Procédures légères

Exposées sous anesthésie à la piqûre de moustiques porteurs du virus de la fièvre du Nil occidental pendant une trentaine de minutes, 1 606 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 286 d'entre elles et modéré pour 1 320 autres. Une partie est rendue immunodéficiente par manipulation génétique ou par injection d'anticorps détruisant certaines cellules immunitaires. Le porteur annonce ensuite quatorze jours d'observation et de pesée, et indique attendre des symptômes métaboliques et neurologiques liés à l'infection flavivirale, sans les décrire. Il justifie le choix de la souris par sa petite taille et la facilité de manipulation, en ajoutant que cette taille "permet aussi la piqûre simultanée par plusieurs moustiques, nécessaire pour maximiser l'effet de l'infection".

Objectifs

Le projet vise à promouvoir le développement d’un vaccin contre les flavivirus transmis par les moustiques. La cible du vaccin candidat a été identifiée et correspond à un facteur de transmission dans la salive du moustique. L’équipe de recherche a déjà démontré que l’immunisation contre ce facteur de transmission protège contre l’infection par le virus de la fièvre du Nil Occidental dans un modèle murin de type sauvage. Pour soutenir le développement vaccinal, le projet décrit ici a deux objectifs : (i) décrypter le(s) mécanisme(s) de protection ; et (ii) évaluer la protection contre plusieurs flavivirus transmis par les moustiques. Ces deux objectifs nécessitent l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés. (i) Pour décrypter les facteurs immunitaires responsables de la protection, nous évaluerons l’efficacité de la vaccination dans différentes colonies de souris où les diverses branches de l’immunité ont été supprimées par des manipulations génétiques ou par l’injection d’anticorps ciblant différentes cellules. (ii) Les souris de type sauvage ne sont pas susceptibles d’être infectées par d’autres flavivirus que le virus de la fièvre du Nil Occidental. L’infection par des flavivirus tels que ceux de la dengue, du Zika, de la fièvre jaune et de l’encéphalite japonaise nécessite des souris dont l’immunité innée a été génétiquement altérée. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU1/2 et EU2/2).

Bénéfices attendus

Ce projet soutiendra le développement d’un vaccin contre plusieurs flavivirus. Ces flavivirus infectent plus d’un demi-milliard de personnes dans le monde et causent la mort d’environ 200 000 personnes chaque année. Pourtant, il n’existe actuellement aucune méthode de protection contre tous. En soutenant le développement d’un vaccin contre les flavivirus, ce projet contribuera à étoffer l’arsenal thérapeutique contre ces maladies.

Procédures

Dans un premier temps, nous évaluerons les facteurs immunitaires nécessaires pour la vaccination. Nous injecterons à deux reprises des souris présentant différents types de déficiences immunitaires avec le candidat vaccin. Les injections dureront quelques minutes. Deux semaines après la dernière injection, les souris seront anesthésiées pour prélever du sang, puis euthanasiées pour prélever la rate afin d’analyser la réponse immunitaire. Ensuite, nous évaluerons l’effet des facteurs immunitaires sur la protection conférée par le vaccin. Des souris présentant les mêmes types de déficiences immunitaires que précédemment seront injectées avec le vaccin, puis exposées à la piqûre de moustiques infectés par le virus de la fièvre du Nil Occidental. L’exposition aux moustiques, sous anesthésie, durera moins de 30 minutes. Nous effectuerons ensuite un seul prélèvement sanguin pour vérifier l’infection et évaluerons les symptômes pendant 14 jours en observant et pesant les souris. Enfin, nous évaluerons l’effet de la vaccination sur la protection contre l’infection par les virus de la dengue, du Zika, de la fièvre jaune et de l’encéphalite japonaise. Des souris génétiquement modifiées, susceptibles à ces flavivirus, seront injectées avec le vaccin, puis exposées à la piqûre de moustiques infectés par ces virus. Nous procéderons de la même manière que pour le virus du Nil Occidental pour la vérification de l’infection et le suivi des symptômes. Toutes les immunisations seront conduites dans l’EU2/2. Toutes les infections et les procédures sur animaux infectées seront conduites dans l’EU1/2.

Impact sur les animaux

Douleur passagère au niveau du site d’injection lors de l’administration du vaccin candidat et des anesthésiques, ainsi que lors des prélèvements sanguins. Développement de symptômes métaboliques et neurologiques associés à l’infection flavivirale.

Devenir

Les animaux utilisés pour l’étude de la réponse immunitaire à notre vaccin candidat seront euthanasiés afin de permettre la collecte de sang et d’organes. Tous les animaux infectés seront euthanasiés à la fin des procédures, conformément à l’obligation légale.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun modèle autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet de l’immunisation sur la transmission par piqûre de moustique. Néanmoins, nous avons généré les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles cellulaires in vitro.

Réduction

Pour évaluer l’effet de la réponse immunitaire dans les différentes conditions de déficiences immunitaires, nous utiliserons 5 souris par groupe car ce nombre est le minimum pour obtenir des données fiables selon des travaux préliminaires. Pour quantifier l’effet de la vaccination sur l’infection nous utiliserons 15 souris par groupe, nous avons effectué des calculs statistiques de puissance à partir d'expériences préliminaires pour connaitre le nombre minimum d'individus nécessaire.

Raffinement

Les souris auront accès à des enrichissements variés. Les souris seront anesthésiées avant leur exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler de possibles anomalies liées à la narcose. Entre autres, nous suivront les grandes fonctions. En dehors des expériences, le suivi des animaux s’effectuera quotidiennement en se basant sur la grille de scoring des symptômes. Des points limites seront mises en place suivant ce score.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris. Les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler, avec lesquelles nous avons développé et évalué la stratégie vaccinale. Nous continuerons à documenter la protection conférée par notre vaccin candidat sur souris avant de tester le vaccin candidat sur des animaux plus grands pour soutenir une demande d’essais cliniques. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6-8 semaines car ils ont un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate. Leur taille permet aussi la piqûre simultanée par plusieurs moustiques, nécessaire pour maximiser l’effet de l’infection. Leur taille facilite leur manipulation.

Pour étudier la fibrose de l'hypophyse provoquée par l'hypothyroïdie, 7 756 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 420 d'entre elles et modéré pour les 7 336 autres. Une hypothyroïdie leur est induite par un régime pauvre en iode pendant cinq semaines au maximum. Jusqu'à 3 240 souris sont opérées pour implanter une fibre optique ou une lentille dans le cerveau, puis hébergées seules, l'isolement étant reconnu par le porteur comme une source de stress. Il écrit que les animaux implantés "ne présentent aucun signe de stress lors des séances d'imagerie", et annonce dans le même document que l'ensemble des expérimentations prévues ne sera pas réalisé, sans dire combien de souris seront effectivement utilisées.

Objectifs

L'hypothyroïdie est une maladie courante qui touche 5% de la population mondiale et plus particulièrement les femmes. Elle est causée par une baisse de la fonction thyroïdienne indispensable au bon fonctionnement de nombreux processus métaboliques due à divers facteurs comme des maladies auto-immunes, des traitements médicaux ou simplement des carences en iode. Problème de santé publique majeur, elle entraine fatigue chronique, forte prise de poids incontrôlable, dépression, ... Non traitée, elle peut entraîner des complications graves, telles que des maladies cardiovasculaires, des troubles neurologiques ou encore des problèmes de fertilité. L'axe hypothalamo-hypophysaire contrôle la fonction thyroïdienne grâce à des boucles hormonales de rétrocontrôle au niveau de la thyroïde, de l’hypophyse et de l’hypothalamus. Lors d’études précédentes, nous avons mis en évidence une perturbation de la sécrétion d’une hormone clé hypophysaire de la fonction thyroïdienne, la thyréostimuline (TSH), chez des souris atteintes d’hypothyroïdie. En parallèle, nous avons observé un remodelage du collagène hypophysaire chez des souris présentant une hypothyroïdie. Ces résultats laissent supposer que cette pathologie entrainerait une inflammation au niveau de l’hypophyse conduisant à une fibrose dont les mécanismes et l’impact sont encore inconnus. Ce projet a pour but : o L’étude des mécanismes responsables de la sécrétion pulsatile de la TSH en conditions physiologique et pathologique (hypothyroïdie) et un potentiel dimorphisme sexuel, o L’étude de la mise en place et de l’impact d’une fibrose hypophysaire chez la souris hypothyroïdienne, o L’étude des relations intra-hypophysaires entre les différents types cellulaires impliqués dans l’hypothyroïdie dont en particulier les cellules régulant le flux sanguin (les vaisseaux étant largement impactés par la maladie), les cellules endocrines et les cellules produisant le collagène.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes associés à l’hypothyroïdie afin d’établir de nouvelles pistes de diagnostic et de thérapie en santé humaine, mais également comment les femmes sont plus touchées par la maladie à moyen terme. A plus long terme, le rôle de la fibrose potentiellement bénéfique lors de l’hypothyroïdie n’a encore jamais été exploré et pourrait permettre à la fois une meilleure compréhension des mécanismes de protection de l’hypophyse et l’ouverture d’une nouvelle voie thérapeutique.

Procédures

L’ensemble des animaux (excepté les souris contrôles) seront soumis à un régime spécifique pauvre en iode afin d’induire une hypothyroïdie. Ce régime est prolongé au maximum 5 semaines. Au très grand maximum, 3744 souris seront manipulées uniquement sous anesthésie générale associée à une analgésie. 420 souris seront prélevées de quelques microlitres de sang pendant 1 à 2 heures une fois par semaine pendant maximum 8 semaines. Au très grand maximum, 3240 souris seront opérées sous anesthésie générale et sous analgésie afin d’implanter une fibre optique ou une fine lentille dans le cerveau. Nous continuons l’analgésie pendant 2 à 3 jours. Cette opération permettra par la suite d’avoir accès à une zone d’intérêt dans le cerveau pour imagerie ou stimulation lumineuse. Ces animaux sont imagés libres de leurs mouvements après habituation et ne présentent aucun signe de stress lors des séances d’imagerie. Ils peuvent être utilisés pendant plusieurs mois et sont leur propre contrôle ce qui permet de diminuer drastiquement le nombre d’animaux utilisés.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables sont attendus selon les procédures. Les injections sur souris vigiles vont entrainer une légère douleur au niveau de la zone d’injection. Les injections via le sinus rétro-orbital réalisées sous anesthésie peuvent entrainer une gêne au niveau de l’œil pendant 1 à 2 heures post-injection. Enfin les animaux implantés peuvent souffrir de douleurs post-chirurgicales et d’une perte de poids légère et temporaire, ainsi que d’une augmentation du stress due à leur isolement.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récupérer les organes.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant de reproduire les différentes composantes du remodelage cellulaire dans un système hormonal intégré. Les expérimentations prévues in vivo vont permettre de compléter ce projet par l’étude des interactions entre les différents types cellulaires, localisés à plusieurs niveaux dans l’organisme et communiquant entre eux via la circulation sanguine.

Réduction

Dans une logique de réduction, le nombre d’animaux nécessaire par groupe est proposé à partir d’un logiciel statistique permettant de calculer le nombre minimum d’animaux pour avoir une différence statistique significative. Une partie des expérimentations sera réalisée avec l'animal étant son propre contrôle (suivi de la pathologie et de la récupération) pour réduire le nombre d'animaux nécessaire. Nous ferons des études qui nous permettront de valider les lignées nécessaires et de faire des choix expérimentaux. Ainsi, l’ensemble des expérimentations proposées ne seront pas réalisées ; ce qui devrait réduire drastiquement le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures ne débuteront que sept jours après réception des animaux pour diminuer le stress lié au changement d’environnement. Cette étude impliquera l’isolement des souris ; pour diminuer le stress inhérent, ces dernières seront placées dans un milieu enrichi (frisottis de papier, bâtonnets de coton et abri en carton) sous surveillance régulière et en portoir ventilé et garderont un contact visuel avec leurs congénères. Pour les actes chirurgicaux, les animaux seront opérés sous anesthésie et analgésie et suivis par antalgie les 3 jours suivants l'opération toutes les 24 heures pendant les deux premiers jours post-opératoires). Pour améliorer le quotidien des souris, des matériaux de litière ou des structures de repos adaptés sont installés dans les cages (cabanes, coton, mouchoir en papier, rouleau en carton…). Tous nos protocoles sur animaux vigiles sont réalisés sur animaux non stressés, nous attachons beaucoup d’importance à les habituer aux différentes manipulations pendant plusieurs semaines avec récompense (alimentaire) lors des premières séances d’entrainement. D’anciennes études réalisées dans notre équipe montrent que le taux de cortisol ne traduit aucun stress chez nos animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour plusieurs raisons : la physiologie des hormones thyroïdiennes fonctionne de manière très similaire chez l'homme et la souris, tant au niveau des structures que des hormones et de leur régulation, son patrimoine génétique est relativement proche de celui de l’être humain et il existe une très grande quantité disponible de lignées génétiquement modifiées qui nous permettrons dans ce projet d’étudier une grande variété de types cellulaires impliqués dans l’hypothyroïdie. Les expériences seront réalisées chez des souris adultes (de 8 à 22 semaines) afin que la croissance et la puberté soit terminées. Les animaux seront hébergés une semaine avant le début des expérimentations pour s’acclimater avant le début des expérimentations.

Porteurs d'une insuffisance cardiaque qui se déclare vers vingt-quatre semaines, 228 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils sont exposés plusieurs jours à des conditions de canicule, obtenues par dérogation aux règles d'hébergement, avec hyperthermie et accélération cardiaque et respiratoire attendues. S'y ajoutent trois à cinq échocardiographies et trois à cinq IRM sous anesthésie, trois séjours de vingt-quatre heures en cage à diurèse, deux gavages, des mesures de pression à la queue et une chirurgie pour implanter un capteur télémétrique. Le bénéfice annoncé tient à de meilleures recommandations médicales pour les patients cardiaques pendant les fortes chaleurs, quand le stress thermique imposé aux rats est, lui, planifié.

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre comment les fortes chaleurs, comme celles rencontrées lors des canicules, peuvent aggraver certaines maladies cardiaques. Pour cela, nous utilisons un modèle de rat qui présente naturellement plusieurs problèmes de santé similaires à ceux observés chez les patients atteints d’insuffisance cardiaque. Les animaux seront exposés à une température élevée pendant quelques jours, dans un environnement sécurisé et surveillé. Leur état de santé sera suivi à l’aide d’examens non douloureux, comme l’échographie, ou de petits capteurs mesurant la température ou la pression artérielle. Les résultats aideront à mieux protéger les personnes fragiles lors d’épisodes de chaleur extrême.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre comment la chaleur intense, comme lors d'une canicule, peut aggraver une maladie cardiaque déjà présente. Grâce à ce modèle animal, il sera possible d’observer les effets de la chaleur sur le cœur et la circulation, et d’identifier des signes d’alerte utiles pour prévenir les complications. L’étude évaluera aussi des outils permettant de surveiller les animaux de manière plus précise et moins stressante. Ces travaux pourraient, à terme, aider à mieux protéger les patients cardiaques pendant les périodes de fortes chaleurs, en améliorant les recommandations médicales.

Procédures

Les animaux sont soumis à différentes interventions tout au long de l’étude. Des échocardiographies sont réalisées entre 3 et 5 fois, pour une durée de 15 minutes, sous anesthésie. La pression artérielle est mesurée à la queue à trois reprises, sur animaux vigiles, avec une durée moyenne de 15 minutes par session. Les animaux sont également placés en cage à diurèse à trois reprises, pour des périodes de 24 heures, sans anesthésie. Deux séances de gavage sont effectuées avec contention manuelle, chacune durant seulement quelques secondes, sur animaux vigiles. Une procédure chirurgicale est réalisée une seule fois pour l’implantation d’un capteur télémétrique, sous anesthésie, avec une durée de 20 à 30 minutes. Enfin, des examens d’IRM sont effectués entre 3 et 5 fois, d’une durée de 30 minutes chacun, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

l n’est pas attendu de douleur qui ne soit pas soulagée par des traitements analgésiques appropriés. Toutefois, certaines interventions peuvent entraîner des nuisances pour les animaux. L’utilisation d’un tapis de course pour évaluer la capacité d’exercice chez des animaux vigiles (classe légère) peut provoquer une fatigue, sans douleur manifeste. La pose de capteurs télémétriques nécessite une intervention chirurgicale, susceptible d’induire des douleurs post-opératoires, qui seront prises en charge par une analgésie adaptée. Le placement en cage à diurèse peut engendrer un stress comportemental lié à l’isolement. La prise de pression artérielle peut entrainé un stress de l'animal. Le gavage, quant à lui, peut occasionner une irritation ou une gêne transitoire au niveau de l’œsophage. Enfin, les conditions caniculaires représentent un facteur de stress thermique important, pouvant se manifester par une hyperthermie, une augmentation de la fréquence respiratoire et cardiaque, ainsi qu’une altération du comportement alimentaire et de l’hydratation.

Devenir

À la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés conformément aux normes éthiques en vigueur afin de permettre les prélèvements nécessaires aux analyses post-mortem (histologie, biologie moléculaire, etc.). Ces analyses sont indispensables pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, notamment pour comprendre les mécanismes tissulaires associés à la décompensation cardiaque. Aucun relogement ou maintien prolongé en élevage n’est prévu, afin d’éviter toute souffrance inutile ou altération de l’état de santé des animaux au-delà de la période utile à l’étude.

Remplacement

Le projet porte sur les effets d’un stress thermique sur l’évolution de l’insuffisance cardiaque dans un contexte métabolique. Les mécanismes étudiés impliquent une réponse cardiovasculaire intégrée, thermorégulatrice et inflammatoire, impossible à reproduire in vitro ou in silico avec pertinence. Les méthodes alternatives ont été considérées pour l’optimisation des phases exploratoires (modélisation informatique, revue bibliographique, données historiques), mais les objectifs scientifiques nécessitent ici l’utilisation d’un organisme entier. Aucun modèle alternatif ex vivo ou cellulaire ne permet à ce jour de simuler la complexité des interactions physiopathologiques impliquées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été optimisé grâce à plusieurs stratégies complémentaires : la mutualisation de certains groupes entre procédures pour éviter les redondances ; la constitution de sous-groupes expérimentaux permettant de répartir les manipulations et de limiter le stress tout en assurant la robustesse statistique des résultats ; l’exploitation de données historiques internes, notamment pour les groupes témoins lorsque cela est justifié ; l’utilisation de dispositifs de suivi longitudinal (thermopuces ou télémétrie) autorisant des mesures répétées sur un même individu ; et enfin, une estimation rigoureuse du nombre nécessaire d’animaux par calcul de puissance, prenant en compte la mortalité attendue dans ce modèle.

Raffinement

Des mesures ont été mises en place pour améliorer le bien-être animal tout au long du projet : 1) Points limites clairs et validés pour prévenir toute souffrance prolongée. 2) Répartition réfléchie des examens d’imagerie, pour éviter les cumuls d’interventions stressantes ou longues sur un même individu. 3) Dérogation à l’hébergement (condition « canicule ») strictement limitée dans le temps, et aménagée en conséquence (enrichissements adaptés, monitoring renforcé, suivi clinique rapproché). L’hébergement social est maintenu selon les normes en vigueur. 4) Utilisation de thermopuces dès que cela est possible pour limiter, voire supprimer l’utilisation de la télémétrie dans ce projet 5) S’il y a chirurgie (pour la pose de l’implant de télémétrie), raffinement des méthodes d’analgésie pré et post-opératoire, et chirurgies standardisées et de courte durées, réalisées par du personnel expérimenté. Une grille de scoring clinique est utilisée pour un suivi rigoureux de l’état général des animaux, avec des points limites définis permettant une euthanasie anticipée en cas de décompensation ou de souffrance avérée. La mise à mort est réalisée sous anesthésie générale profonde, par injection en surdose d’anesthésique, conformément aux recommandations éthiques en vigueur.

Choix des espèces

Le choix des rongeurs, et spécifiquement des rats est motivé par plusieurs facteurs. D’une part, ces animaux permettent de répondre aux objectifs du projet, qui incluent l’étude des mécanismes physiopathologiques de l’insuffisance cardiaque dans un contexte métabolique. D’autre part, les rats sont largement utilisés dans des études similaires au sein du laboratoire, ce qui permet de comparer et d’enrichir les résultats avec les données historiques accumulées. Leur taille, qui facilite les manipulations pratiques, ainsi que leur place intéressante dans la phylogénie, sont également des éléments importants. En outre, ces rats présentent une insuffisance cardiaque à 24 semaines, stade idéal pour étudier l’évolution de cette pathologie.

Des femelles gestantes au dernier tiers de la gestation sont opérées sous anesthésie pour une injection dans le cerveau de leurs embryons, d'autres souris recevant un vecteur viral. Cent souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet sert de test préliminaire pour sélectionner un sérotype de virus et une dose en vue d'un futur essai de thérapie génique, sans tester de traitement à ce stade. Le porteur indique qu'il n'y aura ni analyse statistique ni test de puissance, annonce deux souris par condition chirurgicale et trois par dose de virus, et ne précise pas comment ces chiffres aboutissent à un effectif de cent.

Objectifs

La connaissance des mécanismes impliqués dans le développement de réseaux neuronaux fonctionnels est essentielle pour comprendre l’origine des troubles du neurodéveloppement (TDNs), des atteintes du développement cognitif ou fonctionnel du cerveau ayant un impact important sur la vie des patients. Il est estimé que près d’une naissance sur 6 est concernée par un trouble du neurodéveloppement, et les options thérapeutiques restent dans la majorité des cas limitées. Ce projet, qui se déroulera dans deux établissements utilisateurs, s’inscrit dans le cadre d’un projet de recherche translationnelle, conduit chez la souris, qui constitue des essais préliminaires à visée thérapeutique. D’abord, nous testerons les fonctions neuronales d'un gène identifié comme un régulateur du trafic de membranes intracellulaires. In vitro, ce gène a un effet sur la pousse neuronale, dont la prédiction serait qu'elle module la connectivité cérébrale. Dans le cadre d’une approche translationnelle, il a développé des molécules interférantes qui bloquent la fonction de ce gène in vitro. Nous testerons l'effet de ces molécules in vivo. Dans un second temps, nous ferons la mise au point de virus vecteurs pour un futur projet de thérapie génique. Notre objectif sera de tester des virus contrôle, afin de sélectionner le sérotype et la dose de virus adaptés à de futurs essais thérapeutiques. A terme, le sérotype de virus sélectionné nous permettra d’exprimer les molécules d’intérêt dans des populations de neurones ciblées.

Bénéfices attendus

Les résultats de ces travaux permettront de comprendre les fonctions d’un gène impliqué dans le développement cérébral. Les outils développés dans ce projet seront la base d’études précliniques qui à terme pourront aboutir à la composition de thérapies ciblées pour le système nerveux.

Procédures

Dans l'EU1 : Les animaux inclus dans ce projet subiront entre une et trois injections d’analgésiques (durée contention/injection : 10 secondes par animal par injection). Certaines femelles subiront une chirurgie avec réveil, sous anesthésie et en respectant les règles d’analgésie et d’asepsie chirurgicale. La chirurgie dure environ 30 minutes et sera réalisée une seule fois. La procédure peut entraîner une douleur et du stress dans les heures suivant la chirurgie. Des animaux subiront une injection d’un vecteur de thérapie génique, une seule fois, sous anesthésie. Dans l'EU2 : Certains animaux seront mis à mort par injection d'un fixateur, sous anesthésie et analgésie (durée 3 minutes).

Impact sur les animaux

Certains animaux subiront une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, qui peut entraîner une douleur le temps de la cicatrisation. Certains animaux subiront une injection au stade embryonnaire qui n'entraine aucune lésion ou nuisance chez les embryons à cet âge. Certains animaux recevront une injection de virus, une seule fois, qui entraînera un léger stress au moment de l’injection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques

Remplacement

Ce projet a pour objectif de caractériser les changements de connectivité cérébrale lors de la modulation d'un gène dont les fonctions ont été étudiées au préalable in vitro. Il est à présent nécessaire de tester l’effet de ce gène in vivo afin de valider les conséquences sur le ciblage des connexions neuronales, qui ne peut être reproduit in vitro en raison de la complexité cérébrale et de la diversité des types neuronaux impliqués. Dans l’état actuel des connaissances scientifiques, les étapes de développement du cortex cérébral et la mise en place des circuits neuronaux ne peuvent être modélisées entièrement in vitro. L’étude de circuits corticaux nécessite d’avoir recours à un animal possédant une structure corticale et par conséquent empêche le remplacement par un modèle invertébré. De même, nous souhaitons tester la distribution d’un virus pour la thérapie génique, ce qui ne peut être reproduit fidèlement in vitro (effet de la circulation et des barrières sang-cerveau, entre autres).

Réduction

Dans ce projet, nous limiterons le nombre d’animaux au strict minimum pour atteindre les résultats scientifiques et faire la preuve de concept de l’efficacité de nos approches en vue d’applications précliniques ultérieures. Il n’y aura pas d’analyse statistique et pas de test de puissance réalisé au préalable. Les chirurgies seront réalisées sur deux souris par condition, ce qui est le nombre minimum pour nous assurer de la reproductibilité des résultats sur deux expériences indépendantes. Les injections de virus seront réalisées sur des groupes de trois souris, ce qui est le nombre minimum pour nous assurer de résultats interprétables (en cas de variabilité d’un animal à l’autre). Nous commencerons par la dose la plus faible de virus, si celle-ci donne satisfaction, nous n’aurons pas besoin de réaliser la dose la plus importante.

Raffinement

Pour l'ensemble des procédures, nous avons défini des points limites prédictifs et précoces afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. La procédure chirurgicale est bien maîtrisée par les expérimentateurs et sera réalisée uniquement par un chercheur expérimenté. Un recours à l’analgésie péri-opératoire, ainsi qu’à une analgésie post-opératoire (calibrée par rapport à une grille d’évaluation de la douleur) nous permettra de limiter le stress et la douleur. Les mises à mort pourront se dérouler dans un autre EU, dans ce cas le transport des animaux est rapide puisque les deux établissements utilisateurs sont dans le même bâtiment. Les animaux seront placés dans une cage de transport adaptée et pris en charge immédiatement à leur arrivée afin de limiter le stress lié à un nouvel environnement. Les animaux seront traités individuellement, pendant que le reste de la portée sera isolée dans un portoir ventilé qui procure une isolation visuelle, acoustique et olfactive.

Choix des espèces

L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales tels l’autisme et/ou les déficiences mentales. Les outils moléculaires que nous allons tester sont adaptés à la souris. La chirurgie se fera chez des femelles au 3ème tiers de la gestation chez la souris, qui est le stade auquel le développement cérébral a lieu chez la souris. Cette procédure est parfaitement standardisée au laboratoire. L’injection de virus sera faite dans des animaux jeunes adultes, entre 8 et 14 semaines. Il n’est pas attendu d’incidence de l’âge sur la distribution des virus. Le stade jeune adulte correspond à une cible thérapeutique potentielle à terme pour les maladies neuropsychiatriques.

Pour observer comment se forment les circuits inhibiteurs du cortex visuel, 960 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie des souriceaux reçoit une injection dans le cerveau, puis une plaque métallique est fixée sur leur crâne par chirurgie. Les animaux vivent ensuite en cage avec cet implant et sont immobilisés par la tête, éveillés, jusqu'à trente-deux séances d'une heure trente réparties sur trois mois. Une partie est tuée pour des analyses post-mortem, les autres sont proposées en don à d'autres équipes ou tuées faute de pouvoir être réutilisées en raison de leur modification génétique.

Objectifs

Notre projet de recherche cherche à comprendre comment se développent les réseaux inhibiteurs, ces circuits neuronaux qui régulent l'activité du cerveau, dans les régions responsables du traitement de la vision. Ces circuits sont composés de neurones particuliers, appelés interneurones, qui ont pour rôle de moduler l'activité cérébrale en empêchant une excitation excessive. Ils sont essentiels pour assurer un traitement équilibré et précis des informations visuelles. Nous étudierons chez des souris génétiquement modifiées comment ces réseaux inhibiteurs se forment et se connectent pendant le développement, en particulier dans le cortex visuel primaire, une région clé pour interpréter ce que nous voyons. Notre hypothèse est que le bon développement de ces réseaux est crucial pour que le cerveau puisse analyser les images de manière stable et cohérente. En comprenant mieux la manière dont ces circuits se construisent, nous espérons aussi mieux cerner certains troubles du développement cérébral, comme ceux liés à l'autisme ou à la schizophrénie, où l'équilibre entre excitation et inhibition est souvent perturbé.

Bénéfices attendus

Les maladies cérébrales ont un impact profond sur la santé des individus, affectant leur autonomie, leur éducation, leur capacité à travailler, leur mobilité ainsi que leurs relations sociales. Elles représentent ainsi un lourd fardeau à la fois humain, social et économique. Il est donc essentiel de mieux comprendre les propriétés fondamentales qui régissent la force, la dynamique, l’organisation spatiale, la localisation anatomique et la composition moléculaire des connexions synaptiques entre types neuronaux spécifiques, tant dans des conditions normales que pathologiques. Nous faisons l’hypothèse que de nombreux troubles cognitifs et psychiatriques, tels que la schizophrénie, l’autisme, la dépression, ou encore certaines formes de douleur chronique, trouveraient leur origine dans un dysfonctionnement des circuits du néocortex. Toutefois, les mécanismes précis du fonctionnement normal de ces circuits, ainsi que les altérations qui surviennent dans ces pathologies, restent encore largement inconnus. Par le biais de nos recherches, nous visons à combler ces lacunes fondamentales. En utilisant des modèles animaux génétiquement modifiés, nous serons en mesure de cibler des types cellulaires et des réseaux neuronaux spécifiques. Cela nous permettra d’élaborer un cadre physiopathologique robuste pour mieux comprendre les maladies du cerveau, avec pour objectif à long terme de développer de nouvelles approches thérapeutiques et d'améliorer la prise en charge des patients. En comprenant mieux la manière dont ces circuits se construisent, nous espérons aussi mieux cerner certains troubles du développement cérébral, comme ceux liés à l'autisme ou à la schizophrénie, où l'équilibre entre excitation et inhibition est souvent perturbé.

Procédures

Un petit prélèvement du bout de la queue sera fait sur une partie des jeunes animaux vigiles (1 fois, moins d’1min) afin de connaitre leur patrimoine génétique. Une partie des souriceaux recevra une injection dans une zone du cerveau (1 fois, durée 5minutes environ) sous anesthésie générale. Ces animaux auront au minimum 9 jours après une implantation d’un dispositif sur leur tête lors d’une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1 fois, durée 1h maximum). Ils seront ensuite habitués au dispositif expérimental pendant 5 jours, avec 1 à 2 sessions quotidiennes en commençant par quelques minutes et en augmentant progressivement jusqu'à 1h30 maximum. L’habituation pourra être prolongée d’1 semaine si nécessaire, soit 20 sessions maximum par animal avec 1h30 maximum par session. Des enregistrements quotidiens de 1h30 sont effectués ensuite, sur animal vigile, pendant 4 jours consécutifs, pendant 3 mois avec 1 semaine de repos entre chaque période d’enregistrements de 2 semaines, soit 32 sessions maximum par animal avec 1h30 maximum par session. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress dû aux manipulations et contentions nécessaires au cours du projet. Pour connaitre le patrimoine génétique des animaux nous prélèverons un petit fragment de la queue pouvant générer une brève et légère douleur. Pour la biopsie caudale, il y a un risque de saignement. L’injection intracérébrale chez les souriceaux est associée à un risque d’hémorragie et un risque de rejet de la portée par la mère. L'implantation d'une plaque métallique sur la tête des animaux pour l'imagerie biphotonique nécessite une procédure chirurgicale qui est associée à un risque de douleur et d’inconfort pendant quelques jours ainsi qu’un risque d’infection. Cette chirurgie implique une anesthésie générale qui entrainera un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de dépression cardiorespiratoire. De plus, après l'implantation de la plaque métallique, l'animal devra vivre dans la cage avec cette plaque métallique sur la tête, ce qui peut provoquer une gêne due à l’encombrement et limiter son comportement habituel, il existe également un risque rare de perte de l’implant. Afin d'imager l'animal sous un éclairage à deux photons, les animaux seront éveillés mais leur tête sera immobilisée, ce qui limitera les mouvements de la tête et génèrera un stress pour les animaux.

Devenir

À la fin des procédures, une partie des animaux sera euthanasiée afin de réaliser des analyses post-mortem et les autres seront proposés en dons à d’autres équipes ou euthanasiés car ils ne pourront pas être réutilisés en raison de leur modification génétique spécifique.

Remplacement

Il n’y a malheureusement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car l'objectif est de découvrir le fonctionnement de zones spécifiques dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie neuronale des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles en culture cellulaire. Il est important de noter que notre projet scientifique global comporte une composante alternative à l’expérimentation animale : l’analyse de modèles in silico (création d’un modèle numérique du circuit neuronal étudié incluant les résultats de notre caractérisation expérimentale). Ce modèle sera diffusé publiquement et constituera une alternative à l’expérimentation animale pour l’étude du rôle fonctionnel de certaines cellules cérébrales spécifiques.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (960) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux recevront des injections virales puis participeront à l’imagerie afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur un même animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de complications chez les animaux et de minimiser les dommages durables. En outre, notre expertise dans l'entraînement des animaux à être fixées par la tête dans l'installation d'imagerie réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille réelle de l'échantillon dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur la plateforme https:ebrains.eu (la plateforme de partage de données neuroscientifiques financées par l’U.E.) ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton, bâtonnet de bois à ronger et maison) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement. En cas d’anomalie celle-ci sera gérée en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire qui apportent conseils et recommandations pour assurer une prise en charge adaptée de l’animal. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera le plus petit possible et réalisé sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide). Nous nous assurerons de la bonne reprise en charge des petits par leur mère immédiatement après le geste et environ 30 minutes après. La chirurgie stéréotaxique sera effectuée sous anesthésie générale et des analgésiques seront administrés avant et après l’intervention pour limiter la douleur. Nous maintiendrons la température des animaux au cours de toute la durée de l’anesthésie pour éviter toute hypothermie. Un soutien nutritionnel et hydrique ainsi qu’une surveillance étroite seront mis en place à la suite des chirurgies pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Pour les séances d’imagerie tête fixée, afin de réduire le stress, nous prévoyons d'effectuer entre 1 et 2 semaines d'habituation des animaux au dispositif de fixation de la tête. Nous ajusterons également la surface du disque rotatif pour faciliter une bonne prise pour les animaux et réduire l'inconfort. Et enfin nous prévoirons des périodes de repos entre les sessions d’imagerie, par exemple 3 jours de repos par semaine et 1 semaine de repos toutes les 2 semaines. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits de cellules du cerveau chez la souris sont similaires à celles des autres mammifères, y compris l'homme, ce qui rend les résultats obtenus avec un tel modèle éventuellement transposables à la médecine humaine. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types de cellules spécifiques que nous étudions. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Le développement du cerveau chez la souris est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Dans ce projet, nous prévoyons d'étudier les mécanismes cellulaires aux stades précoces et tardifs du développement. C'est pourquoi nous prévoyons d'utiliser des animaux dès leur naissance et jusqu'à plusieurs mois.

Des femelles au dernier tiers de gestation sont opérées trente minutes sous anesthésie, leurs embryons recevant une injection que le porteur décrit comme sans lésion ni nuisance à ce stade. 100 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées, une partie par injection d'un fixateur sous anesthésie, pour prélèvement de tissus et analyses histologiques. D'autres animaux reçoivent un vecteur de thérapie génique sous anesthésie, l'objet étant de choisir le sérotype et la dose de virus pour de futurs essais visant les troubles du neurodéveloppement. Le porteur annonce des chirurgies sur deux souris par condition et des injections de virus sur des groupes de trois, sans analyse statistique ni test de puissance, et sans expliquer comment ces groupes conduisent à cent animaux.

Objectifs

La connaissance des mécanismes impliqués dans le développement de réseaux neuronaux fonctionnels est essentielle pour comprendre l’origine des troubles du neurodéveloppement (TDNs), des atteintes du développement cognitif ou fonctionnel du cerveau ayant un impact important sur la vie des patients. Il est estimé que près d’une naissance sur 6 est concernée par un trouble du neurodéveloppement, et les options thérapeutiques restent dans la majorité des cas limitées. Ce projet, qui se déroulera dans deux établissements utilisateurs, s’inscrit dans le cadre d’un projet de recherche translationnelle, conduit chez la souris, qui constitue des essais préliminaires à visée thérapeutique. D’abord, nous testerons les fonctions neuronales d'un gène identifié comme un régulateur du trafic de membranes intracellulaires. In vitro, ce gène a un effet sur la pousse neuronale, dont la prédiction serait qu'elle module la connectivité cérébrale. Dans le cadre d’une approche translationnelle, il a développé des molécules interférantes qui bloquent la fonction de ce gène in vitro. Nous testerons l'effet de ces molécules in vivo. Dans un second temps, nous ferons la mise au point de virus vecteurs pour un futur projet de thérapie génique. Notre objectif sera de tester des virus contrôle, afin de sélectionner le sérotype et la dose de virus adaptés à de futurs essais thérapeutiques. A terme, le sérotype de virus sélectionné nous permettra d’exprimer les molécules d’intérêt dans des populations de neurones ciblées.

Bénéfices attendus

Les résultats de ces travaux permettront de comprendre les fonctions d’un gène impliqué dans le développement cérébral. Les outils développés dans ce projet seront la base d’études précliniques qui à terme pourront aboutir à la composition de thérapies ciblées pour le système nerveux.

Procédures

Dans l'EU1 : Les animaux inclus dans ce projet subiront entre une et trois injections d’analgésiques (durée contention/injection : 10 secondes par animal par injection). Certaines femelles subiront une chirurgie avec réveil, sous anesthésie et en respectant les règles d’analgésie et d’asepsie chirurgicale. La chirurgie dure environ 30 minutes et sera réalisée une seule fois. La procédure peut entraîner une douleur et du stress dans les heures suivant la chirurgie. Des animaux subiront une injection d’un vecteur de thérapie génique, une seule fois, sous anesthésie. Dans l'EU2 : Certains animaux seront mis à mort par injection d'un fixateur, sous anesthésie et analgésie (durée 3 minutes).

Impact sur les animaux

Certains animaux subiront une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, qui peut entraîner une douleur le temps de la cicatrisation. Certains animaux subiront une injection au stade embryonnaire qui n'entraine aucune lésion ou nuisance chez les embryons à cet âge. Certains animaux recevront une injection de virus, une seule fois, qui entraînera un léger stress au moment de l’injection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques

Remplacement

Ce projet a pour objectif de caractériser les changements de connectivité cérébrale lors de la modulation d'un gène dont les fonctions ont été étudiées au préalable in vitro. Il est à présent nécessaire de tester l’effet de ce gène in vivo afin de valider les conséquences sur le ciblage des connexions neuronales, qui ne peut être reproduit in vitro en raison de la complexité cérébrale et de la diversité des types neuronaux impliqués. Dans l’état actuel des connaissances scientifiques, les étapes de développement du cortex cérébral et la mise en place des circuits neuronaux ne peuvent être modélisées entièrement in vitro. L’étude de circuits corticaux nécessite d’avoir recours à un animal possédant une structure corticale et par conséquent empêche le remplacement par un modèle invertébré. De même, nous souhaitons tester la distribution d’un virus pour la thérapie génique, ce qui ne peut être reproduit fidèlement in vitro (effet de la circulation et des barrières sang-cerveau, entre autres).

Réduction

Dans ce projet, nous limiterons le nombre d’animaux au strict minimum pour atteindre les résultats scientifiques et faire la preuve de concept de l’efficacité de nos approches en vue d’applications précliniques ultérieures. Il n’y aura pas d’analyse statistique et pas de test de puissance réalisé au préalable. Les chirurgies seront réalisées sur deux souris par condition, ce qui est le nombre minimum pour nous assurer de la reproductibilité des résultats sur deux expériences indépendantes. Les injections de virus seront réalisées sur des groupes de trois souris, ce qui est le nombre minimum pour nous assurer de résultats interprétables (en cas de variabilité d’un animal à l’autre). Nous commencerons par la dose la plus faible de virus, si celle-ci donne satisfaction, nous n’aurons pas besoin de réaliser la dose la plus importante.

Raffinement

Pour l'ensemble des procédures, nous avons défini des points limites prédictifs et précoces afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. La procédure chirurgicale est bien maîtrisée par les expérimentateurs et sera réalisée uniquement par un chercheur expérimenté. Un recours à l’analgésie péri-opératoire, ainsi qu’à une analgésie post-opératoire (calibrée par rapport à une grille d’évaluation de la douleur) nous permettra de limiter le stress et la douleur. Les mises à mort pourront se dérouler dans un autre EU, dans ce cas le transport des animaux est rapide puisque les deux établissements utilisateurs sont dans le même bâtiment. Les animaux seront placés dans une cage de transport adaptée et pris en charge immédiatement à leur arrivée afin de limiter le stress lié à un nouvel environnement. Les animaux seront traités individuellement, pendant que le reste de la portée sera isolée dans un portoir ventilé qui procure une isolation visuelle, acoustique et olfactive.

Choix des espèces

L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales tels l’autisme et/ou les déficiences mentales. Les outils moléculaires que nous allons tester sont adaptés à la souris. La chirurgie se fera chez des femelles au 3ème tiers de la gestation chez la souris, qui est le stade auquel le développement cérébral a lieu chez la souris. Cette procédure est parfaitement standardisée au laboratoire. L’injection de virus sera faite dans des animaux jeunes adultes, entre 8 et 14 semaines. Il n’est pas attendu d’incidence de l’âge sur la distribution des virus. Le stade jeune adulte correspond à une cible thérapeutique potentielle à terme pour les maladies neuropsychiatriques.

Deux modèles de colite doivent mimer les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin pour tester une enzyme candidate au statut de médicament. 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever des organes entiers. Les donneuses reçoivent cinq injections intrapéritonéales en cinq jours sur animal vigile, les receveuses une injection puis, deux jours plus tard, soit un agent dans l'eau de boisson pendant sept jours, soit un agent par voie rectale sous anesthésie. Le porteur estime la colite modérée compte tenu des points limites retenus, avec un score de sévérité relevé chaque jour et un suivi de la prise hydrique et alimentaire.

Objectifs

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) sont caractérisées par une inflammation intestinale inappropriée. Elles représentent un fardeau majeur pour les populations occidentalisées. En effet, leur incidence et prévalence ont augmenté de façon spectaculaire au cours des dernières décennies. Les thérapies actuelles ne sont que partiellement efficaces et principalement basés sur des immunosuppresseurs (médicaments affaiblissant le système immunitaire). Celles-ci sont associés à des effets secondaires, notamment des infections et des cancers. Il est donc urgent de mieux comprendre leur origine et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons observé chez les patients atteint de MICI, une altération dans l’une des voies métaboliques qui est directement corrélée à l’inflammation. L'hypothèse principale du projet est de caractériser l'effet de notre enzyme d’intérêt dans les MICI afin de pouvoir développer l’enzyme humaine comme un candidat thérapeutique. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements pour les MICI.

Bénéfices attendus

Ce projet est dans la continuité d’un programme de recherche complet et ciblé sur le métabolisme dans le contexte de la santé et des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). En France, ces maladies touchent environ 300 000 personnes (données 2021), ce qui en fait un enjeu majeur de santé publique. L’approche que nous proposons est entièrement nouvelle, fondée sur des découvertes récentes concernant le rôle de certains métabolites dans les processus inflammatoires. Elle repose sur la modulation de voies métaboliques altérées dans les MICI, avec pour objectif de restaurer la production de métabolites anti-inflammatoires et de réduire celle des métabolites pro-inflammatoires. Ce projet est multidisciplinaire, à l’interface de l’immunologie et du métabolisme. Les études menées devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes pathologiques impliqués dans les MICI, tout en ouvrant la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques transposables chez l’homme.

Procédures

Les souris donneuses seront soumises à un traitement par injections afin d’induire la modification génétique, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours soit un total de 5 injections par souris. Les injections seront effectuées sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. Les souris receveuses seront soumises à une injection unique sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. Deux jours plus tard, ces mêmes animaux seront impliqués dans l’un des deux modèles de colites mimant les aspects des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Une partie sera exposée à un agent dans l’eau de boisson pendant 7 jours puis replacée en eau standard durant 5 jours. Une seconde partie sera exposée à un agent par voie rectale (par voie naturelle) sous anesthésie générale à raison de quelques minutes. Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraiches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état métabolique des souris, les animaux subiront un prélèvent de sang de faible volume sur animal vigile par simple contention par une personne formée avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.

Impact sur les animaux

L’induction du modèle génétiquement modifié utilisé dans ce projet comme souris donneuses reposent sur une injection intrapéritonéale tous les jours pendant 5 jours pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection pour les animaux. Aucun effet secondaire n’a été décrit dans la littérature pour cette administration. Il existe un risque (faible) d’inflammation abdominale ou de péritonite. Les souris receveuses auront une injection unique pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection puis seront soumises à une colite induite expérimentalement. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus liée à l’inflammation intestinale. On peut estimer que son intensité sera légère à modérée au maximum. Pour l’un des modèles de colite, une anesthésie est nécessaire et pourrait induire dans de rare cas, une mauvaise réaction (stress thermique, difficulté respiratoire, arrêt cardio-respiratoire). Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraiches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient pas induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons également un prélèvement sanguin de faible volume pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.

Remplacement

Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.

Réduction

Ce projet impliquera donc un maximum de 600 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux à trois fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que si les résultats vont dans le sens de l’hypothèse de travail et que la puissance statistique n’est pas encore atteinte. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. La principale contrainte dans le cadre de ce projet est liée à la colite induite expérimentalement et aux signes cliniques qui y sont associés. Néanmoins, nous disposons d’une très grande expérience de ce type de modèle et assurons un suivi quotidien associé à un scoring de la sévérité de la colite permettant une prise de décision immédiate en cas d’aggravation des symptômes. Dans ce projet, la colite est estimée comme étant modérée compte-tenu des points limites mis en œuvre. En complément nous suivons également, la prise hydrique et alimentaire et l’aspect général des animaux quotidiennement. Pour les administrations, nous utilisons du matériel adapté (petite taille) afin de réduire au maximum la contrainte. De plus, les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris non transgéniques mais également des lignées transgéniques (toutes sur le même fond génétique). Justification des stades : Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 12 semaines de vie. Cet âge est couramment utilisé dans la littérature pour les modèles de colites.

4 003 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certaines femelles gestantes subissant une laparotomie de quarante-cinq minutes suivie d'injections toutes les douze heures pendant deux jours en cas de douleur. Des nouveau-nés sont injectés directement dans le cerveau. Les souris menées jusqu'à l'âge adulte passent trois tests cognitifs de vingt minutes sur une à trois semaines, avant une chirurgie terminale sans réveil par perfusion, l'objet étant de savoir comment une réaction allergique induite après la naissance modifie les plexus choroïdes et le développement du cerveau. Le porteur justifie les effectifs par des groupes de cinq à sept animaux répétés en triplicat sur cinq stades de développement, sans détailler comment on parvient à 4 003 animaux.

Objectifs

Le cerveau a longtemps été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, notamment par les cellules immunitaires. Parallèlement, certaines barrières du cerveau ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra de mieux comprendre comment la mise en place physiologique du système immunitaire après la naissance façonne le développement de la fonction cérébrale via les cellules étudiées. Plus particulièrement, le but de notre projet est d’identifier comment une réaction inflammatoire de type allergique au cours du développement post-natal, modifie la physiologie des cellules étudiées, altère la composition de certains tissus et entraîne l’apparition de maladies neurodéveloppementales. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que sont les cellules étudiées et qui reste encore très peu étudiée, particulièrement au cours du développement après la naissance. Cette analyse permettra d’identifier les facteurs produits par les cellules étudiées et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité cérébrale au cours d’une réponse de type allergique et favoriser à terme la mise au point d’immunothérapie permettant de mieux lutter contre les maladies neurodéveloppementales.

Procédures

Une injection (quelques secondes) sera réalisée aux souris 16h avant une autre injection (quelques secondes). Une laparotomie sur femelles gestantes (environ 45 min de chirurgie) sera réalisée sous. A leur réveil, de nouvelles injections seront réalisées 6h après l’intervention puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. 1 à 3 injections de quelques secondes seront réalisées en l’espace de 24h. Sur certains des animaux une injection supplémentaire de quelques secondes aura été réalisée 6 jours auparavant. Les animaux maintenus jusqu’à l’âge adulte seront testés pour leur capacité cognitive (30min-1h/jour). Trois tests de 20min chacun seront réalisés, à raison d’un test maximum/jour sur une période d’1 à 3 semaines. A la fin de la procédure, dans les heures suivants la dernière injection ou plusieurs semaines plus tard, la procédure s’achèvera par une dernière injection. Des injections dans le cerveaux des nouveaux nés seront réalsiées. Une chirurgie terminale sans réveil sera réalisée (perfusion).

Impact sur les animaux

Les injections en elles-mêmes pourront causer un peu de stress aux animaux mais peu ou pas de douleur. L’induction d’une inflammation de type allergique par les molécules injectées pourront augmenter le niveau d’anxiété des animaux dans la première demi-heure après injection ainsi qu’une légère hypothermie avant de revenir à la normale au bout d’une heure. Les chirurgies pourront s’accompagner d’une douleur légère à modérée pendant 4 à 5 jours, d’un inconfort et d’une légère augmentation du stress des animaux. Les tests comportementaux réalisés sur animaux adultes entraineront peu ou pas de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par à la fin de chaque procédure soit pour la dissection des tissus afin de répondre aux questions scientifiques posées dans cette proposition, soit car les effets de la procédure que les animaux ont subie pourraient potentiellement introduire une variabilité indésirable/confondre les résultats de toute étude ultérieure.

Remplacement

Notre but est d’étudier comment certaines cellules agissent sur le développement du cerveau après la naissance. Le recours à l’animal est nécessaire car il n’existe aucun système in vitro qui puisse reproduire la complexité cellulaire de l’interface barrière du cerveau que nous étudions : les cellules étudiées sont en effet composées de plusieurs types cellulaires et tissus en intéraction. De plus, la fonction sécrétrice de l’épithélium des cellules étudiées est modulée par l’activation des cellules que nous cherchons à étudier varie avec l’âge et la réponse immunitaire locale et périphérique, et est spécifique de la première semaine après la naissance et ne peut être reproduites et étudiée in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu dans ce projet se base sur notre précédente expérience et des tests statistiques. Un des tissus étudiés est très petit et ne peut être utilisé que pour une seule analyse à la fois. Les analyses de la composition d’autres tissus et zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les même animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (animaux maintenus jusqu’à l’âge adulte). Nous prévoyons pour chaque groupe de souris nouveau-nées 5 animaux par analyse, et 7 animaux adultes pour les tests de comportement, mâles et femelles. Des tripliquas d’expérience seront réalisés, à l’exception de certaines analyses pour lesquelles nous avons observé que 5 animaux par groupe permettaient l’acquisition de résultats significativement solides. Certaines études seront réalisées en comparant 5 stades de développement (5 variables). Les effectifs proposés (5x3 individus par groupe) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet forte à très forte. L’étude de certains effets sur l’activité du cerveau sera réalisée selon les cas en comparant 2 variables (5x3 individus par groupe seront néecessaires) ; en comparant 4 variables et 6 variables (5x3 individus par groupe nouveaux nés ou 7x3 individus par groupe adulte seront nécessaires).

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Des points limites spécifiques et précoces sont appliqués pour chaque protocole, pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, et nous rechercherons à minimiser la douleur par injection d’antalgiques, ajout de gel hydrique, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Nous renforcerons également l’enrichissement des cages. Nous surveillerons l’utilisation des cotons, et l’état de la nidification le cas échéant sous les dômes en carton.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives car de nombreuses lignées sont disponibles et est génétiquement modifiable. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproduction facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le nombre des cellules étudiées évoluant après la naissance, nous étudierons leur phénotype à différentes périodes du développement post-natal, de la naissance à l’âge du sevrage : P0/P1, P6, P10, P15 et P21. Le phénotype induit par nos expériences n’est analysable qu’au minimum 6-7 jours après injection. Afin d’étudier l’effet sur le développement du cerveau, nous injecterons des souris embryonnaires au stade E14-15 afin d’en étudier les effets chez les souris âgées de 0 à 2 jours, puis chez l’adulte enfin d’en étudier les effets à long terme sur la fonction cognitive.

Anesthésiés cinq minutes, munis d'une puce d'identification implantée, mesurés, puis enfermés en cage trois semaines ou placés soixante-douze heures en respiromètre. 780 bars européens et soles communes juvéniles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, 420 bars et 270 soles tués pour prélèvement d'organes, 30 bars et 30 soles relâchés après leur passage en respiromètre. Certains sont transportés moins de quatre heures hors de l'établissement pour être placés près d'une éolienne en mer, d'autres subissent deux mises à jeun de douze puis soixante-douze heures et six jours cumulés de bruit, l'enjeu étant de documenter les effets du bruit des parcs éoliens sur le comportement et la physiologie des poissons. Sur la réduction, le porteur écrit seulement que les effectifs tiennent compte de la variabilité individuelle, sans justifier le nombre retenu.

Objectifs

La France montre des ambitions importantes en matière d’éolien en mer, et souhaite développer massivement cette énergie. Face aux enjeux environnementaux, une meilleure compréhension des mécanismes d’impacts est essentielle pour améliorer la prise en compte du milieu marin dans le développement de cette activité. Aujourd’hui, on ne connaît pas encore très bien tous les effets du bruit sur les poissons. On sait que des bruits de très fortes amplitudes peuvent leur causer des problèmes de santé, comme des pertes d’audition ou des blessures. Mais avant de provoquer de blessures, le bruit peut déjà déranger les poissons : il peut les empêcher de bien communiquer, les stresser ou les forcer à changer de comportement. Par exemple, un poisson peut fuir une zone où il trouve habituellement de la nourriture ou où il se reproduit. Ces effets peuvent ensuite avoir des conséquences plus larges sur la santé et la reproduction de ces animaux. Il faut donc s'intéresser non seulement aux blessures visibles, mais aussi à ces effets indirects. Il est aussi possible que certains poissons s’habituent au bruit avec le temps, mais cela reste à étudier. Ce projet de recherche veut mieux comprendre les effets des éoliennes en mer sur les poissons, en étudiant deux espèces présentes dans les zones côtières où les éoliennes se développent beaucoup : le bar européen (Dicentrarchus labrax) et la sole commune (Solea solea). Le réchauffement climatique ajoute un autre problème : la température de l’eau augmente. Or, chez les poissons, la température environnementale influence leur température corporelle, et donc l’ensemble des processus physiologiques y compris leur fonction auditive. Plusieurs études suggèrent ainsi que la sensibilité auditive pourrait augmenter avec la température, mais cela reste encore peu étudié, surtout chez les espèces marines. C’est pourquoi ce projet va aussi s’intéresser à l’effet de la température sur l’audition du bar.

Bénéfices attendus

Les résultats à courts termes permettront de mieux évaluer les impacts de l'environnement sonore émanant de l'activité de l'éolien offshore sur la faune marine. Ces impacts sont généralement établis au travers des lésions physiologiques qu'ils génèrent sur la fonction auditive. Or, d'autres types d'effets qualifiés d'indirects, comme des modifications du comportement, des déséquilibres cellulaires en lien avec une situation de stress, ..., peuvent aussi être déclenchés. C'est sur ce type d'impacts que le présent projet est centré, en s’intéressant à deux espèces: le bar et la sole. Les résultats permettront d'établir à moyens termes des mesures de type 'Eviter, Réduire, Compenser' afin de réduire les effets néfastes sur les écosystèmes marins et la biodiversité.

Procédures

1/ 60 soles et 60 bars seront anesthésiés 1 fois pendant 5 minutes pour implantation d'une puce d'identification active et pour des mesures biométriques (poids, taille). Parmi eux, 30 soles et 30 bars seront ensuite exposés, de manière vigile et pendant 12 jours, à des enregistrements sonores (bruits éoliens). 2/ 240 soles et 240 bars seront anesthésiés 1 fois pendant 5 minutes pour implantation d'une marque d'identification active et pour des mesures biométriques (poids, taille). Les 480 poissons seront mis en cage 3 semaines (dont une semaine d'acclimatation), et parmi eux, 120 soles et 120 bars seront mis à proximité d'une éolienne offshore 2 semaines (donc exposés à du bruit). Transport de ces 480 poissons, en condition vigile, durée inférieure à 4 heures, une fois. 3/ 30 soles et 30 bars seront placés, en condition vigile, dans un respiromètre pendant 72 heures une fois. Ils seront soumis à 2 mises à jeun, l'une de 12 heures et l'autre de 72 heures et exposés à du bruit pendant 24 heures. Chaque individu sera anesthésié 1 fois pendant 5 minutes pour des mesures biométriques (poids, taille). 4/ 120 bars auront une mise à jeun de 12 heures une fois puis seront placés, en condition vigile, dans des arènes pendant 9 jours. Parmi eux, 60 seront, en plus, exposés à 6 jours cumulés de bruit en alternance avec 48 heures cumulées de silence pendant 8 jours consécutifs. Chaque individu sera anesthésié 1 fois pendant 5 minutes pour des mesures biométriques (poids, taille).

Impact sur les animaux

Un stress de très faible intensité et de très courte durée (moins de 5 minutes) pourrait être déclenchés par les manipulations associées aux biométries. Une angoisse de faible intensité (moins de quelques minutes) pourrait avoir lieu lors du réveil suite aux évènements d’anesthésie. Un stress modéré, une douleur et un prurit localisé de faible intensité durant les deux premiers jours pourraient être provoqués par l’injection des puces d'identification. Un stress de faible intensité et un risque faible de blessures mineures pourraient être provoqués lors de la manipulation et du déplacement des animaux hors de l'établissement utilisateur (durée d’environ 4 heures). Un stress de faible intensité lié à une limitation modérée de la mobilité des animaux lors de leur placement en respiromètre (72 heures) pourrait être observé. Une sensation de faim de faible intensité pourrait être induite par la mise à jeun des animaux pendant 84 heures, soit 12 heures avant transfert plus 72 heures en respiromètre. Un stress et une angoisse de faible intensité, voire une faible baisse d’appétit pourrait être induite en présence de bruit représentatif de l’environnement sonore produit par une éolienne en fonctionnement sur la durée de l’exposition (d’une durée variant entre 1 et 15 jours), ou de manière temporaire en cas de phénomène d’habituation.

Devenir

420 bars et 270 soles seront mis à mort pour effectuer le prélèvement de différents organes en vue d’une étude moléculaire complémentaire des paramètres de comportement mesurés sur les poissons vigiles exposés au bruit. 30 bars et 30 soles seront relâchés après le passage dans le respiromètre. Ce replacement sera effectué en accord avec le vétérinaire référent de l'établissement.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact de l’environnement sonore produit par l’activité de l’éolien offshore en conditions thermiques stables ou variables au travers d’analyses écophysiologiques et comportementales chez le bar et la sole. Aux vues des phénomènes biologiques étudiés (comportement) et de l’approche visée (écophysiologie intégrative) le projet requiert l’utilisation d’animaux vivants. Le recours à d’autres stratégies d’expérimentation telles que des études in vitro ne s’avère pas pertinent. Il n'existe pas encore de modèle in vitro ou in silico permettant d'évaluer l'impact sonore sur le développement des poissons

Réduction

Le nombre d’animaux par condition expérimentale a été évaluée de façon à prendre en compte la variabilité individuelle.

Raffinement

Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de score qui aide dans le suivi des points limites stricts et précis et des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Pour les anesthésies, l’utilisation d’un linge humide permettra de limiter la dessication et maintenir le poisson au calme et immobile. Un suivi sera effectué au réveil avec vérification de la reprise de la fréquence operculaire. Les volumes des diverses structures d’hébergement (bassins, claires, arènes, respiromètres) sont adaptés à la morphologie et à taille des individus ce qui leur permet de s’y mouvoir. Les biomasses sont largement inférieures à celle des milieux d’élevage dont sont issus les animaux. Ce sera également le cas pour les bidons utilisés pour le transport des animaux. L’oxygénation de l’eau pendant ces phases de transport sera assurée par un aérateur sur batterie. La teneur en oxygène sera vérifiée toutes les 2 heures. Les amplitudes sonores auxquelles seront exposés les animaux sont en deçà des seuils sonores connus pour engendrer des désordres physiologiques chez le bar et la sole.

Choix des espèces

Le bar européen a été ciblé du fait de son importance écologique et économique, et de sa dépendance vis à vis des habitats littoraux au vu de son cycle de vie qui en dépend en totalité ou en partie. Dans le souci d’une meilleure compréhension des effets, et d’une approche intégrée encore plus avancée, une espèce benthique (c'est à dire vivant sur le fond plutôt que dans la colonne d'eau) sera également considérée sur certaines des procédures, afin de transposer et de valider les approches et les effets qui auront pu être mis en évidence sur le bar. Il s’agira de la sole Solea solea. En effet, au vu de son écologie et sa tolérance au stress différentes, des stratégies de réponses variées et complémentaires sont attendues chez cette espèce benthique en comparaison des observations qui pourraient être faites chez le bar européen. C’est le stade juvénile qui sera ciblé. C’est à ce stade que ces 2 espèces se distribuent principalement dans les zones côtières, terrain d’installation privilégié des champs d’éoliennes.