation. De plus, le nombre d’animaux par groupe est fixé au minimum permettant de garantir la fiabilité des données obtenues. Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données et la caractérisation correcte des effets sur la coagulation.

Raffinement

Les mesures de raffinement mis en place sont : Une période d’acclimatation de 7 jours. Un programme d’enrichissements validé par la SBEA est appliqué quotidiennement pour garantir des conditions de vie optimales/minimiser les impacts des expérimentations. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi SBEA. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux compatibles pour réduire le stress/le risque de blessures liés à un réallotement. Les animaux sont observés quotidiennement par un personnel formé pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. Les volumes prélevés/administrés respectent les recommandations vétérinaires. Un protocole d’anesthésie/analgésie est optimisé pour réduire douleur et stress (prémédication réduisant le stress de l’animal, anesthésie par un personnel formé avec analgésie, suivi vétérinaire si nécessaire) le temps du test.

Choix des espèces

Le lapin est un modèle animal couramment utilisé pour étudier la thrombose car : • Sa physiologie vasculaire et hémostatique est proche de celle de l’homme. • Il permet l’induction contrôlée de thrombose (chirurgie, agents pro-thrombotiques). Selon les guidelines pharmaceutiques internationales, les animaux doivent être jeunes et sains. Ils seront utilisés à partir de 10 semaines.

Pour produire des sérums de référence servant aux contrôles sanitaires des élevages, 100 poules et 30 dindes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles sont inoculées à deux reprises avec des mycoplasmes par voie trachéale, nasale ou veineuse, puis subissent des prises de sang chaque semaine jusqu'à six semaines. Toutes sont tuées, au plus tard au quarante-deuxième jour, pour récolter leur sang. Le porteur indique qu'une cinquantaine de poules fournit environ 500 mL de sérum, écoulés sur cinq ans par le laboratoire et des laboratoires d'analyses.

Objectifs

L'objectif du projet est de produire des sérums de poules ou de dindes positifs vis-à-vis de différentes espèces de mycoplasmes, afin de servir de contrôles positifs lors des contrôles sanitaires réglementaires des élevages de sélection et de reproduction de poules et de dindes (règlement UE 2016/429). Les mycoplasmoses aviaires figurent parmi les maladies infectieuses les plus fréquentes dans les élevages de poules et de dindes où elles sont à l'origine d'infections respiratoires, génitales ou articulaires. Les principales espèces pathogènes sont responsables de pertes économiques importantes dans les élevages dues à des retards de croissance, à l'augmentation des indices de consommation, à des saisies à l'abattoir, à une baisse de la production d'œufs, à des mortalités embryonnaires et aux traitements antibiotiques. Les mycoplasmoses aviaires dues à ces espèces pathogènes sont classées en catégorie DE par la nouvelle loi de Santé Animale : certification aux échanges (D) et déclaration obligatoire et surveillance (E). Cette surveillance est essentiellement effectuée via la sérologie et/ou des tests PCR, très peu par des techniques de bactériologie car les mycoplasmes sont des bactéries très difficiles à isoler et cultiver. La technique de dépistage la plus couramment utilisée par les laboratoires d'analyses est l'agglutination rapide sur lame car elle est très simple à mettre en oeuvre et peu coûteuse. Elle nécessite l'utilisation de sérums de référence pour valider les essais.

Bénéfices attendus

La production de sérums de poules ou de dindes positifs vis-à-vis des différentes espèces de mycoplasmes aviaires pathogènes permet de valider les contrôles sanitaires obligatoires réalisés dans les élevages de volaille et contribuer ainsi à améliorer le dépistage et à limiter la propagation de ces maladies contagieuses dans les élevages.

Procédures

Les animaux seront inoculés à deux reprises, à une semaine d'intervalle, par voies intra-trachéale et intranasale, ou intra-trachéale et intra-veineuse, en fonction de l'espèce de mycoplasme d'intérêt. Une prise de sang à la veine alaire sera effectuée toute les semaines (de J0 à J42 au maximum) afin de suivre leur réponse sérologique vis-à-vis de l'infection. Ces interventions (inoculations et prises de sang) seront réalisées sur animaux vigiles. Les durée d'interventions seront au maximum d'environ une minute pour les inoculations et d'une minute pour les prises de sang. La contention sera effectuée par un personnel de l'animalerie.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu de symptomatologie sévère lors de ces différents essais, les infections par les mycoplasmes n'entraînent généralement que peu ou pas de signes cliniques chez des poulets ou dindonneaux en absence de toute surinfection. Seuls quelques signes cliniques respiratoires (râles trachéaux, jetage nasal) pourraient être observés. Le stress et la douleur seront essentiellement générés par l’inoculation de la souche de mycoplasme et les prélèvements réalisés chaque semaine sur les animaux (prises de sang). seule une douleur très légère et fugace directement liée à l'acte de piqure est subie par l'animal : aucun protocole de médication particulière n'est prévu. Les personnels seront attentifs à toute anomalie éventuelle qui pourrait occasionner une baisse d'activité ou d'appétit des oiseaux, des signes d'inconfort (tassement, boiteries, blessures légères, position anormale,...) ou d'atteinte de l'état général (prostration, plumes ébouriffées, décubitus,...) ou d'autres signes cliniques.

Devenir

Les animaux seront mis à mort lorsqu'ils auront développé une réponse sérologique spécifique, et au plus tard à J42, pour récolter leur sang.

Remplacement

La production de sérums de référence est nécessaire pour la validation des contrôles sanitaires effectués dans les élevages. Cette production ne peut être réalisée que sur espèces cibles (poulets et dindes). Il n'existe pas de méthodes alternatives de production de sérums expérimentaux spécifiques.

Réduction

Le nombre d'animaux de chaque espèce et pour chaque infection expérimentale pour la production d'un sérum positif a été calculé afin d'obtenir une quantité suffisante de sérums permettant de répondre aux besoins du laboratoire et des laboratoires d'analyses vétérinaires pour une durée de 5 ans. Pour exemple, l’infection expérimentale de 50 poulets permet de récolter environ 500 mL de sérum positif, quantité quasiment intégralement utilisée par notre laboratoire et les laboratoires vétérinaires d’analyses en 5 ans.

Raffinement

L'expérience acquise au cours des différentes infections expérimentales réalisées auparavant au sein du laboratoire, notamment pour la production de sérums positifs au cours de ces 30 dernières années, permet de limiter le nombre d'interventions, Les prises de sang seront réalisées par des personnels expérimentés pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les animaux seront alimentés et abreuvés à volonté, et observés quotidiennement par des animaliers formés à l’expérimentation animale et qualifiés. L’ambiance d’hébergement est maîtrisée par ajustement de la température et de la lumière (intensité, plages d’éclairage) en fonction du stade physiologique des animaux. En cas de blessure (accident, picage), la plaie sera décontaminée par l'huile de cade, ce produit ayant un effet répulsif, évitant une aggravation de la plaie par picage. Si les animaux manifestent des signes cliniques graves et/ou des signes de souffrance (atteinte d’un point limite), ils seront sacrifiés, après concertation avec les personnes responsables de la mise en œuvre du projet.

Choix des espèces

La production des sérums de référence ne peut être réalisée que sur espèces cibles (poulets et dindes) pour valider les contrôles sanitaires. Les infections expérimentales sont effectuées sur des poulets d'au moins 3 semaines et des dindonneaux d'au moins 5 semaines. L'expérience du laboratoire acquise lors d'infections expérimentales antérieures a en effet montré que les animaux doivent être suffisamment âgés pour permettre le développement d’une réponse immunitaire vis-à-vis de l’infection.

Une partie des 144 souris utilisées est génétiquement modifiée pour supprimer un récepteur au froid, afin d'en tester le rôle. Toutes vont être exposées deux heures par jour à un champ électromagnétique de type 5G pendant six jours ou un mois, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le porteur cherche à savoir si ces ondes déclenchent des changements métaboliques proches d'un syndrome métabolique. Toutes sont tuées par prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie, puis leurs organes sont prélevés.

Objectifs

Depuis novembre 2020, des champs électromagnétiques (CEM) de type 5G sont émis. En France, 3 bandes sont utilisées, dont deux le sont déjà pour la 4G. En 2020, 54 000 sites d’émission étaient installés en France, soit 30 000 de plus qu’il y a 5 ans. L’extension de l’exposition à ces rayonnements pose la question des effets sanitaires, notamment chez les personnes qui se disent atteintes d’hypersensibilité électromagnétiques caractérisée par divers symptômes. Nous avons montré que des rongeurs exposés aux CEM développaient progressivement des épisodes d’augmentation de température corporelle similaires à ceux observés lors d’une activation de la thermogenèse via l’activation de récepteurs au froid. La détection du froid par les voies afférentes permet l’activation des récepteurs adrénergiques du tissu adipeux brun par la noradrénaline. De plus, la thermogenèse induit une lipolyse et est accompagné par une libération d’acides gras libres dans la circulation sanguine. Nous avons montré que l’augmentation de température corporelle de souris exposés aux CEM était accompagnée d’une augmentation des niveaux de noradrénaline et d’acides gras libres dans le sang. Au-delà d'une exposition de 6 jours aux CEM, l'activité de thermogenèse semble rester stable à un niveau élevé ce qui devrait déclencher des adaptations métaboliques. Pour preuve, nous avons reporté l'induction d'une protéine dans les adipocytes blancs qui activerait le phénomène de brunissement des adipocytes blancs. Dans l'ensemble, nos résultats soutiennent l'hypothèse selon laquelle les CEM déclenchent des changements métaboliques favorisant l'augmentation de l'activité thermogénique basale. Ce projet évaluera les effets des CEM de type 5G et 4G en s’appuyant sur les résultats observés précédemment après 6 jours d’exposition chez des souris mâles et femelles. Puis, nous évaluerons si une exposition de 6 jours ou d’un mois aux CEM peut induire des changements métaboliques dans le modèle murin. L’utilisation de souris KO pour un récepteur au froid permettra d’évaluer l’implication de ce récepteur dans ces changements. Les effets seront évalués chez des animaux mâles et femelles en utilisant la fréquence pour laquelle nous observerons le plus d’effet dans la précédente procédure. Au maximum, 144 souris seront étudiées réparties dans 24 groupes d’animaux.

Bénéfices attendus

Si nous trouvons que l'exposition aux CEM 5G induit effectivement des changements métaboliques similaires à ceux observés dans des pathologies comme le syndrome métabolique, un deuxième projet pourrait être mis en place afin de mesurer la synergie entre un régime hypercalorique associé ou non à une exposition aux CEM. Ce projet pourrait aider à estimer le rôle cofondateur de l'exposition aux CEM dans le développement d'un syndrome métabolique et de ses maladies cardiovasculaires associées comme l'hypertension et l'insuffisance cardiovasculaire. Le syndrome métabolique est une maladie courante, débilitante et en pleine expansion et devient un fardeau pour la santé publique dans les sociétés occidentales. A court terme, les résultats de ce projet, en collaboration avec des cliniciens, pourraient permettre de réaliser un essai clinique exploratoire dans le but de vérifier la signature moléculaire des CEM chez des patients atteints de syndromes métaboliques ou de diabète. Alternativement, un essai clinique pourrait être conçu afin de suivre l'activité métabolique des patients soumis à l'exposition quotidienne normale aux CEM par rapport à un groupe protégé de toute exposition. La signature moléculaire de l'exposition aux CEM pourrait être testée dans des échantillons de sang.

Procédures

Les animaux seront exposés à un champ électromagnétique 2h par jour (2 sessions d'une heure) pendant 6 jours ou 1 mois selon les groupes d'animaux. Les différentes mesures effectuées seront réalisées en utilisant des techniques non invasives (comportement alimentaire en pesant l'alimentation et température cutanée en utilisant une caméra infrarouge). Un seul prélèvement sanguin sera réalisé à la fin de la procédure sous anesthésie générale et après application d'un anesthésique local avant la mise à mort. Il faut moins d'une minute pour prélever le sang nécessaire avant l'arrêt cardiaque. Une fois l'animal déclaré mort, différents organes d'intérêt seront prélevés.

Impact sur les animaux

Dans le passé, nous avons exposé des rats et des souris à 900 MHz entre 1 et 5 semaines à la même intensité que ce projet afin d’étudier les effets sur différentes fonctions physiologiques. Durant l’exposition, aucun effet indésirable notable n’avait été observé (comportement, poids corporel, prise alimentaire). Toutefois, les animaux peuvent avoir du stress liés à l'exposition elle-même, aux manipulations par l'expérimentateur et à l'isolement pour mesurer individuellement la prise alimentaire.

Devenir

A l'issue des procédures 1 et 2, les animaux seront anesthésiés afin de réaliser un prélèvement sanguin intracardiaque qui induira la mort.

Remplacement

Les fonctions étudiées dans ce projet sont la thermorégulation et l'activation métabolique. Il existe des mannequins qui permettent d’étudier les échanges thermiques entre le corps et l’environnement mais il n’existe pas de modèle permettant d’étudier les modifications de la régulation thermique ainsi que l'adaptation métabolique en lien avec ces modifications. Les modèles in vitro ou in silico permettant de modéliser les modifications métaboliques mais ils ne peuvent reproduirent les adaptations métaboliques suite à une possible activation de la thermogenèse. De plus, pour étudier l'implication du récepteur au froid dans ces modifications, le modèle murin KO est le plus adapté pour comprendre les mécanismes impliqués et il permettra d'observer les adaptations sur l'organisme en entier. Actuellement, les modèles in vivo et in silico ne permettent pas d'intégrer toutes ces adaptations.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe par expérimentation a été déterminé pour obtenir d’éventuels effets avec des différences statistiques suffisamment robustes. Ainsi, nous utiliserons 6 animaux par groupe car lors d’une précédente étude, 4 animaux par groupe permettaient d’observer seulement une tendance à une diminution de la température de la queue sans atteindre le seuil de significativité alors qu’avec 6 animaux nous nous assurerons d’observer une éventuelle diminution significative de la température de la queue. Pour les analyses lipidomiques et transcriptomiques, 6 animaux par groupe sont suffisants pour obtenir des effets robustes statistiquement. Les données seront analysés statistiquement avec des logiciels adaptés.

Raffinement

Pour assurer le raffinement des animaux dans ce projet, ils seront quotidiennement observés selon des critères bien précis qui permettront de déterminer un score. Selon la valeur du score, une action sera réalisée pour soulager au maximum l’animal dans le cas où ce score est supérieur à 3. Si le score est inférieur à 3, cela signifiera que l'animal ne présente pas de souffrance et/ou douleur. Pour diminuer le stress lié à l’hébergement individuel, différents enrichissements (cylindres en carton et lanières de papier kraft) seront présents dans chaque cage. Un fond sonore sera également présent afin de couvrir d’éventuels bruits extérieurs, brefs et bruyants, sources de stress pour les animaux. Les paramètres physiologiques étudiés in vivo seront mesurés sans contrainte pour l’animal : la température cutanée de la queue sera mesurée avec une caméra infrarouge et la prise alimentaire par une balance reliée à la mangeoire.

Choix des espèces

Le modèle d’étude sera la souris pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à une contrainte. - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude des modifications transcriptomiques. - la souris est le modèle de prédilection pour obtenir des individus KO, ici pour le récepteur au froid TRPM8. Les animaux seront étudiés à l’âge adulte car la taille de la queue des jeunes ne permettra pas de mesurer la température cutanée avec la caméra thermique.

Exposées aux contaminants dès la vie intra-utérine à travers leur mère, 300 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Une partie subit une chirurgie de retrait des gonades avec pose d'un implant hormonal sous anesthésie, des injections répétées, puis des tests de comportement sexuel pouvant durer jusqu'à dix heures. Le projet évalue les effets d'un mélange de polluants du lait maternel sur la fertilité. 240 souris sont tuées pour des prélèvements et 60 mâles sont transférés vers d'autres projets de l'équipe.

Objectifs

Dans le cadre de la santé environnementale, l’un des défis actuels majeurs est l’évaluation de risque pour les mélanges de contaminants chimiques auxquels la faune et l’humain sont exposés au quotidien. Cette évaluation se fait encore actuellement substance par substance. L’équipe a récemment participé à l’élaboration d’une méthodologie visant à faire l’évaluation de mélanges de contaminants. Cette méthodologie a été appliquée à un mélange de substances identifiées pour les contaminants du lait maternel en France. Cette première évaluation théorique des risques combinés a suggéré un risque élevé pour les nourrissons, en particulier lié à des effets potentiels neuraux et neuroendocriniens. Ce projet s’inscrit dans le cadre de partenariats, un national et un Européen, aux expertises complémentaires et pluridisciplinaires, qui visent à produire les données expérimentales permettant d’établir et d'améliorer cette méthodologie pour l'évaluation des mélanges de polluants chimiques. Il s’agit de caractériser chez la souris les effets neuraux de l’exposition développementale, i) au mélange de polluants persistants identifié dans le lait maternel humain, et ii) au mélange de contaminants non persistants identifié dans des cohortes humaines. Ce travail combinera des approches complémentaires d’analyses comportementales, neuroendocrines, cellulaires et moléculaires.

Bénéfices attendus

Les données obtenues seront d'une grande pertinence car elles participeront à i) l'évaluation des effets potentiels sur la santé humaine de l'exposition aux cocktails de contaminants environnementaux, ii) l’identification des biomarqueurs pertinents de l’exposition, et iii) l’établissement et l’amélioration de l'approche théorique nouvellement développée pour l'évaluation générale des risques de mélanges de contaminants chimiques à des doses de l'ordre de l'exposition environnementale

Procédures

L’ensemble des souris subiront une exposition in utero (20 jours anténatal) et développemental (25 jours après la naissance) à deux mélanges de contaminants. Cette exposition se fait à travers la mère par prise spontané quotidienne d’une céréale exposée aux mélanges de contaminants. Une partie de ces animaux seront impliqués à l’âge adulte dans une unique chirurgie associée à une pose d’implant hormonal sous anesthésie générale d’une durée maximale de 30 minutes et avec une prise en charge analgésique pré et post-opératoire. Un lot de souris stimuli subira une deuxième chirurgie sous anesthésie générale afin de remplacer l’implant hormonal. De plus, les souris femelles vigiles subiront une injection (de l’ordre de la minute) répétés maximum 4 fois. L’ensemble des animaux de cette demande d’autorisation de projet seront impliqué dans des tests de comportements sexuels (durant entre 5 min et 10h en fonction du comportement reproducteur testé) permettant d’étudier les effets d’une exposition développementale à un mélange de contaminants chimiques environnementaux sur la fertilité. Enfin, l’euthanasie des animaux sera réalisée par différentes méthodes réglementaires.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, nous pratiquerons sur certains animaux une chirurgie sous anesthésie générale afin de retirer les gonades et insérer des implants d’hormones. De manière générale, cette chirurgie dure en moyenne 15 à 30 minutes. La chirurgie peut causer d’éventuels douleurs post-opératoires et des symptômes à court et à long terme liés à cette chirurgie qui seront prises en charge par l’expérimentateur. Les tests de comportement sexuel se font pendant la période d’activité des animaux, phase obscure, et sont filmés en lumière rouge afin d’interférer le moins possible avec le comportement des animaux. Il n’est pas prévu de nuisances ou d’effets indésirables de ces tests de comportement qui sont des comportements exprimés de manière spontanée chez la souris. Un léger inconfort peut être généré par la première introduction des souris dans les dispositifs liés aux tests comportementaux d’activité locomotrice et d’état d’anxiété. Les injections d’hormones chez les femelles avant chaque test de comportement peuvent générer une douleur légère au point de piqûre. De même, les injections d’anesthésiques et d’antalgiques au moment de l’euthanasie peuvent également générer une douleur légère au point de piqûre.

Devenir

240 souris seront euthanasiées à la fin des différentes procédures afin de réaliser des prélèvement et analyses post-mortem nécessaires à l’étude des effets reproducteurs et neuroendocrines d’une exposition developpementale à des mélanges de polluants chimiques. 60 souris utilisés pour tester les comportements de reproduction mâle seront réutilisés dans d’autres projets au sein de l’équipe de recherche.

Remplacement

L’évaluation pour la santé humaine des effets de l’exposition aux polluants chimiques dont les perturbateurs endocriniens repose sur l’utilisation des modèles rongeurs et la caractérisation dans ces modèles in vivo des effets, des modes d’action endocriniens et du lien entre l’effet et le mode d’action. Jusqu’à présent, ces critères ne peuvent être étudiés que dans ces modèles in vivo. En effet, l’étude de la fonction et du comportement de reproduction ne peut se faire que sur l’organisme entier. Une méthode alternative ne peut remplacer l’animal entier pour la définition des trois critères cités ci-dessus. Néanmoins, certains aspects de cette étude seront remplacés par de la modélisation mathématique et une approche in vitro de cultures des neurones générés par la technologie des cellules souches pluripotentes induites, comme décrit ci-dessous.

Réduction

Dans cette demande d’autorisation de projet, un total de 300 animaux (120 mâles et 180 femelles) seront impliqués. L’expertise scientifique de l’équipe et du porteur de projet permet de connaitre le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour des résultats fiables et consistants. Les effectifs utilisés ont été calculés à l'aide d'un calcul de puissance afin de garantir une analyse statistique significative le cas échéant, compte tenu de la variabilité interindividuelle. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les mêmes cohortes d’animaux pour les analyses neuroendocrinologiques et comportementales qui seront ensuite divisé en deux groupes pour les analyses moléculaires et cellulaires. De plus, l’utilisation des animaux servira seulement pour l’exposition au mélange complet, afin de caractériser les effets induits par le mélange, les modes d’action endocrinien et le lien entre les deux. La comparaison des effets de certaines substances seules à ceux des mélanges, ou la dissection de certains mécanismes moléculaires et cellulaires des polluants du mélange seront effectuées in vitro sur des cultures des neurones générés par la technologie des cellules souches pluripotentes induites. Pour finir, plusieurs zones du cerveau (hypothalamus, bulbe oflactif, amygdale médiane, etc…) seront collectées et stockées pour des études futures, les autres organes (sang, hypophyse, dents, squelette…) seront proposés aux membres et/ou collaborateurs de l’équipe.

Raffinement

Les animaux seront produits et hébergés dans une animalerie, sous la supervision des soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010-63-EU en termes d’espaces et d’environnement. Les souris seront soumises à un cycle de lumière-obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal sera placé dans la cage. Afin de minimiser les effets indésirables de la chirurgie tels que la douleur, l’apathie ou la léthargie, les animaux seront prises en charge avec des anti-inflammatoire et des opioïdes toutes les 24h pendant 3 jours suivants l’opération. Les nombreuses études réalisées pas l'équipe et précédemment publiées montrent que l'exposition directe ou indirecte à des contaminants chimiques à des doses faibles, proches de l'exposition environnementale humaine, ne génère aucune souffrance, douleur ou inconfort. Les souris sont surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement. De plus, une habituation à l'expérimentateur est pratiquée pendant au moins une semaine avant le début des tests comportementaux, afin d'éviter tout stress lié à la manipulation. Des points limites adaptés à la chirurgie et aux tests comportementaux auxquels sont soumis les animaux sont mis en place afin d’arrêter la procédure en cas de besoin.

Choix des espèces

La souris commerciale est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...), et de données dans la littérature permettant d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Dans le cadre de la problématique de la perturbation endocrinienne, l'équipe de recherche et le porteur de projet ont déjà effectué de nombreuses études par le passé dans ce domaine, qui servent de base pour les projets en cours. Les animaux rentreront dans les procédures expérimentales après sevrage, qui aura lieu entre le 21 ème et 25 ème jour postnatal. Les analyses se feront chez les juvéniles après sevrage et à l’âge adulte. Les stades juvéniles et adultes permettent de suivre ces animaux après la fin de l’exposition (effets à court terme) et à l’âge adulte (effets à long terme). Chaque souris sera identifiée soit par un tatouage aux doigts soit par encoche au niveau des oreilles au moment du sevrage.

Développés par un collaborateur industriel, des candidats vaccins contre les poxvirus sont testés sur 2 800 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit deux injections puis cinq prélèvements sanguins avant la mise à mort, qui sert à mesurer la réponse immunitaire par nécropsie. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternatives non-animales" et qu'un "organisme entier" au système immunitaire développé est requis. L'objectif reste de comparer jusqu'à quinze molécules antigéniques aux antigènes déjà présents dans les vaccins de Moderna et BioNtech.

Objectifs

L’objectif du projet est l’évaluation préclinique chez la souris de l’immunogénicité et de l’efficacité des différents candidats vaccins développés par un collaborateur. Les capacités de stimulation du système immunitaire seront aussi évaluées dans des modèles de souris afin de transposer l’efficacité potentielles en clinique. Ces objectifs sont justifiés du point de vue scientifique car ils permettent de démontrer la fonctionnalité des candidats vaccins contre un pathogène donné. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre des maladies infectieuses transmissibles, à risque pandémique, d’impact majeur en santé publique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer des molécules immunogènes à inclure dans de nouveaux vaccins contre les poxvirus. Actuellement, deux vaccins à sous-unités sont en cours d'essais cliniques, l'un développé par Moderna et l'autre par BioNtech. Les deux vaccins sont basés sur une combinaison de quatre antigènes dont un ne génère pas une réponse neutralisante optimale. Un composant important de ces mélanges, bien que l'antigène génère une forte réponse neutralisante contre le virus modèle des poxvirus, la réponse immunitaire ne semble pas neutraliser le virus de la variole du singe . En nous basant sur des études de la réponse humorale chez des patients vaccinés contre la variole, nous avons identifié des régions de ce composant qui génèrent des anticorps neutralisants contre virus de la variole du singe . Nous avons utilisé ces données structurelles pour concevoir des nouveaux antigènes basés sur ce composant et des nouveaux types d’antigènes qui, nous l'espérons, généreront une réponse cross-neutralisante contre les poxvirus. Nous cherchons à tester jusqu’à 15 molécules antigéniques pour développer de nouveaux vaccins contre des poxvirus pathogènes. Bien sûr, nous allons comparer l'efficacité de ces nouveaux antigènes par rapport aux cinq antigènes présents dans les vaccins développés par Moderna et BioNtech. Les candidats vaccins développés dans le laboratoire sont destinés à être évalués par la suite dans des essais cliniques. Leur évaluation préalable dans un modèle murin permet de démontrer leur efficacité et leur sûreté préclinique et de définir les doses et schémas vaccinaux. L’immuno-monitoring par les prélèvements sanguins et après la mise à mort lors des prélèvements de la nécropsie permettront d'établir si le prototype vaccinal permet une réponse anticorps et cellulaires à un pathogène donné. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs ou thérapeutiques contre les poxvirus pour lesquelles le besoin médical est avéré.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux injections à 3-4 semaines d’intervalles et de 5 prélèvements sanguins effectués à une semaine d’intervalle. Les injections come les prélèvements dureront quelques secondes.

Impact sur les animaux

Effets indésirables potentiels liés à l’administration de produits vaccinaux prophylactiques chez la souris : -Stress, douleur et inconfort légers de courte durée au moment des gestes d’injection et prélèvements -douleurs musculaires systémiques liées à l’inflammation de courte durée Les adjuvants utilisés sont des produits classiques connus et utilisés chez la souris couramment. Ils vont être appliqués avec de doses couramment utilisées. Le but est d’induire une réponse immunitaire au vaccin.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure, car elles ont reçu au moins une injection de candidats vaccins et ne peuvent donc pas être réutilisés.

Remplacement

Il n'existe pas d'alternatives non-animales dans le domaine de la recherche préclinique sur les vaccins. En absence de telles alternatives, l'utilisation d'animaux vivants dans les procédures expérimentales est prévue pour atteindre les objectifs du projet. L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins.

Réduction

Sur la base sur nos expériences antérieures, nous avons optimisé notre approche expérimentale afin de limiter autant que possible le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique de nos résultats. 1. Optimisation de la taille des cohortes : Nos calculs de puissance statistique ont été réalisés en amont par une analyse biostatistique afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs avec une puissance de 80% tout en évitant une surutilisation. 2. Maximisation des données obtenues par animal : nous utilisons des approches multimodales sur un même animal (humorale et cellulaire), ce qui permet d’exploiter pleinement chaque individu et d’éviter la nécessité de cohortes supplémentaires pour différentes analyses. 3. La standardisation de nos protocoles expérimentaux permet de minimiser la variabilité et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique. En combinant ces stratégies, nous nous engageons à minimiser le recours au modèle murin tout en garantissant la pertinence scientifique de nos travaux sur les vaccins.

Raffinement

Les manipulations telles que les injections ou les prélèvements sanguins entraînent une douleur passagère et légère, ne justifiant pas l’usage d’anesthésie ou d’analgésie. Après chaque prélèvement sanguin, nous injectons du sérum physiologique aux souris afin d'éviter toute déshydratation. Mais il est possible que les souris puissent mal supporter les substances injectées et elles peuvent montrer une réaction inflammatoire (gonflement présent après quelques jours, rougeur). Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse, comme les yeux mi- fermés, le poil hérissé, le dos vouté ou une absence de réaction à la manipulation, l'absence de toilettage ou elles se tiennent à l'écart du groupe. Dès que nous observons une de ces signes nous allons intervenir afin de limiter la souffrance : - éviter une inflammation locale à l’aide des massages et application de l’eau tiède régulièrement après l’injection - faciliter la consommation alimentaire dès l’apparition de signes d’affaiblissement en ajoutant un gel nutritif dans la cage - chauffés les animaux en cas d’hypothermie à l’aide de chaufferettes installés sous la cage - suivi de poids d’animaux Les protocoles seront régulièrement réévalués afin d’intégrer les améliorations possibles en matière de bien-être animal.

Choix des espèces

L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins car les réponses humorales et cellulaires chez le rongeur de petite taille comme la souris sont souvent de même nature et de même amplitude que les réponses humaines. Ainsi, en vaccinologie et immunothérapie préclinique, il est recommandé de commencer par un modèle préclinique murin, puis de valider l’immunogénicité chez les primates non humain, d’évaluer la toxicité chez d’autres modèles précliniques plus gros (rat, lapin, autres modèles de toxicité), avant de proposer une étude clinique chez l’homme. Les animaux doivent être adultes et matures au plan immunologique (au moins 6 semaines). Nous allons utiliser des souris âgées entre 8-12 semaines.