Procédures légères

Pour étudier le rôle du système immunitaire dans le mélanome, 200 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées. Chaque animal porte une tumeur implantée qui peut gêner ses déplacements, reçoit des applications cutanées après tonte et, pour une partie, des injections d'immunothérapie. Le porteur indique que les métastases se forment dans les ganglions et parfois les poumons, avec de possibles gênes respiratoires. Il mentionne des études parallèles sur des prélèvements de patients mais juge l'approche in vivo nécessaire pour cibler le système immunitaire.

Objectifs

Le mélanome est la forme la plus agressive des cancers de la peau. Malgré les progrès majeurs apportés par l'essor des immunothérapies, près d’un patient sur deux résiste encore aux traitements. Il demeure donc crucial de comprendre les mécanismes de résistance mis en place par les cellules cancéreuses et de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques. L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle du système immunitaire dans le développement du mélanome et la réponse au traitement par immunothérapie.

Bénéfices attendus

Le mélanome métastatique est le cancer de la peau le plus agressif. Malgré l’essor récent des immunothérapies dans le traitement du mélanome, des problèmes de résistance sont observés. Trouver de nouvelles cibles thérapeutiques permettrait d’ouvrir d’autres pistes de traitements qui pourraient également être testées plus tôt afin de prévenir le développement de métastases voire l’initiation tumorale.

Procédures

Dans la procédure 1, les animaux subiront une tonte sur le dos et auront une application locale (sur le dos) d'un traitement, sans contention. Le geste durera moins d'une minute. Dans la procédure 2, les animaux subiront également une tonte sur le dos et auront une application locale (sur le dos) de traitement, sans contention, qui durera moins d'une minute. Ils subiront aussi des injections intra-veineuses (3 injections espacées de 2 jours) d'immunothérapie. Le geste durera quelques minutes.

Impact sur les animaux

Dans la procédure 1, la tonte, bien que réalisée sans contention, leur génèrera du stress et l'application d'un traitement leur provoquera une légère sensation de froid. Les animaux auront aussi une tumeur localisée aléatoirement (souvent sur le dos), qui pourra les gêner leur déplacement et leur induire de la douleur. Dans la procédure 2, les animaux les injections intraveineuses d'immunothérapie pourront leur générer de la douleur. Dans le temps du protocole, les métastases se feront au niveau des ganglions inguinaux et parfois au niveau pulmonaire, ce qui pourra occasionner des gênes respiratoires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car ils ne rentreront pas dans une nouvelle procédure.

Remplacement

Des études parallèles sont menées sur des prélèvements tumoraux issus de patients. Cependant, les approches in vivo sont nécessaires pour étudier et cibler le système immunitaire, cela ne pouvant se faire sur des cellules en culture.

Réduction

Nous avons calculé statistiquement le nombre minimum de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience, les études déjà publiées utilisant ce modèle pour rendre nos résultats interprétables et reproductibles. Ce test a été validé pour le satisticien du comité d'éthique qui a évalué notre projet.

Raffinement

Nous avons évalué de manière précise et exhaustive les points de vigilance pour chaque procédure afin d'anticiper la souffrance de l'animal et proposer des actions spécifiques en fonction du degré de souffrance observé. Nous avons pris en considération plusieurs paramètres tels que l'état général, le développement tumoral, le suivi du poids. En fonction du niveau de souffrance observé, le suivi sera renforcé, allant jusqu'au suivi quotdien de l'animal avant la mise à mort. Des actions spécifiques seront prises en fonction du paramètre observé (application locale de solution cicatrisante pour des plaies, gel alimentaire appétant en cas de perte de poids, utilisation d'antalgique en cas d'immobilité). Nous avons essayé de raffiner au maximum les gestes expérimentaux de notre projet en évitant le plus possible les contentions et l'utilisation d'anesthésie.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études de mélanomagenèse car c'est un modèle proche de la pathologie humaine qui reproduit les caractéristiques histologiques. Nous disposons également d'outils, d'expérience et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris. Des souris mâles et femelles âgées de 8 semaines (âge standard l'étude du système immunitaire) seront utilisés.

Jusqu'à sept séances d'imagerie TEP sous anesthésie et une chirurgie cérébrale pour le modèle de Parkinson: 156 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue. Une partie sont des rats SHR qui développent une hypertension avec l'âge, atteignant cœur, reins et cerveau. L'objectif est de valider de nouveaux radiotraceurs cholinergiques en vue d'un transfert vers la clinique humaine. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'animal entier et conclut au caractère indispensable du recours au rat.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de développer et d’évaluer de nouveaux traceurs utilisés en imagerie médicale afin de mieux observer le fonctionnement du cerveau et du système cardiovasculaire. Ces traceurs, appelés ont été conçus par notre équipe et seront utilisés en imagerie TEP (tomographie par émission de positons), une technique permettant de visualiser l’activité de certains systèmes biologiques dans l’organisme. L’étude se concentre sur le système cholinergique, un système de communication entre les cellules nerveuses qui repose sur une molécule appelée acétylcholine. Ce système joue un rôle essentiel dans la mémoire, l’apprentissage, les mouvements et la régulation de la pression artérielle. Son dysfonctionnement est impliqué dans plusieurs maladies, comme la maladie de Parkinson, le trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH) et certaines maladies cardiovasculaires. Dans la maladie de Parkinson, un déséquilibre entre différents systèmes de communication du cerveau contribue aux troubles moteurs. Dans le TDAH, des anomalies du système cholinergique ont également été mises en évidence. Par ailleurs, ce système intervient dans la dilatation des vaisseaux sanguins et le contrôle de la tension artérielle ; lorsqu’il fonctionne mal, il peut favoriser l’hypertension. Un traceur existe déjà pour étudier ce système chez l’homme, mais il est aujourd’hui utilisé uniquement en recherche. Un des traceurs développés par notre équipe, présente de meilleures performances et a déjà fait l’objet de tests de sécurité montrant qu’il est non toxique, même à des doses très supérieures à celles utilisées en imagerie. L’un des objectifs du projet est donc de finaliser sa validation afin de permettre son utilisation chez les patients. En parallèle, un second traceur, a été mis au point pour étudier un autre élément clé du système cholinergique, situé cette fois au niveau des cellules nerveuses qui reçoivent le message. Ce traceur est plus performant que ceux actuellement disponibles. Grâce à ces deux outils complémentaires, le projet vise à mieux comprendre les dysfonctionnements du système cholinergique dans des modèles de la maladie de Parkinson et du TDAH, ainsi que leurs liens avec l’hypertension et les maladies cardiaques, afin d’améliorer à terme le diagnostic et la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider des radiotraceurs, afin d’améliorer la compréhension des pathologies cérébrales et cardiaques liées au système cholinergique. Le but du financement est de pouvoir finaliser le transfert vers la clinique. Dans un objectif de réduction et raffinement, nous utiliserons les mêmes animaux pour poursuivre la validation de notre nouveau radiotraceur, pour pouvoir le transférer également en clinique humaine. Ces traceurs permettront un diagnostic clinique plus précis ainsi que le suivi thérapeutique des pathologies associées aux altérations cholinergiques.

Procédures

Pour la chirurgie du modèle de maladie de Parkinson (MP), les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse d’environ 1 heure et recevront 2 injections (1 i.p. et 1 s.c.) de moins d’une minute chacune. Une partie des animaux auront deux séances d’imagerie TEP (environ 70-130 min/séance), réalisées avant et après la chirurgie, sous anesthésie gazeuse, avec une injection du traceur par voie i.v. (< 1min). Dans le modèle spontané de TDAH, les animaux auront au maximum 7 séances d’imagerie entre 6 et 14 semaines d’âge. Lors de la première séance, une injection i.p. (< 1 min) du traceur sera effectuée sous anesthésie gazeuse avant l’imagerie qui durera 30 min. Les imageries suivantes (traceur 1 et 2) se dérouleront également sous anesthésie, gazeuse avec une injection des traceur i.v. (< 1 min) en début d’acquisition. Chaque imagerie durera entre 60 à 120 minutes.

Impact sur les animaux

Pour tous les groupes, la manipulation/contention des animaux peut provoquer un léger stress, qui reste temporaire. Groupes 1, 2 et 3 : Après chirurgie, les animaux seront observés afin de vérifier l’absence de signes douloureux tels que : un changement de comportement, une agressivité inhabituelle, une diminution du toilettage, des difficultés à se déplacer, une perte de poids ou un état général affaibli. Groupes 2, 3, 4 et 5 : Après les examens d’imagerie, un petit hématome peut apparaître au niveau de la queue, à l’endroit où une veine a été utilisée pour l’injection. Cet effet est généralement léger et transitoire. Groupes 4 et 5 : Après certains examens d’imagerie, une gêne ou une légère douleur peut être ressentie au point d’injection pendant quelques minutes seulement. Groupe 4 (rats SHR) : Avec l’âge, ces rats développent naturellement une hypertension artérielle, qui peut affecter plusieurs organes comme le cœur, les reins et le cerveau, et s’accompagner de troubles métaboliques et cognitifs.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort et les organes seront prélevés pour des études in-vitro.

Remplacement

L'objectif du projet étant de développer des traceurs d'imagerie utilisables chez l'humain, aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'animal entier, étant donnée la complexité des processus mis en jeu telles que l'altération de la transmission cholinergique, les données pharmacocinétiques et de biodistribution et métabolisme multi-organes. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude du développement de nouveaux radiotraceurs d'imagerie.

Réduction

L’utilisation de techniques d’imagerie réalisées directement chez l’animal vivant permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’étude en utilisant le même animal pour mesurer plusieurs paramètres à différents âges. Malgré cette réduction, le nombre d’animaux par groupe reste déterminé par la nécessité d’obtenir des résultats fiables et suffisamment précis pour répondre correctement à la question scientifique étudiée. Le nombre d’animaux a été calculé à partir de résultats déjà publiés et de données précédemment obtenues au laboratoire. Ces calculs prennent en compte les différences naturelles entre les animaux ainsi que les effets attendus entre les groupes étudiés. Il a ainsi été estimé que 10 animaux par groupe pour le modèle de MP et 20 animaux par groupe pour le modèle de TDAH permet de détecter des différences d’environ 15 % entre les groupes, avec un haut niveau de fiabilité des résultats. Ce nombre offre également une marge de sécurité pour identifier des différences plus faibles ou faire face à une variabilité plus importante que prévue. Au total, cette étude utilisera 156 rats, répartis de manière équilibrée entre femelles et mâles. Parmi eux, certains seront utilisés pour l’apprentissage et la mise au point des techniques, tandis que d’autres feront partie des groupes expérimentaux, incluant des animaux présentant des atteintes ciblées dans différentes régions du cerveau, afin de comparer leurs effets.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des conditions, conformes aux normes en vigueur, avec un environnement enrichi (tunnels, bâton à ronger, papier absorbant, etc…) pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés au moins une semaine avant le début des expériences et surveillés quotidiennement. Toutes les mesures nécessaires seront mises en place pour limiter la douleur et l’inconfort (antalgiques). Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse, avec une surveillance continue de la température corporelle et de la respiration. Les examens d’imagerie réalisés à différents moments chez un même animal permettent de mieux comprendre les mécanismes étudiés tout en réduisant le nombre total d’animaux utilisés. Après chirurgie, un traitement antidouleur et un complément alimentaire seront systématiquement proposés. L’état des animaux sera évalué chaque jour. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce la plus adaptée pour cette étude en raison des similitudes entre son cerveau et le cerveau humain (circuits cholinergiques comparables entre les 2 espèces), ainsi qu’en raison de la taille de son cerveau qui est compatible avec la résolution spatiale de notre imageur. Les rats Wistar seront étudiés à l’âge adulte. Concernant les souches SHR et WKY, les animaux seront étudiés avant leur 8ème semaine de vie (avant apparition de l’hypertension) jusqu’à leur 14ème semaine de vie qui correspond aux premiers stades d’apparition de l’hypertension.

Société de services en études précliniques, l'établissement propose une offre de tests comportementaux qu'il veut étendre aux maladies du système nerveux central. 5 360 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, pour évaluer une vingtaine de candidats médicaments. Chaque animal peut subir jusqu'à cinq tests dont la nage forcée, une privation de nourriture, un isolement de 72 heures et l'implantation répétée de pompes osmotiques sous la peau. Le porteur mesure la résignation à l'immobilité dans la nage pour évaluer un état dépressif, et présente ces tests comme le cœur de son offre commerciale.

Objectifs

Notre établissement utilisateur est une société de services spécialisée dans les études précliniques qui fournit une offre variée de tests de comportement chez la souris. Nous souhaitons par ce projet pouvoir offrir notre expertise du comportement murin dans le domaine des maladies liées au système nerveux central (maladies neurodégénératives, maladies neurologiques ou psychiatriques ou troubles neuro-développementaux) à des acteurs scientifiques académiques ou privés. Les modèles développés dans notre société nous permettent d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur les fonctions cognitives, la mémoire, le comportement anxio-dépressif, l’activité motrice ainsi que la force motrice des animaux. Dans les pathologies telles que la maladie d’Alzheimer par exemple, on retrouve différents symptômes comme les troubles cognitifs et perte de mémoire mais également des symptômes anxieux et dépressifs. Notre objectif est donc ici de pouvoir proposer une gamme de tests comportementaux chez le rongeur permettant d’étudier l’effet d’un potentiel candidat médicament dans des maladies liées au système nerveux central. Selon la cible thérapeutique d’intérêt du candidat médicament et donc de ses propriétés pharmacologiques, il pourra être testé dans un ou plusieurs tests de comportement réalisés en routine dans notre EU afin de définir son efficacité thérapeutique dans un des domaines cités précédemment ainsi que ses potentiels effets secondaires. Le nombre estimé de candidats médicaments testés lors de ce projet est de 20.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de permettre l’avancée de potentiels candidats médicaments dans leur développement préclinique afin de développer et de rendre accessibles des nouveaux médicaments dans des pathologies touchant le système nerveux central et qui aujourd’hui ne possèdent pas de réel traitement ou des traitements ayant des effets limités avec beaucoup d’effets secondaires.

Procédures

Des administrations seront réalisées sur animaux vigiles (moins d’une minute, au maximum 90). Les fréquences d'administration dépendront des caractéristiques pharmacologiques des candidats médicaments. Un prélèvement sanguin sur animal anesthésié sera réalisé en fin d’étude d’une durée inférieure à 2 min avec un volume maximal de 0.5 ml. Les animaux seront soumis à un ou plusieurs tests de comportement (maximum 5 d’une durée de 5 min à 15 jours selon le test). Les animaux pourront être soumis à une implantation de pompe osmotique par voie sous-cutanée d’une durée de 5 minutes environ qui aura lieu au maximum 3 fois avec 2 semaines entre chaque renouvellement minimum. Selon le test comportemental, les animaux pourront être soumis à une privation de nourriture (inférieure à 24h une seule fois) ou à un isolement de 72h maximum une seule fois sur la durée de l'étude.

Impact sur les animaux

Les administrations d’un produit peuvent induire une légère douleur au site d’administration et un stress lié à la contention de l’animal. Les administrations répétées peuvent également induire des hématomes. L’implantation d’un dispositif de diffusion de candidat médicament en sous-cutané (à 3 reprises maximum au court d’une étude) implique la réalisation d’un acte chirurgical sous anesthésie générale précédée d’une analgésie de moins de 10 minutes. Les risques liés à ce type de procédure sont les suivants : douleur post-opératoire, œdème, inflammation ou hématome au point d’implantation, risque faible d’infection locale. Les tests de comportement utilisés dans ce projet peuvent induire un stress léger (ex : Test d’activité locomotrice) à modéré (ex : test de la nage forcée) de courte durée. Les animaux doivent être isolés durant une période de 72h avant le test d’hyperthermie induite par un stress. Durant les 24h qui précèdent le test d’alimentation supprimée par la nouveauté, les animaux sont soumis à une restriction alimentaire complète. L’administration de candidats médicaments peut entraîner des effets tels que l’hyperactivité, la sédation ou une myorelaxation. Les molécules administrées pour l’induction des modèles de pathologie peuvent induire des déficits de mémoire et/ou une hyperactivité.

Devenir

En fin d’étude, pour des analyses sérologiques, histologiques, moléculaires et immunohistochimiques, les animaux pourront soumis à différents types de prélèvements (organes) post mortem. L’ensemble des animaux arrivant au point limite avant la fin de l’étude comportementale sera mis à mort.

Remplacement

Le développement de candidats médicaments, en amont de l’utilisation de l’animal, est réalisé en plusieurs étapes : L’identification de la cible thérapeutique (pathologie), la compréhension des voies neurobiologiques de cette pathologie, la découverte de composés modulant la cible thérapeutique, l’optimisation de ces composés pour améliorer leur spécificité, leur profil pharmacocinétique et leur sécurité, leur validation fonctionnelle in vitro (cultures de neurones, organoïdes) et leur évaluation pharmacocinétique et toxicologique in vitro. Suite à ces étapes et en amont du présent projet, des études in vivo pourront également être réalisées ou sous-traitées par le donneur d’ordre afin de déterminer plus précisément leur pharmacocinétique et leur toxicité. L’ensemble de ces études permettent de choisir les doses dénuées de toxicité, ainsi que la voie et le temps d’administration qui seront optimaux pour notre projet. Ce projet consiste à évaluer différents comportements chez l’animal représentatifs de pathologies. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Selon notre expérience, les tests statistiques utilisés dans ce projet montre la nécessité d’un nombre d’animaux par groupe égal à 12 pour observer des effets significatifs des candidats médicament (p

Raffinement

Une période d’acclimatation de 6 jours minimum sera respectée avant d’inclure les animaux dans une étude. Autant que possible, les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Une stratégie d’enrichissement particulière sera mise en place pour les animaux isolés et les animaux stabulés durant plus d’un mois. Leur état général sera évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. Si un animal atteint un des critères prédéfinis dans notre grille de scoring à un moment donné de l'expérience, il sera immédiatement mis à mort. Lors de la chirurgie pour l’implantation de système de diffusion sous-cutanée, l’administration d’antidouleur sera réalisée afin de garantir l’analgésie. Une période de récupération minimale de 5 jours sera respectée avant le passage en test de comportement et, pour les tests de piscine de Morris ou de stress de nage forcée, la période nécessaire à la cicatrisation complète sera respectée (environ une semaine confirmée par avis vétérinaire). Les injections intrapéritonéales seront préférentiellement réalisées dans le quart inférieur gauche afin d’éviter le colon descendant situé dans le quart inférieur droit. Les administrations sous-cutanées seront réalisées sur 3 sites d’injection alternativement (entre les omoplates ou sur chacun des flancs latéraux). L’implantation d’un système de diffusion sous-cutané sera réalisée sous anesthésie générale précédée d‘une analgésie. Les animaux seront soumis à une habituation progressive à la contention et à l’instillation intranasale (suivie d’une récompense alimentaire) sur une durée de 3-4 semaines avant l’administration du candidat médicament. Après chaque séance dans la piscine de Morris et après le test de la nage forcée, les animaux sont placés dans une cage contenant un tissu sec sur tapis chauffant jusqu’à ce que l’animal soit sec. La résignation des animaux, mesurée par le temps d’immobilité, sert à évaluer un potentiel « état dépressif » ou un effet antidépresseur par exemple. Dans les deux cas, une vigilance particulière est apportée aux animaux pendant (avec des critères d’arrêt strict) et après le test. Des études in vitro et in vivo seront réalisées préalablement à ce projet pour définir les doses non toxiques, n’induisant pas de nuisances potentiellement invalidantes pour les animaux (nuisances supérieures à une hyper ou hypoactivité ou myorelaxation chez les animaux), qui seront utilisés dans notre projet.

Choix des espèces

Le choix des rongeurs se justifie par la richesse et la complexité de leur répertoire comportemental, qui permettent d’explorer de manière pertinente les fonctions motrices, cognitives et émotionnelles ciblées dans ce projet. Des espèces présentant un système nerveux central moins développé ne disposent pas d’une organisation neurobiologique ni d’expressions comportementales suffisamment élaborées pour répondre de façon fiable aux objectifs scientifiques poursuivis. De plus, la souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de transposer (par des modèles A partir de 5 semaines d’âge. Les pathologies étudiées peuvent toucher l’adolescent, l’adulte comme le sujet âgé.

Sept prélèvements de sang en trois semaines après une injection unique : 168 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet mesure la durée de vie dans le sang et la répartition dans les tissus d'anticorps thérapeutiques modifiés par ajout d'un sucre. Les souris sont tuées pour prélever sang et organes et y doser ces anticorps. Le porteur s'attend à ce que la modification ne change ni les propriétés ni la distribution, une hypothèse que l'expérience sur les souris doit confirmer avant toute étude d'efficacité.

Objectifs

Les anticorps thérapeutiques (mAb) représentent aujourd’hui des outils reconnus pour des multiples pathologies telles que le cancer, les maladies auto-immunes ou inflammatoires. Cependant ces traitements nécessitent encore des améliorations importantes pour augmenter leur efficacité et éviter ou limiter les effets secondaires indésirables. Le projet concerne une nouvelle technologie visant à améliorer le potentiel thérapeutique de l’ensemble des anticorps. Cette innovation est basée sur une modification spécifique des anticorps en ajoutant un composé, un sucre appelé AMFA . Des études préliminaires in vitro ont montré que l’addition des AMFA aux anticorps ne modifie pas la capacité de lier leur cible. Grâce à leur mécanisme d’action, les anticorps-AMFA ont une meilleure efficacité thérapeutique que les anticorps natifs. En revanche, bien que les anticorps-AMFA aient été conçus pour apporter un bénéfice sans causer une modification importante à la structure de l’anticorps, les expériences in vitro ne permettent pas de savoir si la modification par les AMFA aura un impact sur la durée de vie de l’anticorps dans le sang (pharmacocinétique) et si l’anticorps-AMFA sera accumulé dans les tissus (biodistribution) de la même façon que l’anticorps non modifié. Les trois anticorps qui ont montré une meilleure efficacité in vitro ont été sélectionnés pour être testés chez la souris.

Bénéfices attendus

L’objectif de notre technologie est d’améliorer des anticorps actuellement utilisés en traitement clinique. Dans ce projet, on s’attend à une conservation des propriétés et une distribution similaire dans les différents tissus des anticorps que nous avons modifiés. Par la suite, des études d’efficacité dans des modèles pertinents permettront de valider la preuve de concept de notre technologie

Procédures

Les animaux vigiles seront injectés une fois en début de procédure. Pour l’étude de pharmacocinétique, des prélèvements de sang seront réalisés (7 prélèvements de faible volume en 3 semaines).

Impact sur les animaux

Les anticorps étudiés dans ce projet seront administrés à des doses déjà utilisées dans des études publiées où l’absence d’effets secondaires chez la souris est démontrée. L’injection unique d’anticorps thérapeutiques à faible dose ne devrait pas provoquer d’effets secondaires ou de douleur et le niveau de sévérité est considéré comme léger. Pour les animaux de l'étude de pharmacocinétique il y aura des prélèvements répétés d’un faible volume de sang. Ce geste est considéré de sévérité légère, mais la répétition de prélèvements (7 fois en 3 semaines) pourrait causer une nuisance de sévérité modérée.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de prélever le sang et différents tissus pour réaliser des dosages biochimiques.

Remplacement

Les anticorps thérapeutiques sont des médicaments destinés à être administrés par voie intraveineuse chez l'homme. La durée de vie de l'anticorps et les quantités distribuées dans les tissus sont des paramètres importants pour l’efficacité thérapeutique du médicament et ces informations ne peuvent être collectées qu’en suivant le comportement et le devenir de l’anticorps après son administration dans un organisme vivant complexe tel que la souris, qui est utilisée couramment pour ce type d’étude.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significatifs, une recherche bibliographique pertinente a été réalisée afin de baser les tests statistiques de manière sérieuse pour chaque mAb. Pour les études de pharmacocinétique, le nombre d’animaux par groupe (n=8) a été choisi en accord avec des études publiées et à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique, de façon à pouvoir détecter une éventuelle différence de plus de 10% entre l’anticorps natif et l’anticorps-AMFA correspondant. Pour les études de biodistribution, le nombre d’animaux par groupe (n=8) a été obtenu en accord avec des études publiées et à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés qui seront utilisés pour évaluer les différences significatives entre les deux courbes de pharmacocinétique et pour comparer la concentration des anticorps dans les tissus des groupes CTR, mAb et mAb-AMFA.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions d’hébergements réglementaires, avec un milieu enrichi et seront placés par 4 par cage afin de stimuler les contacts sociaux entre eux. Aussi, les animaux seront manipulés quotidiennement dès leur arrivée pour limiter le stress des animaux lors de l’expérimentation. Aucune douleur n’est attendue à la suite de l’injection des anticorps. Les animaux seront quotidiennement surveillés selon une fiche de suivi clinique standard. Si des signes de douleur de l’animal sont perçus, les animaux seront sortis de l’étude.

Choix des espèces

Pour ce projet nous avons choisi d’employer des souris BALB/c qui sont couramment utilisées dans des études de pharmacocinétique et bio-distribution des anticorps thérapeutiques. Les animaux utilisés dans l’étude seront âgés de 10 à 12 semaines, c’est-à-dire un stade adulte pour que leur système immunitaire soit à maturité et la réponse métabolique optimale.

18 225 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la quasi-totalité et modéré pour 360 d'entre elles, toutes tuées à l'issue. Les animaux d'intérêt subissent une biopsie de la queue, une injection et une castration chirurgicale de quinze minutes, suivie d'une perte de poids liée à la chute des androgènes. Le projet teste le rôle d'un gène dans la récidive du cancer de la prostate après castration, sur des mâles génétiquement modifiés. La majorité de cet effectif n'est jamais utilisée dans une procédure, souris au mauvais génotype et femelles étant écartées de l'étude puis tuées faute de pouvoir être réutilisées.

Objectifs

Le cancer de la prostate est la troisième cause de mortalité par cancer chez l’homme. Dès lors que le cancer est invasif, la castration chimique (déprivation en hormones masculines) est mise en place pour ralentir efficacement le cancer, mais dans 100% des cas, la tumeur récidive, menant au décès du patient. Une population cellulaire a été identifiée chez la souris comme candidate dans cette récidive tumorale. Plus particulièrement, ces cellules sont amplifiées dans des souris génétiquement modifiées et résistent à la castration. Un gène identifié, pourrait être un acteur majeur contrôlant les capacités tumorales de ces cellules. L’objectif est donc de tester cette hypothèse du rôle important de ce gène en obtenant une lignée de souris qui présente une extinction de son expression de manière tissu spécifique (dans les cellules de la prostate). Dans un deuxième temps, cette lignée sera croisée avec deux lignées de souris présentant un état de la prostate pré-tumorale ou tumorale et l’absence du gène sera étudié en présence ou en absence d’androgènes.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra alors d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à éliminer l’apparition et/ou l’agressivité de ces cellules responsables, stratégies qui seront basées sur l’inhibition de la protéine ou de protéines majeures dont l’expression est contrôlée par ce gène. Une telle stratégie serait alors additive à la castration chimique, permettant au moins de diminuer/retarder l’agressivité de la récidive tumorale.

Procédures

Biopsie – 1 ( 1 seconde) ; Injection intrapéritonéale – 1 (quelques secondes) ; Chirurgie – 1 (15 min).

Impact sur les animaux

Biopsie de queue : Douleur légère et rapide (une seconde). Injection par voie intrapéritonéale : Stresse et douleur légère et rapide (quelques secondes). Acte chirurgical (15 min) réalisé sous anesthésie et analgésie qui peut occasionner une hypothermie, une déshydratation et l’asséchement des yeux. Suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir modérément et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection. Perte de poids de 10% suite à la chirurgie en raison du baisse des androgènes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, soit parce qu’ils n’auront pas le bon génotype, soit parce qu’il ne pourront pas être utilisés dans cette étude (femelles), soit car ils auront participé aux procédures. En effet, l'étude ne se fera que dans la prostate, seul organe que nous analyserons, nos animaux d'intérêt ne seront donc que des mâles. De ce fait les femelles ne peuvent être utilisées mis à part pour les accouplements pour générer les animaux d'intérêt. Les femelles restantes ne peuvent replacées ou réutilisé car leur génotype spécifique à notre modèle ne le permet pas.

Remplacement

Dans un premier temps des études in silico (étude bio-informatique) et in vitro (cellule en culture) ont été menées pour montrer le rôle joué par le gène que nous visons dans nos cellules responsales de la récidive. Cela a été démontré par différentes approches, incluant les cultures cellulaires selon le principe de Remplacement. Toutefois, pour démontrer définitivement le rôle de ce gène, il faudrait utiliser des modèles animaux. Aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire comme chez la souris l’évolution de l’état physiologique et pathologique (pré-tumoral et tumoral) de la prostate au cours du développement post-natal et suite à la castration à l’âge adulte (mimant le traitement des patients atteint d’un cancer agressif de la prostate).

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculés selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour réaliser au mieux ces expériences. En outre, les croisements ont été optimisés pour produire les animaux d’intérêt. Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et lorsque cela est nécessaire une grille de score adaptée sera mise en place et rempli de manière hebdomadaire. Chaque expérimentation est soumise à des points-limites de gravité variable qui conduisent à une décision immédiate ou différée, qui peut inclure, le renforcement de la surveillance des animaux, l'augmentation de l'enrichissement et/ou à la mise à mort. Les biopsies de queue sont effectuées à un âge adapté. Les injections sont effectuées avec des aiguilles adaptées. Les animaux sont mis sous anesthésie et analgésie lors des chirurgies. L’hypothermie sera évitée grâce à un tapis chauffant. Pour éviter le dessèchement des yeux, un gel sera appliqué et 500µl de sérum physiologique chauffé à 38°C sont déposés dans le péritoine avant la suture pour éviter une déshydratation de l’animal. Une pulvérisation d’antiseptique sera faite sur la cicatrice à la fin de la chirurgie et sera renouvelée 24h après et plus si nécessaire.

Choix des espèces

La souris permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques proche de l’homme. Ici elles présentent un état pré-tumoral et tumoral similaire à ce qui est observé chez l’homme. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale permettant l’étude de phénotypes plus ou moins complexes en étudiant de nombreux paramètres. Ne disposant pas de données préalables sur les conséquences de la délétion du gène, il faudrait évaluer ses effets à différents temps (1 semaine, 3 semaines, 1, 3, 6, 9, 12 et 18 mois), afin d’en cerner l’évolution, en particulier autour de la période estimée de délétion complète (6 à 9 mois).Pour les castrations, il faut attendre que les souris aient développé un phénotype tumoral ou pré-tumoral pour faire cette étude, c’est-à-dire chez des souris âgées de 6 à 8 mois.