Procédures modérées

Opérées en vingt minutes pour recevoir des cellules tumorales dans la rate, puis isolées de leurs congénères, 308 souris subissent ensuite des injections dans l'abdomen cinq fois par semaine pendant trois semaines. Deux cent quarante-six d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, les autres d'un niveau modéré, avec une tumeur du pancréas et des métastases qui provoquent douleur, perte de poids et mobilité réduite. Le porteur affirme que le recours aux animaux est "absolument indispensable" pour valider des biomarqueurs sanguins avant de les chercher dans le plasma de patients, la quantité de plasma humain disponible étant limitée. Toutes sont tuées sous anesthésie après un dernier prélèvement de sang, pour que leurs organes alimentent aussi des projets connexes de l'équipe.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de valider des biomarqueurs sanguins du développement tumoral et de la résistance au traitement dans le contexte du cancer pancréatique.

Bénéfices attendus

Dans l'ensemble, nous exploiterons les résultats obtenus ici pour valider une signature de biomarqueurs afin d’améliorer le diagnostic et la prise en charge des patients atteints de cancers pancréatiques. La validation des ces biomarqueurs permettra la mise en place de validation dans les échantillons sanguins de patients et ensuite la mise en place d’un essai de grande ampleur pour valider la fiabilité des signatures. L’amélioration du diagnostic (éligibilité à la chirurgie et sensibilité au traitement) sont des éléments majeurs permettant d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. La forte augmentation d’incidence des cancers pancréatiques (8.000 cas en 2000 et 16.000 cas en 2021, en France) en fait un réel problème de santé publique.

Procédures

Les animaux seront soumisent à 1 procédure chirurgicale (durée 20 minutes), des injections dans l'abdomen (durée 30 secondes) 5 fois par semaine pendant 3 semaines et enfin, un prélèvement de sang sous anesthésie juste avant la mise à mort pour prélèvement des organes d'intérêt (donc 1 seul prélèvement par souris, qui dure 30 secondes au maximum).

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux sont pour les procédures 1 et 3: avant l’acte chirurgical : contention et injections sous-cutanées d’antalgique et d’anesthésique local qui peuvent générer un léger stress ; au cours de l’acte chirurgical : l’anesthésie gazeuse peut engendrer une hypothermie et une détresse respiratoire si elle est mal contrôlée ; en post-chirurgie : des complications post-opératoires (rupture des points de sutures, infection de la plaie) peuvent survenir et engendrer de la douleur qui doit être rapidement prise en charge ; les animaux devront être isolés de leurs congénères ce qui génère un stress. Pour les procédures 1, 2 et 3, les nuisances au cours du développement de la tumeur primaire et des métastases sont les suivantes : douleur, perte de poids, mobilité réduite, apparences et/ou comportements anormaux, celles-ci sont grâce à notre expertise du modèle rapidement détectées et en fonction du score déterminé, la procédure adaptée sera mise en œuvre.

Devenir

Le sort de tous les animaux sera la mise à mort sous anesthésie pour prélèvement d'organes en vue d'analyses cellulaires, biochimiques et histologiques.

Remplacement

Le recours à des animaux est absolument indispensable pour mener à bien ce projet qui vise à confirmer la faisabilité de la détection de biomarqueurs vésiculaires sanguins associés à la résécabilité ou à la chimiorésistance avant de pouvoir les valider dans le plasma de patients. La quantité de plasma humain est limitée et les protocoles d’isolation des vésicules extracellulaires et d’identification des biomarqueurs doivent pouvoir être mis au point afin de s’assurer qu’aucun échantillon ne soit perdu. Ce projet fait suite à plusieurs validations in vitro en modèle organoïde de la pertinence de ces biomarqueurs pour stratifier les patients entre les groupes réséqués et non réséqués, et pour identifier les vésicules extracellulaires capables d’induire la chimiorésistance. Ces signatures spécifiques ont été identifiées de telle sorte que, par exemple, une protéine présente dans un groupe ne soit pas du tout identifiée en spectrométrie de masse dans l’autre. Nous disposons donc de signatures spécifiques qui reposent sur la haute sensibilité du spectromètre de masse et sur une quantité importante d’échantillons biologiques différents (n=15 organoïdes).

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires dans chaque procédure pour l’obtention d’un résultat significatif a été défini en utilisant le test statistique d’analyse de la variance suivie de comparaisons multiples; en précisant la diminution attendue de l’incidence/taille des tumeurs et les différences inter-individuelles, estimées sur la base de données bibliographiques et de résultats antérieurs de l’équipe. Par ailleurs, nous prélèverons, par nécropsie, d’autres tissus de chacune de ces souris afin d’alimenter d’autres analyses au laboratoire. Le prélèvement des principaux organes associés aux métastases de l’ADKP (foie, poumon, …), à la régulation du métabolisme, ainsi que de la réponse immunitaire (rate, ganglion lymphatique, moelle osseuse) serviront à des projets connexes de l’équipe afin de mieux comprendre les mécanismes métaboliques de la réponse au traitement, du développement des métastases ainsi que les mécanismes conduisant à l’évasion immunitaire dans l’ADKP, en réponse à un agent chimio-thérapeutique.

Raffinement

Une voire 2 personnes compétentes (formations en expérimentation animale + chirurgie) réaliseront les injections en IP d’antalgiques en pré et post-opératoire, la désinfection de la zone à inciser, l’injection en SC de l’anesthésique local avant l’incision, puis l’implantation des cellules tumorales dans la rate. Ceci afin d’éviter toutes complications post-opératoires et limiter ainsi le nombre d’animaux à opérer. Une surveillance et une manipulation quotidienne des souris avec un phénotype dommageable seront effectuées, des critères objectifs seront quantifiés et un score cumulé sera établi (e.g. Score cumulé 10 apparences et/ou comportements anormaux). Lorsque ce score cumulé est > à 10 pour une souris avec un phénotype dommageable, celle-ci sera rapidement euthanasiée. Un enrichissement matériel (twists, cocon ou nid) de l’environnement des animaux est mis en place dans toutes les cages afin qu’ils expriment un répertoire diversifié de comportements normaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris de référence dans le domaine du cancer pancréatique car leurs tumeurs miment fidèlement la maladie chez l’homme. De plus, cette espèce se caractérise par de nombreux avantages, notamment leur développement rapide, une descendance nombreuse et une facilité d’entretien et d’élevage.

Quarante-cinq minutes de chirurgie pour prélever un poumon sur 150 rats donneurs, deux heures pour le greffer sur 150 rats receveurs : 300 rats vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les donneurs sont mis à mort avant le prélèvement du poumon, les receveurs trois jours après la greffe pour mesurer la dysfonction du greffon et la réponse immunitaire. Jusqu'à 90 d'entre eux reçoivent auparavant une injection de corticoïdes dans la veine de la queue quinze heures avant l'opération, et 30 une administration directe dans la trachée. Le porteur écrit que les effets indésirables de cette administration trachéale "ne sont pas bien connus" et qu'une difficulté à respirer au réveil est envisageable.

Objectifs

La transplantation pulmonaire est souvent le dernier espoir pour les personnes atteintes de graves maladies respiratoires. Malheureusement, même si de plus en plus de patients ont besoin de cette opération, les résultats restent décevants : seuls 60 % des patients sont encore en vie cinq ans après la greffe. L’un des grands problèmes est qu’un grand nombre de patients développent, dès les premiers jours après l’opération, un dysfonctionnement du nouveau poumon peut ensuite entraîner des complications à long terme. Les recherches récentes en immunologie montrent que le stress subi par les cellules pendant l’opération joue un rôle important dans l’échec du greffon. Ce stress déclenche une inflammation, la mort de certaines cellules et attire des cellules du système immunitaire qui peuvent endommager le nouveau poumon. Aujourd’hui, pour éviter ces réactions, les médecins injectent des corticoïdes (anti-inflammatoires puissantes) au patient juste après la chirurgie. Notre projet vise à aller plus loin : nous pensons qu’il serait encore plus efficace de traiter le donneur, avant la greffe, avec ces corticoïdes. Pour tester cette hypothèse, nous allons utiliser un modèle bien connu de greffe de poumon chez le rat. Nous allons comparer plusieurs méthodes : traitement du donneur vivant avant le prélèvement, ou traitement du poumon une fois prélevé, pendant une phase où il est maintenu en vie artificiellement grâce à une machine. Cette dernière méthode permet d’utiliser des doses de médicament plus fortes, sans risque pour le reste de l’organisme. Nous testerons aussi plusieurs types de corticoïdes : la forme classique, mais aussi deux nouvelles versions conçues pour cibler plus précisément les cellules responsables de l’inflammation.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de montrer qu’un traitement du poumon du donneur, avant la greffe – soit directement sur le donneur (in vivo), soit sur l’organe une fois prélevé et maintenu en vie par une machine (ex vivo) – peut améliorer nettement les résultats de la transplantation. Le traitement réalisé sur le poumon en dehors du corps (ex vivo) pourrait être encore plus efficace, car il permet d’utiliser des doses plus fortes de médicaments anti-inflammatoires (corticoïdes) sans effets secondaires pour le reste du corps. Les résultats de ce projet pourraient ensuite servir à lancer une étude chez l’homme. Si les résultats sont positifs, cela pourrait changer les méthodes actuelles et grandement améliorer les chances de survie des patients greffés. Ce type de traitement pourrait aussi profiter à d’autres types de greffes, comme celles du rein, du foie ou du cœur. Ce projet permettra également de tester une approche innovante : l’utilisation de microparticules pour transporter les corticoïdes directement vers les cellules du système immunitaire responsables de l’inflammation. Les résultats de ce projet pourraient ouvrir la voie à un nouveau protocole de traitement des donneurs de poumons chez l’homme, et ainsi améliorer significativement la survie des personnes greffées. Enfin, ce travail représente une première en France : il permettra de mettre en place un modèle de greffe de poumon chez le rat, avec maintien de l’organe en vie en dehors du corps. Ce modèle pourra ensuite être utilisé pour tester d’autres traitements innovants, comme des thérapies cellulaires, géniques ou de nouveaux médicaments, et ainsi faire progresser encore davantage la médecine de la transplantation.

Procédures

Toutes les procédures appliquées aux animaux seront effectuées sous anesthésie générale : -injection une seule fois sur les animaux donneurs sur une durée de 5 minutes, maximum 90 animaux -administration du meilleur traitement, une seule fois, sur une durée de 15 minutes, sur max. 30 animaux donneurs -chirurgie pour récupérer le poumon donneur, 1 seule fois, durée de 45minutes, sur les animaux donneurs, 150 animaux -chirurgie pour transplantation du poumon, 1 seule fois, animaux receveurs, durée de 2h, 150 animaux

Impact sur les animaux

Pour les animaux donneurs : L’injection de médicament dans la veine de la queue est faite sous anesthésie générale 15h avant le prélèvement du poumon. Bien que la piqure n’induit pas une douleur ressentie pendant l’anesthésie, elle pourrait générer une douleur légère et passagère au réveil. Les effets indésirables dus à l’administration dans la trachée ne sont pas bien connus, on pourrait s’attendre a observer une difficulté à respirer après le réveil. Pour les animaux receveurs : Il est fréquent que les animaux aient un peu moins d’appétit pendant un ou deux jours après l’opération. Cela est souvent dû à l’anesthésie plus qu’à la chirurgie. Une cicatrice sur le thorax gauche peut, dans de rares cas, provoquer une gêne temporaire. Cette gêne disparaît généralement en 24 à 48 heures et n’empêche pas l’animal de manger ou de boire. Les problèmes respiratoires sont très rares, car l’autre poumon (le droit) continue de fonctionner normalement. Jusqu’à présent, aucune difficulté respiratoire n’a été observée dans les trois jours suivant la greffe. Enfin, une hémorragie interne pourrait survenir si les vaisseaux sanguins ne sont pas parfaitement refermés pendant l’opération. Des signes comme des saignements, une grande pâleur ou des difficultés à respirer seront surveillés de très près pendant la période de suivi de 3 jours post-transplantation. Une nuisance liée à l’hébergement individuel en post-greffe pourrait être générée, mais elle sera atténuée par le maintien de contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux.

Devenir

Tous les animaux donneurs seront mis à mort avant la récupération du poumon (n=150). Les animaux receveurs seront mis à mort pour évaluer les paramètres biologiques de dysfonction primaire du greffon, l’inflammation, et la réponse immunitaire.

Remplacement

Aucune méthode ne permet d’évaluer l’effet de la transplantation pulmonaire en raison des effets complexe de la chirurgie (sections, sutures), et des réponses au stress de nombreux types cellulaires (cellules de la structure du poumon, cellules des vaisseaux, cellules immunitaires) qui sont issus du donneur et qui rencontrent les cellules étrangères du receveur venues par la circulation sanguine. Cette complexité n’est strictement pas modélisable in vitro. Seule cette méthode permettra d’apprécier l’effet du traitement du poumon donneur (in vivo et/ou ex vivo) sur l’issue clinique de la transplantation.

Réduction

Nous avons pris toutes les mesures possibles pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette expérimentation. Cependant le nombre d'animaux par groupe ne doit pas être inférieur à 10, en raison de la nécessité d'obtenir des résultats fiables en tenant compte des variations inter-individus. Ce nombre est basé sur des expériences précédentes réalisées sur des porcs, sur l’expérience de nos collaborateurs, et des calculs d’estimation statistique.

Raffinement

L’état général des rats est surveillé quotidiennement : une fois par jour avant l'intervention, et trois fois par jour après la transplantation. Les animaux sont pesés avant l'intervention et trois jours après, au moment de l'euthanasie, ou plus fréquemment s’ils n’ont pas commencé à manger normalement. Un complément alimentaire hautement nutritif sera donné en post-transplantation et des hamacs chauffants seront installés dans les cages. Toutes les interventions sont réalisées de manière à réduire au maximum le stress et la douleur des animaux. Cela inclut l'anesthésie, la gestion de la douleur pendant et après l'opération, ainsi que l'utilisation de coussin ou de lampes chauffantes pendant la chirurgie. Un suivi systématique est mis en place pour évaluer la douleur des animaux et leur fournir des traitements appropriés. Des contrôles réguliers sont effectués pour minimiser la douleur, avec des évaluations trois fois par jour après l'opération. . Des points limites sont définis pour évaluer les paramètres de suivi, permettant ainsi de minimiser la douleur animale. Ces évaluations sont consignées sur des fiches de suivi pour chaque animal.

Choix des espèces

Le rat est une espèce animale de référence pour la transplantation pulmonaire. C’est également un modèle animal utilisé pour analyser la réponse biologique du poumon à la perfusion et pour évaluer l’effet du traitement chez le donneur directement. Il permet aussi d’employer des animaux dont la génétique est mieux maitrisée que celle du porc, ainsi que des animaux consanguins (tous les donneurs sont du même type génétique, tous les receveurs sont d’un autre type génétique). Le modèle rat est désormais maîtrisé et a été validé par plusieurs équipes internationales. Les animaux seront utilisés à l'âge de 70 à 85 jours, lorsqu'ils auront atteint un poids minimal de 300 g, suffisant pour garantir un développement adéquat des vaisseaux sanguins permettant la réalisation des sutures vasculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge de 70 à 85 jours, lorsqu'ils auront atteint un poids minimal de 300 g, suffisant pour garantir un développement adéquat des vaisseaux sanguins permettant la réalisation des anastomoses vasculaires.

Biopsie de la queue entre le troisième et le sixième jour de vie, chirurgie d'une heure trente pour implanter des sondes dans le cerveau et un boîtier sous la peau du dos, puis hébergement seul pendant quatre-vingt-dix jours au plus : 1 263 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Après une semaine de récupération, certaines reçoivent vingt-quatre injections en seize jours, puis restent branchées à un système d'enregistrement jusqu'à dix heures par jour pendant deux semaines. Les souris filmées pour détecter leurs crises perdent tout enrichissement bloquant la caméra, maison et matériau de nidification compris, et une partie des lignées modifiées fait des crises tonico-cloniques à partir de trois mois. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leur tissu cérébral.

Objectifs

Les troubles neurologiques, comme l'épilepsie, sont souvent liés à des problèmes dans l'équilibre des ions dans les neurones, en particulier le chlorure. Un transporteur important joue un rôle clé dans ce processus. Des mutations du gène qui produit cette protéine sont associées à divers troubles, allant de l'autisme à des formes sévères d'épilepsie chez les enfants. Cependant, on ne sait pas encore exactement comment ces mutations provoquent des crises d'épilepsie. Notre projet de recherche cherche à comprendre ces mécanismes en étudiant des souris portant une mutation d’un gène spécifique, avec l'espoir de trouver de nouvelles pistes pour traiter ces maladies.

Bénéfices attendus

Ce projet étudie une mutation d’un gène spécifique, responsable d’une forme grave d'épilepsie chez l'enfant. Les patients ont des crises d’épilepsie dès la première année de vie associée avec un déficit cognitif (problème pour parler, marcher indépendamment). Les crises de ces patients ne répondent pas aux médicaments actuellement disponibles. En comprenant mieux comment cette mutation affecte le fonctionnement des cellules, nous espérons découvrir de nouvelles pistes pour des traitements plus ciblés et personnalisés. La mutation que nous étudions grâce à une nouvelle lignée de souris a été associée avec un syndrome épileptique sévère : l’épilepsie du nourrisson à crises focales migrantes. Les patients atteints ont des crises d’épilepsies fréquentes et non contrôlées par voie médicamenteuse dès la première année de vie avec un délai neurodéveloppemental sévère ou une régression neurodéveloppementale lors de l’apparition des crises. L’identification et la compréhension des mécanismes cellulaires liés à cette mutation à l’origine de ce trouble permettra d’identifier de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques pour une médecine de précision.

Procédures

Une intervention d’une biopsie de queue est réalisée sur souris vigiles à l’âge de 3 à 6 post-natal. Cet acte technique dure moins de 1 minute. Une partie des animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptées pour l’implantation de sondes au niveau du cerveau et d’un appareil en sous-cutané au niveau du dos (1 fois, durée 1h30). Ils seront ensuite hébergés individuellement jusqu’à la fin de la procédure, soit 90 jours maximum. Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, afin d’évaluer l’effet d’un composé sur notre modèle pathologique, certains animaux opérés recevront des injections d’une molécule d’intérêt ou de son contrôle pendant 2 périodes de 8 jours, 2 fois par jour (matin et soir), soit 24 injections maximum (durée inférieure à 1 minute). Ces injections sont faites sur animal vigile. Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, l’activité électrique du cerveau des animaux opérés sera mesurée, pour cela ils seront connectés à un système d’enregistrement, vigiles et libres de se déplacer durant les mesures (maximum 10 heures par jour, pendant 2 semaines maximum). Un groupe de souris sera soumis à une chirurgie sous anesthésie pour induire l’expression d’un gène dans leur cerveau par un virus ou un plasmide (45 min), elles seront ensuite euthanasiées selon une procédure adaptée. Un groupe de souris recevront une injection intrapéritonéale (temps de manipulation inférieur à 1 minute) à un stade précis de développement. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les manipulations et contentions nécessaires au cours des procédures pourront générer un stress chez les animaux. Les injections peuvent induire une légère douleur et un inconfort au point d’injection. Les étapes d’anesthésie peuvent provoquer une détresse respiratoire, et une perte de chaleur de l’animal. Les actes chirurgicaux peuvent entrainer risque d'infection de la cicatrice ainsi qu’une souffrance locale. L’implantation d’électrodes dans le cerveau peut induire une douleur locale pendant 24 à 48 heures post chirurgie et une légère perte de poids. Les souris implantées devront être en hébergement individuel dès la chirurgie et le resteront pendant toute la durée de l’étude, soit une durée totale d’hébergement individuel de 90 jours maximum. S’agissant d’animaux grégaires, cela pourra générer un stress. Les animaux qui seront pris en vidéo pour détecter des crises n’auront pas d’enrichissement qui bloque visuellement la caméra comme une maison rouge ou de la nidification. La manipulation et la contention des souriceaux induisent un léger stress. Un risque de rejet des nouveau-nés par la mère ou de cannibalisme est possible. Le prélèvement à la queue induit une douleur lors du prélèvement et un saignement est possible. Une partie des animaux génétiquement modifiés sont sujets à des crises tonico-cloniques à partir de trois mois qui peuvent induire une fatigue ou en cas de crises d’un stade élevé (qui n’ont pas été observés chez ces souris) une atonie et une perte de poids.

Devenir

A l’issue du projet, l’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever et étudier leur tissu cérébral post-mortem.

Remplacement

Les mutations étudiées ici ont été identifiées chez des patients humains. Nous avons d’abord étudié cette mutation avec des modèles cellulaires avec lesquels nous avons pu observer une diminution de l’expression membranaire. Toutefois, ce modèle ne permet pas de tester des effets cellules-spécifiques de cette mutation au cours du développement ni l’apparition de rhythmopathies ou de crises d’épilepsie. Pour cela, le recours à un modèle animal est indispensable.

Réduction

Les expériences antérieures de nos collaborateurs sur ce type d’étude et de modèle animal indique qu’un échantillon de 6 animaux par condition pour une expérience donnée d’histologie et de 10 pour une expérience d’électrophysiologie est suffisant pour mettre en évidence une différence de 20 pour cent. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. A l’aide de ces calculs, nous estimons devoir utiliser 1263 animaux dans le cadre de ce projet. Nous analyserons nos résultats avec les tests statistiques appropriés afin d'avoir une interprétation fiable.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximum (sauf en post-chirurgie où ils seront en hébergement individuel, identifié et avec enrichissement complémentaire) et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification et d’une maison en plastique sauf lors des enregistrements vidéo. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Tout le long des procédures, nous assurerons une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée. Au cours de l’anesthésie, la température des animaux sera maintenue grâce à un tapis chauffant. Un produit spécifique sera appliqué sur les yeux pour éviter tout dessèchement des cornées. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont placées sur une plaque chauffante, anesthésiées et reçoivent des injections d'analgésiques en pré- et post-opératoire. Après les chirurgies, une litière utilisée spécifique pour les animaux opérés permet de diminuer les risques d'infection de la cicatrice. La surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance et l’analgésie est maintenue sur 48h après l’opération à raison d’une administration par jour. Une grille d'évaluation de l’état des animaux est mise en place comprenant notamment l’évaluation de l’état du poil, la motilité, et le poids de l’animal. Une injection d'analgésique ou l’euthanasie de l'animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites. Un délai d’une semaine d’acclimatation sera respecté pour les animaux élevés en dehors de l’institut.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix afin d’étudier le développement du cerveau ainsi que les connexions neuronales chez l’adulte, à la fois car c’est un modèle présentant un développement très bien caractérisé et stéréotypé mais surtout en raison des similarités du développement du système nerveux entre la souris et l’humain. De plus, l’organisation de l’hippocampe et du cortex chez l’adulte est très similaire chez la souris et l’humain (organisation en couches, morphologie…). Nous souhaitons étudier une nouvelle lignée de souris portant une mutation. Au vu des rôles connus de cette protéine et de son expression au cours du développement, nous émettons l’hypothèse que cette mutation pourrait avoir des impacts sur le développement cortical à des stades embryonnaires ou postnataux précoces. Nous allons donc étudier les différences histologiques à des stades embryonnaires et précoce (1 et 4 jours après la naissance). Nous savons aussi que les adultes de cette lignée présentent des crises tonico-cloniques. Nous souhaitons caractériser ces crises ainsi que le décours temporel de leur survenue. Nous étudierons donc également le stade adulte.

2 957 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever moelle osseuse, rate et foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules de moelle osseuse sous anesthésie, un gavage déclenchant l'expression des mutations étudiées, des prélèvements sanguins toutes les deux à trois semaines pendant un an au plus, et des injections de traitement tous les un à deux jours. Certaines développent une polyglobulie de Vaquez avec démangeaisons et rougeurs, que le porteur qualifie de modérées. Il conclut que l'utilisation d'animaux est "incontournable", l'auto-renouvellement des cellules souches du sang exigeant selon lui un environnement médullaire qu'aucun organoïde ni modèle mathématique ne reproduit.

Objectifs

Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des cancers hématologiques caractérisés par une prolifération incontrôlée de cellules sanguines. Les NMP regroupent 3 maladies : la polyglobulie de Vaquez (PV) caractérisée par une sur-production de globules rouges, la thrombocytémie essentielle (TE) qui présente un excès de plaquettes et la myélofibrose primaire (MFP), qui est la forme la plus sévère, caractérisée par une sur-production des lignées myéloïdes associée à la présence invalidante de fibres de collagène dans la moelle osseuse. Ces maladies, pourtant différentes, sont dues à l’acquisition au niveau des cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse, de mutations affectant JAK2, la calréticuline et le récepteur à la thrombopoïétine. Les patients peuvent présenter des complications hémorragiques et thrombotiques ainsi qu’à long terme, un risque majeur de transformation du néoplasme en leucémies aigües myéloïdes qui sont de très mauvais pronostic avec une médiane de survie de 3 à 5 mois. Ces pathologies restent sans traitement curatif spécifique, excepté l’interféron alpha (IFNa) dans 8-20% des PV ou ET mais pas dans les MFP qui restent incurables et fatales à court terme. De plus, l’étape d’initiation de ces maladies reste mal comprise. Nous travaillons avec plusieurs modèles de souris exprimant qui miment une PV évoluant en myélofibrose, ou qui ont des mutations de la calréticuline qui développent une TE progressant en myélofibrose, ou qui ont des mutations qui pourraient évoluer d'une TE vers la myélofibrose. Nous travaillons également sur un facteur de prédisposition (CNV) à des formes familiales de NMP se transformant rapidement en LAM et dont l’étude va nous permettre de mieux comprendre les mécanismes d’amplification du clone muté et et les étapes de transformation en LAM à l’aide d’un modèle de souris spécifique. Les objectifs de ce travail sont d’étudier par quels mécanismes ces différentes mutations induisent des NMP différents à partir de l’expansion des cellules souches mutées pour tester l’efficacité de traitements innovants dans ces différents types de maladies.

Bénéfices attendus

Les mutations responsables des néoplasme myéloprolifératifs sont acquises au niveau des cellules souches hématopoiétiques. L'objectif principal est d’étudier comment les mutations d'intérêt affectent la composition du compartiment de ces cellules souches, ce qui permettrait d’identifier les cellules initiatrices de la maladie à cibler thérapeutiquement. Dans un second objectif, nous allons tester l’efficacité de nouveaux traitements. Enfin, notre troisième objectif est de comprendre les mécanismes d’initiation des NMP. L’un des bénéfices majeurs de ce projet est d’améliorer la prise en charge des patients souffrant de NMP en identifiant et testant de nouvelles thérapies.

Procédures

Nous allons générer des modèles de souris greffées en injectant des cellules de moelle osseuse (1 injection durant 10 secondes) à des souris receveuses anesthésiées. L’analyse du développement de la maladie se fait par prélèvements sanguins (1 prélèvement de 10 secondes/souris) sur souris anesthésiées (anesthésie générale) toutes les 2-3 semaines pendant 1, 3, 6 ou >6 mois

Impact sur les animaux

La greffe n’induit généralement pas d’effet particulier. Certaines souris développent une polyglobulie de Vaquez, comme les patients. Les animaux peuvent avoir des prurits et des érythèmes modérés. Le gavage pour induire l’expression des mutations d'intérêt peut causer une légère perte d’appétit. Les divers traitements ont pour but de résoudre la maladie et devraient donc apporter une amélioration de la maladie développée par les souris.

Devenir

Le sort des souris étudiées dans les différentes procédures est la mise à mort de tous les lots afin d’étudier les organes hématopoïétiques (Mo, rate et foie).

Remplacement

L’utilisation d’animaux est incontournable car les mutations s’expriment dans les cellules souches hématopoiétiques dont les propriétés d’auto-renouvellement (à la base de la résistance et de la dominance clonale de ces maladies) requièrent l’environnement médullaire impossible à reproduire in vitro. De plus, la progression de la maladie s’accompagne d’une mobilisation des cellules souches hématopoiétiques de la moelle osseuse vers la rate dont nous souhaitons caractériser le rôle afin de le contrer. Enfin, seuls les traitements des souris mimant les symptômes hématologiques des patients atteints de néoplasmes myéloprolifératifs permettront d’analyser leurs efficacités dans l’organisme dans sa globalité, incluant la réponse immunitaire contre les cellules mutées. Il n'est donc pas possible d'utiliser des méthodes in vitro telles que les organoïdes ni des méthodes de modélisation mathématique.

Réduction

Nous allons réaliser des greffes pour réduire le nombre d’accouplements et de souris à générer en élevage. Pour nos études ainsi que les traitements, nous réduirons au maximum le nombre de souris par groupe pour conserver cependant un pouvoir statistique permettant de valider leur efficacité. Pour les greffes, nous considérons que 2 expériences indépendantes sont nécessaires pour confirmer les résultats. Les résultats des traitements comparés à la condition non traitée (véhicule) ou entre eux (dosages) seront statistiquement analysés pour deux conditions.

Raffinement

Toutes les interventions invasives (greffes, prélèvements de sang) seront faites sous anesthésie générale. Une surveillance quotidienne sera effectuée pour s’assurer de leur santé physique et comportementale : un régime adapté haute énergie sera ajouté dans les cages en cas de diminution de la prise alimentaire et les points limites seront strictement appliqués Un suivi quotidien est réalisé. En cas de besoin, une analgésie sera appliquée.

Choix des espèces

L’utilisation de souris nous permet d’obtenir dans un temps très court un nombre nécessaire d’animaux prêts à être expérimentés. Ces modèles de souris miment parfaitement les divers néoplasmes myéloprolifératifs humains et permettent de reproduire les résultats de thérapies chez l’homme. Ce sont donc de très bons modèles pour les études proposées. La maladie survient chez l’homme à l’âge adulte. Nous avons la possibilité d’induire l’expression des mutations à un moment choisi (vers 3 mois après la naissance) pour mimer au mieux le développement de la maladie humaine.