Procédures légères
Potentiel thérapeutique d’agonistes dans les déficits en ocytocine
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Opérées deux heures pour l'implantation d'un détecteur d'activité neuronale, ou tuées par ponction cardiaque sous anesthésie terminale, 4 828 souris vont être utilisées dans ce projet. 2 556 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 2 272 un niveau léger, toutes tuées pour des analyses ex vivo. L'objectif est de vérifier si l'activation d'une protéine restaure la sécrétion d'ocytocine chez des modèles murins d'autisme et de myopathie de Duchenne, jusqu'à sept tests de comportement et de force étant pratiqués par animal. Le porteur décrit ces tests comme des situations "soit non anxiogènes ou très peu", et fonde l'effectif de 4 828 animaux sur sa seule expérience du domaine.
Objectifs
De multiples maladies cérébrales sont associées à un déficit d’ocytocine (OT) et de vasopressine (VP), une neurohormone importante dans nos capacités d’interactions sociales et dans les comportements anxieux. Ceci concerne notamment des maladies neurodéveloppementales très différentes telles que le trouble du spectre de l’autisme (TSA) et les déficiences intellectuelles. Une possibilité intéressante émerge de nos données : améliorer la sécrétion endogène d'OT et/ou de VP cérébrale pour favoriser une libération physiologiquement appropriée. En effet , il a été démontré qu'une protéine joue un rôle majeur dans la libération d'OT et de VP par les neurones. Ainsi, le but de ce projet est de fournir la preuve de concept que cette protéine peut être pharmacologiquement ciblé pour restaurer les niveaux de ces neuropeptides dans des conditions pathologiques pour lesquelles elle sontt déficientes : le TSA, la myopathie de Duchenne (DMD) et la corticothérapie.
Bénéfices attendus
Les essais cliniques portant sur l’efficacité de l’administration exogène d’OT ne montrent pas de bénéfice à long-terme. Ce revers incite à une réévaluation de l'approche de supplémentation pour proposer des stratégies alternatives : augmenter la sécrétion endogène d'OT du cerveau pour obtenir une libération physiologiquement appropriée de ce neuropeptide. Cependant, cette quête est confrontée au défi important d'une compréhension insuffisante des mécanismes contrôlant la sécrétion d'OT. Notre étude permettra ainsi d’évaluer l'efficacité de l’activation de cette protéine comme stratégie thérapeutique de correction des sécrétions endogène d'OT mais également de VP dans des modèles murins de pathologies distinctes : TSA et DMD. Nous proposons en outre de tester si cette stratégie thérapeutique peut être efficace pour atténuer les effets secondaires associés à la corticothérapie dans la DMD. La corticothérapie étant utilisée dans de multiples maladies cérébrales associées à une neuroinflammation (par exemple, la sclérose en plaques, les lésions cérébrales périnatales, la neuroinflammation induite par le stress et la dégénérescence), nos résultats ont le potentiel d'avoir un impact thérapeutique élevé sur un certain nombre de conditions pathologiques.
Procédures
Une perfusion intracardiaque sous anesthésie sera réalisée sur les animaux pour un prélèvement du cerveau afin de réaliser une étude d'immunomarquage sur le cerveau ainsi fixé. La durée de cette procédure est de 30 minutes. Des souris seront sujettes à une intervention chirurgicale sous anesthésie pour analyser les variations cérébrales d'ocytocine et de vasopressine. La durée de cette procédure est d'une heure. Des souris seront également sujettes à une intervention chirurgicale d'une durée de deux heures visant à l'implantation d'un détecteur d'activité neuronale. Finalement, des animaux subiront une ponction cardiaque sous anesthésie afin de pouvoir mesurer l'ocytocine et la vasopressine plasmatique. Certain animaux subiront une série de tests comportementaux qui sera réalisée une seule fois après 5 semaines de traitement. Les tests d'une durée de 5 à 15 minutes seront réalisés une seule fois (un seul essai) avec des délais entre tests de 24h. Il y aura au maximun pour une souris 5 tests pour l'analyse comportementale et 2 tests pour l'évaluation de la force soit 7 tests maximun.
Impact sur les animaux
La contention ainsi que l’injection d’analgésique et d’anesthésique peuvent engendrer un stress chez l’animal. Certains animaux seront soumis à une chirurgie sous-anesthésie. Les animaux impliqués dans les tests d'évaluations comportementales sont dans des situations soit non anxiogènes ou très peu, n’impliquant pas de stress ou inconfort majeur. Finalement, des animaux subiront une ponction cardiaque sous anesthésie profonde et terminale sans réveil.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour l'analyses de parametres physiologiques ex vivo.
Remplacement
Le but du projet est d'étudier le potentiel thérapeutique de molécules dans la sécrétion de neurohormones qui regissent de nombreuses fonctions physiologiques et comportementales et dont la dérégulation est impliqué en dans de nombreuses maladies neurodéveloppementales. Dans ce contexte il est necessaire d'utiliser des animaux et un tissu nerveux intact afin de comprendre les mécanismes qui régulent les fonctions patho-physiologiques et comportementales liés à ces neurohormones hypothalamique. Effectuer cette étude sur un système in vitro aboutirait à une étude de processus non-physiologiques et ne serait donc pas pertinent.
Réduction
Pour réduire autant que possible le nombre d'animaux nécessaires, le nombre de souris total nécessaire utilisé pour chacune des stratégies correspond à notre expérience dans le domaine pour assurer la validité statistique des résultats.
Raffinement
Pour toute chirurgie, les animaux recevront les doses nécessaires d’anesthésiques, analgésiques et antalgiques en pré- et postopératoire. Les jours suivant l'opération chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés tous les jours par l'expérimentateur et/ou les animaliers (avec une fiche post-opératoire pour chaque animal), et recevront si besoin un analgésique. Une grille de score avec des points limites précoces pour évaluer le bien être des souris sera utilisée. Pendant la période de repos, aucune manipulation expérimentale n’est entreprise.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère dont le système nerveux central présente de nombreuses analogies avec les mammifères supérieur (dont l'humain). La grande maitrise des méthodes d'élevages, des conditions de bien-être animal et la haute standardisation des lignées en fait un organisme de choix pour une étude physiologique des interactions neurogliales. De plus, la modification génétique indispensable à la réalisation de ce projet est seulement disponible chez la souris. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 6 semaines, âge auquel les souris peuvent être traitées 5 semaines et être étudier à l’âge adulte (3 mois). Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 2 à 3 mois, âge auquel, la plupart des expériences décrites dans la littérature ont été réalisées. A ce stade de 2 mois, les animaux ont un cerveau qui a fini son développement et les animaux présentent un comportement d’adulte.
Evaluation de l’effet d’un additif anti-méthanogène sur les émissions de méthane, les rejets d’azote, les performances de productions et la digestibilité de la ration chez le jeune bovin en engraissement
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
40 jeunes bovins vont être utilisés pendant huit à dix mois, 24 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 16 dans un niveau léger. Trois séries de prélèvements comprennent 18 mL de sang à la veine caudale, une fouille rectale et 400 mL de jus de rumen recueillis par sonde gastro-œsophagienne, geste qui peut irriter l'œsophage. Quinze jours à l'attache en stalle complètent la mesure de digestibilité. L'additif testé doit réduire les émissions de méthane entérique, et les 24 animaux du volet digestibilité sont abattus pour que leur carcasse soit évaluée, les 16 autres vendus sur pied. Le porteur indique avoir déjà mené les tests in vitro sur la fermentation du rumen et revendique un "besoin" d'animaux expérimentaux pour confirmer les effets in vivo.
Objectifs
L'objectif de cette expérimentation, menée chez le jeune bovin engraissé avec des régimes à base d’ensilage d’herbe, est de mesurer les émissions de méthane entérique, les performances zootechniques (in vivo et à l’abattoir), la digestibilité de la ration, la partition de l'azote alimentaire, ainsi que les modifications du métabolisme protéique et de la structure du microbiote ruminal induites par la supplémentation de la ration avec un additif anti-méthanogène. Un objectif secondaire consistera à confirmer ou identifier des proxies plasmatiques, urinaires, fécaux et ruminaux permettant de prédire les émissions de méthane, la digestibilité de la ration et les rejets d'azote urinaire chez le bovin engraissé.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de confirmer l'effet anti-méthanogène de l'additif, d'identifier les mécanismes d'action de l'additif sur le microbiote ruminal et d'évaluer les effets secondaires de cet additif sur la digestion, les rejets d'azote, le métabolisme, les performances et la qualité de la carcasse de l'hôte. L’ambition est d'implémenter des bases de données incluant des données phénotypiques de bovins, tels que l'émission de méthane entérique, la digestibilité de la ration, et les rejets d'azote, ainsi que des prédicteurs de ces phénotypes d'intérêt zootechnique (microbiens, analyse fécale (spir), abondance naturelle isotopique, métabolites sanguins) difficiles à mesurer en pratique avec des méthodes de réference.
Procédures
Durant les 8-10 mois de l'expérimentation, 3 prélèvements de sang, de fécès et de jus de rumen auront lieu en début, milieu et fin de période. Le volume de sang prélevé au niveau de la veine caudale sera à chaque fois de 18 mL. La prise de sang durera moins de 3 minutes. La collecte de fécès sera de 500g et se fera en quelques secondes lors de la déféquation de l'animal. Le prélèvement de jus de rumen d'un volume de 400 mL sera réalisé en 3 minutes par prélèvement gastro-oesophagien. La fréquence des prélèvements exclue tout type de complications liée à la récupération des animaux. La phase de digestibilité durera 15 jours (5 jours d'habituation à l'environnement et 10 jours de mesures).
Impact sur les animaux
Différents prélèvements (collecte de jus de rumen, fécès, sang) sont prévus pour caractériser la réponse physiologique, métabolique et digestive des bovins allaitants. Le prélèvement de jus de rumen sera réalisé par prélèvement gastro-oesophagien (PGO) et pourrait engendrer une légère iritation de l'oesophage. La prise de sang sera effectuée à la veine caudale et les de prélèvements de fèces par fouille rectale. Ces prélèvements seront réalisés en cage de contention et sont susceptibles d'induire de l'inconfort (léger à modéré) pendant la manipulation. La fréquence des prélèvements des 3 matrices (fécès, sang et jus de rumen) sera limitée au minimum nécessaire à savoir en début, milieu et fin d'expérimentation pour mesurer une cinétique d'action du produit. Au total, les animaux seront prélevés 3 fois pendant l'essai qui durera entre 8 et 10 mois. La contention de l'animal pour ces 3 prélèvements durera 10 minutes maximum. Concernant la digestibilité, les animaux seront à l'attache durant 15 jours dont 5 jours d'habituation. (cf préconisations consortium Eu-smartcow)
Devenir
A l'issue de cette expérimentation, les 16 animaux de la procédure 1 seront vendus sur pieds. Les 24 autres animaux (ceux ayant participé à la procédure 2) seront abbatus car leur carcasse sera évaluée pour l'étude des performances zootechniques à l'abbatoir.
Remplacement
La réponse concomittante de l'hôte et du microbiote ruminal à l'additif ne peut à ce jour être remplacé par aucune stratégie in vitro ou in sillico. L'un des objectifs du projet est d'identifier et de valider des indicateurs ou biomarqueurs capables de prédire la digestibilité de la ration et les rejets d'azote, deux paramètres qui nécessitent actuellement l’utilisation de cages de digestibilité. En conséquence, nous avons besoin de méthodes de référence qui ne peuvent être remplacées par la procédure en cours. À terme, ces indicateurs pourraient être proposés comme alternative aux méthodes de référence nécessaires en recherche. L'utilisation des techniques in-vitro pour étudier l'effet de l'additif sur la fermentation ruminale a été déjà réalisée et par conséquent nous avons besoin d'animaux expérimentaux pour confirmer les effets in-vivo.
Réduction
Pour cette expérimentation, 40 jeunes bovins seront mobilisés. Ce chiffre est basé sur les résultats obtenus au préalable par notre équipe chez le jeune bovin Charolais en engraissement alimentés avec des régimes comparables. Pour les mesures de digestibilité notre objectif est de démontrer l'absence de différence entre les deux traitements (test d'équivalence). Pour cela nous avons obtenu 20 animaux par traitement en considérant une absence d'effet lorsque la différence entre les deux traitements est inférieur à 2%. Dans le cadre cette expérimentation, les émissions de méthane seront mesurées au moyen de 2 collecteurs et analyseurs d'air (GreenFeed), une alternative toute aussi précise mais moins contraignante que les chambres respiratoires pour les animaux.
Raffinement
Les bâtiments sont dotés d'équipements pemettant un enrichissement du confort des bovins (brosses) et un suivi fin de leur santé et de leur bien-être (outils d'élevage de précision). Les animaux sont habitués à la cage de contention (passage systématique tous les 15 jours pour effectuer des pesées et notes d’état corporel). De plus, les prélèvements de fecès par fouille rectale ne sont réalisés que si les animaux ne défèquent pas naturellement. Concernant la phase d'étude de la digestibilité, les stalles ont été développées pour répondre aux besoins des animaux en termes de bien-être animal. Elles sont ainsi modulables pour s'adapter à la morphologie de l'animal, sont équipées de tapis et offrent un accès à volonté à l'eau et au sel. Ces stalles ouvertes permettent aux animaux de garder un contact visuel, auditif et olfactif entre eux. Concernant les points limites, l’ensemble des manipulations (contention + prélèvement) n’excèdera pas 10 minutes par animal et dans le cas contraire, sera reporté ou annulé. Pour le prélèvement d'adipocyte, une anestésie locale sera mise en place sur la zone d'incision. Les signes de modification de comportement dans la prise alimentaire, la posture, la réactivité ou/et les vocalisations seront surveillés les jours suivants les prélèvements. Dans le moindre doute, le vétérinaire d'élevage sera contacté et les soins prescrits mis en place et si besoin l'animal sera sorti de la procédure.
Choix des espèces
En France, l’agriculture représente 19% des émissions de gaz à effets de serre (selon le CITEPA), dont près de la moitié provient des élevages bovins lait et viande. Les émissions de méthane entérique, coproduit de la digestion de la cellulose par les ruminants, représentent environ 50% des émissions de GES d’une exploitation bovine. Le méthane entérique des bovins représente donc près de 5% des GES totaux français. Les élevages bovins lait et viande sont ainsi confrontés aux objectifs de décarbonation des activités. Il convient donc d'acquérir des références sur les bovins allaitants pour lesquels, on dispose de très peu de références. Les jeunes bovins seront en croissance dans des conditions similaires à ceux élevés pour la filière commerciale.
Prélèvements de tissu pour la caractérisation phénotypique de souris génétiquement altérées élevés pour l’étude de structures cérébrales
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 000 souris vont être utilisées dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées. Les nouveau-nés sont maintenus une minute pour une biopsie de la queue. Celles qui n'ont pas le génotype recherché sont tuées, par décapitation avant dix jours et par dislocation cervicale ensuite, les autres par ponction intracardiaque sous anesthésie profonde pour prélèvement du cerveau. Le but déclaré est de cartographier en trois dimensions deux populations de neurones de l'hypothalamus rendues fluorescentes, l'une liée à l'appétence, l'autre à la satiété. Sur le raffinement, le porteur ne mentionne que les 2 mm de queue prélevés, et fixe l'effectif de 2 000 animaux d'après des stratégies d'accouplement calculées "selon nos expériences antérieures".
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'identifier de façon précise certains neurones présents dans l'hypothalamus, structure majeure dans la régulation du métabolisme. Comme cette structure ne représente que 1% à 1.5% du cerveau total, les neurones qui le composent sont peu nombreux et présentent des localisations très précises. Parmi ceux-ci des neurones contrôlent respectivement l'appétence et la satiété. L'utilisation de souris exprimant des molécules fluorescentes marquant spécifiquement ces 2 populations neuronales permettront de les détecter in situ et d'en connaître l'architecture en 3 dimensions. Ces données complétées à celles de physiologie offriront une apporoche complémentaire du rôle de ces neurones dans la prise alimentaire.
Bénéfices attendus
Les principaux bénéfices attendus du projet sont l'identification des 2 populations neuronales d'intérêt grâce à la présence de fluorescence endogène au sein de ces neurones, d’en comprendre leur architecture et leurs connexions au sein de l'hypothalamus ainsi que la possibilité d’identifier des protéines s’exprimant spécifiquement dans ces 2 populations neuronales.
Procédures
Les nouveau-nés subiront une contention d'une minute et une biopsie de queue sera prélevée. Les adultes du génotype d’intérêt subiront une injection d'analgésique puis une anesthésie profonde suivie d'une perfusion intracardiaque terminale..
Impact sur les animaux
La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress chez l’animal ainsi qu’une légère souffrance de courte durée.
Devenir
Les animaux ne possédant le génotype d’intérêt seront mis à mort. Les nouveaux nés jusqu’à 10 jours sont mis à mort par décapitation et les souris âgées de plus de 10 jours seront mis à mort soit par dislocation cervicale. Les animaux présentant le génotype d’intérêt seront mis à mort par ponction intracardiaque après analgésie et anesthésie profonde pour prélèvement du cerveau.
Remplacement
Les questions scientifiques posées ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux prélevés sur des animaux adultes. Il s’agit de comprendre in situ les interactions qu'entretiennent 2 populations neuronales spécifiques avec les autres neurones, ainsi que leur organisation en 3 dimension, et cela ne peut pas être reproduit in vitro
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculés selon nos expériences antérieurs pour générer un nombre suffisant d’animaux pour réaliser au mieux nos expériences. En outre, les croisements ont été optimisés pour produire les animaux d’intérêt. D’autre part, les 2 sexes seront utilisés pour les expériences de qui réduit le nombre d’animaux. Enfin, la perfusion intracardiaque permet d’augmenter la viabilité des tranches individuelles, ce qui réduira le nombre d’animaux et en limitera leur nombre.
Raffinement
Le prélèvement lors de la biopsie est réalisé sur une extrémité réduite la queue (environ 2 mm) permettant néanmoins d'obtenir suffisamment d'ADN pour réaliser pour le génotypage.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur l'importance des neurones régissant la prise alimentaire. Cette régulation trouve son siège dans l'hypothalamus, petite structure qui représente 1% à 1.5% du cerveau. Des outils adaptés à la souris et à la taille de cette petite structure sont disponibles pour la réalisation de ce projet tels que la détection de molécules biologiques, la disponibilité de modèles génétiques murins permettant de répondre aux questions scientifiques posés. Des animaux adultes (3 mois) seront utilisés car la maturité et l’organisation neuronale de l'hypothalamus est alors à son climax.
Evaluation de l’efficacité de candidats vaccins contre la parvovirose canine par suivi de la réponse immunitaire et possible épreuve chez le chien 1/2
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Vaccinés sous la peau, puis soumis à des prises de sang une à deux fois par semaine pendant jusqu'à vingt-quatre semaines, 80 chiots relèvent du volet sérologique d'un essai de vaccins contre la parvovirose canine. 72 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 8 un niveau sévère, 59 étant gardés vivants pour réutilisation ou adoption, les autres tués. L'essai vise à démontrer qu'un vaccin déclenche une réponse immunitaire chez des chiots dont les anticorps maternels bloquent l'immunisation, ce qui suppose de les vacciner dès quatre semaines. La phase d'épreuve, où le virus est administré par voie oro-nasale sous anesthésie, n'est déclenchée que "si besoin", et le RNT ne dit ni combien de chiots y passeront ni ce qui fera basculer l'essai vers cette étape.
Objectifs
Le projet sera réalisé sur 2 sites. Un site d'élevage où se déroulera partie efficacité sérologique (EU1) et un autre site (EU2) pour la partie efficacité par épreuve. Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité immédiate vis-à-vis des anticorps maternels de candidats vaccins contre la parvovirose canine chez le jeune chien. Chez le jeune animal, la réaction immunitaire après une vaccination peut être freinée par la présence des anticorps maternels transmis par la mère (elle-même vaccinée), ce qui entraine une mauvaise immunisation des chiots contre la maladie. Ce projet vise à évaluer la capacité de candidats vaccin à entrainer une production d’anticorps efficace et suffisante contre la maladie chez des jeunes chiens conventionnels (dont les mères ont été vaccinées contre la maladie). Cette efficacité sera évaluée par suivi de la réponse immunitaire et si besoin, par une phase d’épreuve après administration du vaccin. L’épreuve consiste en l’administration de l’agent pathogène contre lequel sont dirigés les candidats vaccins. Les études sont réalisées sur l’espèce cible (chien) pour s’approcher au mieux des conditions réelles d’utilisation.
Bénéfices attendus
La finalité de cette étude est de permettre le développement d’un vaccin efficace précocement contre la parvovirose canine, qui reste une pathologie majeure/sévère sur des chiots de jeunes âges.
Procédures
Les nuisances prévues sur les animaux sont les suivants : - Administration du vaccin : 1 fois sur tous les animaux vigiles des groupes vaccinés en vigile par voie sous cutanée, acte inférieur à 1 minute. (EU1) - Administration de l’agent pathogène : en oro-nasale sous anesthésie, 1 sur tous les animaux de la procédure 2, acte inférieur à 5 minutes (EU2) - Prélèvements sanguins : acte inférieur à 1 minute, sur animaux vigiles (EU1 et EU2) o Pendant la procédure 1 : 1 à 2 (cas exceptionnel) par semaine pendant maximum 10 semaines (jusqu’à obtention des intervalles d’anticorps maternels souhaités) (EU1) o Pendant la procédure 2 : 1 à 2 fois par semaine, pendant maximum 24 semaines (jusqu’à ce que le groupe contrôle soit sensible à l’épreuve) (EU1) o Pendant la procédure 3 : 1 à 4 fois par semaine pendant 3 semaines (1 semaine baseline + 14 jours épreuve) (EU2) - Ecouvillons rectaux : 1 par jour pendant 14 jours sur tous les animaux de la procédure 3, sur animauxen vigiles, acte inférieur à 1 minute. (EU2)
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : - La contention et la répétition d’actes techniques (administrations et prélèvements) peuvent occasionner un stress et éventuellement une douleur légère et transitoire au point d’introduction de l’aiguille. - Stress lié au transport. - L’administration oro-nasale peut provoquer des éternuments et/ou une gêne respiratoire momentanée. - Les écouvillons rectaux peuvent provoquer une gêne pour l’animal. - Le développement de la pathologie peut donner lieu à des signes cliniques sévères (diarrhées, vomissements) notamment chez les animaux non-vaccinés = animaux témoins dans les études d’efficacité.
Devenir
Les animaux non sélectionnés, du fait d'un taux antiparvovirose trop bas, seront gardés en vie et pourront être réutilisés et/ou adoptés. Dans le cas où certains animaux doivent être utilisés pour la phase d'efficacité par épreuve, ceux-ci devront être euthanasiés pour des raisons de biosécurité après administration d’un agent pathogène ARG2.
Remplacement
La première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats, ce qui permet une première sélection, réduisant ainsi le nombre de candidats à tester in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie. Le produit testé est un candidat vaccin vivant atténué qui a déjà démontré une certaine efficacité sur des animaux SPF. Il s’agit maintenant de démontrer son efficacité - seul ou couplé - sur des animaux conventionnels c’est à dire en présence d’anticorps maternels. L’étude visant à évaluer l’efficacité du vaccin face aux anticorps maternels présents, le recours à l’espèce cible est à l’heure actuelle indispensable, car il n’existe pas de modèle pouvant reproduire les interactions existantes entre les anticorps maternels, le vaccin administré et la réponse immunitaire en découlant.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans la procédure 1 de screening est calculé de manière à obtenir un nombre suffisant de chiots avec un taux d’anticorps maternels anti-CPV permettant l’inclusion dans la procédure 2, en se basant sur des données obtenues historiquement (cf détail §3.4.10). En cas de vaccination avant sevrage des animaux (l’âge de vaccination dépendant d’un taux de MAB cible), les animaux seront inclus dans les procédures 2 et 3 par portées; le nombre de chiots dans ces procédures sera donc fonction du nombre de chiots par portée. Dans tous les cas, le nombre minimum de chiots/groupe sera de 8 dans les lots vaccinés et de 5 dans le lot contrôle, nombre minimal pour garantir la validité des résultats obtenus et limiter l’impact de la variabilité des anticorps maternels au niveau du groupe. Ce nombre a été calculé en se basant sur les exigences de la Pharmacopée Européenne et sur l’historique des études précédentes.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’au moins 4 jours est prévue. Si les chiots sont déjà hébergés avec leur mère avant le début des procédures, la période d’acclimatation ne sera pas nécessaire. Les conditions d’hébergement seront adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe ou par portée. Des enrichissements adaptés au milieu seront mis en place : litière, jouet, panier ou tunnel/plateforme. La contention et les actes techniques seront réalisés par un personnel hautement qualifié. Ils pourront avoir recours à une anesthésie et/ou une analgésie si l’acte ou l’animal le nécessite. Pour la phase vaccinale, les animaux seront hébergés dans un milieu protégé pour éviter toutes contamination des animaux non vaccinés par un virus sauvage ou une souche vaccinale provenant d’animaux vaccinés sur le même site. Dans tous les cas, les animaux sont suivis quotidiennement voire biquotidiennement en période de phase critique. Des points limites spécifiques de la parvovirose sont appliqués.
Choix des espèces
Le chien est l’espèce cible d’un vaccin contre la parvovirose canine, et le jeune chien est le modèle optimal pour évaluer l’efficacité d’un vaccin vis-à-vis des anticorps maternels. Des chiots à partir de 2 semaines seront prélevés afin d’évaluer et de suivre les taux d’anticorps maternels anti-CPV. Des chiots à partir de 4 semaines d’âge et possédant un taux d’anticorps maternels contre CPV élevés seront inclus dans la procédure 2 (vaccination pouvant être réalisée jusqu’à 8-9 semaines d’âge). Pour pouvoir évaluer l’efficacité de candidat vaccin vis-à-vis des anticorps maternels, il est nécessaire d’utiliser des chiots ayant encore un taux élevé d’anticorps maternels. La cible est fixée pour une vaccination des animaux à des titres forts rencontrés lors des schémas de vaccination classique contre la parvovirose. Ces titres peuvent être obtenus à partir de 4 semaines d’âge, il est donc nécessaire de commencer à suivre les titres d’anticorps de manière précoce (2 semaines d’âge).
Étude de la réponse immunitaire associée aux cellules dendritiques et lymphocytes T dans le microenvironnement tumoral du mélanome cutané
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1 244 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, presque toutes tuées à l'issue, quinze restant en accouplement continu pour entretenir les lignées. 148 reçoivent sur les oreilles un analogue de la vitamine D pendant trois jours pour déclencher un mélanome, 540 une injection intradermique de cellules dendritiques dans les deux oreilles, 556 des injections intrapéritonéales d'immunothérapie deux fois par semaine pendant deux semaines. Le porteur annonce inflammation, démangeaisons et rougeur des oreilles, et une mise à mort dès que la tumeur atteint un centimètre cube. Il justifie le recours aux souris par le fait que le microenvironnement tumoral engage plusieurs organes, ce qui rend selon lui l'expérience in vivo "nécessaire", onze lignées génétiquement modifiées étant mobilisées.
Objectifs
Le mélanome cutané est un cancer se développant à partir de mélanocytes cancéreux, les cellules pigmentées de la peau. Le système immunitaire est généralement en mesure d’éliminer les cellules tumorales. Toutefois, les cellules tumorales peuvent perturber la réponse immunitaire de manière à favoriser leur propre croissance, ce qui impacte négativement le pronostic des patients atteints de mélanome cutané. Ce cancer de la peau est hautement agressif, premièrement à cause de son potentiel à métastaser, et deuxièmement par sa fréquente résistance à la plupart des immunothérapies et thérapies ciblées utilisées aujourd’hui. Notre laboratoire s'intéresse à une molécule qui possède un rôle pro-tumoral dans le microenvironnement tumoral associé au mélanome cutané. Cependant, les cellules et molécules impliquées dans la réponse immunitaire pro-tumorale sont encore mal connues. Le projet vise donc (1) à étudier dans un modèle murin de mélanome cutané, l’impact de cette molécule sur les différentes sous-populations cellulaires immunitaires ; (2) à identifier et étudier la fonction des sous-populations cellulaires immunitaire induite par cette molécule ; et enfin (3) à évaluer et améliorer l’effet du blocage de cette molécule associée à une thérapie déjà utilisée pour soigner les mélanomes cutanés chez l'humain. Afin de répondre à ces questionnements, nous étudierons la réponse immunitaire au niveau du microenvironnement tumoral associé au mélanome cutané ainsi que dans les ganglions lymphatiques drainant la tumeur et dans le sang.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à approfondir notre compréhension de la réponse immunitaire impliquée dans le développement du mélanome cutané. Par ailleurs, ces nouvelles connaissances sur les différentes sous-populations cellulaires immunitaires dans le microenvironnement tumoral pourraient nous permettre éventuellement de la moduler en agissant sur ces types cellulaires spécifiques. De plus, cette étude permettra également d'évaluer le potentiel d’une nouvelle cible thérapeutique afin d’améliorer la survie des patients atteints de mélanome cutané.
Procédures
Lors de la 1ère partie, 148 souris au maximum seront anesthésiée par voie gazeuse et traitées pendant une durée de 3 jours (le traitement est d'une durée d'environ 30 secondes) afin d'induire un mélanome cutané. Pour la 2ème partie du projet, 540 souris seront anesthésiées et injectées par voie intradermique avec des cellules immunitaires au niveau des deux oreilles, et gardés pendant 7 jours (l'injection est d'une durée de 6 minutes). Enfin, la 3ème partie concernera 556 souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale 2 fois par semaine pendant 2 semaines (durée de 20 secondes) avec une immunothérapie combinée.
Impact sur les animaux
Une minorité des animaux de 2 lignées de souris utilisées (moins de 30% des effectifs) est susceptible de développer un phénotype dommageable se traduisant par l'apparition de tumeurs spontanées non pigmentées et à croissance rapide, un suivi particulièrement attentif sera mis en place. L'application d'analogue de ka vitamine D sur les oreilles des animaux sous anesthésie gazeuse légère engendrera un léger stress d'une courte durée. (Lors des transferts des cellules dendritiques, les animaux donneurs seront de la même espèce, du même sexe et du même fond génétique que les animaux receveurs (qui recevront l'injection de ces cellules) éliminant les risques de rejet. Néanmoins, cette procédure engendrera un léger stress et douleur d'une courte durée sur les animaux receveurs et une inflammation au niveau des oreilles, accompagnées de démangeaisons et d'une rougeur. Les injections intrapéritonéales d'anticorps sur d'autres modèles ont déjà été réalisées par le passé dans notre équipe, et nous n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection et un stress du à la contention sera ressenti pendant un temps court ( quelques secondes). Le traitement avec des anticorps devrait faire régresser la tumeur mais une rougeur pourrait apparaitre sur la peau recouvrant la tumeur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales afin de prélever les différents organes ou tissus nécessaires à l'étude de la réponse immunitaire dans le mélanome cutané. permettent de maintenir les lignées utilisées dans ce projet de recherche. Au maximum 15 animaux seront utilisés pour les expérimentations en utilisation continue, pour avoir 5 accouplements en continu.
Remplacement
Les lignées de souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet vont nous permettre d'étudier des gènes ou des cellules dont l'implication dans le mélanome a été suggéré in vitro par notre laboratoire ainsi que d'autres. Les phénomènes impliqués dans le mélanome cutané mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires qui composent l'ensemble du microenvironnement tumoral. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Afin de différencier les rôles de différentes cellules et molécules pouvant être impliquées dans le développement du mélanome, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 11 lignées de souris différentes et d'un maximum de 1204 animaux. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions statistiquement significatives. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro ont été réalisées afin d’éliminer certaines hypothèses et de mieux définir les expériences à effectuer sur les modèles in vivo.
Raffinement
Tous les animaux feront l'objet d'une observation quotidienne basée sur leur apparence générale, leur posture et leur comportement. Tous les animaux intégrés dans une procédure expérimentale seront soumis à l'application de points limites définis, stricts et spécifiques de ce projet. En cas de signes cliniques tels qu'un dos courbé, un pelage ébouriffé, une absence de réaction aux stimuli ou encore une inflammation ou une infection au niveau des sites d'injection, l'animal sera retiré de l'étude et pourra recevoir des soins selon l'avis du vétérinaire. Si l'état de l'animal est jugé critique (blessure importante par exemple), une euthanasie immédiate sera pratiquée. Pour les souris développant des tumeurs cutanées, un suivi renforcé sera assuré quotidiennement. Le volume tumoral sera mesuré à l'aide d'un pied à coulisse et l'euthanasie sera réalisée si la taille de la tumeur atteint 1 cm3. Toutes procédures pouvant induire douleur ou stress chez l'animal sera effectuée sous anesthésie légère gazeuse, n'engendrant qu'un stress léger de courte durée dû à la contention. Les animaux seront hébergés en groupe et auront un accès constant à de l'eau et de la nourriture pendant toute la durée de l'expérience.
Choix des espèces
Les mécanismes cellulaires dans le microenvironnement tumoral du mélanome cutané impliquent plusieurs organes différents (peau, ganglions lymphatiques, etc.) et ces interactions inter-organes nécessitent plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre la croissance tumorale, l'implication du système immunitaire et à terme, identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.
Etude de l’effet du pâturage séquentiel alterné mixte ovins/bovins sur le bien-être et le parasitisme des animaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Bovins : 22
Comparer deux conduites de pâturage, l'une mêlant ovins et bovins, l'autre spécialisée en ovins, place 292 brebis, agneaux et génisses dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Prélèvements de fèces par stimulation rectale chaque mois pendant quatre mois, prises de sang de 10 mL à la veine jugulaire ou caudale en début et en fin d'essai. Le porteur reconnaît qu'une très forte infestation parasitaire pourrait survenir, surtout chez les agneaux du lot spécialisé, ceux-là mêmes qui tiennent le rôle de point de comparaison. Aucun animal n'est tué dans le cadre du projet. Les brebis et les génisses rejoignent le troupeau de l'établissement, les agneaux repartent vers l'engraissement.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier les effets du pâturage séquentiel alterné entre ovins et bovins au printemps sur le parasitisme et le bien-être des animaux. Une de nos hypothèses de travail est que les bovins apportent un bénéfice aux ovins en termes de parasitisme, y compris lors de pâturage séquentiel alterné. L’expérimentation analytique vise donc à mesurer les effets de l’introduction d’un troupeau de bovins dans le cycle de pâturage d’un troupeau ovin. Pour cela, un système mixte sera comparé à un système ovins spécialisé pris comme témoin. Seront notamment abordées les questions de la conduite au pâturage des deux espèces et la gestion des lots. L’excrétion parasitaire, les performances zootechniques du troupeau, ainsi que les conditions de travail seront observées.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus sont dans un premier temps une réduction du parasitisme chez les ovins du système mixte par rapport à ceux du système spécialisé, particulièrement chez les agneaux plus sensibles que les agnelles ou les brebis. L’objectif sera de suivre l’excrétion parasitaire du troupeau d’ovins et du troupeau de bovins (strongles, douves) et de déterminer si cette pratique peut être une alternative à la résistance au traitement anthelminthique. En ce sens elle s’insère pleinement dans la transition agroécologique en mentant à profit des processus biologiques en remplacement de molécules chimiques (anthelminthiques) dont l’efficacité est de plus en plus limitée compte tenu du développement rapide de résistances dans les populations de parasites. D’un point de vue sanitaire, les anthelminthiques de synthèse sont les médicaments couramment utilisés en médecine vétérinaire pour gérer les infestations parasitaires. Cependant, des métabolites ou des molécules non dégradées se retrouvent dans les produits dédiés à la consommation humaine (viande, lait, fromage), et peuvent impacter indirectement la santé humaine. Pour certaines molécules, des conséquences environnementales ont aussi été signalées. Des temps d’attente sont donc à respecter avant de commercialiser et consommer ces denrées alimentaires. De plus, depuis ces dernières années, une multiplication des résistances aux anthelminthiques de synthèse est observée dans les élevages ovins et caprins. Pour pallier à ces problèmes, l’exploitation dans la ration de métabolites secondaires bioactifs naturellement présents dans certains végétaux ou ressources végétales serait une méthode alternative à l’emploi des traitements chimiques. Enfin, l’aspect innovant de ce projet tient également à l’étude de la mixité en pâturage séquentiel, qui a l’intérêt de faciliter la gestion des lots au quotidien (pas de mélange simultané des espèces) et pourrait en ce sens aider au développement de la mixité ovin/bovin pour plus de résilience.
Procédures
Deux types de prélèvements sont prévus sur les animaux : i) Des prélèvements de fèces (5 grammes) auront lieu tous les mois durant les 4 mois de l’expérimentation, sur 60 brebis et 60 agneaux préférentiellement mâles (30 brebis et 30 agneaux de chaque troupeau ovin, 40 agneaux l'année 2), ainsi que sur les 11 génisses. ii) Des prises de sang (10mL) seront réalisées sur les 11 génisses et sur 20 brebis (10 brebis de chaque troupeau ovin) en début et fin d’expérimentation. Les interventions n'excéderont pas 1 à 2 minutes par animal, et elles seront regroupées dès que cela est possible afin de limiter la manipulation et la contention des animaux.
Impact sur les animaux
On peut noter 3 types de nuisances attendues : tout d’abord pour effectuer des sérologies, des prises de sang seront réalisées à la veine jugulaire (ovin) ou caudale (bovin). Des hématomes peuvent apparaitre en cas de prélèvements répétés mais ceux-ci n’auront lieux qu’en début et fin d’essai soit un espacement de plus de 3 mois. Ensuite afin de réaliser des coprologies, des prélèvements de fèces auront lieu par stimulation rectale en évitant au maximum le prélèvement direct par fouille. L’ensemble des prélèvements (prise de sang + fèces) ne dure que 1 à 3 minutes par animal, et elles seront réalisées par du personnel compétent et formé. Enfin, une très forte infestation parasitaire pourrait survenir dans les troupeaux ovins, particulièrement chez les agneaux du système spécialisé. Pour cela le suivi régulier des performances et la de la santé des animaux, couplé à une surveillance quotidienne par le personnel animalier qualifié, permettra de déceler suffisamment précocement les animaux à traiter.
Devenir
Les agneaux poursuivront leur engraissement dans un schéma classique d’élevage ovin. Les brebis et les génisses retourneront dans le troupeau d’élevage de l’établissement utilisateur.
Remplacement
Aucun essai in vitro ni modélisation n’existe à ce jour pour une telle étude. L’étude in vivo est indispensable pour étudier le lien entre le parasitisme et pratiques de pâturage. De nombreuses mesures ne sont possibles qu’en expérimentation in vivo : mesures de parasitologie (évaluation de la charge parasitaire par analyses coproscopiques sur les fèces et sérologie sur prise de sang), étude des performances zootechniques (gain de poids, note d’état corporel). Ces analyses fines permettront de produire des références.
Réduction
Le nombre d’animaux a été optimisé et réduit au minimum pour i) s’assurer d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour des analyses statistiques fiables des paramètres de parasitologie (mesure de coproscopie) sur les 2 lots infestés et ii) assurer des répétitions pour obtenir la puissance statistique nécessaire pour arriver à faire le lien entre infestation parasitaire et pratiques de pâturage. Ainsi le dimensionnement a cherché à être minimaliste tout en veillant à avoir des effectifs minimaux pour reproduire les effets troupeaux. Par ailleurs, les surfaces des parcelles doivent être suffisamment grandes pour être représentatives de la diversité et capter la variabilité des prairies permanentes de montagne ici étudiées. Le nombre d’animaux permet également d’avoir un chargement adapté au potentiel de production des prairies.
Raffinement
Les animaux se trouveront dans le cadre d’une conduite d’élevage classique (pâturage à l’herbe). Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été définis (cf. 4.2.1) et l’état de santé des animaux sera suivie de manière rapprochée par une méthode de scoring. L’état de santé des animaux sera évalué tous les jours lors de la surveillance sur les parcelles par un animalier habilité, responsable de la mise en œuvre du protocole. Tout changement de comportement (isolement, abattement, baisse d’appétit ou refus de s’alimenter) ou tout autre comportement anormal sera signalé et pris en charge, consigné dans le cahier d’expérimentation. Les évaluations des performances zootechniques et du bien-être animal serviront également à surveiller la santé des animaux. Un diagnostic approfondi de l’animal malade sera réalisé, et si nécessaire un traitement adéquat sera administré sur avis du vétérinaire. Si aucune amélioration n’est constatée dans les jours suivants, l’animal sera sorti de la procédure.
Choix des espèces
L’étude vise à étudier la mixité ovin/bovin au pâturage. Les bovins seront de race charolaise et les ovins de race limousine et sont actuellement présentes sur la ferme expérimentale. Ces deux espèces sont l’objet d’élevage de rente et font parties des productions de viande majoritaire en France. Les suivis sur le parasitisme sont impossibles à réaliser sans l’utilisation d’animaux. Les agneaux mâles seront suivis préférentiellement car ils plus sensibles au parasitisme. Brebis allaitantes et agneaux en croissance avant sevrage
Induction et suivi des modèles de colite chez le rat ou la souris pour évaluer le rôle des protéases et leurs récepteurs dans les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 1800
L'état général des animaux est observé au minimum une fois par semaine, et tout individu atteignant un point limite est tué. 5 760 souris et rats vont être utilisés dans des modèles de colite, dont 4 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour prélever le colon et l'iléon. La colite provoque perte de poids, diarrhée, sang dans les fèces et hypersensibilité viscérale. Les animaux subissent jusqu'à sept endoscopies sous anesthésie, un gavage pouvant aller jusqu'à deux fois par jour pendant deux mois, et des administrations intracoliques pratiquées sur rat vigile en contention, avec un risque de perforation de l'intestin. L'objet est de tester des molécules candidates contre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, et le porteur précise qu'aucun logiciel ni test statistique n'a servi à fixer l'effectif, son expérience des modèles lui suffisant.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) se caractérisent par une inflammation du tractus gastrointestinal. Il existe deux pathologies : la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Ces pathologies touchent entre cinq et six personnes sur 100 000. Elles débutent généralement chez le jeune adulte et touchent indifféremment les deux sexes. Les traitements disponibles aujourd’hui sont soit des traitements symptomatiques, soit reposant sur des actes chirurgicaux. Les causes des MICI sont encore mal connues. Les modèles animaux ont grandement enrichi notre compréhension de nombreuses pathologies intestinales. En plus d'améliorer la compréhension de la maladie, les modèles animaux sont également utilisés de manière importante pour tester les nouveaux médicaments ainsi que pour les interventions diagnostiques ou thérapeutiques précliniques. Des techniques d'imagerie sophistiquées ont été développées afin de surveiller l'activité de la maladie chez la souris. Ces techniques endoscopiques permettent une visualisation directe de l'inflammation intestinale ou la cicatrisation des plaies. Ce processus donne un état objectif en temps réel permettant des études chez le même animal à des moments répétés. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques pour les MICI chez le rat et la souris. Le modèle utilisé sera adapté aux cibles thérapeutiques à évaluer.
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes de l'inflammation dans les modèles de colite est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre projet vise a évaluer le rôle de récepteurs activés par les protéases et des protéases elles mêmes dans les modèles de colite.
Procédures
- endoscopie sur animal anesthésié (au minimum 2 fois maximum 7 fois) durée : 15 minutes par endoscopie - gavage minimum 1 fois sur la durée de l'expérimentation (2 mois maximum), maximum 2 fois par jour quotidiennement durée: 1 minute par geste - prélèvement de sang sur animal anesthésié 1 fois sur la durée de l'expérimentation (2 mois maximum), maximum 1 fois par semaine durée: 5 minutes par geste - administration intracolique de produit sur souris anesthésiée minimum 1 fois maximum 4 fois durée 2 minutes par geste - administration intracolique sur rat vigile en contention minimum 1 fois maximum 4 fois durée 3 minutes par geste - administration intrapéritonéale sur animal vigile 2 fois (1 fois par jour, 2 jours consécutifs) durée 1 minute par geste -administration cutanée sur animal vigile (1 fois par jour, 2 jours consécutifs) durée 1 minute par geste)
Impact sur les animaux
L'induction de la colite est caractérisée par la perte de poids des animaux, l'apparition de diarrhée et de sang dans les féces ainsi qu'une douleur et hypersensibilité viscérale. L'administration intracolique chez le rat vigile et le gavage peuvent induire du stress. L'endoscopie et les biospsies sont réalisées sous anesthésie mais il y a un risque de perforation de l'intestin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever des tissus (colon, ileon).
Remplacement
La colite est une réaction integrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’experimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'inflammation intestinale. Dans le cadre de ce projet, l’expérimentation animale est indispensable.
Réduction
La technique d'endoscopie utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux). De plus, les résultats obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: avant traitement versus après traitement). Les tests statistiques utilisés peuvent comparer les mesures sur le même individu ou entre individus. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Aucun logiciel ou test statistique n'ont été utilisé mais notre expérience de ces modèles nous permet de connaitre le nombre d'animaux minimum nécessaire afin d'obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des igloos et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine. Pour chaque procédure des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. Les souris sont anesthésiées lors des administrations intracoliques et du prélèvement de sang.
Choix des espèces
Chaque espèce présente une sensibilité différente pour les différents modèles. Dans le but d’une plus grande homogénéité des réponses et donc pour limiter le nombre d’animaux nécessaire, nous utiliserons des espèces «sensibles » (plus reproductibles). Ainsi, en fonction du modèle : des rats (espèce pour laquelle le modèle est plus reproductible) et/ou des souris (le choix rat ou souris dépendra du mécanisme et/ou cible de la molécule à tester). De plus nous avons des souris transgéniques pour des protéases d'interet. 3 modèles seront réalisés car ils miment chacun des pathologies différentes. Les souris seront âgées d'au moins 8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures. Leur métabolisme, leur système immunitaire et leur physiologie étant stabilisés nous auront ainsi moins de variation que sur des jeunes animaux.
Rôle de la communication cytokine-microbiote dans l’homéostasie intestinale : étude de la physiologie et de la régénération de l’intestin du poisson zèbre
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
À quatre jours de développement, des larves de poisson zèbre ont l'intestin sectionné en deux sous anesthésie, geste que le porteur chiffre à dix secondes. 29 200 poissons zèbres vont être utilisés, 16 645 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 11 205 un niveau modéré et 1 350 un niveau sévère. La mortalité annoncée après cette section intestinale atteint environ 20 %, et le porteur prévoit que certains inhibiteurs testés altèrent la régénération, ce qui pourrait encore l'augmenter. 16 725 individus restent vivants au titre de l'élevage des lignées, les autres sont tués par surdose d'anesthésique après cinq séances d'observation au microscope, pour analyse post mortem.
Objectifs
Les cytokines sont des acteurs essentiels du système immunitaire, assurant la communication intercellulaire grâce à des récepteurs spécifiques situés à la surface des cellules cibles, qui transmettent leur signal. Produites principalement en réponse à un agent infectieux (virus, bactérie ou constituant) par les cellules lympoides innées (ILC), elles agissent comme médiateurs de l’immunité. La colonisation intestinale par les micro-organismes commensaux (organismes vivant dans l’hôte sans lui nuire) débute avec l’ingestion de nourriture et s’intensifie avec l’introduction d’aliments secs dans l’alimentation des poissons. Cytokines et microbiote participent à des processus cellulaires comme la prolifération, la mort et la migration des cellules. Ils jouent aussi un rôle clé dans l’inflammation et la fonction de barrière intestinale, qui empêche le passage du contenu (microbes, toxines, etc) de l’intestin vers l’intérieur du corps. Cependant, leurs interactions restent mal comprises, notamment durant la physiologie normale et la régénération après une lésion grave de l’intestin. L'objectif principal du projet est d'étudier le rôle de l'interaction entre les cytokines et le microbiote dans la physiologie et la régénération de l'intestin après une blessure qui laisse l'intestin non fonctionnel. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons le poisson-zèbre, qui est largement utilisé dans les études biologiques. Ce modèle offre des avantages uniques, tels que sa transparence durant les premiers stades de développement, permettant d’observer les conséquences des interactions entre le microbiote et les cytokines dès les premiers jours de vie. Il présente également une grande capacité de régénération, ce qui en fait un outil précieux pour étudier les facteurs déterminant une régénération tissulaire réussie. L’identification de ces facteurs et la compréhension de leurs mécanismes moléculaires ont pour but d’apporter des connaissances utiles à la régénération intestinale humaine après une lésion.
Bénéfices attendus
La régénération est la capacité à restaurer un organe ou un tissu endommagé par une blessure ou une dégénérescence. Cependant, les mammifères, y compris les humains, ont un potentiel régénératif limité, qui diminue avec l'âge. En conséquence, les dommages graves subis par de nombreux organes essentiels sont irréversibles, ce qui entraîne des problèmes de santé potentiellement mortels. Bien que l'on ait longtemps pensé qu'il avait été perdu au cours de l'évolution, le potentiel régénératif semble persister à l'état latent et pourrait être réactivé. Il est donc très important et utile d'identifier les mécanismes fondamentaux de la régénération chez les espèces qui sont naturellement capables de se régénérer efficacement. Le poisson zèbre, en raison de sa remarquable capacité à régénérer la plupart de ses organes, est devenu un modèle de référence en biologie régénérative. Il a révélé que certains mécanismes de régénération sont conservés chez les mammifères et pourraient être réactivés, ouvrant la voie à des approches innovantes en médecine humaine (doi: 10.3390) Ce projet vise des avancées significatives pour la santé humaine et la médecine régénérative en étudiant le rôle clé des cytokines et du microbiote dans la guérison intestinale. À court terme, il pourrait améliorer notre compréhension des maladies intestinales telles que les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin) et, à long terme, inspirer des traitements innovants pour les lésions graves, réduisant la nécessité d'interventions chirurgicales complexes. Cela bénéficierait non seulement aux humains mais aussi à d'autres espèces, tout en approfondissant nos connaissances scientifiques sur les interactions entre notre corps et les micro-organismes.
Procédures
À 4 jours après la fécondation, les larves subiront une intervention : une partie de leur tube digestif, située près de leur sortie uro-génitale, sera coupée en deux parties après qu’elles aient été profondément anesthésiées (La coupe de l’intestin ne prend pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Une fois remises, les larves seront de nouveau anesthésiées (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) pour être observées au microscope sans stress. Cette observation sera répétée 5 fois jusqu’à leurs 10 jours de développement. Certaines larves seront prélevées après observation et euthanasiées avec une forte dose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. D’autres larves recevront des substances (appelées "drogues" en termes scientifiques) qui pourraient influencer la régénération de l’intestin. Ces drogues seront directement administrées dans l’eau des larves pendant une durée qui est fonction de la drogue mais connue de la littérature. Ensuite, les larves sont remises dans une eau sans droque. Elles seront également observées par imagerie pour voir si ces substances ont un effet (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) Au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. Enfin, nous ferons grandir des larves dans un environnement stérile, sans microbes grâce à un milieu contenant des antibiotiques. À 5 jours, elles subiront aussi une coupure de l’intestin sous anesthésie (pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Ces larves seront ensuite placées avec d’autres larves élevées dans un environnement normal (sans antibiotique), contenant des microbes. Ces larves seront observées 5 fois sous le microscope sous anesthésie (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) jusqu’à leurs 10 jours de développement. Comme précédemment, au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Il est possible que certaines lignées créées présentent des phénotypes dommageables entraînant par exemple des scolioses prématurées ou des problèmes de reproduction. Pour génotyper le poisson, il est nécessaire de prélever du tissu par biopsie (ici, un prélèvement de quelques millimètres de la queue), ce qui induit une douleur légère lors de l’incision. L’intervention ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement de très faible taille induit une gêne légère dans le déplacement, la régénération de la nageoire étant complète en moins de 5 jours. Suite à la coupe de l’intestin, les poissons peuvent ressentir une gêne pour la nage. Le taux de mortalité est autour de 20% suite à cette chirurgie. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement Suite à nos travaux issus d’une autre autorisation, nous ne rencontrons pas de mortalité dû aux antibiotiques présents dans le milieu.dû aux antibiotiques présents dans le milieu. En ce qui concerne l'utilisation d'inhibiteurs, leur utilisation a déjà été rapportée dans des articles de recherche utilisant des larves de poisson zèbre. Nous appliquerons donc les traitements (concentration et durée d'exposition) décrits dans la littérature. Nous nous attendons à ce que certains inhibiteurs altèrent le processus de régénération, ce qui pourrait potentiellement entraîner une augmentation de la mortalité après une blessure.
Devenir
A l’exception de la première procédure d’élevage de poissons utilisés ensuite dans les procédures suivantes, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem.
Remplacement
Pour notre projet, nous nous appuyonsà la fois sur sur des données déjà accessibles au public et sur nos propres données de séquençage de l’ARN issues du modèle poisson-zèbre. Cettetechnique permet d’identifier et de quantifier le matériel génétique à un moment précis Actuellement, la culture in vitro de l’intestin et sa colonisation par un microbiote restent actuellement impossibles. Par ailleurs, la régénération est une interaction complexe entre les éléments moléculaires, cellulaires et environnementaux. Ceci ne peut pas être transposé dans les cellules et il n’existe pas d’alternative non animale. Il est donc difficile de trouver un remplacement efficace et suffisamment proche des mécanismes que nous souhaitons étudier.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Les tailles des lots ont été déterminées en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet.
Raffinement
Les observations ont été définies selon notre expérience et celle de collaborateurs. Les expériences sont généralement courtes, et les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute intervention, chirurgicale (biopsie de la queue pour l’identification, coupe de l’intestin pour le projet) ou non chirurgicale (imagerie). Pour déterminer le génotype, nous mettons en place l’écouvillonnage (prélèvement d’ADN contenu dans le mucus par frottement de la peau avec un coton) en parallèle de la coupe de queue. Cela permettra de comparer les résultats et d’évaluer si cette méthode, moins invasive, est aussi fiable. À terme, elle pourrait remplacer le finclip. Tout le matériel utilisé sera stérilisé ou décontaminé pour limiter les risques d’infection et favoriser la cicatrisation. Après intervention, les poissons seront placés 24 h dans un bac équipé d’un séparateur transparent, sur fond de galets, contenant un milieu avec analgésique et antifongique. La cicatrisation est obtenue en 1 jour et la régénération de la queue en 5 jours. La coupe prend moins de 30 secondes hors de l’eau. Un suivi du réveil et du bien-être est réalisé selon une grille validée par l’animalerie. Pour la coupe intestinale, la larve est anesthésiée. L’intervention dure 10 secondes. Du matériel stérile à usage unique est utilisé. Après la chirurgie, l’animal est placé dans un milieu contenant un antiseptique. La cicatrisation s’observe en 2 jours, avec un suivi selon une grille établie avec le SBEA. En cas de signe de mal-être d’un poisson, nous agirons pour réduire le stress / douleur.. L’animal est mis à mort si son état le nécessite. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Grâce à cela, les animaux n’ont pas besoin d’être génotypés. Il suffit d’observer les larves très jeunes (autour de 4 jours après la fertilisation des oeufs) pour visualiser l’expression du gène d’intérêt et sélectionner ainsi les animaux.
Choix des espèces
Notre compréhension du rôle des cellules, des gènes de l'hôte et du microbiote dans le développement des organes des vertébrés reste limitée chez les mammifères. Ces modèles rendent difficile la manipulation précise de l'environnement et le suivi en temps réel du développement intestinal. Pour dépasser ces obstacles, nous utilisons le poisson zèbre, un modèle qui allie ses atouts naturels aux avancées technologiques. Partageant 70 % de ses gènes avec l'Homme, le poisson zèbre est idéal pour étudier le développement des vertébrés grâce à sa facilité de manipulation génétique, sa descendance abondante, sa transparence et son développement rapide hors de l’organisme maternel. Ce modèle permet également d'explorer les interactions spécifiques au microbiote et les mécanismes de régénération cellulaire. Enfin, les similitudes immunitaires entre poissons et mammifères renforcent son intérêt scientifique. Pour l’élevage, nous aurons besoin d’animaux de 5j jusqu’à 18 mois. Des protocoles expérimentaux autres que les techniques d’élevage s’effectueront sur des larves de 4 jours jusqu’à 10 jours. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoce.
Evaluation de l’efficacité de candidats vaccins contre la parvovirose canine par suivi de la réponse immunitaire et possible épreuve chez le chien 2/2
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Un écouvillon rectal par jour pendant quatorze jours, et des prises de sang jusqu'à deux fois par semaine pendant vingt-quatre semaines : 80 chiens vont être utilisés dans un essai de candidats vaccins contre la parvovirose canine. 72 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 8 un niveau sévère, 59 étant gardés vivants pour être réutilisés ou adoptés quand les autres sont tués pour raisons de biosécurité. L'épreuve consiste à inoculer le parvovirus par voie oro-nasale après vaccination, et les chiots du groupe témoin, non vaccinés, peuvent développer diarrhées et vomissements sévères. Le porteur indique que le recours à l'espèce cible est "indispensable" et que des chiots doivent être prélevés dès l'âge de deux semaines pour suivre leur taux d'anticorps maternels.
Objectifs
Le projet sera réalisé sur 2 sites. Un site d'élevage où se déroulera partie efficacité sérologique (EU1) et un autre site (EU2) pour la partie efficacité par épreuve. Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité immédiate vis-à-vis des anticorps maternels de candidats vaccins contre la parvovirose canine chez le jeune chien. Chez le jeune animal, la réaction immunitaire après une vaccination peut être freinée par la présence des anticorps maternels transmis par la mère (elle-même vaccinée), ce qui entraine une mauvaise immunisation des chiots contre la maladie. Ce projet vise à évaluer la capacité de candidats vaccin à entrainer une production d’anticorps efficace et suffisante contre la maladie chez des jeunes chiens conventionnels (dont les mères ont été vaccinées contre la maladie). Cette efficacité sera évaluée par suivi de la réponse immunitaire et si besoin, par une phase d’épreuve après administration du vaccin. L’épreuve consiste en l’administration de l’agent pathogène contre lequel sont dirigés les candidats vaccins. Les études sont réalisées sur l’espèce cible (chien) pour s’approcher au mieux des conditions réelles d’utilisation.
Bénéfices attendus
La finalité de cette étude est de permettre le développement d’un vaccin efficace précocement contre la parvovirose canine, qui reste une pathologie majeure/sévère sur des chiots de jeunes âges.
Procédures
Les nuisances prévues sur les animaux sont les suivants : - Administration du vaccin : 1 fois sur tous les animaux vigiles des groupes vaccinés en vigile par voie sous cutanée, acte inférieur à 1 minute. (EU1) - Administration de l’agent pathogène : en oro-nasale sous anesthésie, 1 sur tous les animaux de la procédure 2, acte inférieur à 5 minutes (EU2) - Prélèvements sanguins : acte inférieur à 1 minute, sur animaux vigiles (EU1 et EU2) o Pendant la procédure 1 : 1 à 2 (cas exceptionnel) par semaine pendant maximum 10 semaines (jusqu’à obtention des intervalles d’anticorps maternels souhaités) (EU1) o Pendant la procédure 2 : 1 à 2 fois par semaine, pendant maximum 24 semaines (jusqu’à ce que le groupe contrôle soit sensible à l’épreuve) (EU1) o Pendant la procédure 3 : 1 à 4 fois par semaine pendant 3 semaines (1 semaine baseline + 14 jours épreuve) (EU2) - Ecouvillons rectaux : 1 par jour pendant 14 jours sur tous les animaux de la procédure 3, sur animauxen vigiles, acte inférieur à 1 minute. (EU2)
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : - La contention et la répétition d’actes techniques (administrations et prélèvements) peuvent occasionner un stress et éventuellement une douleur légère et transitoire au point d’introduction de l’aiguille. - Stress lié au transport. - L’administration oro-nasale peut provoquer des éternuments et/ou une gêne respiratoire momentanée. - Les écouvillons rectaux peuvent provoquer une gêne pour l’animal. - Le développement de la pathologie peut donner lieu à des signes cliniques sévères (diarrhées, vomissements) notamment chez les animaux non-vaccinés = animaux témoins dans les études d’efficacité.
Devenir
Les animaux non sélectionnés, du fait d'un taux antiparvovirose trop bas, seront gardés en vie et pourront être réutilisés et/ou adoptés. Dans le cas où certains animaux doivent être utilisés pour la phase d'efficacité par épreuve, ceux-ci devront être euthanasiés pour des raisons de biosécurité après administration d’un agent pathogène ARG2.
Remplacement
La première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats, ce qui permet une première sélection, réduisant ainsi le nombre de candidats à tester in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie. Le produit testé est un candidat vaccin vivant atténué qui a déjà démontré une certaine efficacité sur des animaux SPF. Il s’agit maintenant de démontrer son efficacité - seul ou couplé - sur des animaux conventionnels c’est à dire en présence d’anticorps maternels. L’étude visant à évaluer l’efficacité du vaccin face aux anticorps maternels présents, le recours à l’espèce cible est à l’heure actuelle indispensable, car il n’existe pas de modèle pouvant reproduire les interactions existantes entre les anticorps maternels, le vaccin administré et la réponse immunitaire en découlant.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans la procédure 1 de screening est calculé de manière à obtenir un nombre suffisant de chiots avec un taux d’anticorps maternels anti-CPV permettant l’inclusion dans la procédure 2, en se basant sur des données obtenues historiquement (cf détail §3.4.10). En cas de vaccination avant sevrage des animaux (l’âge de vaccination dépendant d’un taux de MAB cible), les animaux seront inclus dans les procédures 2 et 3 par portées; le nombre de chiots dans ces procédures sera donc fonction du nombre de chiots par portée. Dans tous les cas, le nombre minimum de chiots/groupe sera de 8 dans les lots vaccinés et de 5 dans le lot contrôle, nombre minimal pour garantir la validité des résultats obtenus et limiter l’impact de la variabilité des anticorps maternels au niveau du groupe. Ce nombre a été calculé en se basant sur les exigences de la Pharmacopée Européenne et sur l’historique des études précédentes.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’au moins 4 jours est prévue. Si les chiots sont déjà hébergés avec leur mère avant le début des procédures, la période d’acclimatation ne sera pas nécessaire. Les conditions d’hébergement seront adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe ou par portée. Des enrichissements adaptés au milieu seront mis en place : litière, jouet, panier ou tunnel/plateforme. La contention et les actes techniques seront réalisés par un personnel hautement qualifié. Ils pourront avoir recours à une anesthésie et/ou une analgésie si l’acte ou l’animal le nécessite. Pour la phase vaccinale, les animaux seront hébergés dans un milieu protégé pour éviter toutes contamination des animaux non vaccinés par un virus sauvage ou une souche vaccinale provenant d’animaux vaccinés sur le même site. Dans tous les cas, les animaux sont suivis quotidiennement voire biquotidiennement en période de phase critique. Des points limites spécifiques de la parvovirose sont appliqués.
Choix des espèces
Le chien est l’espèce cible d’un vaccin contre la parvovirose canine, et le jeune chien est le modèle optimal pour évaluer l’efficacité d’un vaccin vis-à-vis des anticorps maternels. Des chiots à partir de 2 semaines seront prélevés afin d’évaluer et de suivre les taux d’anticorps maternels anti-CPV. Des chiots à partir de 4 semaines d’âge et possédant un taux d’anticorps maternels contre CPV élevés seront inclus dans la procédure 2 (vaccination pouvant être réalisée jusqu’à 8-9 semaines d’âge). Pour pouvoir évaluer l’efficacité de candidat vaccin vis-à-vis des anticorps maternels, il est nécessaire d’utiliser des chiots ayant encore un taux élevé d’anticorps maternels. La cible est fixée pour une vaccination des animaux à des titres forts rencontrés lors des schémas de vaccination classique contre la parvovirose. Ces titres peuvent être obtenus à partir de 4 semaines d’âge, il est donc nécessaire de commencer à suivre les titres d’anticorps de manière précoce (2 semaines d’âge).
Formation concepteur – Rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 150
Former jusqu'à vingt-quatre étudiants par an à la contention, aux injections et à la mise à mort des rongeurs : 150 souris et 150 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Chaque participant manipule un seul animal par séance, une séance avec des rats et une avec des souris. Les injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intramusculaires et intraveineuses ainsi que les gavages volontaire et imposé se font sans anesthésie, sur une dizaine de minutes, les prélèvements de sang étant eux réalisés sous anesthésie. La mise à mort fait partie du programme et se prolonge par des prélèvements d'organes, le porteur écrivant qu'après un apprentissage sur maquettes, modèles en silicone et peluches, il reste "incontournable" de réaliser quelques gestes de base sur souris vigiles.
Objectifs
La formation sera conposée de séances de travaux pratiques intégrées au modules d'enseignements. Leurs objectifs seront dans un 1er temps de bien connaître les bonnes pratiques de manipulation des rongeurs, incluant l’enrichissement de leurs milieux d’hébergement. Les participants seront initiés aux principaux gestes techniques réalisés sur rats et souris (différentes méthodes de préhension et de contention dans le cadre de socialisation, pesée...). Les séances viseront également à apprendre les techniques d’administrations et de prélèvements sur animaux vigiles les mieux adaptées. La gestion de la souffrance (reconnaissance des signes) et de la douleur grâce à l’emploi adapté d’analgésiques et d’anesthésiques. Ensuite, les participants apprendront les meilleures techniques de mise à mort des animaux et à effectuer des prélèvements d’organes post-mortem. Pour ces séances, nous avons estimé qu’il serait suffisant de faire deux séances dans lesquelles chaque participant manipulera un seul animal : une séance avec rats et une séance avec souris. Etant donné l’objectif de ce projet, les tests statistiques ne sont pas nécessaires. Au cours de ce projet 24 étudiants au maximum seront formés par an.
Bénéfices attendus
Les travaux pratiques permettront l'acquisition des principaux gestes techniques dans le respect de la régle des 3 R, aux participants de notre formation concepteur de procédures expérimentales chez le rongeur.
Procédures
Toutes les administrations seront effectuées sans anesthésie (ou sur animaux vigiles), à savoir : les administrations intrapéritonéales, sous -cutanées, intra-musculaires, et intraveineuses, ainsi que les gestes de gavages volontaire et imposé (les volumes de solution de NaCl injectés lors de ces travaux pratiques seront réduits au minimum). L'ensemble dure 10 minutes. Tous les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie : le prélèvement de sang au niveau de la veine caudale chez le rat (5 minutes) et le prélèvement de sang au niveau de la veine mandibulaire chez la souris (5 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances seront liées à l'apprentissage de la contention des animaux et de l’administration par voie orale par les apprenants pratiquant pour la premier fois ce geste avec un animal vigile. Les injections et prélevements sanguins pourront être à l’origine de douleurs légères et de courtes durées.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. De plus cela permettra de faire des prélèvements post mortem afin de compléter l’apprentissage.
Remplacement
Nous avons mis en place des méthodes alternatives pour l’anatomie (utilisation de maquette et de table numérique Anatomage), les gestes basiques (modèles en silicone, peluches pour l'apprentissage des injections et prélèvements…). Ce projet a été ainsi conçu avec le minimum possible d’animaux. Cependant, il apparaît incontournable de réaliser quelques gestes de bases sur souris vigiles dans ce contexte de formation.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux pour la formation, les apprenants auront 1 animal par TP. Nous utiliserons les animaux des 2 sexes : 3 mâles et 2 femelles souris et rats; et 2 mâles et 3 femelles souris et rats par session de TP.
Raffinement
Les animaux sont hébergées par lot dans des cages dont la taille est règlementaire, avec enrichissement modifiable (tubes, feuilles de papier ouaté, dômes…). Cet hébergement sera réalisé dans une animalerie en conditions contrôlées. Un suivi de soin journalier sera effectué durant toute la période d'hébergement. Les format.eurs.rices sont des experts en expérimentation animale, maitrisant tous les gestes basiques sur souris et les rats. Tous les gestes techniques seront appris et répétés sur des mannequins, ce qui limitera le risque de nuissance sur animaux vivant lors des séances. Le gavage sera réalisé avec des sondes souples, limitant toute nuisance. Par ailleurs les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie. En cas d'atteinte des points limites, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La Formation concepteur (Rongeurs ) demandée ici est liée à la « Formation à l’utilisation des rongeurs à des fins scientifiques – Conception et Réalisation des Procédures » que nous proposont concernent l'utilisation des rongeurs (rats et souris) majoritairement utilisés dans les laboratoires de recherche. Notre agrément de formation concernera uniquement ces 2 espèces. Les animaux seront tous adultes pour faciliter l'apprentissage des gestes techniques.
Sélection de nouvelles constructions génétiques chez la souris pour la restauration visuelle par stimulation optique ou ultrasonore.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une injection de particules virales dans les deux yeux, quatre séances d'imagerie du fond d'œil et, pour une partie, un électrorétinogramme de trente minutes, chaque acte sous anesthésie générale : 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées après treize semaines au maximum pour prélever les yeux et le cerveau. L'injection peut provoquer une hémorragie oculaire, une cataracte ou une inflammation de la rétine, et toute atteinte oculaire sévère entraîne la mise à mort de l'animal. Il s'agit de comparer des protéines sensibles à la lumière et des protéines sensibles aux ultrasons, introduites par vecteur viral, pour sélectionner des constructions génétiques candidates à une restauration de la vision. La moitié des souris appartient à une lignée mutante dont les photorécepteurs ont entièrement disparu à cinq semaines, ce qui reproduit selon le porteur les conditions de cécité étudiées.
Objectifs
Notre projet vise à mettre au point de nouvelles méthodes pour restaurer la vision chez des personnes devenues aveugles. La perte de la vue représente un handicap majeur qui réduit fortement l’autonomie. Parmi les principales causes figurent la rétinite pigmentaire et le glaucome, deux maladies pour lesquelles il n’existe pas encore de traitement permettant de retrouver une vision utile. Nous étudions deux approches innovantes et complémentaires : l’optogénétique, qui repose sur l’utilisation de protéines sensibles à la lumière, et la sonogénétique, qui utilise des protéines sensibles aux ultrasons. L’idée est de rendre certaines cellules nerveuses de la rétine réactives à ces signaux afin de restaurer la transmission d’informations visuelles au cerveau, même lorsque les photorécepteurs ont disparu. Nos expériences sont menées sur deux types de souris : une lignée non génétiquement altérée et une lignée mutante présentant une dégénérescence complète de la rétine, qui reproduit les conditions observées dans certaines formes de cécité. Nous sélectionnons différentes protéines photosensibles ou mécanosensibles, que nous introduisons dans les cellules nerveuses à l’aide de vecteurs de thérapie génique sûrs dérivés de virus. Plusieurs combinaisons sont testées afin d’identifier celles qui offrent la meilleure efficacité et la meilleure sensibilité. Enfin, nous analysons la réponse des rétines ainsi traitées pour déterminer les conditions d’activation les plus adaptées, avec l’objectif final de transférer ces stratégies vers de futures applications cliniques.
Bénéfices attendus
La rétinite pigmentaire (RP) regroupe des dystrophies rétiniennes héréditaires caractérisées par une dégénérescence progressive des photorécepteurs. Elle débute le plus souvent par une perte du champ visuel périphérique (dite vision en tunnel), pouvant évoluer vers une atteinte centrale. Sa prévalence est estimée à 1/3 000–5 000, soit environ 1,5 million de patients dans le monde, dont 30 000 à 40 000 en France. Maladie rare et génétiquement très hétérogène, la RP ne bénéficie pas encore de traitement curatif. À l’inverse, le glaucome est une neuropathie optique fréquente, caractérisée par la perte progressive des cellules ganglionnaires rétiniennes et une atteinte du nerf optique, souvent liée à une élévation de la pression intraoculaire. Il évolue silencieusement, entraînant une perte du champ visuel périphérique puis central. Principale cause de cécité irréversible, il touche environ 80 millions de personnes dans le monde, dont 1 à 1,5 million en France, avec une forte proportion de patients non diagnostiqués. L’optogénétique et la sonogénétique représentent deux pistes prometteuses pour redonner la vue à des personnes atteintes de cécité liée à des maladies de la rétine. L’optogénétique utilise des protéines sensibles à la lumière, tandis que la sonogénétique fait appel à des protéines réactives aux ultrasons. Ces approches visent à rendre certaines cellules de la rétine capables de transmettre à nouveau un signal visuel au cerveau, même lorsque les photorécepteurs ont disparu. L’optogénétique est déjà bien avancée : les premières preuves expérimentales datent de 2006 et un premier essai clinique chez l’homme a eu lieu en 2021. Ce projet s’inscrit dans cette dynamique en cherchant à améliorer ces thérapies au niveau de l’œil, tout en explorant le potentiel complémentaire de la sonogénétique. L’approche sonogénétique, développée récemment présente de nombreux avantages sur la stratégie optogénétique, notamment grâce aux évolutions conjointes des sondes d’imagerie qui permettent de stimuler en imageant les structures stimulées. Dans ce projet, nous identifions des constructions génétiques candidates (vecteurs candidats) pour des tests précliniques qui pourraient en découler. La comparaison des résultats entre stimulation lumineuse pour l’optogénétique et par ultrason pour la sonogénétique sera également un atout majeur, apportant un bénéfice direct de joindre ces tests.
Procédures
Un premier lot d’animaux non génétiquement altérés sera soumis à une chirurgie consistant en une injection intraoculaire de particules virales, réalisée sous anesthésie générale et analgésie. L’intervention, d’une durée d’environ dix minutes, sera effectuée une seule fois par animal sur les deux yeux. Ces animaux feront également l’objet de séances d’imagerie oculaire permettant l’observation du fond d’œil. Ces examens, eux aussi réalisés sous anesthésie générale, dureront environ dix minutes pour les deux yeux et seront répétés quatre fois par animal. Un second lot d’animaux mutants suivra le même protocole chirurgical, avec une injection intraoculaire de particules virales sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée d’une dizaine de minutes, réalisée une fois pour les deux yeux. Ils bénéficieront également de quatre séances d’imagerie du fond d’œil, chacune d’environ dix minutes sous anesthésie générale. Enfin, ces animaux feront l’objet d’un enregistrement de l’activité électrique de la rétine par électrorétinogramme, toujours sous anesthésie générale et analgésie, pour une durée d’environ trente minutes, effectué une seule fois pour les deux yeux.
Impact sur les animaux
L’imagerie du fond de l’œil et l’enregistrement de l’activité rétinienne par electroretinogramme comportent un risque faible de défaillance cardio-respiratoire lié à l’anesthésie. L’injection intraoculaire présente également ce risque, auquel s’ajoute la possibilité de provoquer une petite hémorragie oculaire localisée lors de l’administration du vecteur candidat. Cette hémorragie se résorbe généralement dans les 24 heures. Dans les jours qui suivent l’injection, une cataracte ou une inflammation localisée du tissu rétinien peut apparaître, cette dernière disparaissant le plus souvent en moins de quinze jours. Ces complications demeurent cependant peu fréquentes, avec une incidence inférieure à cinq pour cent. Enfin, pour les souris ayant reçu une injection intraoculaire, toute atteinte oculaire sévère, telle qu’une inflammation marquée ou un gonflement, entraînera l’euthanasie de l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié en fin de période de maintien (13 semaines au maximum) par une méthode réglementaire. Des prélèvements et analyses ex-vivo des tissus (yeux et cerveau) sont nécessaires post mortem pour les animaux inclus dans ce projet.
Remplacement
Avant toute expérimentation in vivo, des mesures de remplacement ont été mises en œuvre afin de limiter le recours aux animaux. Les séquences des vecteurs candidats ont d’abord fait l’objet d’analyses in silico approfondies afin d’évaluer leur efficacité potentielle d’expression et leur spécificité. Seules les constructions les plus prometteuses identifiées par cette étape préliminaire ont été retenues pour un passage à l’expérimentation animale, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au strict nécessaire. Les expériences impliquant les animaux sauvage et mutant aboutissent à la collecte des rétines et du cerveau, une analyse détaillée ex vivo sera réalisée permettant d’obtenir une pré-validation des vecteurs candidats, en définissant leur efficacité fonctionnelle. Nous voulons également utiliser les tissus collectés pour la culture de coupe de cerveau ou de morceau de rétine, ce qui permettra de tester des vecteurs candidats de façon plus détaillée ou de tester d’autres constructions. Ces tests ex-vivo restent cependant limités notamment pour évaluer les capacités de traitement des vecteurs viraux. Les mécanismes physiologiques de diffusion des particules virales dans l’œil et la pénétrance de ces particules dans la rétine, ne peuvent être observés que sur un œil en fonctionnement. L’utilisation de l’animal est donc indispensable.
Réduction
Le nombre et le type de vecteurs viraux utilisés dans ce projet ont été rigoureusement optimisés en amont afin de limiter le recours aux animaux. Parmi l’ensemble des constructions génétiques théoriquement possibles, seules celles présentant un intérêt scientifique clairement établi et une pertinence démontrée ont été retenues. Cette sélection permet de réduire le nombre de conditions expérimentales testées tout en garantissant la validité des résultats obtenus. Ainsi, le protocole proposé repose sur un choix restreint mais justifié de vecteurs, évitant toute utilisation superflue et respectant les principes de réduction et de raffinement de l’expérimentation animale. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables et répondre aux objectifs scientifiques. Ce nombre a été calculé à partir d’études précédentes et confirmé par des méthodes statistiques permettant de s’assurer que les résultats auront une valeur scientifique solide. Concrètement, cela signifie que nous avons choisi la plus petite taille de groupe possible tout en garantissant que les conclusions soient robustes et interprétables. Au total, nous prévoyons d’utiliser 480 souris non génétiquement altérées et 480 souris présentant une mutation spécifique.
Raffinement
Les animaux venant de l’extérieur passeront une période d’adaptation d’au moins 5 jours. Ils seront logés dans des cages équipées de matériel d’enrichissement, avec nourriture et eau disponibles en permanence. La température et l’humidité de la salle seront maintenues stables. Nous utilisons de la litière de peuplier dépoussiérée afin de limiter les irritations possibles des yeux. Lors des séances d’imagerie, les animaux recevront une anesthésie par gaz. Pour les enregistrements d’électrorétinogramme, une anesthésie locale de la cornée sera ajoutée, et les animaux seront installés sur une table chauffante. La chirurgie d’injection dans l’œil sera réalisée dans des conditions stériles, avec les animaux placés sur un tapis chauffant. Ils recevront une anesthésie générale (par gaz) et locale (sur la cornée), ainsi qu’un traitement antidouleur à base d’opioïdes. Après la chirurgie, une surveillance quotidienne renforcée sera mise en place grâce à une signalisation spécifique. Des critères précis permettront de définir des points limites pour assurer le bien-être des animaux
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle expérimental car elle est largement utilisée pour l’étude du système visuel et validée pour explorer la perception sensorielle ainsi que le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce projet, deux modèles complémentaires seront employés : l’un avec une rétine intacte et fonctionnelle, l’autre présentant une dégénérescence complète des photorécepteurs, reproduisant ainsi la situation rencontrée chez l’humain dans certaines maladies rétiniennes responsables de cécité. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de cinq semaines, moment où les structures cérébrales et rétiniennes ont atteint leur maturité fonctionnelle. Chez les modèles dégénérés, ce stade correspond à la perte complète des photorécepteurs, ce qui garantit la pertinence de leur utilisation pour reproduire les conditions de cécité étudiées.
Test de stratégies expérimentales permettant de prévenir les troubles moteurs et cognitifs dans un modèle murin de paraplégie spastique héréditaire MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Les souris porteuses de deux copies du gène muté développent des difficultés locomotrices, une prostration et une perte de poids à partir de seize mois, un phénotype que le porteur réserve aux lots expérimentaux. 3 086 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la quasi-totalité et modéré pour quarante d'entre elles. Le génotypage passe par le prélèvement de l'extrémité de la queue, puis viennent un traitement de sept mois incorporé aux croquettes ou un gavage unique de la mère gestante. Suivent trois séries de deux tests comportementaux, un test de mémoire répété cinq jours et un test de coordination motrice répété trois jours, et pour un groupe jusqu'à quatorze prélèvements de sang sous anesthésie toutes les deux semaines. Les couples reproducteurs sont tués dès que leur reproduction baisse, les autres à la fin de chaque procédure pour récupérer des tissus ou prélever des embryons.
Objectifs
Les paraplégies spastiques héréditaires sont des maladies neurodégénératives d’origine génétique caractérisées par une mort neuronale, mais aussi parfois des troubles de développement du cerveau. Ces maladies sont très hétérogènes et sont causées par des mutations dans environ 80 gènes différents. Elles touchent environ 3 personnes sur 100.000 en Europe, avec un début généralement à l’âge adulte mais qui peut apparaitre dans l’enfance. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour la prise en charge de ces pathologies. Nous travaillons sur une des formes les plus fréquentes de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles de développement du système nerveux. Nous utiliserons un modèle animal (souris) pour cette forme de paraplégie spastique héréditaire. Nous avons déjà montré que ce modèle présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau et il récapitule les principaux signes observés chez les patients. L’objectif du projet est de mieux caractériser les différentes étapes d’évolution de la maladie, de son développement à la mort neuronale, et d’évaluer dans un modèle animal des stratégies thérapeutiques qui pourraient permettre de prévenir l’apparition des symptômes et la mort neuronale. MODIFICATION : l’allongement du temps de maintien des animaux de 8 à 12 mois implique l’ajout de tests comportementaux et d’un prélèvement sanguin ce qui nécessite une modification du projet initial sans ajout d'animaux.
Bénéfices attendus
Nous travaillons sur une des formes les plus fréquente de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles du neurodéveloppement et actuellement aucun traitement ne peut être proposé aux patients. Un premier aspect du projet permettra de tester l’efficacité de deux médicaments sur la mort neuronale dans le modèle animal de la maladie. Si nous pouvons démontrer qu’au moins un de ces deux médicaments retarde la mort neuronale, notre projet pourrait permettre d’avancer vers une stratégie thérapeutique pour les patients atteints de cette paraplégie spastique héréditaire. Par ailleurs, nous savons que la maladie que nous étudions est associée à de légers défauts de développement du cerveau, mais nous ne savons pas si, et dans quelle mesure, ces défauts participent à l’apparition des symptômes de la maladie. Notre projet pourrait permettre de répondre à cette question. Comme le diagnostic des patients a généralement lieu à l’adolescence, après la phase de développement, la compréhension du rôle du développement permettra de mieux expliquer la maladie aux patients et d’améliorer leur prise en charge.
Procédures
La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un petit prélèvement de l’extrémité terminale de la queue sera effectué sur les jeunes animaux. Cet acte sera réalisé rapidement (moins d’une minute par animal) et une seule fois sur chaque animal. Nous réaliserons des traitements pour évaluer leur impact sur l’évolution de la maladie. Une approche sera un traitement chronique pendant 7 mois qui sera administré par incorporation dans les croquettes pour éviter des gestes invasifs. Une autre approche sera une administration unique par gavage de la mère gestante à un moment précis du développement embryonnaire (une fois, inférieur à une minute). Une partie des animaux sera soumise à trois séries de 2 tests comportementaux sur des animaux vigiles (à l’âge de 6 semaines, 4 mois et 8 mois, ou 4 mois, 8 mois et 12 mois). Le premier test est répété pendant 5 jours et vise à étudier les troubles de la mémoire (3minutes maximum par session, 2 fois 5 jours) ; le second test est répété pendant 3 jours et vise à tester la coordination motrice (5 minutes maximum par session, 5 fois 3 jours). A l’issue de chaque série de tests comportementaux, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie générale (3 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement). Un groupe d’animaux sera soumis à des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie générale toutes les 2 semaines (14 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement) L’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire en fin de procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour le génotypage peut générer une légère douleur chez l’animal et un risque rare de saignement. Pour l’étude de l’effet thérapeutique de médicaments, des effets secondaires (diarrhées, perte de poids) pourraient être associés au traitement. Pour l’étude sur la contribution du développement à la maladie, nous administrerons un médicament par gavage, ce qui peut générer une gêne et un inconfort et des effets indésirables liés à la molécule administrée. Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. Les prélèvements de sang peuvent générer un stress, une douleur et un inconfort lié à la piqûre, et leur répétition peut engendrer une déshydratation. Il existe un risque d’hématome après le prélèvement. L’anesthésie générale mise en place pour les prélèvements sanguins sera associée à une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque rare de dépression cardiorespiratoire. La mutation génétique portée par les souris porteuses de 2 copies du gène muté peut générer des souffrances après de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.
Devenir
Les couples ayant permis les générations des animaux seront euthanasiés lorsqu'une diminution significative de la reproduction est observée. A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem ou prélever des embryons.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons dans la mesure du possible des modèles in vitro qui évitent l’utilisation d’animaux. En effet, nous utilisons des modèles in vitro qui miment le développement du cerveau et qui permettent de répondre à certaines questions sur la contribution de ce développement sur la maladie que nous étudions. Cependant ce modèle in vitro ne permet pas de répondre à toutes les questions car : (i) le comportement des neurones diffère selon leur environnement in vitro et in vivo ; et (ii) la mise en place de l'organisation du cerveau ne peut pas être reproduite in vitro. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de mener des expériences comportementales. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable pour notre projet, mais nous utiliserons le modèle in vitro dès que possible afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans le cadre de la maladie que nous étudions, il existe un modèle de souris permettant d’évaluer les différents aspects que nous souhaitons étudier dans ce projet et ainsi obtenir des données transposables chez l’homme. L’étude de l’effet thérapeutique de médicaments sur les symptômes de la maladie ne peut se faire que sur un modèle animal et ne peut pas être remplacé par un modèle in vitro. De même, l’étude de l’influence d’un développement anormal sur l’organisation du cerveau adulte et ses conséquences comportementales ne peut se faire qu’avec des modèles animaux. Il n’existe pas de méthodes expérimentales n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettent d'étudier le développement du cerveau et ses effets sur des troubles moteurs et cognitifs. Ces éléments rendent l’utilisation de l’animal indispensable pour notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte la lignée de souris génétiquement modifiée nécessaire à l'étude et en réduisant au plus le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables et valides. Nous affinerons les analyses statistiques en fonction de données à analyser. De plus, afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. En nous basant sur nos études précédentes, nous estimons qu’il nous faudra de 8 à 20 animaux par groupe en fonction des analyses à réaliser. Ainsi, au total, nous estimons qu’il faudra 3086 animaux pour obtenir des résultats significatifs dans ce projet. Toutefois, si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux, tous ne seront pas utilisés, ni produits. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires pour nos lots expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce et seront observés quotidiennement. Les animaux que nous utilisons sont génétiquement modifiés. Comme seules les souris porteuses de 2 copies du gène muté présentent un phénotype dommageable, nous privilégierons un schéma de croisement permettant de limiter le risque d’expression du phénotype dommageable seulement aux animaux nécessaires pour les lots expérimentaux. Le maintien de la lignée privilégiera les animaux avec une seule copie du gène muté. Les animaux porteurs de 2 copies du gène muté seront particulièrement surveillés pour détecter tout signe précoce d’expression du phénotype dommageable, notamment des difficultés locomotrices et une prostration qui sont 2 signes caractéristiques liés à la mutation. La biopsie pour génotypage sera la plus petite possible et réalisée sur un animal jeune (cicatrisation rapide). Il s’agit d’un geste rapide, réalisé au calme et parfaitement maitrisé. Pour le maintien de notre lignée, afin d’éviter toute dérive génétique, toutes les 10 générations, nous croiserons notre lignée de souris avec des souris sauvages provenant d’un élevage extérieur. Les souris qui recevront des traitements à visée thérapeutique seront traitées à des doses déjà utilisées dans des publications et n’entrainant pas d’effets délétères. Ces souris seront néanmoins surveillées dans les jours qui suivent l’intervention pour vérifier qu’elles continuent à s’alimenter. De plus, les traitements chroniques seront administrés par incorporation à la nourriture afin de diminuer la manipulation des animaux. Pour réduire le stress en lien avec les prélèvements de sang ils seront réalisés sous anesthésie générale. Pour les animaux soumis à des prélèvements répétés, après chaque prélèvement une injection de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir toute déshydratation. Des points limites spécifiques à chaque procédure sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Un protocole d’analgésie sera utilisé lors de l’euthanasie des souris afin qu’elle se fasse sans douleur et sur un animal pré-sédaté.
Choix des espèces
Dans le projet, nous utiliserons un modèle de souris déjà caractérisé et qui récapitule les principaux symptômes observés chez les patients atteints de la forme de maladie que nous étudions. L’étude de ce modèle nous permettra donc d’obtenir des données transposables chez l’homme. Le modèle de souris utilisé présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau. Ce modèle est donc parfaitement adapté pour répondre à notre question scientifique, et il est impossible de répondre à cette question sans l’utilisation d’un modèle animal. Afin d’étudier les différentes composantes de la maladie et l’impact d’un traitement à différents âges sur son évolution, nous étudierons des animaux à partir du stade embryonnaire jusqu’à l’âge de 12 mois. La mutation génétique des animaux sera vérifiée à l’âge de 7 à 10 jours.