Procédures modérées

Pour documenter les effets cardiovasculaires des immunothérapies anticancéreuses chez des individus déjà hypertendus, 450 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'hypertension leur est imposée par une mini-pompe implantée sous la peau, qui diffuse une molécule pendant vingt-huit jours. Viennent ensuite des anticorps deux fois par semaine pendant deux semaines, trois prélèvements de sang de dix minutes, des échographies du cœur et des carotides, une imagerie de l'œil, une imagerie du mésentère et des mesures de pression à la queue. Le porteur écrit avoir "soigneusement optimisé" le nombre de rats par groupe, sans donner de calcul de puissance, et arrive à un effectif d'environ 450 à partir d'un minimum de dix rats par groupe.

Objectifs

Documenter les potentielles toxicités cardio-vasculaires liés aux traitements par inhibiteurs des points de contrôles immunitaires utilisés dans le traitement des pathologies malignes. Comprendre les mécanismes de toxicités cardio-vasculaires liés aux traitements par inhibiteurs des points de contrôles immunitaires. Identifier les pistes de travail pour prévenir cette toxicité cardio-vasculaire.

Bénéfices attendus

La compréhension des conséquences cardio-vasculaires liés aux traitement par inhibiteurs des points de contrôles immunitaires, traitement des pathologies malignes, nous permettra d'appréhender au mieux ces complications. La compréhension des mécanismes physiopathologiques de ces complications et l'identification des cibles pour l'initialement d'une potentielle prévention avant l'apparition des complications cardio-vasculaires sont les enjeux de ce travail. L'incidence des pathologies malignes dans le monde augmente, de part notamment le vieillissement de la population. Aujourd'hui l'utilisation d’inhibiteurs de points de contrôles immunitaires est une pierre angulaire dans le traitement des pathologies malignes et l’amélioration des connaissances sur les effets indésirables potentiels de ces traitements est indispensable.

Procédures

Les rats seront soumis à la mise de place de mini-pompes sous la peau ( temps du geste 10 minutes) pour diffuser une molécule qui les rend hypertendus pendant une période de 28 jours. De plus, des traitements par anticorps qui modulent le système immunitaire seront administrés deux fois par semaine pendant 2 semaines afin d'évaluer la toxicité de ces traitements. Les rats bénéficieront de prélèvements sanguins à J1, J15, J28 jours soit 3 au total pour réaliser des analyses diverses (10 mn par prélèvement). Les rats bénéficieront de plusieurs examens in vivo : - Echographie trans-thoracique et carotidienne à J1 et J28 (temps d’intervention estimé à 10-20 min à J1 et à J28) – une imagerie oculaire à J28 (temps d’intervention estimé à 10 min à J28) – une imagerie du mésentère à J28 (temps d’intervention estimé à 5 min à J28) – la mesure de la pression artérielle au niveau de la queue du rat à J1 et J28 (temps d’intervention estimé à 10 min à J1 et à J28)

Impact sur les animaux

Pose de la mini-pompe sur un animal anesthésié : cette intervention entraîne une douleur post-chirurgicale ainsi qu’une gêne liée à la présence du capteur sous la peau. Injections : elles génèrent du stress lors de la contention de l’animal éveillé et peuvent également entraîner une gêne au niveau du point d’injection. Pléthysmographie sur un animal vigile : cette procédure induit un stress chez l’animal.

Devenir

A l'issu de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes pour des études biomoléculaires et histologiques. Ces tissus sont nécessaires pour valider les effets des traitements sur l'organisme.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les effets cardiovasculaires des traitements par inhibiteurs des points de contrôle immunitaire dans des conditions de physiopathologie intégrées, autrement dit, chez des animaux présentant déjà un facteur de risque cardio-vasculaire, comme l'hypertension artérielle. De ce fait, l'utilisation de modèles cellulaires ou ex vivo n'est pas adapté pour répondre de façon pertinente aux questionnement scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été soigneusement optimisé afin de limiter l'utilisation d'animaux au strict nécessaire. Une stratégie spécifique a été mise en place pour réduire au maximum les prélèvements, que ce soit lors des analyses pharmacocinétiques ou au moment de la mise à mort. Cela permet de limiter à la fois le nombre d’animaux utilisés et les volumes prélevés sur chacun. Quelle que soit la conception des études exploratoires, nous nous engageons à utiliser le moins d’animaux possible. Pour garantir la robustesse des résultats, un minimum de 10 rats par groupe est requis. Au total, en incluant l’ensemble des procédures prévues dans ce projet, environ 450 rats seront utilisés.

Raffinement

Dans la mesure du possible, l'hébergement social est choisi afin de réduire le stress et l'angoisse, avec un enrichissement adapté à chaque espèce. Un suivi quotidien de l'état clinique des animaux est réalisé pendant toute la durée du projet. Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 3 à 4 par cage avec de l’enrichissement adapté à l’espèce. Les animaux seront maintenus avec un environnement contrôlé et stabilisé (température de 21°C, hydrométrie à 55% et luminosité à 100lux avec un cycle de lumière 12h/12h). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des animaux sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal est utilisée quand un animal présente un état de mal-être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et avis du responsable bien-être animal. L’anesthésie et l’analgésie sont rigoureusement respectées pour toutes les interventions effectuées sur les animaux tout au long de l’étude. À l’issue de chaque procédure, les rats seront euthanasiés conformément aux protocoles en vigueur.

Choix des espèces

Le choix d’espèces rongeurs est justifié par : - Les objectifs du projet : disponibilité d’un modèle de maladie déjà existant (hypertension artérielle par injection de traitement dans les mini-pompes sous cutanés) permettant d'étudier l'injection des traitements par inhibiteurs de points de contrôles immunitaires chez des animaux avec un facteur de risque cardio-vasculaire. - La comparaison possible avec d’autres études menées chez ces modèles animaux au laboratoire - Aspects pratiques de manipulation Des rats âgés de 12 à 18 semaines seront utilisés, car le protocole requiert des animaux adultes. Le choix de rats adultes permet d'établir un parallèle avec la situation humaine, dans laquelle les traitements sont généralement administrés à l'âge adulte. De plus, les individus adultes présentent un risque accru de développer des pathologies vasculaires, ce qui justifie l'utilisation de cette tranche d'âge dans notre modèle expérimental.

Une fibrose est provoquée dans les poumons de 1 024 souris par l'administration sous anesthésie d'un produit inducteur. S'ensuivent, selon les lots, un gavage quotidien de J8 à J20 ou sept injections intraveineuses, puis des séances d'imagerie sous anesthésie pouvant durer quarante minutes par souris, cathéter posé. Toutes ces souris, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, sont tuées à la fin pour mesurer la fibrose de leurs poumons par histologie. Le porteur décrit une inflammation des voies respiratoires et une perte de poids dans les jours qui suivent l'induction, puis écrit dans la même rubrique n'anticiper aucun effet indésirable au moment des traitements ou de l'imagerie.

Objectifs

La fibrose pulmonaire est une maladie pour laquelle il n’existe pas de traitements curatifs. Une des limites de la fibrose pulmonaire est le manque de marqueur permettant d’évaluer la réponse aux traitements. Nous avons démontré la possibilité de suivre l’évolution de la fibrose pulmonaire avec une méthode d’imagerie du métabolisme des lipides. Nous devons maintenant valider son utilisation comme outil pour vérifier l’efficacité des traitements actuels ou en développement de la fibrose pulmonaire. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer une nouvelle technique d’imagerie du métabolisme lipidique: 1/ pour le suivi de l’efficacité des traitements approuvés de la fibrose pulmonaire 2/ pour le suivi de l’efficacité des traitements en cours de développement 3/ pour la possibilité de prédire l’efficacité des traitements testés Ce projet permettra de proposer un outil pour prédire et monitorer l’efficacité des traitements de la fibrose pulmonaire afin d’améliorer la prise en charge des patients avec cette maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront multiples grâce à une approche complète et robuste basée sur plusieurs modèles expérimentaux. Ce projet vise à améliorer la prise en charge des patients atteints de fibrose pulmonaire. A court terme, nous pensons que l’imagerie du métabolisme lipidique pourra être testée chez des patients avec fibrose pulmonaire pour valider son utilisation dans l’évaluation de l’efficacité des thérapies actuellement en clinique. A plus long terme, notre méthode d’imagerie permettra de faciliter le développement de nouvelles thérapies de la fibrose pulmonaire, au niveau préclinique et aussi des essais cliniques.

Procédures

Les souris recevront une administration d’un inducteur de fibrose. Cette intervention sous anesthésie générale dure 30 secondes maximum. Ce même type d’injection sera également utilisé, de façon répétée, pour l’administration des agents thérapeutiques dans la procédure 2. Aucune nuisance supplémentaire n’est anticipée du fait de la répétition. Une partie des animaux recevra des traitements par gavage oral (100µl, quotidiennement de J8 à J20). Ce geste sera réalisé sur animaux vigiles, après contention, et ne durera pas plus de 10 secondes. Une partie des animaux recevra des traitements par injection intraveineuse (100µl, tous les deux jours de J8 à J20, 7 injections au total). Ce geste sera réalisé après contention, et ne durera pas plus de 20 secondes. Tous les animaux seront suivis par imagerie. L'ensemble de cette procédure s'effectue sous anesthésie. Chaque animal aura un cathéter afin de permettre l’injection intraveineuse du marqueur (100 µl). Ceci n’excède pas 2 minutes par animal. Les animaux seront placés dans le système d’imagerie équipé d’un lit chauffant préchauffé et d’un système d’anesthésie gazeuse.La durée totale de la procédure n’excède pas 40 min par souris. A la fin du protocole, les animaux sont analgésiés puis anesthésiés profondément, avant que soit réalisé un prélèvement sanguin puis leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Entre 2 et 7 jours après l’induction du modèle, une inflammation des voies aériennes peut avoir lieu et elle peut être associée à une perte de poids des animaux. Le modèle de fibrose est associé aussi à une inflammation des voies respiratoires au cours des 6 premiers jours après l’induction. Elle peut être associée à une perte de poids des animaux. Les administrations intraveineuses peuvent induire un stress lié à la contention ainsi qu’une douleur brève (1 sec) au moment de l’insertion de l’aiguille. Lors des réveils de l’anesthésie, les animaux connaissent quelques minutes de désorientation, rapidement résolues par la reconnaissance de leur environnement. Nous n’anticipons aucun effet indésirable après administrations des traitements anti-fibrotiques, ou à l’étape d’imagerie.

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéines)

Remplacement

Le poumon est un organe complexe composé de plus de 40 types cellulaires différents et le phénomène de fibrose fait lui intervenir plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire etc). Aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un animal entier. L’étude de la fibrose pulmonaire chez le rongeur est de ce fait le modèle d’étude de référence dans la littérature.

Réduction

Le nombre d’animaux indiqué correspond au nombre minimal requis pour remplir les conditions des tests statistiques. Ces chiffres ont été déterminé par test statistique, sur la base de données antérieures issues de l’équipe, pour valider la puissance des résultats attendus.

Raffinement

Le personnel impliqué dans ce projet, au-delà de la formation légale à l’expérimentation animal, aura une formation et l’habitude de l’application des procédures et du suivi des animaux spécifique des modèles murins de fibrose pulmonaire. Les transports des animaux seront réalisés dans des boites d’hébergement avec couvercle, entourées d’un sac opaque pour protéger les animaux des changements de luminosité et de température. Après exposition aux facteurs déclenchants de la fibrose, les animaux auront accès à un supplémentation d’alimentation (aliments gélifiés, morceaux de pommes, céréales) afin de limiter la perte de poids. Après chaque étape d’anesthésie à l’isoflurane, les souris seront placées sous lampe chauffante ou tapis chauffant pour favoriser le retour de l’anesthésie. Une attention particulière sera apportée à la reprise d’une activité normale des animaux après anesthésie. Avant la mise à mort, les animaux sont analgésiés et anesthésiés profondément et ne reprennent pas conscience.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal (développement des poumons, système immunitaire mature). D’après notre expérience des modèles, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g afin de limiter la toxicité générale des produits inducteurs de fibrose.

Jusqu'à cinq séances de trente minutes d'enregistrement des démangeaisons, puis cinq autres séances de trente minutes de stimulation au toucher léger : 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Après un rasage sous anesthésie, elles reçoivent des injections locales d'une substance qui déclenche des démangeaisons chez l'humain, et le porteur décrit des démangeaisons spontanées d'intensité faible à modérée réparties sur les vingt à trente minutes qui suivent chaque injection. Le projet cherche à identifier quels nerfs de la peau cette substance active, avec l'espoir de traiter un jour les démangeaisons de l'eczéma ou du psoriasis. La substance n'est jamais nommée, désignée d'un bout à l'autre du résumé comme "la substance étudiée".

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'identifier les nerfs de la peau activés par une substance induisant des démangeaisons chez l’homme. Pour cela, il étudiera si la substance étudiée est capable d'augmenter les démangeaisons induites par des substances de référence, qui induisent des démangeaisons en activant des nerfs bien identifiés. Inversement, il étudiera si ces substances augmentent les démangeaisons induites par la substance étudiée.

Bénéfices attendus

Actuellement, il n'existe aucun traitement spécifique des démangeaisons induites chez l’homme par la substance étudiée. Mieux connaître leurs mécanismes permettra à terme de développer des traitements spécifiques pour les soulager. Identifier les nerfs affectés est une première étape d'étude des mécanismes impliqués. Les bénéfices de ce projet en termes d’avancées scientifiques et thérapeutiques pourraient aussi s’étendre aux démangeaisons présentes dans d’autres maladies (eczéma, psoriasis).

Procédures

1) Rasage de la future zone d’injection, réalisé 1 fois sous anesthésie, éventuellement renouvelé 1 fois, durée maximale de 5 minutes. 2) Injection locale des substances de référence (1 ou 2 fois), de la substance étudiée (1 fois) et/ou d’une substance-contrôle (1 fois), durée maximale de 30 secondes.

Impact sur les animaux

1) Stress de faible intensité lors de l’anesthésie générale (durée < 5 min, réalisée 1 fois). 2) Stress et inconfort lors des manipulations et de l’injection (durée < 5 min, réalisées 2 fois ou 4 fois). 3) Stress lors de l’enregistrement des démangeaisons spontanées dans un espace dédié (durée 30 min ; réalisé 3 ou 5 fois). 4) Stress lors des mesures des démangeaisons induites par le toucher léger dans un espace dédié (durée 30 min, réalisées 3 ou 5 fois). 5) Démangeaisons spontanées localisées, d’intensité faible à modérée, intermittentes, d’une durée < 2 secondes chacune, réparties pendant 20-30 minutes suivant l’injection (réalisée 2 ou 4 fois). 6) Démangeaisons localisées induites par à un toucher léger, d’intensité très faible, d’une durée < 1-2 secondes uniquement en réponse au toucher léger appliqué. Épreuve réalisée 3 ou 5 fois, durée 30 min.

Devenir

En fin de procédure, il est prévu la mise à mort de tous les animaux (480) car leur exposition à la substance étudiée interdit leur réutilisation, replacement ou adoption et/ou ils sont destinés à des prélèvements post-mortem de tissus à des fins d'analyses.

Remplacement

Depuis plus de 10 ans, nous étudions les effets de la substance sur des modèles cellulaires. Nous avons montré l’implication de plusieurs mécanismes qui, cependant, peuvent aussi être à l’origine d’autres sensations que les démangeaisons, que nos modèles cellulaires ne permettent pas de distinguer. Nous continuerons à utiliser ces modèles cellulaires pour cette étude mais nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale pour étudier les mécanismes des démangeaisons induites. Un 2ème aspect est l’implication de multiples types cellulaires dans les démangeaisons. Ces cellules ne peuvent pas être rassemblées dans un modèle cellulaire. Nous ne pouvons pas nous passer de l’expérimentation animale pour prendre en compte l’ensemble de ces types cellulaires.

Réduction

L’ensemble du projet a été conçu en vue de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés sans compromettre les objectifs ou l’analyse statistique des résultats. Étant donnée la variabilité́ des démangeaisons induites par la substance, nous prévoyons 20 animaux/groupe pour garantir des résultats robustes. Cependant, nous réaliserons toujours une 1ère série d’expériences sur 12 souris (minimum pour que des résultats se dessinent) suivie de son analyse, et ne complèterons que si nécessaire d’après ces 1ers résultats. Le nombre d’animaux prévu est un maximum qui sera réduit autant que possible en pratique.

Raffinement

Les responsables du projet mettront en œuvre des mesures pour assurer et maintenir le bien-être de chacun des animaux : enrichissement des cages (matériel de nidification et igloo), habituation des animaux aux manipulations et aux tests, renforcement positif (coupelle de gel appétant en récompense pendant l'habituation), points limites et stratégie d’analgésie. Des points limites prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée comme modèle d’étude des démangeaisons. Le développement des nerfs impliqués dans les démangeaisons évolue chez la jeune souris jusqu’à l’âge de 3-4 semaines. Leur état de développement est stable à partir de l’âge de 5 semaines. Les souris âgées ne sont pas appropriées du fait de modifications physiologiques dues à l’âge. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 8 à 16 semaines.

Toutes tuées sous anesthésie à la fin d'une seconde chirurgie qui peut durer six heures, 120 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une première chirurgie d'environ 90 minutes leur injecte un vecteur viral, avec une douleur post-opératoire modérée attendue pendant 24 à 48 heures. Pendant la seconde, dont elles ne se réveillent pas, l'équipe stimule leurs neurones à dopamine et enregistre l'activité de l'hippocampe, puis, après leur mise à mort, prélève des organes pour des analyses histologiques. Le porteur affirme qu'aucune autre méthode, "ni modélisation ni culture cellulaire", ne permet cette étude, parce que les données sur le sujet sont "trop rares et parcellaires". Une meilleure compréhension de la maladie de Parkinson, de l'addiction ou du TDAH reste renvoyée "à plus long terme".

Objectifs

Dans ce projet nous explorerons par quels mécanismes la dopamine permet la plasticité neuronale responsable de la mémorisation chez la souris. Pour cela, nous provoquerons la modification des connexions entre neurones de l’hippocampe en stimulant les neurones à dopamine. Après la mise à mort des souris, nous prélèverons des organes pour étudier les modifications moléculaires et cellulaires déclenchées par de cette plasticité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques de la mémoire chez les mammifères en général et chez l’homme en particulier. Il permettra d’identifier les mécanismes qui font qu’on se souvient de certaines choses et pas d’autres, et à plus long terme de mieux comprendre les troubles cognitifs associés à des dysfonctionements de la transmission dopaminergique, comme par exemple dans la maladie de Parkinson, dans l’addiction ou les désordre neurodéveloppementaux comme le Trouble du Déficit de l'Attention avec ou sans Hyperactivité (TDAH).

Procédures

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale, une première permettant l’injection d’un vecteur viral durera environ 90 minutes et une seconde pour les enregistrements électrophysiologiques et la stimulation des neurones à dopamine durera de 1 à 6 heures.

Impact sur les animaux

Les animaux seront exposés à deux anesthesies générales, une première d'une durée inferieure à 90 minutes et une seconde sans réveil (durée comprise entre 1h et 6h). La première chirurgie est susceptible d’induire une douleur post-opératoire modérée durant 24 à 48 heures. Les pesées nécessaires au suivi post-opératoire peuvent entraîner un stress léger de quelques dizaines de secondes.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en vue d’analyses histologiques.

Remplacement

Le projet a pour objectif d’évaluer comment la dopamine déclenche la plasticité dans l’hippocampe. Ceci nécessite l’intégrité de l’ensemble du cerveau (l’hippocampe et le système à dopamine) et l’utilisation de souris transgéniques qui permettent de stimuler spécifiquement les neurones à dopamine avec une résolution de l’ordre de la milliseconde. Il n’est pas possible, à l'heure actuelle, d’étudier cela par d’autres moyens que l’expérimentation animale in vivo (ni modélisation ni culture cellulaire) car les données biologiques sur ce sujet sont trop rares et parcellaires.

Réduction

Cette étude étant exploratoire, le nombre d’animaux par groupe (n= 12) a été déterminé sur la base de d’études antérieures utilisant les mêmes techniques de mesure des modifications neurobiologiques induites par des plasticités synaptiques s’approchant de celle étudiée ici. Les tissus prélevés seront réutilisés pour mesurer plusieurs types de modifications moléculaires et cellulaires.

Raffinement

Pendant les jours qui suivent la première chirurgie, une fiche de suivi est remplie quotidiennement pendant tout le temps nécessaire à la récupération totale de l'animal. Si une altération de l’état de l’animal est observée suite à la chirurgie une grille de scoring sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant le début de la première chirurgie. Des analgésiques seront également administrés en post opératoire le lendemain. Pendant les semaines qui suivront la chirurgie, les animaux seront inspectés tous les jours. Les animaux seront anesthésiés pendant toute la durée de la seconde chirurgie et tout au long des enregistrements électrophysiologiques, jusqu’à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Dans cette étude, nous utilisons la souris en raison de sa pertinence comme modèle en neurosciences et de la disponibilité d’outils adaptés pour manipuler précisement les circuits neuronaux. Les animaux seront des jeunes adultes afin d’éviter les effets liés au développement ou au vieillissement.

36 souris privées d'un fragment d'ADN vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent huit heures à 4 °C, suivent quatorze semaines de régime riche en graisses, subissent deux prélèvements de sang sur animal vigile et deux anesthésies de quinze minutes, avec un isolement en cage individuelle pouvant durer quatre jours. Les bénéfices avancés, de nouvelles cibles contre l'obésité, le diabète ou les troubles rénaux, tiennent au conditionnel et supposent que ce fragment d'ADN joue bien le rôle qu'on lui prête. Le porteur affirme que ces fonctions métaboliques ne sont modélisables que dans un organisme complet, et que seul un mammifère permet une première collecte de données.

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre le rôle d’une partie de l’ADN qui ne code pas pour une protéine, et qui était autrefois considérée comme peu utile. Pourtant, des recherches récentes suggèrent qu’elle pourrait jouer un rôle important dans le fonctionnement du corps, notamment dans la gestion de l’énergie, la régulation de la température corporelle et le bon fonctionnement des reins. Pour étudier cela, nous utiliserons des souris chez lesquelles cette portion de l’ADN a été supprimée. Elles passeront une série de tests pour évaluer leur métabolisme, leur comportement, leur poids et d’autres aspects de leur santé. Elles seront ensuite soumises à un régime alimentaire enrichi pendant 14 semaines, avec un suivi régulier. À la fin de l’étude, plusieurs organes seront analysés afin de mieux comprendre les effets de cette absence. Ce projet pourrait ainsi ouvrir la voie à de nouvelles pistes de recherche sur les maladies métaboliques ou rénales.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous utilisons une approche complète pour étudier l’impact d’une portion particulière de l’ADN qui ne produit pas de protéine. En combinant des tests sur le comportement, l’activité du métabolisme, des analyses sanguines et l’étude de plusieurs organes à la fin de l’expérimentation, nous espérons obtenir une vision globale de son rôle dans le corps. Si cette partie de l’ADN est effectivement impliquée dans la régulation de la température, la production d’énergie ou le bon fonctionnement des reins, elle pourrait devenir une cible intéressante pour développer de nouveaux traitements contre des maladies comme l’obésité, le diabète ou les troubles rénaux. Les résultats de cette recherche pourraient aussi nous permettre d’améliorer la détection de certains problèmes de santé grâce à de nouveaux marqueurs biologiques, ou même de proposer des traitements plus ciblés à l’avenir.

Procédures

Les animaux seront exposés à un environnement à 4 °C pendant 8 heures. Ils suivront ensuite un régime riche en graisses pendant 14 semaines. Deux prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux vigiles par contention, chaque prélèvement durant environ une minute. Les animaux seront également soumis à deux anesthésies médicamenteuses d’une durée de 15 minutes chacune.

Impact sur les animaux

Parmi les nuisances attendues, des contentions seront pratiquées, ce qui entraîne un stress léger. Les prélèvements sanguins peuvent entraîner une légère douleur. Les animaux seront isolés, ce qui entraîne un léger stress. Les animaux seront soumis au froid, pouvant entraîner une diminution transitoire de leur température corporelle.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les tissus pour réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l’impact de l’inhibition d’un gène sur des fonctions métaboliques complexes. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet, capable d’exprimer l’ensemble des fonctions physiologiques de régulation (thermorégulation, fonction hépatique, fonction rénale). Seule une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (régulation des lipides, des glucides, dérèglements mitochondriaux et biochimiques, balance inflammatoire), fournissant de nombreuses informations qui pourront ensuite être utilisées dans une approche translationnelle visant à mieux comprendre la physiologie humaine..

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques. Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seule cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique

Raffinement

Nous suivrons l'état général des animaux, incluant le toilettage, la posture et la présence de vocalisations. Tous ces éléments nous permettront d'évaluer l'atteinte de points limites, pouvant entraîner l’euthanasie de l'animal afin d'éviter toute souffrance. Les animaux seront maintenus en groupes dans des conditions d'animalerie optimales, avec un accès illimité à la nourriture, à l'eau et à un environnement enrichi (nids en quantité suffisante, bâtons et balles à ronger). Si nécessaire, des soins locaux seront administrés. En cas de douleur, un antalgique pourra être administré conformément aux recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés chaque semaine, en plus du suivi quotidien habituel. Lors des prélèvements sanguins, le volume prélevé sera compensé par l'injection de sérum physiologique. Concernant les tests deux d’entre eux se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles. La seule contrainte est donc l’isolement des animaux pendant 4 jours maximim. A la fin de ces tests, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement), les animaux sont surveillés afin de vérifier qu'ils ne se battent pas. . Les souris seront soumises à une température de +4 °c pendant 8h. Les souris s’adaptent bien au froid, leur température corporelle pouvant descendre de 37°C à 34°C. Néanmoins, tout animal dont la température corporelle chuterait en dessous des 34°C, montrant son incapacité à s’adapter au froid, sera sorti du test et remis quelques minutes dans un environemment à 37°C.

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement du modèle d'intérêt porteur de modifications génétiques sur le gène d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 10 semaines. A ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique qui est mise en place.

800 souris vont être utilisées, chacune mise à jeun quinze à seize heures avant de subir neuf prélèvements de sang au cours d'une séance de deux à six heures, l'opération étant répétée une semaine plus tard. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leur pancréas. Après anesthésie locale, la queue est incisée, puis vient une injection de glucose et, pour certains lots, un gavage avec une solution lipidique. Le porteur reconnaît que les contentions et le jeûne stressent les animaux, que les incisions font mal et que le gavage irrite l'œsophage. Les retombées annoncées, savoir s'il suffira un jour de greffer les seules cellules productrices d'insuline chez des personnes diabétiques, restent une perspective lointaine face à ces atteintes immédiates.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de comprendre l’influence d'un type particulier de cellules des îlots pancréatiques sur le maintien du taux de sucre sanguin dans des valeurs « normales » à la fois dans les conditions physiologiques (régime normal) et dans les conditions physiopathologiques (régime gras classiquement utilisé pour mimer des conditions diabétogènes).

Bénéfices attendus

Le diabète est une maladie grave qui s’étend. Il est lié à une augmentation anormale et prolongée de la concentration de sucre dans le sang : c’est l’hyperglycémie. Les petits organes qui libèrent les hormones régulant la concentration de sucre dans le sang (la glycémie) s’appellent les îlots du pancréas. Ils sont constitués de plusieurs types des cellules, les principales cellules des îlots sécrétent l’insuline, la seule l’hormone qui diminue la glycémie. Dans le diabète de type 1, ces cellules sont absentes. Dans le diabète de type 2, elles fonctionnent mal. En ce sens, ces cellules ont toujours été au centre des études sur la régulation glycémique en conditions normales et pathologiques. On connait donc très peu le rôle des autres cellules du pancréas dans ces mécanismes et surtout la manière dont elles influencent les cellules produisant l’insuline. Une autre limite de la plupart des études est d’avoir été centrées uniquement sur les effets du sucre (le glucose). En effet, l’alimentation contient d’autres nutriments : protéines, lipides…. Dans le présent projet, les chercheurs disposent de souris dont la particularité est de pouvoir supprimer certaines des autres hormones pancréatiques que l’insuline. La manière dont ces souris régulent leur glycémie suite à une administration de glucose combiné ou non avec d’autres nutriments pourra donc être étudiée et surtout comparée avec celle des souris « normales » qui ont dans leurs îlots tous les types d’hormones. Ceci apportera des informations cruciales sur le rôle de ces cellules dans ces processus. Pour mieux comprendre les interactions entre les différents types de cellules pancréatiques dans le diabète, certaines souris seront soumises à un régime gras qui mime certaines conditions favorisant le diabète de type 2. Les informations fournies par ce projet seront aussi cruciales par rapport au diabète de type 1. En effet, dans la perspective des futures thérapies cellulaires, nous saurons s’il suffit de greffer seulement les cellules produisant l’insuline ou un mélange équilibré des différentes cellules pancréatiques.

Procédures

Pour les tests de tolérance au glucose, 2 expériences effectuées à 1 semaine d’écart (durée du test de 2 à 6h) : animaux mis à jeûn la veille au soir (durée 15 à 16h), le jour J, une incision (2 secondes) de la queue sera faite après anesthésie locale , s’en suivra une injection (10 secondes) de glucose avec ou sans autres nutriments, 6 prélèvements très légers de sang (10 à 30 secondes) pour détermination glycémie (espacés de 15min à 1h) seront effectués et 3 prélèvements (1 à 2minutes) un peu plus importants de sang pour la détermination d’hormones (espacés de 15min à 45min), prélèvements de sang effectués dans le respect de la réglementation. Pour les animaux de certains lots, 1 gavage (20 secondes) avec une solution lipidique sera effectué (après injection de glucose).

Impact sur les animaux

Les contentions pourront être sources de stress, les mises à jeûns source de faim et de stress, les injections et les incisions sources de douleur et les administrations orales d'irritation de l’œsophage. Nous veillerons à réduire le stress au maximum, tous les gestes seront effectués par une personne formée et expérimentée et un anesthésique local sera appliqué avant les incisions. Dans les 24h suivant les expérimentations, si une perte de poids >10% est constatée, une alimentation enrichie sera mise à disposition des animaux concernés. Cette alimentation enrichie sera maintenue jusqu’à ce que ces animaux aient recouvré leur poids d’avant les tests. Des souris de ce type sont actuellement en élevage pour un autre projet, et d'après notre expérience avec ce type de protocoles, aucun effet délétère n’a été observé chez ces animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, les souris seront mises à mort en utilisant une méthode réglementaire et leur pancréas sera prélevé pour diverses expérimentations ex-vivo.

Remplacement

Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes d’organes sur puce sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’homéostasie nutritionnelle des mammifères impliquant des interactions entre de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, rein…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère. Le modèle souris est le plus adapté car c’est le seul à ce jour permettant la suppression sélective des cellules dont nous voulons étudier le rôle dans les îlots pancréatiques. Il n’existe actuellement aucun simulateur modélisant l’homéostasie nutritionnelle qui est au cœur de cette étude. Toutefois, nous travaillons justement sur un simulateur de l’homéostasie glucidique. Les données acquises dans ce projet sur ces animaux seront entre autres destinées à enrichir ce simulateur renforçant ainsi la puissance de cette approche de simulation afin de réduire encore le recours à l’expérimentation animale dans le futur.

Réduction

Une réflexion approfondie a été effectuée pour réduire le nombre d’animaux tout en préservant une puissance statistique nécessaire sans laquelle il faudrait refaire l’étude. Les expériences effectuées lors de précédents tests montrent sans réserve la faisabilité du projet. Les tests in vivo décrits dans cette étude sont réalisés de manière courante depuis des années par notre équipe dans d’autres projets, mais sont aussi des tests courants largement utilisés dans les laboratoires qui travaillent sur le diabète au travers le monde, ils sont donc très standardisés. Il n’y a donc plus de mise au point technique et aucune perte d’animaux n’est à prévoir à ce niveau, ce qui contribue à limiter également le nombre d’animaux. Pour réduire encore le nombre de souris produites en élevage, nous réutiliserons les animaux d’un même lot pour 2 séries d’expériences ce qui permet de diminuer encore notre besoin total d’animaux, et enfin, après les tests in-vivo, les animaux produits seront utilisés pour récupérer leurs pancréas pour des investigations sur ces tissus au sein de la même étude. Ceci permet encore une réduction de moitié des animaux utilisés. Ainsi, 800 animaux des 2 sexes maximum avec l’application des mesures précédentes seront utilisés. Chaque lot sera optimisé pour que le nombre d’animaux utilisés assure une significativité statistique. Les règles statistiques communément admises seront appliquées (à savoir : si la répartition des résultats suit une loi normale, des tests statistiques paramétriques seront employés. Si la distribution des données ne suivait pas une loi normale, les tests non paramétriques appropriés seront appliqués).

Raffinement

Les animaux seront regroupés entre 5 et 10 animaux par cage pour éviter les effets délétères de l’isolement de ces animaux. Leur habitat sera enrichi des dômes et carrés de ouate pour la nidification. Un suivi quotidien des animaux sera effectué par le personnel de l'animalerie. Une habituation des animaux aux manipulations, contentions sera effectué la semaine précédant les tests. Les animaux seront pesés 1 fois par semaine et les 3 jours suivant les expérimentations pour les lots concernés. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue des animaux avant les incisions et une crème cicatrisante sera appliquée en fin d'expérience avec un suivi et nursing si besoin des animaux. Des points limites adaptés sont établit et seront appliqués si l'état des animaux le nécessite.

Choix des espèces

Le modèle souris adulte est le plus adapté car c’est un mammifère dont le fonctionnement de l’organisme est transposable à celui de l’Homme adulte, notamment pour la régulation du glucose sanguin. C’est aussi le seul animal à ce jour permettant une suppression sélective de certaines hormones dans les îlots pancréatiques dans le modèle transgénique que nous proposons d’étudier dans ce projet. Les études in vivo sur ces animaux seront faites au stade jeune adulte, de 14 à 22 semaines.

Rendus parkinsoniens par l'injection d'une neurotoxine directement dans le cerveau, 2 025 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après cette première chirurgie de trente minutes, certains reçoivent sous la peau une pompe à diffusion continue, puis des injections quotidiennes d'une molécule proche de la dopamine pendant six semaines, jusqu'à deux fois par jour, destinées à provoquer les mouvements anormaux involontaires que développent les patients. Ces mouvements sont ensuite observés une minute toutes les vingt minutes pendant trois heures, une fois par semaine. Le porteur annonce trois tests de comportement sous contention pour classer les rats selon la sévérité de leur atteinte, sans préciser lesquels, et jusqu'à huit prélèvements sanguins en 72 heures. Tous les rats sont tués à la fin, pour récupérer leur cerveau, après un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre de l’étude de l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à réduire les effets secondaires induit par un des médicaments le plus utilisé dans la maladie de Parkinson (MP). La MP se caractérise par un syndrome moteur défini par une lenteur d’initiation des mouvements associée à un tremblement de repos, une rigidité musculaire et une instabilité posturale. La principale caractéristique de la maladie de Parkinson est la mort progressive et massive des neurones produisant la dopamine (un messager chimique permettant la communication entre les neurones) dans le cerveau, impliqués dans la coordination des mouvements. Les évènements qui sous-tendent cette mort restent mal connus. Ceci rend le diagnostic de la maladie de Parkinson difficile, d’autant que l’apparition des symptômes ne se produit qu’après une perte neuronale importante. À l’heure actuelle, le traitement de la maladie est donc essentiellement symptomatique et vise à compenser le déficit en dopamine par l’administration d'une molécule semblable. Néanmoins, à long terme l’efficacité de cette molécule s’atténue et des effets secondaires très invalidants, caractérisés notamment par des mouvements anormaux involontaires appelés « dyskinésies », apparaissent. Compte tenu de ces complications, des stratégies médicamenteuses visent à atténuer le caractère invalidant de ces dyskinésies. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité de ces nouvelles thérapies dans un modèle préclinique de la maladie de Parkinson chez le rat. Ce modèle repose sur une injection de toxine dans le cerveau en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine afin de mimer la mort des neurones entraînant la pathologie. Au cours du protocole, des tests comportementaux sont utilisés pour évaluer la sévérité des troubles moteurs « parkinsonien » et classer les animaux selon la sévérité de leur atteinte. Des injections journalières d’une molécule semblable à la dopamine sont ensuite effectuées sur plusieurs semaines pour reproduire les mouvements anormaux involontaires observés chez le patient en réponse à ce type de traitement. Ainsi, l’efficacité de chaque nouvelle molécule thérapeutique sera testée sur ces mouvements anormaux involontaires et pourra être comparée aux traitements de référence, c’est-à-dire à ceux déjà utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Le modèle de toxine utilisé dans ce projet apparaît comme un modèle élaboré, mimant la mort des neurones produisant la dopamine observée dans la maladie de Parkinson et permettant l’induction des mouvements anormaux involontaires retrouvés chez les patients à la suite d’un traitement chronique avec une molécule semblable à la dopamine. Il permet de tester l’efficacité des nouvelles molécules thérapeutiques sur les mouvements anormaux involontaires. Ainsi, à terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques

Procédures

Les animaux subissent une première chirurgie afin d’injecter la neurotoxine dans le cerveau (durée environ 30 minutes). Une deuxième chirurgie pourra être réalisée afin d’implanter sous la peau un dispositif permettant de diffuser un traitement en continu (durée environ 15 minutes). Les animaux seront soumis à 3 tests de comportement effectués sous contention ou non (selon le test) par l’expérimentateur (durée totale : 20min) jusqu’à 2 fois au cours du protocole afin d'évaluer la sévérité de leurs troubles fonctionnels. Les animaux subiront des injections journalières (sur 6 semaines maximum, 2 fois par jours maximum, 1min par injection) sous la peau d'une molécule semblable à la dopamine pour induire des mouvements anormaux involontaires. Ces derniers pourront être analysés et quantifiés 1 fois par semaine sur 6 semaines. Chaque session d'observation inclut 1min d'observation toutes les 20min durant 3h. Des prélèvements répétés de sang pourront être réalisés sur animal vigile, à la veine de la queue (durée : 5min) ainsi qu’un prélèvement terminal sur animal anesthésié. Lors de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés sur 72h, ou encore 4 prélèvements maximum par semaine tous les 28 jours (1min/prélèvement). Des administrations quotidiennes de molécules thérapeutiques ou de traitement de référence pourront être effectuées pendant toute la durée du protocole (8 semaines au maximum, 2 fois par jour au maximum). Un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien (liquide entourant le cerveau) sous anesthésie pourra être réalisé. A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort afin de prélever le cerveau.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration de la nouvelle molécule thérapeutique testée. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. -Les animaux seront soumis à une administration dans le cerveau de la toxine nécessitant une chirurgie. Cette étape peut engendrer des douleurs durant les 24-48h suivant la chirurgie et peut être source d'une infection. Une perte de poids des animaux peut être observée ainsi qu’une altération de la mobilité avec des rotations contraires au site d’injection pendant quelques jours après la chirurgie. -Une chirurgie d’implantation de pompe diffusant des subtances liquides sera réalisée nécessitant une anesthésie gazeuse pouvant être source de douleur et/ou une gêne au réveil. -Lors des sessions de tests de comportements ou d’évaluation des mouvements anormaux involontaires, les animaux devront être régulièrement placés en isolements pour de courtes durées et/ou être maintenus sous contentions pouvant générer du stress. -L’induction des mouvements anormaux involontaires, présents jusqu’à 3h après l’injection de la molécule semblable à la dopamine, entraine une altération de l’activité motrice des pattes et de la face et peut limiter l'alimentation/hydratation. -Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention pouvant être à l’origine 1) d’une douleur légère de courte durée, 2) de stress et 3) d’un écoulement sanguin persistant. -Les rats subiront un prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie/analgésie générale pour effectuer une chirurgie et accéder à la zone ou se trouve ce liquide (sous les muscles de la nuque).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est necessaire de récupérer le cerveau de l'animal pour faire des analyses sur ce dernier.

Remplacement

L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composé in vivo. Afin d’évaluer l’effet de nouveaux composé sur les mouvements anormaux involontaires, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions comportementales associées aux mouvements anormaux involontaires.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe pour ce projet est basé sur des données préalables obtenues au sein de l’entreprise sur ce modèle préclinique (n=15-20 pour assurer n=12 animaux inclus dans l’analyse finale, nécessaires pour observer une différence significative entre les groupes). Ce nombre se justifie pour les raisons suivantes : après la chirurgie induisant la lésion, environ 20% des animaux ne présentent pas de lésion sévère, paramètre essentiel pour induire une réponse aux traitements permettant d'induire les mouvements anormaux involontaires. De plus, parmi les animaux sévèrement lésés, seulement 80% sont sensibles à ce traitement chronique et exprimeront ces mouvements anormaux involontaires. Cela nous assure donc d’avoir 12 animaux par groupe avec 5-8 animaux de sécurité par groupe.

Raffinement

Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés par 2-3 par cage selon leur poids. Des enrichissements multiples leur sont proposés (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Par ailleurs, les animaux seront habitués à la manipulation par l'Homme ainsi qu’aux environnements nouveaux dans lesquels seront réalisés les tests comportementaux afin de réduire le stress relatif à cela. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire durant 48h. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Un tapis chauffant rétrocontrôlé est utilisé pendant toute la durée de l’anesthésie pour maintenir la température corporelle des animaux à 38°C. Les zones d’injections en sous-cutanée pour les traitements récurrents avec la molécule semblable à la dopamine seront alternées entre les flancs gauches et droits.

Choix des espèces

Les rongeurs, classiquement utilisés en laboratoire, présentent plusieurs similitude sur l'anatomie cérébrale et l'activité des neurones produisant la dopamine que celles que l'on retrouve chez l'Homme. Le modèle de lésion induite par l'injection dans le cerveau d'une toxine s'est rapidement imposé comme un modèle préclinique de référence pour le test de nouveaux médicaments car ils reproduisent la mort des neurones produisant la dopamine. Des rats adultes d'environs 7 semaines (pesant entre 250 et 320g) le jour de la chirurgie de la lésion seront utilisés dans ce projet car la grande majorité des résultats de la littérature concernant ce modèle a été obtenue sur des rats appartenant à cette gamme de poids. De même, les coordonnées exactes utilisées pour procéder à la lésion dans le cerveau proviennent de données issues d'un livre qui a également été réalisé sur la base d’observations faites sur des rats entre 250-300g. En fonction des objectifs de l’étude et des composés à tester, des rats mâles ou femelles pourront être utilisés puisque cette pathologie touche aussi bien les hommes que les femmes.

960 souris vont être utilisées, toutes injectées de cellules cancéreuses puis tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tumeurs poussent sur leurs flancs, avec un œdème possible au point d'injection qui peut gagner les pattes arrière et gêner la marche, et des métastases dont le porteur reconnaît ne pas savoir évaluer les effets sur les organes touchés. Elles reçoivent un traitement par la bouche cinq jours sur sept et une prise de sang à la queue chaque semaine sous anesthésie, pour tester une association de deux médicaments déjà approuvés contre les rechutes du cancer du poumon. L'effectif, lui, est calé sur "le nombre d'animaux communément accepté pour une publication".

Objectifs

Les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) présentent, chez environ 15% des patients, des altérations dites primaires de l'EGFR, un Récepteur du facteur de croissance EGF. Malheureusement, après traitement par thérapie ciblée, une récidive de la tumeur est observée avec apparition, dans plus de 50% des cas, d'une mutation secondaire de l'EGFR pour laquelle un inhibiteur de dernière génération a été développé, l'osimertinib. Finalement, de nouveaux mécanismes de résistance ont été constatés chez des patients traités plusieurs mois avec l'osimertinib, tels qu'une amplification d'autres récepteurs à activité tyrosine kinase, des mutations touchant des acteurs des voies de signalisation contrôlant la survie et la prolifération cellulaire, ainsi que l'apparition d'une mutation tertiaire de l'EGFR pour laquelle il n'y a pas encore de traitement spécifique utilisé en clinique. Par des méthodes de génie génétique, nous avons généré plusieurs modèles cellulaires de résistance du cancer bronchique humain en introduisant, dans une petite sous-population de cellules de CBNPC humaine, différentes mutations de l'EGFR décrites chez les patients. Sur ces modèles cellulaires, nous avons réalisé un criblage de molécules potentiellement capables d'inhiber l'émergence de clones résistants. Finalement, un inhibiteur déjà approuvés en clinique, le sorafenib, utilisé en combinaison avec l'osimertinib, s’est montré efficace in vitro pour limiter la croissance cellulaire des lignées arborant plusieurs mécanismes de résistance décrits chez les patients récidivant. Ces résultats ont aussi été obtenus in vivo sur l’inhibition de la pousse tumorale de ces lignées dans des souris immunodéprimées. Au vu de l'importance du contexte physiologique, de la toxicité des inhibiteurs utilisés en thérapie et du microenvironnement tumoral, nous avons créé un modèle syngénique murin de cancer du poumon qui n’existait pas. Nous avons généré 6 lignées cellulaires qui récapitulent les principaux mécanismes de résistances observés dans les CBNPC. Les études in vitro menées sur ces nouvelles lignées cellulaires ont révélé des caractéristiques de croissance et de résistance à la thérapie ciblée similaires à celles observées précédemment sur les lignées humaines. Ces nouveaux modèles murins vont nous permettre désormais d'étudier l'implication du système immunitaire dans la tumorigenèse et dans la réponse au traitement, avant d'envisager tout essai clinique.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront tout d’abord de déterminer la capacité de ces nouvelles lignées cellulaires à former des tumeurs chez l’animal ; il sera possible alors de comparer les résultats de croissance tumorales de ces lignées cellulaires murines à ceux déjà obtenus avec les lignées cellulaires humaines dans des souris immunodéficientes, et confirmer ainsi l'intérêt de ce nouveau modèle d’étude syngénique de cancer du poumon chez la souris. Dans la littérature, l’implication d’EGFR muté dans l’installation d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur reste controversé ; notre étude va nous permettre de mesurer et caractériser l’éventuelle infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs en fonction des mécanismes de résistance mais aussi des traitements. La possibilité de mesurer la bioluminescence des cellules cancéreuses à l'aide d'un imageur du petit animal va nous premettre de détecter et suivre le développement de foyers tumoraux secondaires qu'il aurait été difficile de mettre en évidence par des méthodes d'analyses macroscopiques traditionnelles. Ces métastases pourront être mieux caractérisées (culture cellulaire, analyses génétique et moléculaire) et identifier d'éventuels nouveaux mécanismes de résistance. L'intérêt de notre étude est de mieux comprendre les mécanismes responsables de la rechute tumorale de la tumeur primaire et des métastases en fonction du contexte immunitaire et des traitements.

Procédures

Les animaux seront injectés avec une aiguille adaptée de petite taille et de petit diamètre et sous anesthésie et analgésie. Des prélèvements sanguins au bout de la queue seront réalisés sur animaux anesthésiés chaque semaine. Les animaux recevront 5 jours par semaine un traitement par voie orale. Cet acte est rapide et non douloureux pour l'animal.

Impact sur les animaux

Peu d'effets indésirables sont attendus sur les animaux injectés en sous-cutané. Il pourrait être observé cependant dans de rares cas des démangeaisons ou un œdème au point d’injection qui s’il s’étend aux pattes arrière pourrait perturber la locomotion quelques jours, le temps qu’il se résorbe. La croissance des tumeurs sur les flancs de la souris, ne perturbe pas la vie de la souris, il n'y a normalement pas de modification du comportement individuel ou social. Une nuisance possible serait que la tumeur, dans sa croissance, puisse gêner les déplacements de l’animal ou altérer sa souplesse entrainant un défaut d'alimentation ou de sa toilette. Concernant les animaux développant des métastases, il est difficile d'évaluer leurs effets sur la fonction des organes touchés, mais un suivi très régulier permettra de détecter le moindre signe clinique défavorable et de procéder à l'arrêt immédiat de l'expérimentation.

Devenir

La totalité des animaux de l'étude sera injectée avec des cellules cancéreuses puis mise à mort pour études.

Remplacement

L’utilisation des animaux est indispensable pour confirmer in vivo l’efficacité de la combinaison d’inhibiteurs identifiée in vitro sur les lignées humaines. Dans le protocole présenté ici, la souris est utilisée comme modèle préclinique obligatoire pour évaluer l'implication du système immunitaire dans la croissance tumorale. Ceci n’est pas possible autrement que chez l’animal vivant, et nécessaire avant toute évaluation chez l’Homme.

Réduction

Les transplantations de nos modèles cellulaires seront réalisées sur l'animal uniquement après obtention de résultats in vitro significatifs permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux par groupe en fonction de l'importance de l'effet obtenu. L'objectif est de collecter un nombre suffisant de données pour respecter le nombre d'animaux communément accepté pour une publication, et appliquer des tests statistiques fiables et adaptés. Les traitements ne concerneront que les lignées cellulaires pour lesquelles une croissance tumorale significative aura été observée. A noter que s'il n'y a pas de différence statistique entre mâles et femelles, la taille des effectifs pourra être réduit à 6 au lieu de 10 animaux (3 mâles et 3 femelles).

Raffinement

Afin d'éviter toute souffrance ou stress, les animaux seront hébergés dans une zone exempte de germe pathogène, à 5 maximum par cage (530 cm2 au sol) dans un environnement enrichi (tube en polycarbonate rouge et Arbrocel Roll), et anesthésiés avant chaque intervention. Nous serons vigilants pour évaluer chaque jour l'apparition d'éventuels signes de souffrance (perte de poids, poils hérissés, prostration) et dans le cas de critères présents, une prise en charge analgésique appropriée sera mise en place ; et dans le cas d'une non amélioration des symptomes, l'animal serait mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour l'étude de la croissance tumorale car il permet de mimer les conditions de formation des tumeurs de manière assez proche de celles rencontrées chez l'Homme. La greffe récapitule les évènements se déroulant lors d'une tumorigenèse : croissance 3D, interaction avec le stroma et le système immunitaire, angiogenèse et métastase. Enfin la souris est le modèle d'étude le plus utilisé dans la communauté scientifique, cela permet des échanges à un niveau international. Les injections de cellules tumorales seront réalisées comme classiquement décrites dans la littérature sur des animaux âgés de 6 à 8 semaines.