Procédures légères
Recherche des mécanismes protecteurs de l’unité motrice dans la sclérose latérale amyotrophique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
6 170 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à deux injections par jour pendant toute la durée du protocole et une séance quotidienne d'exercice de vingt minutes. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 2 374 d'entre elles, modéré pour 2 480 et sévère pour 1 316, et toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Porteuses d'une mutation reproduisant la maladie de Charcot, elles perdent leur force à partir de trois mois puis l'usage de leurs pattes arrière à partir de quatre mois, et reçoivent des injections dans le canal rachidien ou dans le crâne sous anesthésie. Le porteur écrit avoir soigneusement calculé le nombre d'animaux nécessaires sans donner ce calcul, et présente le partage des tissus prélevés entre équipes comme une mesure de réduction.
Objectifs
Notre projet vise à mieux comprendre et traiter la sclérose latérale amyotrophique (SLA), aussi appelée maladie de Charcot. Cette maladie grave entraîne la mort des neurones qui contrôlent les muscles, ce qui cause une perte progressive de force et finit par être fatale. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement qui puisse guérir la SLA, c’est pourquoi la recherche continue. L'activité motrice pourrait aider les personnes atteintes de SLA, mais on ne comprend pas encore bien comment cela fonctionne au niveau des cellules et des molécules. Le but de notre projet est donc de : 1)Étudier les changements dans les cellules du muscle et des nerfs, avant et après l’apparition des symptômes. 2) Découvrir comment l'activité motrice protège les muscles pour 3) essayer de reproduire ces effets grâce à des médicaments et 4) Evaluer si ces traitements peuvent soigner la maladie.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement pour guérir la maladie de Charcot. Notre projet de recherche a deux grands objectifs pour mieux comprendre la maladie et trouver de nouvelles pistes pour la traiter. On étudiera d’une part les bénéfices de l'activité motrice et d’autre part on recherchera des molécules capables de soigner les symptômes de la maladie. Notre projet permettra ainsi de découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques de cette pathologie mortelle qui touche 8000 personnes en France à l’heure actuelle.
Procédures
Dans le cadre du protocole expérimental, différentes manipulations sont réalisées sur les animaux. Pour l'identification génétique des individus malades, une incision à l’extrémité de la queue est pratiquée sur les souriceaux (moins de 1 minute, 1 seule fois). Le protocole comprend une phase d'activité motrice. Les séances durent 20 minutes et sont réalisées quotidiennement jusqu’à la fin de l'expérience. L’intensité et la durée de ces activités sont adaptées aux capacités de l’animal. Concernant les injections, plusieurs types sont effectués : 1) Injections sous la peau ou dans la cavité abdominale : elles sont rapides (moins d’une minute), réalisées sur l’animal vigile, et peuvent avoir lieu jusqu’à deux fois par jour tout au long du protocole. 2) Injections dans le système nerveux central : elles sont effectuées sous anesthésie. Selon le type d’injection, la durée de la procédure varie (environ 10 minutes pour l’injection dans le canal rachidien, environ 30 minutes pour l’injection intracrânienne). Ces dernières ne sont réalisées qu’une seule fois dans la vie de l’animal. Toutes ces manipulations – activités motrices et injections – sont planifiées avec précision dans le calendrier expérimental. Le recours à la contention est limité au strict nécessaire et uniquement pour la durée des procédures.
Impact sur les animaux
Dans notre étude sur la maladie de Charcot chez la souris, certains effets secondaires sont attendus, principalement à cause des symptômes de la maladie elle-même. Les souris malades présentent une faiblesse musculaire et ont des difficultés à bouger lorsque la maladie avance. Les premiers signes apparaissent vers 3 mois avec une perte de force, puis, à partir de 4 mois, les souris commencent à perdre progressivement l’usage de leurs pattes arrière. Pour certains gestes techniques nécessaires à l’étude, comme l’administration de traitements, les animaux sont manipulés brièvement. Cela peut provoquer un stress passager ou une petite douleur, comme au moment d’une piqûre. Dans certains cas, des effets plus durables peuvent apparaître, notamment si les injections sont répétées. Les tests moteurs, lorsqu’ils sont utilisés comme approche thérapeutique, peuvent également provoquer de la fatigue ou du stress, une perte de poids ou des perturbations du sommeil.
Devenir
Dans le cadre de notre travail, certains animaux doivent être retirés de l’étude. Les animaux sont mis à mort à la fin des procédures pour analyser les tissus et mieux approfondir la compréhension de la maladie. Dans tous les cas, ces étapes sont menées avec le plus grand respect pour l’animal et dans le souci constant de limiter toute forme de souffrance.
Remplacement
Cette maladie neuromusculaire est très complexe. Elle touche plusieurs organes et types de cellules en même temps. Les dommages subis par les nerfs et les muscles ont des conséquences directes sur le mouvement et la coordination, ce qui ne peut être observé qu’en étudiant des animaux vivants. Pour mieux comprendre cette maladie et tester les effets de nouveaux traitements, il est donc essentiel de mener des recherches sur des modèles vivants. Bien sûr, en parallèle, nous utilisons aussi des techniques sur des cellules cultivées en laboratoire. Ces approches permettent d’explorer plus en détail certains mécanismes biologiques et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Nous pourrons alors tester sur les souris de possibles thérapies avant de les tester sur l'être humain.
Réduction
Dans le cadre de nos recherches, nous avons fait en sorte d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Notre objectif est de mieux comprendre les effets de cette maladie neurodégénérative, et de mieux comprendre les effets bénéfiques de l'activité motrice afin d’identifier des traitements. Pour cela, nous avons soigneusement calculé le nombre d’animaux nécessaires afin d'obtenir des résultats solides, sans en utiliser plus que ce qui est strictement nécessaire. Nous analysons ensuite les données recueillies à l’aide de méthodes statistiques adaptées à chaque situation, afin de tirer des conclusions justes. Par ailleurs, pour éviter le non emploi, nous prélevons autant de tissus que possible sur chaque animal à la fin de l'expérience. Ces échantillons sont ensuite conservés et mis à disposition de l’ensemble des chercheurs de notre équipe. Une liste des tissus encore disponibles est également partagée afin qu’ils puissent être utilisés dans d’autres projets, réduisant ainsi encore le besoin d’utiliser de nouveaux animaux.
Raffinement
Dans notre projet de recherche sur la SLA chez la souris, nous mettons tout en œuvre pour respecter le bien-être des animaux utilisés et réduire au maximum leur stress et leur inconfort. Pour cela, nous avons mis en place plusieurs mesures spécifiques. Tout d’abord, nous avons créé des grilles d’évaluation de l'état de santé de l'animal, adaptées à cette maladie particulière. Ces grilles ont été conçues avec l’aide du personnel spécialisé en soins animaliers. Elles permettent de suivre l’évolution de la maladie et de repérer rapidement tout signe de détresse chez les souris. Avant de commencer les expériences, les animaux passent par une phase d’adaptation/habituation. Cela permet de réduire leur stress. Quand une manipulation peut être source de mal-être, comme certaines injections, elle est toujours réalisée sous anesthésie. Si un animal montre des signes de faiblesse, comme une perte de poids ou des difficultés à se déplacer, des aliments faciles à consommer et des gels d’hydratation sont placés à sa portée. Et surtout, si malgré tout l’état d’un animal se dégrade, nous appliquons des règles strictes pour arrêter l’expérience à temps. Cela permet d’éviter toute souffrance inutile. Ces points d’arrêt anticipés sont décidés à l’avance pour chaque situation.
Choix des espèces
Les souris sont souvent utilisées dans la recherche car leur fonctionnement biologique est assez proche de celui de l’être humain. Cela permet de mieux comprendre certains mécanismes naturels qui protègent le corps, en particulier lorsqu’ils font intervenir plusieurs organes. Ce type d’étude ne peut se faire que sur un organisme entier, ce qui rend l’animal indispensable. Nous utilisons une lignée de souris bien connue et très utilisée, porteuse de la maladie de Charcot que nous étudions. Ce modèle est particulièrement utile car il permet de suivre précisément l’évolution de la maladie. Grâce à sa capacité de reproduction bien maîtrisée, cette lignée facilite l’organisation des expériences. Pour mieux comprendre comment cette maladie évolue, nous observons les animaux à différentes étapes de la maladie : avant l’apparition des symptômes (avant 3 mois), au cours de la maladie (entre 3 et 4 mois) et à un stade avancé de la maladie (après 4 mois). Cela nous permet de suivre les changements dans leur organisme et de mieux comprendre cette maladie. La maladie étant très comparable à celle chez l’humain, nous pourrons alors essayer sur ces animaux des traitements et vérifier s'ils sont bénéfiques.
Etude des conséquences neurologiques de l’infection par le virus SARS-CoV-2 et validation de l’efficacité de méthodes thérapeutiques contre le Covid long
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour mesurer les suites neurologiques d'une infection au SARS-CoV-2 et tester des pistes contre le Covid long, 1 344 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent le virus par voie intranasale sous anesthésie, jusqu'à deux fois, subissent quatre prélèvements sanguins et passent trois fois chacun une batterie de tests d'anxiété, de dépression, de mémoire, d'apprentissage et d'effort physique. Le porteur décrit une perte de poids et une apathie pendant la phase aiguë, et signale que certains tests placent les hamsters dans des situations anxiogènes. Aucun animal ne sort vivant du dispositif, y compris les non-infectés, faute de pouvoir quitter une animalerie de confinement de niveau 3. Les retombées annoncées restent une contribution au développement de futures approches thérapeutiques.
Objectifs
Ce projet a quatre objectifs : 1) Évaluation des conséquences à long terme de l'infection par le SARS-CoV-2 2) Analyse des répercussions sur le comportement en cas de réinfection par le SARS-CoV 3) Mise au point de nouvelles approches thérapeutiques du Covid long 4) Évaluation de la capacité d’invasion du système nerveux central par de nouveaux variants du SARS-CoV-2
Bénéfices attendus
1) Progression des connaissances des mécanismes infectieux du SARS-CoV-2, notamment liés aux facteurs de virulence, les voies de neuroinvasion et la capacité à induire des effets persistants après l’infection. 2) Contribution au développement de nouvelles approches thérapeutiques contre le Covid long 3) Contribution à la surveillance de l’apparition de nouveaux variants du SARS-CoV-2 à potentiel neurotrope.
Procédures
Interventions uniques - Inoculation virale intranasale sous anesthésie. Durée de l’intervention : de 5 à 30 minutes en fonction du type d’anesthésie. Interventions répétées - - Pour certains animaux : 2 inoculations intranasales. Chaque inoculation intranasale sous anesthésie a une durée entre 5 et 10 minutes. - Prélèvement sanguin sous anesthésie. Durée de l’intervention : moins d’une minute. Nombre d’interventions : 4 - Tests de comportement non-invasifs pour mensuration de signes d’anxiété et de dépression, de la mémoire et de l’apprentissage, et de la performance physique. Durée de l’intervention : entre 5 et 10 minutes par test. Nombre d’interventions des tests de comportement : chaque test est répété 3 fois.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont des conséquences directes de l’infection par le SARS-CoV-2, à savoir perte de poids et apathie pendant la phase aiguë du processus infectieux (entre 2 et 4 jours post-infection). Également, douleur et inconfort légers de courte durée liés à l’inoculation intranasal ou prélèvement sanguin. Certains tests de comportement peuvent générer du stress aux animaux (ex : exposition dans des situations anxiogènes pour mensuration de l’anxiété, induction à l’exercice physique pour test d’effort), cependant ces tests sont réalisés en phase post-aigue, quand les animaux ne présentent plus de signes cliniques de maladie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car infectés par un pathogène. Les animaux non-infectés ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car hébergés dans une animalerie de confinement niveau 3.
Remplacement
Les expériences proposées dans ce projet font suite et viennent compléter des expérimentations effectuées sur culture cellulaire et ne sont utilisées que lorsqu’elles représentent une étape incontournable pour l'avancement de la connaissance scientifique et non actuellement remplaçable par des tests in vitro. Dans ce contexte, l’utilisation d’animaux sera nécessaire dans 3 cas, notamment (i) pour vérifier l’impact de l’infection sur le comportement ; (ii) pour la validation in vivo de molécules candidates pour la thérapie contre le Covid long ayant montré une efficacité in vitro ; et (iii) pour comprendre la pathogénie (les mécanismes utilisés par les virus pour envahir le système nerveux central) de nouveaux variants.
Réduction
Les résultats de notre projet précédant nous ont permis de définir à 8 le nombre minimal d’individus/groupe pour obtenir des résultats significatifs dans les tests de comportement. Les tests statistiques portant sur les caractéristiques moléculaires observées et sur les mesures d’analyse d’image seront effectués par un test de comparaison de deux moyennes indépendantes pour comparer 2 groupes et un test d’analyse de variance pour comparer plusieurs groupes. Pour le comportement, d’autres tests statistiques permettront de prendre en considération l’effet sexe, l’effet temps et l’effet variant. A la fin de chaque procédure les organes des animaux seront prélevés pour des analyses de biologie moléculaire et histologiques.
Raffinement
Les animaux seront suivis de façon quotidienne pour analyse de leur poids et des éventuelles signes cliniques liés à l’infection. Des mesures seront prises pour réduire la douleur et la souffrance (anesthésie, analgésie, support nutritionnel et hydrique). L’enrichissement environnemental sera aussi renforcé par l’ajout dans les cages de boules ou cylindres, et du coton ou du carton déchiré.
Choix des espèces
Le hamster doré syrien (Mesocricetus auratus) est le meilleur modèle animal pour l’étude d’une infection par le SARS-CoV-2 en raison de la capacité de son récepteur ACE2 à se lier au SARS-CoV-2 avec une affinité de liaison élevée. De plus, ce modèle animal recapitule des caractéristiques du long Covid chez l’humain, notamment des changements de comportement à la suite de l’infection, et la persistance virale dans le cerveau. Ce projet utilise des hamsters adultes. Nous utiliserons des animaux adultes car ces animaux présentent des signes d’infection plus proche de ce qui est observé chez l’humain.
Impact de modifications du micro-environnement sur le développement de l’embryon pré-implantatoire de lapin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Six injections d'hormones espacées de douze heures, dont une dans la veine de l'oreille sous contention, sont administrées à chaque lapine pour déclencher une superovulation. 547 lapines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Leur mise à mort sert à récupérer ovocytes et embryons, le porteur indiquant qu'aucun prélèvement in vivo n'est possible assez vite chez cette espèce pour préserver le développement embryonnaire. Il décrit une douleur temporaire possible au moment des piqûres et une stimulation ovarienne, puis affirme que les soigneurs n'ont jamais observé de signe de douleur ou d'inconfort chez les lapines suivant ce traitement.
Objectifs
L’environnement dans lequel se développe un embryon, même dès les tout premiers jours après la fécondation, peut avoir des effets durables sur sa santé une fois adulte. C’est ce que l’on appelle les origines développementales de la santé et des maladies (DOHaD). Par exemple, si une future mère ne mange pas assez ou suit un régime déséquilibré au tout début de la grossesse, cela peut entraîner des problèmes de santé chez l’enfant, notamment au niveau du cœur et du métabolisme. Aujourd’hui, on utilise de plus en plus des techniques de laboratoire pour concevoir des embryons, que ce soit chez l’humain pour aider à la procréation ou chez les animaux pour améliorer certaines espèces. Mais ces embryons sont souvent cultivés dans des conditions de laboratoire (en termes de nutriments, d’oxygène, de température, etc.). Seuls les embryons capables de s’adapter à ces conditions survivent, ce qui pourrait influencer leur développement à long terme. On connaît encore mal les mécanismes biologiques derrière cette capacité d’adaptation et ses conséquences futures. Pour mieux comprendre ces phénomènes, les chercheurs utilisent des modèles animaux. Le lapin est particulièrement intéressant car son développement embryonnaire ressemble beaucoup à celui de l’humain. Ce projet vise donc à mieux comprendre comment les conditions de culture en laboratoire influencent le développement de l’embryon, et à identifier les méthodes les plus adaptées pour limiter les effets négatifs.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mieux comprendre comment les conditions de laboratoire (in vitro) influencent le développement des embryons tout au début de leur vie, avant même qu’ils ne s’implantent dans l’utérus. Pour cela, les chercheurs utilisent le lapin, car son développement est proche de celui de l’humain, ce qui permet d’en tirer des conclusions utiles pour la santé humaine. À court terme, l’objectif est d’améliorer les conditions dans lesquelles les embryons sont cultivés en laboratoire, pour garantir la bonne santé des bébés qui naîtront grâce à ces techniques. À moyen terme, les chercheurs veulent créer des modèles d’embryons simplifiés (appelés "embryoïdes") ou des cellules spécifiques pour mieux étudier le développement, tout en limitant l’utilisation d’animaux dans la recherche. À long terme, l’objectif est de mieux comprendre comment les changements dans l’environnement de la mère (comme un régime trop gras, trop sucré, ou exposé à des substances nocives) peuvent influencer le développement de l’embryon. En modifiant la composition du milieu dans lequel l’embryon est cultivé en laboratoire, les chercheurs peuvent simuler l’effet de ces régimes ou de ces expositions, et observer les conséquences. Cela permettra de mieux accompagner les femmes avant et pendant la grossesse pour favoriser la santé de leurs futurs enfants.
Procédures
Chaque lapine sera soumise à 6 injections (une injection toutes les 12h, sur animal vigile). Chacune des 5 injections sous-cutanées prend 1 à 2 seconde, ce qui correspond à une mobilisation de l’animal au total d’une trentaine de secondes (préhension, contention, injection, réconfort et repose dans la cage). La mobilisation de l’animal pour l’injection intraveineuse dure de l’ordre de 2-3 minutes pour permettre le placement dans la boîte de contention et l’injection dans la veine marginale de l’oreille (3 à 5 secondes d’injection).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce protocole, les lapines subissent quelques changements pour favoriser la production d’ovules. Une semaine avant le début du traitement, on modifie la durée de lumière qu’elles reçoivent chaque jour, ce qui peut provoquer un léger stress. Ensuite, elles reçoivent plusieurs injections d’hormones pour stimuler l’ovulation. Ces injections peuvent entraîner un léger stress lié à la manipulation des animaux, mais les lapines sont habituées à être manipulées régulièrement dans leur élevage. Il peut aussi y avoir une légère douleur temporaire au moment des piqûres ou à cause de la stimulation des ovaires. Toutefois, les soigneurs n’ont jamais observé de signes de douleur ou d’inconfort chez les lapines suivant ce traitement.
Devenir
Après la procédure de superovulation, les femelles sont mises à mort pour collecter les ovocytes ou les embryons. Aucune récupération d’embryons n’est possible chez cette espèce in vivo, sans prélèvement et lavage des voies génitales aussi rapide qu’après une euthanasie. Cette rapidité d’exécution est nécessaire pour éviter des effets délétères sur le développement embryonnaire
Remplacement
Pour étudier l’impact de l’environnement sur le développement de l’embryon, le recours aux animaux pour obtenir des embryons ou des ovocytes est obligatoire. A l’heure actuelle, aucun modèle in silico ou cellulaire ne reproduit la complexité du développement embryonnaire. Nous sommes très attentifs aux éventuels développements de nouvelles technologies qui permettraient de remplacer en partie l’utilisation de l’embryon de lapin.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé : nous développons une stratégie in vitro pour étudier l’impact de l’environnement ; les lapines sont super-ovulées afin d’augmenter le nombre d’embryons récoltés par lapine. Le nombre de lapines impliquées dans ce projet est réduit au maximum, tout en restant compatible avec l’utilisation des tests statistiques non paramétriques permettant une exploitation rigoureuse de nos résultats.
Raffinement
Les animaux sont habitués à la manipulation et à la contention par l’homme. Les lapines utilisées dans ce protocole sont habituées à être placées dans une boîte de contention afin d’éviter tout stress lors des injections nécessitant l’usage de cette boîte (injections intraveineuses). Les injections sous-cutanées sont réalisées par une simple contention manuelle rapide sans recours à la boîte de contention pour éviter un stress inutile à l’animal. L’eau est disponible à volonté, la nourriture est fournie sous forme de rations quotidiennes de granulés, et les paramètres ambiants sont contrôlés en permanence (température, humidité…). Les lapins sont logés en cages individuelles (conformes en tous points aux normes imposées par la Directive Européenne de 2010 / Décret de 2013), sans contrainte et selon les conditions en vigueur dans l'élevage. Les contacts sociaux (visuels, auditifs et olfactifs) obtenus par l'hébergement des différents animaux dans des cages adjacentes participent à l'enrichissement. Un enrichissement de leur milieu est mis en place afin de favoriser le bien-être des animaux, par l'apport d'objets (balles, chaînettes, mezzanines, jouets en polypropylène) dans l'environnement et éventuellement un enrichissement alimentaire par apport de faibles quantités de foin stérilisé et de blocs à ronger.
Choix des espèces
Le développement de l’embryon précoce de lapin présente de nombreuses similitudes avec celui de l’Homme (comme la vitesse de développement ou la dépendance aux nutriments). Le lapin apparaît ainsi comme un modèle de choix de l’Humain pour étudier les effets de l’environnement sur le développement embryonnaire. Les lapines adultes seront utilisées à maturité sexuelle entre 6 et 24 mois.
Effets des régimes nutritionnels paternels sur le métabolisme des spermatozoïdes, la reproduction masculine et la gestation chez la souris, 1/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Comprendre pourquoi les hommes obèses sont moins fertiles, et ce que leurs spermatozoïdes transmettent à leur descendance, sert de cadre à ce projet. 2 914 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour collecte d'organes. Rendues obèses, hyperglycémiques et résistantes à l'insuline par un régime riche en lipides suivi jusqu'à vingt-quatre semaines, elles subissent des jeûnes de vingt-quatre heures, des gavages de glucose, des injections d'insuline et d'hormones, jusqu'à six prélèvements sanguins à la queue, et pour les femelles gestantes une mesure quotidienne de pression artérielle sous contention de dix minutes. Sur les effectifs, le porteur écrit s'assurer d'utiliser "le nombre d'animaux minimal", sans donner ni calcul ni détail des groupes derrière ces 2 914 souris.
Objectifs
De récentes études indiquent que notre mode de vie et notamment un régime alimentaire entraînant une obésité peuvent modifier l’information non-génétique contenue dans les spermatozoïdes, appelée « épigénome ». Cette information peut être transmise à l’embryon lors de fécondations naturelles ou par assistance médicale à la procréation, en cas d’infertilité, et pourrait entraîner des complications pendant la grossesse et des maladies métaboliques chez la descendance. Le projet vise à étudier l’effet du statut nutritionnel et de différents régimes alimentaires en lien avec l’obésité sur le métabolisme des spermatozoïdes et la reproduction masculine chez la souris. Il permettra de mieux comprendre l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses, et le risque de transmission d’informations épigénétiques altérées à la descendance. Il se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre i) l'impact de l’état nutritionnel et du régime alimentaire sur les spermatozoïdes, ii) l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses et iii) l’impact de l’obésité paternelle sur le déroulé de la grossesse. Ceci aura des répercussions à moyen terme importantes d’un point de vue santé publique. Ce projet permettra peut-être d’identifier des biomarqueurs de qualité des spermatozoïdes.
Procédures
Interventions réalisées dans l'établissement 1 : - Prélèvement d'un petit bout de queue sur animaux vigiles une seule fois (durée 10 secondes) - Prélèvements sanguins à la queue sur animaux vigiles 3 à 6 fois. Durée 10 secondes par prélèvement. - Gavage de glucose sur animaux vigiles, une à deux fois, durée 30 secondes. - Injection d’insuline sur animaux vigiles une ou deux fois, durée 30 secondes. - Deux injections d'hormones sur animaux vigiles. Chaque injection dure 30 secondes maximum. Interventions réalisées dans l'etablissement 2: - Anesthésie pour suivi échographique des femelles gestantes. Durée 5 minutes. Fréquence : 3 fois sur toute la grossesse. - Contention d’animaux vigiles pour mesure de la pression artérielle (5 fois avant la gestation, puis tous les jours pendant la gestation). Durée 10 minutes maximum. - Contention d’animaux vigiles pour analyse par imagerie (1 fois, durée: 2 minutes).
Impact sur les animaux
Les injections, les biopsies de l’extrémité de la queue pour le génotypage, l’administration orale de glucose, les prélèvements sanguins au niveau de la queue et l’anesthésie générale causent un stress et une douleur légère de courte durée. La contention lors de ces actes, lors de la mesure de la tension artérielle et lors de l'imagerie, ainsi que le transfert des animaux d’un établissement à l’autre causent un stress de courte durée. La mise à jeun pendant 24h entraîne un stress modéré sur la durée du jeûne. L’anesthésie générale peut causer une hypothermie et une désorientation au réveil de courte durée. La mise sous régime riche en lipides entraîne une obésité, une hyperglycémie à jeun, une intolérance au glucose et une résistance à l’insuline. Les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l’insuline entraînent respectivement une hyperglycémie et une hypoglycémie qui sont transitoires sur une période de 2h.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issu de chaque procédure pour collecte d'organes et analyses.
Remplacement
Pour certaines études biochimiques et moléculaires nous utilisons des lignées cellulaires exprimant nos gènes d’intérêt. Dans le cadre de ce projet, il n’est pas possible de contourner l’utilisation de modèles animaux par des méthodes alternatives car il n'existe pas à ce jour d’approches (culture cellulaire ou organoïdes) permettant d’étudier l’impact de l’état nutritionnel ou de régimes alimentaires sur la spermatogenèse et le métabolisme des spermatozoïdes. L’impact du régime alimentaire paternel sur la grossesse ne peut également se faire que grâce à l’utilisation d’un modèle animal mammifère, comme la souris, pour que les résultats soient transférables à l’espèce humaine.
Réduction
Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux minimal afin d’obtenir des résultats fiables. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement élaborés afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. L'échographie sera réalisée sous anesthésie générale. Les femelles seront maintenues sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué aux responsables du projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour étudier la physiologie, grâce à sa population homogène et à ses similitudes avec la physiologie humaine, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus. Elle est largement utilisée pour simuler des pathologies humaines comme l’obésité et l’infertilité, et mener des études précliniques. La conservation génétique entre la souris et l’homme en fait un modèle privilégié pour étudier la reproduction et le métabolisme. Des souris de 4 à ~33 semaines, femelles et mâles ayant atteint la maturité sexuelle (et une durée maximale de régime alimentaire de 24 semaines) seront nécessaires pour cette étude. Des fœtus seront également analysés à la fin de la gestation.
Mise au point d’un nouvel agent de contraste biocompatible pour l’imagerie photoacoustique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Pose d'un cathéter, épilation à la crème dépilatoire, injection d'un produit inflammatoire ou chirurgie du cerveau de trente minutes, séance d'imagerie, puis perfusion mortelle. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, toutes tuées pour prélever leurs organes. Le projet met au point un agent de contraste à base de microparticules de polydopamine, destiné à repérer l'inflammation en imagerie photoacoustique. Le porteur qualifie cette imagerie de non invasive et annonce dans le même texte que l'injection du produit inflammatoire peut provoquer une insuffisance cardiaque, des lésions de plusieurs organes et la mort des animaux.
Objectifs
L'inflammation joue un rôle central dans de nombreuses maladies, qu'elles soient neurologiques (AVC, traumatismes crâniens), digestives (maladie de Crohn), rénales (néphropathie diabétique) et cardiaques (ischémie du myocarde, myocardite). Ce projet vise à développer l’imagerie photoacoustique, une méthode innovante et non invasive pour visualiser l’inflammation de manière précoce et précise. Il repose sur l’utilisation de microparticules de polydopamine, un matériau biocompatible qui absorbe la lumière infrarouge et devient détectable en imagerie. En associant les microparticules de polydopamine à un anticorps ciblant une molécule inflammatoire, ces particules permettent de localiser les zones touchées dès les premiers stades de la maladie. Déjà prometteuse en IRM avec de l’oxyde de fer, cette approche pourrait offrir une alternative plus accessible pour détecter l’inflammation. L’objectif est d’évaluer sa précision et sa compatibilité biologique en vue d’une future application médicale.
Bénéfices attendus
Il est attendu de la technique d'imagerie photoacoustique utilisant ce nouvel agent de contraste qu'elle puisse permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation dans les différents modèles de maladies inflammatoires proposés. Cette étude pourra apporter les premiers éléments permettant d’envisager une application clinique future. A terme, cette nouvelle méthode d’imagerie pourrait améliorer le diagnostic et la prise en charge de nombreuses pathologies inflammatoires.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o 1 pose d’un cathéter sous anesthésie (durée : environ 15min) o 1 épilation d'une zone de la peau avec une crème dépilatoire sous anesthésie (durée : inférieure à 5 min) o 1 séance d'imagerie photoacoustique (non invasive) avec injection de produit de contraste sous anesthésie (durée : environ 20min) o Induction d'un modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) OU Induction d'un modèle de neuroinflammation par une unique chirurgie stéréotaxique sous anesthésie (durée : environ 30min) o Pesées lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o 1 perfusion après anesthésie et analgésie profonde (durée : environ 5min).
Impact sur les animaux
Les deux modèles d'inflammation utilisés peuvent produire des effets indésirables chez les animaux. Dans le premier modèle, une inflammation cérébrale créée pourra induire des changements dans le fonctionnement cérébral (symptômes dépressifs, de l'anxiété, altérations des fonctions mentales) et la chirurgie cérébrale réalisée pour induire le modèle peut provoquer des micro-saignements et des douleurs au niveau des points de suture de la peau. Dans le deuxième modèle, l'injection du produit inflammatoire peut induire une inflammation généralisée, une insuffisance cardiaque et des lésions touchant plusieurs organes ce qui peut mener à la mort des animaux. L’injection des microparticules pourrait provoquer une légère irritation ou une réaction inflammatoire. Enfin, l’anesthésie, bien que couramment utilisée, peut parfois causer des effets secondaires comme des troubles respiratoires, une baisse de température ou une récupération plus lente après le réveil (fatigue, comportement modifié).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisés en imagerie photoacoustique sur les microparticules de polydopamine (en utilisant des "fantômes") et ont montré que la polydopamine présente une absorption et une fluorescence significatives dans la région du proche infrarouge, adaptée à l'imagerie photoacoustique. Cependant, les expériences in vitro ne peuvent pas totalement remplacer les études in vivo, car il est crucial d’évaluer la sensibilité et la spécificité de détection des microparticules de polydopamine après injection dans un organisme vivant, en tenant compte des facteurs spécifiques à l'environnement biologique, tels que le flux sanguin, le passage du signal à travers la peau, les interactions avec les tissus environnants, la distribution des particules dans les différents organes. De plus, des études in vivo sont nécessaires pour évaluer la biodistribution et la biodégradabilité des particules à long terme, ainsi que pour détecter d’éventuels effets indésirables qui ne peuvent se manifester qu'après une période prolongée dans un organisme vivant. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet sont essentielles et ne peuvent être remplacées par des méthodes ne nécessitant pas l’utilisation d’animaux vivants, car seule l’expérimentation in vivo peut fournir les données complètes nécessaires pour valider cette approche et garantir sa transposition en clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été soigneusement évalué à partir des données issues de nos précédentes études ayant utilisé les mêmes modèles animaux et les mêmes types de microparticules. Conformément aux recommandations scientifiques, pour le développement d’un nouvel agent de contraste dans une modalité d’imagerie donnée, il est essentiel de s’appuyer sur un nombre d’animaux compris entre 5 et 10 par groupe pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre est nécessaire pour évaluer la spécificité (par exemple, à travers des études comparatives avec des particules ciblant les molécules d’adhésion endothéliales ou des particules contrôles) et la sensibilité (notamment via des études de dose-réponse). Le nombre d’animaux requis est important mais d'après nos précédentes expériences dans le développement d’agents de contraste, nous avons établi que ces contrôles sont indispensables pour garantir la validité des résultats. Nous avons conçu le protocole de manière à minimiser ce nombre, en nous assurant que chaque expérience soit la plus informative possible tout en respectant les principes de réduction et de raffinement dans l’utilisation des animaux.
Raffinement
Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des animaux de type boite à oeuf, tunnel PVC et/ou igloo PVC est prévu. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Un gel "diet énergie" sera placé dans la cage pour faciliter la prise alimentaire et l'hydratation. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite dans les 3 heures après les injections, puis tous les jours jusqu’à la mise à mort des animaux. De plus, pendant la durée des modèles et avant la perfusion réalisée pour le prélèvement des organes d'intérêt, la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir ces temps d'étude par une analgésie.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies de type inflammatoire. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les pathologies inflammatoires. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines, car c’est à partir de cet âge qu’ils sont considérés comme adultes.
Étude des conséquences tissulaires, biologiques et fonctionnelles des déafférentations vestibulaires périphériques sur modèles rongeurs
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
Rats : 550
Un animal qui suffoque, tremble ou présente des troubles respiratoires après l'injection du produit ototoxique est aussitôt anesthésié puis tué. 550 rats et 300 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus. Un composé chimique est injecté à travers le tympan sous anesthésie générale pour détruire les capteurs de l'équilibre, ce qui provoque vertiges, pertes d'équilibre, perte de poids et parfois ulcère de la cornée par lésion du nerf facial. Le porteur prévoit des tests comportementaux aux jours 1, 2, 3, 4, 7, 10, 15, 21 et 30 après la lésion, quinze minutes par séance, sans jamais préciser lesquels.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les conséquences d’une atteinte des capteurs vestibulaires de l’équilibre situés dans l’oreille interne. L’objectif est d’identifier les mécanismes responsables des troubles de l’équilibre et ceux qui permettent une récupération naturelle, appelée « compensation vestibulaire ». Les recherches s’organisent autour de plusieurs thématiques : • Comprendre comment les noyaux vestibulaires situés dans le tronc cérébral s’adaptent après une lésion vestibulaire. Tester si la restauration de l’équilibre après lésion vestibulaire peut être améliorée grâce à des médicaments ou des exercices de rééducation. • Étudier la capacité naturelle des capteurs vestibulaires de l’oreille interne à réparer leurs connexions après une atteinte. • Explorer l’impact du vieillissement sur ces capteurs et son lien avec les troubles de l’équilibre liés à l’âge. • Analyser les variations hormonales associées aux lésions vestibulaires afin de déterminer leur rôle dans l’apparition et l’évolution des symptômes vestibulaires. Ces travaux permettront de mieux cerner les mécanismes biologiques à l’origine des troubles de l’équilibre et d’ouvrir de nouvelles pistes pour améliorer leur traitement et leur prise en charge.
Bénéfices attendus
Utilisation du modèle animal de vestibulopathie pour mieux comprendre la physiopathologie vestibulaire. L’objectif étant d’améliorer les processus de rééducation et traitements pharmacologiques anti vertigineux de manière à les rendre plus efficace pour une meilleure prise en charge du patient vestibulaire.
Procédures
Injection d’une solution chimique à travers le tympan sous anesthésie générale pour induire le syndrome vestibulaire (vertige, déficits de la posture et de la marche) : de 5 à 10 min. Test comportementaux aux Jours 1, 2, 3, 4, 7, 10, 15, 21 et 30 après la lésion vestibulaire: 15 min par session. Chirurgie sans réveil (Perfusion intracardiaque) pour les prélèvement d’organes d'intérêts.
Impact sur les animaux
Souffrances inévitables : L’introduction d’un liquide dans l’oreille moyenne (composé ototoxique utilisé pour la lésion vestibulaire) peut être source d’inconfort. Les déficits vestibulaires conduisent à des effets indésirables tels que des problèmes de maintien de la posture, une perte d’équilibre et de la fatigue. Nuisances potentielles : Les animaux soumis à une lésion vestibulaire peuvent avoir un déficit d’hydratation dans les 24-48 heures après l’atteinte vestibulaire. Une perte de poids est attendue chez les animaux après la lésion vestibulaire en conséquence de la chirurgie et des problèmes d’équilibre majeurs présents les premiers jours. Les tests comportementaux peuvent être source de stress pour les animaux car ils sont séparés temporairement de leurs congénères (5 à 10min). Autres nuisances possibles : perte d’appétit, instabilité posturale, absorption possible des composés ototoxiques par voie orale (via la trompe d’Eustache), ulcère de la cornée en raison d’une possible lésion du nerf facial, saignement depuis la cavité tympanique ou apnée aiguë pendant l’administration des composés ototoxiques entraînant le décès de l’animal. Nuisances potentiellement générées par les prélèvements sanguins : œdème
Devenir
La totalité des animaux du projet (rat n=550 ; souris n=300) seront mis à mort afin de récupérer les tissus d’intérêts pour des analyses biologiques.
Remplacement
Il existe des alternatives n’utilisant pas de modèles animaux telles que la méthode in silico ou encore in vitro. La méthode in silico utilise des modèles informatiques dans le but de prédire ce qui se passerait dans la réalité. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle informatique mimant de manière aussi complexe la physiologie et la physiopathologie du syndrome vestibulaire. Un autre modèle serait le modèle in vitro qui consiste en l’étude d’éléments hors de leur environnement en conditions définies et contrôlées. Puisque nous avons besoin de l’individu dans son ensemble, autant au niveau cérébral qu’au niveau périphérique (informations quant à la posture, au barycentre et concernant l’état d’anxiété de l’animal), nous ne pouvons pas substituer le modèle animal par ces modèles.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été fixé avec l’aide d’un statisticien du laboratoire. Nous avons utilisé un logiciel approprié nous permettant de calculer la puissance statistique pour atteindre les résultats escomptés, tout en maintenant un nombre d’animaux le plus faible possible. Dans une approche de réduction, les mêmes animaux serviront à la fois pour les tests comportementaux, les prélèvements sanguins et l’analyse des tissus vestibulaires.
Raffinement
Avant l’administration d’une solution chimique à travers le tympan pour induire les déficits vestibulaires, les animaux sont sous anesthésie générale. La température de l’animal est maintenue avec une couverture chauffante thermorégulée, et une solution d'hydrogel est appliquée sur les yeux pour l’hydratation oculaire. Avant le réveil de l’animal, une solution sera injectée pour sa réhydratation et ainsi compenser les pertes liquidiennes liées à la chirurgie. Les biberons des cages des animaux seront équipés d’une pipette allongée et une solution nutritionnelle complète sera fournie dans la cage des animaux pour faciliter l’hydratation et l’alimentation durant la première semaine post-lésion. La douleur et l’état de santé des animaux seront évalués grâce à une grille d’observation qui prend en compte leur apparence, leur comportement, leur hydratation et d’éventuels signes cliniques. • Si l’animal présente un comportement normal, il poursuit l’expérience. • En cas de signes légers, une surveillance renforcée est mise en place et un traitement contre la douleur peut être donné. • Si des signes de souffrance apparaissent, un traitement contre la douleur adapté est administré et un avis extérieur est demandé pour décider de la suite de l’expérimentation. • En cas de souffrance sévère, l’expérience est immédiatement arrêtée et l’animal est endormi puis mis à mort. Certains signes graves entraînent aussi un arrêt immédiat, comme une perte de poids importante, de fortes difficultés motrices ou respiratoires, ou encore des complications liées à la lésion. Par exemple, si des substances utilisées lors de la lésion vestibulaire provoquent une réaction aiguë (suffocation, tremblements, troubles respiratoires), l’animal est aussitôt anesthésié et mis à mort pour éviter toute souffrance. Les animaux sont habitués à l’expérimentateur et à la salle d’expérimentation pendant 1 à 2 semaines pour limiter le stress. Une récompense (riz soufflé chocolaté) est donnée aux animaux après les tests comportementaux avant leur retour dans l’animalerie. L’hébergement des animaux se fait en groupe pour limiter le stress. Nous vérifierons après chaque prélèvement sanguin si un œdème se présente. Une pression sur la queue de l'animal sera réalisée après chaque prélèvement pour faciliter la coagulation et éviter un saignement. L'animal sera surveillé pendant 5min avant de le remettre dans sa cage et du riz soufflé chocolaté lui sera donné en récompense.
Choix des espèces
Le modèle rat présente de nombreux avantages en termes de manipulation et de coût et il reproduit le syndrome vestibulaire rencontré chez l’homme. Le choix de ce modèle pour les expérimentations sur l’axe Compensation et Hormones relève du souhait de bénéficier des expérimentations réalisées et validées précédemment dans l’équipe. Le modèle souris de déafférentation du vestibule a été précédement développé par notre équipe. Le choix du modèle souris a été priorisé avec l’objectif d’utiliser des modèles de souris génétiquement modifiées. Le modèle TTK souris a permis d’identifier les acteurs impliqués dans le processus de réparation des synases vestibulaires endommagées et dans les processus de restauration fonctionnelle qui en résultent. Nous souhaitons poursuivre les études sur ce même modèle afin de bénéficier des avancées initialement publiées. Le choix du modèle souris pour les expérimentations sur le vieillissement relève du même souhait de bénéficier des expérimentations réalisées sur la souris adulte. Pour étudier la plasticité post-lésionnelle du système nerveux, les rats et les souris utilisés seront âgés d'au moins 3 mois (jeunes adultes), âge auquel le système nerveux est considéré comme mature. Selon les courbes de poids, le poids des rats mâles sera compris entre 300 et 350g, tandis que celui des femelles sera compris entre 200 et 250 g au début des expérimentations. Pour les souris le poids sera compris entre 15 et 35g. Pour l’Axe « AGING », des souris de différents âges seront utilisées (3-6-18-24 mois) afin de suivre l’expression âge-dépendante du BDNF dans le cerveau.
Evaluation de la pharmacocinétique de composés
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 500
Lapins : 125
500 souris, 500 rats et 125 lapins vont être utilisés dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, tous tués pour récupérer organes et fluides et y doser un composé. Les prélèvements sanguins se font au sinus rétro-orbitaire chez la souris, à la veine caudale chez le rat, à la veine marginale de l'oreille chez le lapin, avec des isolements d'une heure par jour en cage individuelle pour récolter urines et fèces. Le projet suit le devenir de molécules dans le corps pour le compte de clients, l'espèce étant choisie selon la demande de ces derniers. Le porteur retient le lapin parce que sa taille permet des prélèvements de plus grand volume, argument de réduction qui repose sur la quantité de matière tirée de chaque individu.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier la pharmacocinétique de composés (médicament ou ingrédient). Lors de l’élaboration d’un nouveau médicament, il est indispensable de s’assurer qu’il atteindra correctement sa cible (cellule, tissu), qu’il pourra être correctement utilisé puis éliminé. C’est précisément l’objectif des études de pharmacocinétique : suivre le devenir d’un composé dans l’organisme. Les résultats de ces études permettent d’identifier les éventuelles étapes au cours desquelles le composé rencontre un obstacle l’empêchant de remplir sa mission (absorption, distribution, métabolisme, élimination). C’est sur la base de ces résultats que la formulation, la dose ou le mode d’administration peuvent être ajustés pour optimiser l’efficacité d’un composé donné. En première intention, des évaluations in silico et/ou in vitro permettent de faire une première étape de caractérisation d’un composé (formulation, structure, concentration, etc.). En deuxième intention, l’évaluation chez l’animal vivant apporte des informations supplémentaires cruciales pour améliorer l’efficacité du composé : biodisponibilité sanguine et tissulaire, concentration des métabolites, clairance, demi-vie, etc. C’est l’objet du présent projet.
Bénéfices attendus
De nombreuses pathologies sont aujourd’hui incurables à cause d’un manque d’efficacité des traitements existants. Nos études de pharmacocinétique contribueront à rendre les traitements du futur plus ciblés et plus efficaces en ayant une meilleure connaissance de leur utilisation par l’organisme.
Procédures
1) Les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie ou non (selon l’espèce, et le site du prélèvement). Ces prélèvements seront très rapides (1 minute). Le nombre de prélèvements sera dépendant de chaque étude, mais respectera les limites décrites dans la procédure. 2) Les animaux pourront être soumis à des prélèvements de fèces ou de mictions. Ces prélèvements s’effectueront sur une durée maximale d’une heure par 24h, en cage isolée. Le nombre de prélèvements sera dépendant de chaque étude. 3) Les animaux recevront une ou plusieurs injections de composés. Les administrations sont très rapides (2-3 minutes). Le nombre d’administrations sera dépendant de chaque étude mais respectera les limites décrites dans la procédure.
Impact sur les animaux
Les nuisances pouvant être causées dans ce protocole proviennent : - De l’introduction d’une aiguille lors de l’injection d’un composé. - D’un prélèvement sanguin (pouvant être réalisé à la veine mandibulaire ou au sinus rétro-orbitaire (souris), à la veine caudale (rat), veine marginale de l’oreille (lapin) du vivant de l’animal. Dans le cas d’un prélèvement au sinus rétro-orbitaire (souris), à la veine caudale (rat) ou à la veine marginale de l’oreille (lapins), les animaux seront anesthésiés. - D’un isolement de courte durée (1h maximum par 24h) pour la récolte de mictions et de fèces ou bien lors de l’administration d’un composé par voie aérienne en cage à nébuliser. Toutes les manipulations seront effectuées par un personnel qualifié. Une attention particulière sera portée au stress de l’animal en favorisant une acclimatation des animaux.
Devenir
Tous les animaux inclus dans cette procédure seront mis à mort afin de récupérer leurs organes et fluides dans le but de pouvoir doser le composé injecté, ses métabolites et ses précurseurs, ou toute molécule nous permettant de retracer le devenir du composé dans l’organisme.
Remplacement
Chaque fois que cela sera possible, les composés de nos clients seront évalués sur culture cellulaire ou organe isolé en remplacement des tests animaux. L’utilisation unique d’études in vitro n'est pas suffisante pour évaluer la pharmacocinétique d’un composé. Les modèles vitro ne permettent pas de réunir toute la complexité des interactions moléculaires, cellulaires, tissulaires d'un animal entier. De plus, c’est une exigence réglementaire de démontrer des effets bénéfiques chez l’animal (puis chez l’Homme), pour qu’un médicament potentiel puisse prétendre à une autorisation de mise sur le marché.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et, chaque fois que cela sera possible, les candidats médicaments seront initialement évalués en culture cellulaire ou sur organes isolés. Le nombre minimum d’animaux est défini en tenant compte de la variabilité interindividuelle, qui nécessite d’être contrecarrée par la taille de nos groupes d’animaux. Le nombre de rats, de souris et de lapins nécessaires a été défini afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Enfin, nous utiliserons en priorité (sauf exigence spécifique de la part de nos clients) des lignées consanguines, qui présentent un génotype contrôlé, ce qui réduit significativement la variabilité interindividuelle, et par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Cela nous conduit à former des groupes de 10 animaux chez la souris et le rat, et des groupes de 5 animaux pour les lapins.
Raffinement
Les expérimentateurs sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences des expérimentateurs est reporté de manière individuelle sur un livret de compétences mis à jour régulièrement. Par ailleurs, les souris et les rats seront hébergés selon les conditions de la directive 2010/63/UE. Leur environnement sera enrichi (igloo, carré de coton) de manière systématique et quelle que soit la durée du protocole. Les lapins seront eux hébergés par 2, selon les conditions de la réglementation 2010/63. L'enrichissement sera composé de buchettes et d'un jouet. Un cycle jour/nuit de 12h/12h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante. Pour les gestes qui le nécessite, conformément à la règle des 3R, les animaux seront anesthésiés et analgésiés. Les animaux seront vus quotidiennement par un expérimentateur et/ou un zootechnicien. En cas de signe de mal-être (défini dans la procédure), un suivi renforcé sera mis en place : l’animal sera pesé et des soins adaptés à son cas seront mis en œuvre. L’atteinte d’un point limite critique conduira à l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
L'utilisation de rats et de souris se justifie, d'une part, par leur proximité avec l'Homme (mammifères). D'autre part, les performances de reproduction des rats et souris permet d'obtenir des effectifs exploitables en termes d'analyses statistiques, dans un délai relativement court et donc compatibles avec nos contraintes de production. Cependant, le lapin est phylogénétiquement plus proche de l'Homme que les rongeurs et compte tenu de sa taille, il permet des prélèvements de fluides ou de tissus importants réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Par conséquent, selon la demande du client l’espèce la plus adaptée sera choisie pour l’étude. Par défaut, les animaux seront utilisés à l'âge adulte car l’essentiel de notre activité se concentre sur des composés visant une population adulte. Nous n’excluons pas la possibilité qu’une étude nécessite de se dérouler chez des animaux plus jeunes (système immunitaire immature). Le cas échéant, l’âge minimum des animaux correspondra à l’âge du sevrage (3 semaines pour les souris et les rats et 7 semaines pour les lapins).
Tests réglementaires d’activité pour la production de vaccins ou de médicaments immunogènes à destination de l’homme
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Cochons d'Inde : 44111
Le contrôle réglementaire de lots de vaccins avant leur mise sur le marché repose ici sur l'injection d'agents pathogènes à des animaux vivants. 136 195 souris et 44 111 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, 4 181 souris et 300 cobayes étant réutilisés et 99 cobayes placés à l'adoption, le reste tué. Les souris reçoivent une à trois injections de virus rabique ou de toxine tétanique, les cobayes jusqu'à sept injections de toxine diphtérique ou de tuberculine, les fortes doses pouvant provoquer des symptômes rabiques du cinquième au quatorzième jour, des symptômes tétaniques sur quatre jours ou une nécrose localisée. Le porteur annonce le remplacement progressif de ces tests par des contrôles 100 % in vitro et l'arrêt du test tuberculine dans les cinq ans, ce qui situe ces 180 306 animaux dans l'intervalle avant une bascule qu'il tient lui-même pour possible.
Objectifs
Ce projet consiste à évaluer l’activité protectrice soit : • De vaccins (valences rage, diphtérie et tétanos), à différents stades de production • D’un composé immunogène (tuberculine), tous destinés à l’homme. Les vaccins contre la rage, la diphtérie et le tétanos jouent un rôle fondamental dans la protection de la santé humaine à l’échelle mondiale. La rage est une maladie virale presque toujours mortelle une fois les symptômes apparus, mais entièrement évitable grâce à la vaccination, notamment en post-exposition. La diphtérie et le tétanos, quant à eux, sont des infections bactériennes graves : la diphtérie peut entraîner des complications respiratoires et cardiaques sévères, tandis que le tétanos provoque des spasmes musculaires douloureux pouvant être mortels. Ces maladies sont aujourd’hui rares dans les pays à forte couverture
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont la mise sur le marché (ou éventuellement l’utilisation en essai clinique) de lots de vaccins ou de composés immunogènes conformes aux spécifications et aux textes de référence, et ainsi améliorer la qualité de vie des patients. Bien que le nombre de dose associé au nombre de lot soit difficilement estimable, on peut considérer que ce projet représente la libération d’environ un million de dose de vaccins contre la diphtérie et le tétanos (soit 1000 lots), 100 000 doses de vaccins contre la rage (soit 100 lots) et 10 000 doses de détection de l’infection tuberculeuse lente même en l’absence de symptôme (soit 10 lots). Il joue donc un rôle fondamental dans la protection de la santé humaine à l’échelle mondiale.
Procédures
3 injections sous anesthésie gazeuse sont réalisées sur les souris. 7 injections sont réalisées sur les cobayes. 1 injection est réalisée sur les cobayes. 5 à 7 injections sont réalisées sur les cobayes. 2 injections sont réalisées sur les souris. 1 injection est réalisée sur les souris. 5 injections sont réalisées sur les cobayes. Ces différents types d’injection durent moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont : • Injection de virus rabique chez la souris (10 secondes) : les plus faibles quantités injectées ne produisent pas d’effet chez l’animal. Les plus importantes quantités de virus peuvent provoquer des symptômes rabiques potentiels de J5 à J14. • Injection de toxine diphtérique chez le cobaye (30 secondes) : les plus faibles quantités injectées ne produisent pas d’effet chez l’animal. Les plus importantes quantités de toxine peuvent provoquer des symptômes diphtériques potentiels sur 24 h. • Injection de toxine tétanique chez la souris (10 secondes) : les plus faibles quantités injectées ne produisent pas d’effet chez l’animal. Les plus importantes quantités de toxine peuvent provoquer des symptômes tétaniques potentiels sur 4 jours • Injection de mycobactérium tuberculosis (10 secondes): la révélation avec la tuberculine peut engendrer des lésions érythémateuses potentiels sur 24h. Ces lésions peuvent dans certains cas exceptionnels aller jusqu’à une nécrose localisée
Devenir
Toutes procédures du présent projet ne permettent pas la réutilisation des animaux, qui ont tous subi des injections d’agents pathogènes ; Ils ne peuvent donc pas être inclus dans un autre test sans risque d’apporter un biais ou un risque sanitaire ; Ils ne peuvent pas non plus être adoptés sans risque pour l’adoptant. Comme ils n’ont pas été inclus dans la procédure, les animaux surnuméraires peuvent éventuellement être soumis à l’adoption ou être réaffectés à une autre procédure ou un autre projet, notamment au projet de formation.
Remplacement
Le remplacement des vaccins rabiques actuels par un vaccin nouvelle génération avec profil de contrôle 100% in vitro. La consommation d’animaux va diminuer progressivement durant la durée de validité du projet (test des stabilités). Concernant les vaccin diphtérique et tétanique : 1er objectif : pour les vaccins à destination Chine, remplacement du profil de contrôle d’activité par challenge par un test d’immunogénicité 2nd objectif : pour tous les vaccins, remplacement progressif par un test 100% in vitro
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est défini par la réglementation. Le prévisionnel du nombre de lots à tester sur les 5 années à venir et la mise en place des stratégies d’arrêt ou de remplacement de ces tests nous permettent de déterminer le nombre d’animaux nécessaires Un arrêt du test tuberculine dans les 5 ans à venir lié à l’arrêt du produit est envisagé.
Raffinement
Certaines injections sont faites sous anesthésie Les tests d’activité du vaccin rabique et tétanique comportent des points limites définis, permettant ainsi de limiter le niveau de souffrance atteint par les animaux. Des essais sont initiés en 2025 dans le but d’héberger les cobayes sur litière. Des récompenses alimentaires (graines et fruits secs) sont distribuées systématiquement après un acte technique. Cet ajout est également conseillé après tout acte jugé stressant (change, tonte, coloration…).
Choix des espèces
Les espèces choisies doivent être sensibles à l’agent infectieux correspondant au vaccin ou au composé immunogène contrôlé. Il s’agit de la souris pour les valences tétanique et rabique, et du cobaye pour la valence diphtérique et pour la tuberculine. Ces espèces sont décrites comme modèles dans les Pharmacopées en vigueur, ainsi que dans les rapports techniques de l’OMS. Les animaux utilisés dans ce projet sont tous a minima au stade sevré afin de garantir un certain niveau de maturité du système immunitaire.
Caractérisation chez la souris de vecteurs synthétiques pour le transfert d’acides nucléiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Vingt prélèvements sanguins, un par semaine pendant vingt semaines, et jusqu'à quatre séries d'injections dans les deux muscles des pattes pour chaque souris. 1 840 souris vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leurs organes et y doser les vecteurs. Ces vecteurs synthétiques doivent transporter des ARN messagers codant des anticorps, avec l'idée de faire produire le traitement par l'organisme lui-même. Le porteur annonce un "tournant majeur dans la lutte contre les épidémies et les pandémies", alors que le projet en est à comparer l'efficacité de formulations chez la souris.
Objectifs
La prévention et le traitement des maladies infectieuses ainsi que le développement d’alternatives au antiviraux chimiques limités pourraient voir le jour sur la base de la production d’anticorps neutralisant directement par l’organisme ouvrant ainsi un nouveau paradigme en biothérapie. Le développement d'une plateforme universelle d’ARNm codant pour ces anticorps permettrai de concevoir rapidement des traitements antiviraux, et ainsi d'offrir des solutions thérapeutiques plus confortables et plus efficaces pour les patients et à moindre coût. Cette approche pourrait être un tournant majeur dans la lutte contre les épidémies et les pandémies. Dans ce cadre, l’utilisation de vecteurs synthétiques est un élément indispensable à son succès car les molécules d’ARN sont incapables de franchir la membrane cellulaire, étape pourtant indispensable pour la production de la protéine correspondante. Les avancées récentes dans la chimie des vecteurs synthétiques ont permis le développement de vecteurs composés de polymères ou lipides, et qui possèdent des caractéristiques permettant d’envisager le transfert d’acides nucléiques (ARNm) avec des efficacités similaires à celles obtenues avec des vecteurs d’origine virale. Cela permet d’envisager simplement l’utilisation de ce type de vecteur à des fins de vaccinations, ou afin d’induire la production de protéines thérapeutiques in vivo. Les objectifs de ce projet sont de poursuivre l’optimisation de vecteurs synthétiques existants et la découverte de nouveaux, d’optimiser leur développement en évaluant l’efficacité (par dosage dans le sang et les tissus) des vecteurs pour le développement de traitements antiviraux à base d’anticorps produits directement dans l’organisme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole, permettra de poursuivre la caractérisation et l’identification des vecteurs synthétiques de nouvelles générations efficaces, simples et non-toxiques. Également, cela permettra d’évaluer l’efficacité de ces vecteurs synthétiques dans le cadre du développement d’alternatives aux anti-viraux chimiques pour lutter contre les maladies infectieuses. - Long terme : en cas de succès de la preuve de concept chez la souris, la voie sera ouverte pour i) le développement de nouveaux traitements innovants des maladies infectieuses ou toute maladie nécessitant la production d’un anticorps thérapeutique, présentant une meilleure efficacité et moins d’effets indésirables et ii) le développement de méthodes de prévention d’infection non chimiques qui présenteraient moins d’effets secondaires et seraient mieux tolérées que les traitements actuels tout en préservant l’environnement de l’accumulation de métabolites chimiques dans l’environnement et (iii) limiter l’utilisation d’antibiotiques qui induisent des résistances. L’impact du succès de ce projet serait de proposer une approche ARNm universelle, immédiatement disponible pour toutes les indications thérapeutiques, offrant une réponse biologique robuste et facilement industrialisable grâce à un outil standardisé et unique quel que soit le produit
Procédures
Les animaux subiront des injections intramusculaires des vecteurs sous anesthésie gazeuse de l'animal, placé sur tapis chauffant. La procédure durera moins de 5 min. Au maximum 4 séries d'injections intramusculaires dans les 2 muscles par souris espacées d’au moins 3 jours. Des prélèvements de sang seront également effectués sur animal anesthésié. Des prélèvements sanguins sont prévus avant l'injection puis 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude pour un durée totale de 20 semaines, soit 20 prélèvements sanguins en tout. Chaque prélèvement durera moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés sont principalement dus à l’injection ou aux prélèvements de sang. Plus précisément, nous surveillerons quotidiennement l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un comportement anormal de l’animal, une perte de poids, un gonflement ou une inflammation au site de prélèvement sanguin, une léthargie…. Les nuisances attendues sur les animaux sont : 1) Inflammation transitoire au niveau du site d’injection; 2) Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang; 3)- Risque infectieux lié à la réalisation du geste invasif (injection et prélèvement).
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et les organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le vecteur et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les vecteurs, évaluer leur efficacité, et / ou réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
De manière systématique, les vecteurs évalués in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des vecteurs testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, la meilleure efficacité de transfection étudiée ici correspond aux conditions où le plus de protéine codée par l’ARN messager issu du vecteur est exprimée dans le tissu dans lequel a été injecté le vecteur, donc seule l’approche in vivo sera considérée pour évaluer leur efficacité. En outre, les vecteurs utilisés dans notre étude sont de nature polymérique et ne sont pas capables de délivrer des ARN dans des cellules en culture, ni même des organoïdes. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. C’est d’ailleurs par cette approche que cette nouvelle classe de vecteurs a été récemment validée et qui a fait l’objet d’un développement préclinique réglementaire dont le plan d’étude a été validé par l’ANSM et les résultats présentés également à l’ANSM démontrant aucune toxicité ni mortalité.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité autant que possible tout en garantissant l’obtention de résultats interprétables, afin d’éviter la nécessité d’une étude supplémentaire. Un premier criblage in vitro a permis de ne retenir que les vecteurs les plus efficaces. En tenant compte de la variabilité attendue des réponses, un maximum de 10 animaux par groupe a été prévu. Ce seuil permet d'assurer la pertinence des analyses et la fiabilité des comparaisons, tout en respectant le bien-être animal. Le nombre a été déterminé à partir de données historiques et d’une approche statistique, et l'utilisation de chaque animal a été optimisée grâce à des mesures longitudinales et à des études pilotes. L’effectif sera revu à la baisse si les résultats préliminaires d’efficacité le permettent, en visant des données cohérentes et reproductibles entre les individus.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement - tube, frisotis, dôme, facilité d’accès à l’alimentation), nous utiliserons un analgésique local lors des prélèvements sanguins. Dans le cas de l'observation d'un inconfort liée aux injections intramusculaires, une injection de buprénorphine sera effectuée. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sera effectué une fois par semaine. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors des prises de sang), et les injections seront réalisées sous anesthésie et les animaux positionnés sur tapis chauffant.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car les vecteurs que nous utiliserons à titre de comparaison ont été validés in vivo sur la souris. De plus, cette espèce mammifère (à l’identique du rat) présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets des vecteurs chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant et analysable de liquides biologiques peut parfaitement être récupéré à partir de cet animal de laboratoire. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté à aux vecteurs étudiés mais concernera quasi exclusivement des souris adultes d’environ 8 à 10 semaines pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux.
Le rôle des gènes SoxC dans le dévelopment du rein
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Des femelles gestantes reçoivent une dose unique de tamoxifène par pipette, sous contention de vingt à trente secondes, pour désactiver trois gènes chez leurs embryons. 214 souris vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Le projet cherche à comprendre comment ces gènes commandent la formation du rein fœtal, sans perspective thérapeutique annoncée au-delà de la connaissance elle-même. Le porteur écrit que le tamoxifène "ne cause aucun effet secondaire" et fonde ses calculs sur 20 embryons, sans expliquer comment on passe de ce chiffre aux 214 souris déclarées.
Objectifs
Certaines malformations du rein et de l’appareil urinaire font partie des anomalies les plus graves que l’on peut détecter à la naissance. Dans les cas les plus sévères, elles peuvent entraîner la mort du nouveau-né. Dans d’autres cas, ces malformations peuvent causer des maladies rénales chroniques qui apparaissent plus tard, à l’adolescence ou à l’âge adulte. Ces maladies sont souvent liées à d’autres problèmes de santé, comme le diabète ou l’hypertension (pression artérielle trop élevée), qui sont les principales causes de mortalité chez les personnes atteintes. Depuis 1990, le nombre de cas de maladies rénales chroniques a augmenté de 29 %. Malgré l’ampleur du problème, il n’existe aujourd’hui aucun traitement permettant de guérir ces maladies. Dans notre laboratoire, nous cherchons à mieux comprendre comment se forment les reins. Pour cela, nous étudions un groupe de gènes qui pourraient jouer un rôle clé dans ce processus. Nous étudions les embryons parce que les reins se forment pendant la grossesse. Pour comprendre l’origine des malformations, il faut observer le développement dès le début, pas une fois que l’organe est déjà formé. Le tamoxifène est un médicament que l’on utilise comme un “interrupteur” pour activer un changement dans les gènes, de manière très ciblée, chez les souris de laboratoire. Dans notre modèle, certaines souris ont été génétiquement modifiées pour posséder un gène qui peut être désactivé (ou "supprimé") à un moment précis de leur vie. Mais ce gène ne se désactive pas tout seul : il faut un signal pour déclencher cette suppression. Ce signal, c’est le tamoxifène. Quand on administre le tamoxifène à ces souris, il agit comme une clé qui active une enzyme spéciale déjà présente dans leur organisme (appelée Cre recombinase, une sorte de petit outil moléculaire). Cette enzyme est inactive tant que le tamoxifène n’est pas là. Une fois activée, cette enzyme va repérer des "balises" spéciales placées autour du gène ciblé et va alors le couper ou le désactiver, comme si on retirait une pièce d’un circuit électrique. Ce mécanisme permet aux chercheurs d’étudier l’effet de la disparition de ce gène, à un moment précis et dans un tissu particulier, sans affecter tout l’organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamentale va permettre de comprendre comment le dysfonctionnement d'un groupe de 3 gènes altère la formation du rein fœtal. Ces malformations peuvent aboutir à une mortalité précoce ou à des maladies rénales chroniques pour lesquels à ce jour, à part la dialyse ou la greffe d’organe, la médecine n’a aucun autre recours. Les éléments de réponse à cette question permettront d’approfondir notre connaissance dans ce domaine.
Procédures
Chaque animal sera nourri par une dose unique de tamoxifène. Temps de contention de l’animal : 20 à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Dans ce projet d’expérimentation, nous envisageons une seule procédure qui consiste à administrer à des femelles gestantes du tamoxifène par voie orale, il ne s’agit pas de gavage mais par la méthode pipet feeding (alimentation par pipette) qui est moins invasive. Le tamoxifène ne cause aucun effet secondaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés selon la réglementation, car il n’est pas possible de les maintenir en vie après l’expérimentation en raisons de contraintes éthiques et sanitaires.
Remplacement
Une des étapes de ce projet nécessite une quantité très importante des cellules progénitrices du rein. Afin de remplacer l’animal nous avons mis au point, dans notre laboratoire, un protocole qui nous nous permet d’obtenir des cellules progénitrices du rein en quantité suffisante sans avoir recours à l’animal. Afin d’étudier d'autres aspects du fonctionnement de ces gènes, nous aurons besoin d'invalider les trois gènes à la fois, ce qui n'est possible que sur le rein des embryons mutants.
Réduction
Selon nos calculs basés sur des tests statistiques, nous nous basons sur 20 embryons mais si nous constatons des variations moins grandes que prévues, nous reverrons le nombre d’embryons à la baisse.
Raffinement
Des points limites seront appliqués : perte de poids >15 %, signes de suffocation, altération persistante de l’état général (prostration, perte de mobilité, difficulté d’alimentation/hydratation), ou douleur manifeste non contrôlée. Tout animal présentant un de ces critères sera immédiatement retiré de l’étude et mis à mort (décrit selon 3.3.3) Une surveillance régulière, adaptée aux périodes critiques, sera appliquée.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris comme modèle de recherche, car elle partage de nombreuses ressemblances génétiques et biologiques avec l’être humain. De plus, son patrimoine génétique peut être facilement modifié et étudié en laboratoire. Cela nous permet de créer des souris porteuses de maladies rénales semblables à celles que l’on observe chez l’humain. Nous utiliserons des femelles adultes âgées d’environ 8 semaines, car c’est à cet âge qu’elles sont le plus fertiles.
Colonisation et impact des archées méthanogènes sur la physiologie de l’hôte MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
142 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées par prélèvement terminal sous anesthésie sans réveil. Des souriceaux au microbiote défini reçoivent jusqu'à six administrations orales, jusqu'à cinq administrations rectales sous anesthésie et jusqu'à cinq injections dans l'abdomen, parfois précédées d'un traitement antibiotique. Cinq stratégies de colonisation par des archées méthanogènes sont mises en concurrence, la plus efficace étant ensuite reproduite deux fois pour en mesurer la variance, ce qui revient à mettre au point un modèle avant toute question biologique. Le porteur reconnaît utiliser des lignées cellulaires et des organoïdes pour explorer le même sujet, et conclut malgré tout qu'il n'existe "pas de méthodologie alternative".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle de colonisation des archées dans le tractus intestinal de souris au microbiote défini Oligo-MM12 (OMM12). Ce modèle va permettre l’étude de l’impact de la colonisation sur la physiologie intestinal et immunitaire de l’hôte. De plus, grâce à la grande stabilité intrinsèque du microbiote OMM-12, nous pourrons examiner quels sont les conséquences des archées sur la communauté microbienne tant en termes de stabilité, d’abondance ainsi que des modifications du métabolisme lié à l’hydrogène. Afin d’atteindre cet objectif, nous allons tester 5 stratégies de colonisation des souris avec les archées intestinales : 1.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux OMM-12 2.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux axéniques 3.Etude de la colonisation chez les souriceaux OMM-12 par des archées et une bactérie syntrophique 4.Etude de la colonisation chez les souriceaux OMM-12 par des archées et une bactérie syntrophique avec l’aide d’un traitement antibiotique 5.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux OMM-12 avec 5 gavages Enfin, après avoir sélectionné l’approche la plus efficace pour la colonisation des archées, nous la reproduirons deux fois indépendamment afin d’en évaluer la reproductibilité et la variance (Etude 6).
Bénéfices attendus
Les données obtenues permettront d’établir un modèle murin de colonisation avec des archées méthanogènes dans un microbiote définit. Ces études permettront de mieux comprendre les déterminant de la colonisation des archées intestinales chez la souris et par extension chez l’humain (dynamique temporelle, impact des bactéries, régime alimentaire). A ce jour, différentes publications montrent des corrélations entre la présence des archées et différentes pathologies chez l’humain mais il n’existe pas de modèle permettant d’étudier les interactions archées-microbiote-hôte. Grâce à ce modèle nous pourrons étudier par la suite le rôle de ces micro-organismes, uniques en termes de structures et de métabolisme, dans le contexte de maladies inflammatoires de l’intestin et d’allergie.
Procédures
- Administrations orales : 1 à 6 fois par une solution non-irritante, chaque administration durant moins d’une minute. - Administrations rectales : 1 à 5 fois par une solution non-irritante, chaque administration durant moins d’une minute. - Injection par voie intrapéritonéale : 1 à 5 lors des administrations rectales, quelques secondes
Impact sur les animaux
Un premier essai de colonisation dans les souris OMM-12 adultes a montré que le gavage par des archées méthanogènes n’induit pas d’effet indésirable comme la perte de poids ou une augmentation du stress des animaux. L’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires pour les administrations et les prélèvements induisent une douleur et un inconfort de courte durée. Le gavage effectué conformément aux bonnes pratiques de gestion des animaux, peut causer un inconfort léger de courte durée. Les administrations rectales seront réalisées sous anesthésie ce qui limitera le stress des animaux et ne devrait pas induire d’effet indésirable au-delà de l’anesthésie elle-même.
Devenir
Les souris seront mises à mort en fin de procédure afin de procéder aux prélèvements terminaux, effectués en fin de procédures et sous anesthésie, ne permettant pas leur réveil. Ces prélèvements sont nécessaires pour évaluer la colonisation des bactéries étudiées et analyser l’impact sur la physiologie de l’hôte.
Remplacement
Nous utilisons des stratégies de remplacements in vitro en utilisant des lignées cellulaires et des organoïdes afin d’explorer le rôle des archées intestinales sur l’inflammation et la barrière intestinale. Cependant ces modèles de remplacement son limité et ne permettent pas d’étudier les interactions complexes entre le microbiote et l’hôte. Toutefois, l’utilisation d’un modèle murin est nécessaire pour tester notre hypothèse car il n’existe pas de méthodologie alternative permettant d’analyser les interactions hôtes-microbiotes dans le contexte intestinal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux dans les différentes études, nous n’entreprendrons certaines études du projet uniquement si elles sont pertinentes scientifiquement. Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’outil de modélisation statistique (Shade) et les conseils d’une statisticienne. Le nombre d’animaux est limité au stricte nécessaire et suffisant pour déterminer si la colonisation des archées est réussie. Des tests statistiques seront menés afin de valider l’impact sur le poids des souris, la stabilité de la colonisation, de quantifier les potentielles modifications du microbiote et de déterminer la variance du modèle. Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à pris en compte grâce à des modèles emboîtés (modèles mixtes) tels que l’effet portée, microbiote, cage et répétition de l'expérience.
Raffinement
Les procédures expérimentales de ce projet sont légères ou modérées du fait de la répétition des injections. Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Nous nous efforçons de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une évaluation régulière des animaux et à la mise en place de points limites pertinents. Le gavage et l’administration rectale seront pratiqués avec du matériel adapté : sondes de gavage souples adaptées à l’âge de souris et à usage unique. Cela permettra de réduire significativement les nuisances liées aux gestes techniques eux-mêmes. De plus, si la colonisation fonctionne avec une seule administration, les autres administrations ne seront pas pratiquées. Pour certains gestes, l’anesthésie sera aussi utilisée D’après les données provenant d’expériences précédentes, l’administration des antibiotiques dans l’eau de boisson ne provoque pas de nuisances chez les animaux.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle murin nous permet d'analyser l'interaction des trois composants : le microbiote, les archées et la réponse de l’hôte. Il n’est pas possible de mener cette étude en utilisant les poissons zèbres ou des invertébrés car ceux-ci ne possèdent pas de microbiote anaérobie similaire aux humains et ni les conditions physico-chimiques nécessaires à la vie des archées méthanogènes. Les souris auxquelles nous allons recourir seront des souriceaux à la naissance que nous suivrons entre la période postnatale et la période adulte (6-10 semaines) ainsi que des adultes.
Vectorisation d’acides ribonucléiques circulaires à visée thérapeutique EU2/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un lymphœdème est provoqué chirurgicalement chez des souris femelles de cinq semaines, sous anesthésie générale, avec trois injections intradermiques d'un vecteur au cours de la même intervention. 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, transportées entre deux établissements pour que les prélèvements terminaux se fassent ailleurs. Le porteur décrit le lymphœdème comme une pathologie douloureuse et handicapante survenant après une chirurgie du cancer, puis résume les effets sur les souris à des douleurs modérées et un léger stress. Toutes sont tuées à l'issue de chaque procédure pour collecter les échantillons.
Objectifs
Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est également implique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation du systeme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude récente menée au laboratoire , notre équipe a montré que l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques permettant la production de facteurs lymphangiogéniques permettait d’améliorer la résolution du lymphoedème sur une durée courte. Dans cette étude, nous nous appuierons sur les résultats déjà obtenus par notre équipe et testerons l’efficacité d’une nouvelle génération de vecteurs à acides ribonucléiques développés au laboratoire. Ces nouveaux vecteurs produiront les mêmes facteurs lymphangiogéniques mais basés sur une nouvelle technologie qui permet de produire des lentivecteurs contenant des acides ribonucléiques thérapeutiques circulaires. La particularité des acides ribonucléiques circulaires est d’être beaucoup plus stable que les acides ribonucléiques linéaires utilisés dans nos études précédantes et devraient ainsi permettre une expression prolongée des molécules thérapeutiques. Le bénéfice attendu sera une meilleure efficacité et un effet renforcé par rapport aux résultats obtenus précédemment. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.La réalisation des procédures dans un 2eme établissement utilisateur nécessite la modification d’un projet initial autorisé sans ajout d’animaux
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques circulaires pour la première fois in-vivo et de faire la preuve du concept de leur utilisation. Les données obtenues au cours de ce projet et comparées à celles obtenues dans nos études précédantes visent à démontrer que cette nouvelle génération de vecteurs possède un avantage thérapeutique en permettant une expression prolongée du vecteur et des molécules thérapeutiques produites.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie sous anestésie générale d'une durée d'envion 20 minutes, 3 injections intradermiques lors d'une même anesthésie générale soit une durée d'envion 5 minutes. Dans le premier établissement utilisateur, les animaux subissent des injections intradermiques et une procédure chirurgicale (15 min par animal) . Dans le second établissement utilisateur, les procédures terminales sont réalisées
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de lymphoedème vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal
Devenir
Les animaux seront euthanasiée à l'issue de chaque procédure afin de collecter les échantillons nécessaires à l'étude.
Remplacement
Les données relatives à l’expression du vecteur ont été évaluées in-vitro (culture de cellules) mais ne sont pas suffisantes pour évaluer le niveau d’expression et la durée d’expression dans un contexte intégré in-vivo (implication de la réponse immunitaire en particulier). Par ailleurs, Le développement du lymphoedème fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours a l’expérimentation animale est l’unique approche intégrée permettant de comprendre les interactions complexes entre le vecteur et l’hôte (souris). Par ailleurs l’approche in-vivo seule permet d’évaluer le bénéfice thérapeutique des molécules exprimées dans le cadre du lymphoedème et la restauration de la fonction endothéliale lymphatique. Le lymphoedème fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires (cellule endotheliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux…) ; il n'y a aucune strategie de remplacement pour l'etude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune strategie de remplacement du modele animal qui permette de repondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de reduire le nombre d'animaux utilises dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorite uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre de l’étude et du traitement du lymphoedème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est reduit a son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calcule de maniere a donner des resultats statistiquement significatifs afin de delimiter l'effet du genotype, du temps et/ou du traitement
Raffinement
Les animaux sont places en piece d'acclimatation lors de leur arrivee a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie competent qui verifie leur etat et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de differents cartons de transport ne sont jamais melanges lors de la repartition dans les cages d'hebergement. Les animaux seront heberges en cage de 4 ou 5 et seront acclimates pendant une periode de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-etre de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillees quotidiennement selon les directives europeennes relatives a l'hebergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procedure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthesie generale avec analgesique sont realisees pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris a euthanasier seront placees dans une salle isolee du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront realisees dans une troisieme piece. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport)
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est oriente vers la souris afin de pouvoir obtenir des résultats comparables et à mettre en perspective par rapport à ceux obtenus dans nos études précédentes dans lequel le même modèle de souris a été utilisé. L’utilisation d’une autre espèce ferait perdre tout le bénéfice des données précédemment obtenues et ne permettrait pas d’évaluer le bénéfice attendu produit par les nouveaux vecteurs à ARN circulaires Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera réalisée chez des souris femelles a l'age de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 a 12 semaines.