Procédures modérées
Etude de l’influence de composés pharmaceutiques dans l’engagement des cellules NK dysfonctionnelles en contexte tumoral.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Un score de douleur compris entre trois et huit déclenche des mesures correctives, en dessous de trois aucune mesure n'est prise. 6 341 souris vont être utilisées, dont 4 841 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales, par voie intraveineuse pour disséminer la tumeur dans tout l'organisme ou en sous-cutané, puis entre cinq et vingt injections de composés répétées tous les trois jours jusqu'au soixantième jour. Le porteur décrit un développement tumoral dans le foie et le cerveau pouvant provoquer une paralysie, l'objet du projet étant d'évaluer des immunothérapies censées réactiver des cellules tueuses naturelles devenues dysfonctionnelles.
Objectifs
Le cancer est un fléau mondial qui touche des dizaines de millions de personnes dans le monde chaque année et qui est l'une des principales causes de mortalité. Les immunothérapies ont considérablement amélioré la prise en charge des patients et leur espérance de vie. La compréhension du système immunitaire, portée par l'utilisation de différents modèles murins, est à l'origine du développement de ces immunothérapies et de leur application à l'Homme. Les principales immunothérapies ciblent des lymphocytes de l'immunité adaptative. Cependant, les taux de réponse observés chez les patients restent hétérogènes et des effets secondaires importants, pouvant entraîner la mort des patients, sont observés. Ainsi, la recherche se penche sur des stratégies alternatives. Certaines cellules tueuses naturelles, des lymphocytes de l'immunité innée sont spécialisées dans l'élimination des cellules tumorales. Récemment, de nouvelles immunothérapies ciblant ces cellules se sont montrées extrêmement prometteuses. Ces nouvelles molécules sont des structures favorisant l'interaction entre les cellules cellules tueuses naturelles et les cellules tumorales en créant un pont moléculaire. A l'aide d'un modèle murin de lymphome, nous avons montré que la stimulation chronique de ces cellules tueuses naturelles par les cellules tumorales entraîne leurs dysfonctions et que le contrôle des cellules tumorales était moins efficace dans des organes tels que le foie, la moelle ou encore les poumons. Les dysfonctions de ces cellules tueuses naturelles sont observées dans de nombreux cas de cancers chez l'Homme mais ne sont jamais prises en compte dans le développement et l'évaluation de l'efficacité des nouvelles immunothérapies. De plus, la dissémination des cellules tumorales dans l'organisme (métastases) est caractéristique d'un mauvais pronostic clinique. Il est donc important de déterminer si ces nouvelles immunothérapies peuvent engager les cellules tueuses naturelles dysfonctionnelles et améliorer la prévention de la dissémination des cellules tumorales. Il s’agit de questions centrales dans la compréhension de l’efficacité de ces nouvelles immunothérapies. Cela permettra d’adapter l’utilisation thérapeutique de ces molécules en fonction de leur capacité ou non à favoriser le contrôle tumoral dans différents organes colonisés par des métastases ou dans le but de prévenir leur apparition qui corrèle avec un mauvais pronostic pour les patients.
Bénéfices attendus
Les immunothérapies ont révolutionné le traitement des cancers mais leur efficacité reste hétérogène et de nombreux patients (10 millions en 2022) meurent encore de cancers. Il est donc important d'améliorer l'efficacité et la compréhension des immunothérapies afin d'améliorer le taux de succès et donc d'impacter significativement l'espérance de vie des patients. Ce projet permettra d'obtenir à court terme une vue d'ensemble du panel d'action de ces nouvelles immunothérapies dans le contrôle tumoral médié par les cellules tueuses naturelles dans différents organes et leur capacité d’action sur ces cellules dysfonctionnelles. Ainsi, cela permettra à plus long terme 1/ d'adapter l'utilisation de ces immunothérapies en fonction de la localisation de la tumeur ciblée, 2/ d’utiliser ces molécules en combinaison avec des thérapies ciblant préférentiellement la tumeur primaire et 3/ d'améliorer la compréhension de l'efficacité des traitements à base de ces nouvelles immunothérapies pour une utilisation la plus efficace chez l'Homme.
Procédures
Les cellules tumorales seront injectées en intraveineuse sur souris vigile (1 injection) ou en sous-cutané sur souris anesthésiées (1 injection). Les composés thérapeutiques seront administrés par voie intraveineuse sur souris vigile (tous les 3 jours jusqu'à la fin de la procédure soit entre 1 et 20 injections maximales). Une population de cellules immunitaires sera éliminée se fera par injection intra-péritonéale (1 injection). Le prélèvement sanguin unique ou encore la mesure de la charge tumorale (tous les jours jusqu'à la fin de la procédure) se fera sur souris anesthésiées. L'ensemble de ces gestes seront réalisés par un personnel formé, compétent et expérimenté. Ainsi, chacun de ces gestes durera moins d'une minute.
Impact sur les animaux
L'injection des cellules tumorales par voie intraveineuse caudale, réalisée sur souris vigile peut être source de stress et de légère douleur. Lors de l'injection des cellules tumorales par voie sous-cutanée, les souris seront anesthésiées afin de réduire leur stress et douleur. L'injection des immunothérapies par voie intraveineuse réalisée sur animal vigile peut être source de stress et de légère douleur. Les animaux inclus dans cette étude subiront entre 5 injections intraveineuses (pour les molécules non efficaces) et 20 injections intraveineuses (Début à J1 et fin à J60, pour les molécules efficaces). La manipulation des souris pour les pesées, la répartition aléatoire des souris dans les groupes de traitements, ou encore la contention représentera un stress de courte durée pour les souris. Certains animaux subiront un prélèvement sanguin unique réalisé sous anesthésie gazeuse juste avant leur mise à mort. Le développement des tumeurs elles-mêmes peut entraîner des douleurs chez les animaux. En effet, l'injection par voie intraveineuse des cellules tumorales entraîne leur dissémination dans tous l'organisme ce qui favorise le développement tumoral dans des organes vitaux (foie, cerveau) pouvant entrainer une paralysie (atteinte moelle osseuse). D’après l’expérience et notre connaissance du modèle, nous pouvons anticiper des signes très précoces de souffrance grâce à un test simple d’agrippement et mettre fin à l’expérience avant l’atteinte des points limites. D'autres effets indésirables peuvent être observés tels qu'une perte de poids, une modification du comportement (prostration) dans les modèles sous-cutané et intraveineux ou encore une inflammation/irritation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée). Enfin, d'après notre expérience, l'utilisation de ces immunothérapies n'entraîne pas d'effets indésirables importants mais peut entrainer une perte de poids ainsi qu'une modification comportementale transitoire.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car chaque procédure implique des prélèvements d'organes ainsi qu'un développement tumoral entrainant l'atteinte de points limites justifiant leur euthanasie.
Remplacement
L'étude de l'efficacité d'un composé thérapeutique ciblant la réactivation des cellules tueuses naturelles dysfonctionnelles implique de se placer dans un système biologique complexe tel que le microenvironnement tumoral. De plus, l'efficacité de ces molécules peut dépendre de leur métabolisation et de leur distribution dans l'organisme, il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal afin que l'ensemble de ces caractéristiques soient présentes. En effet, il n'est, dans l'état actuel des connaissances, pas possible de prendre en compte l’ensemble de ces paramètres dans des modèles vitro ou ex vivo. Cependant, l'ensemble des molécules auront été préalablement testées in vitro afin de vérifier leur fonctionnalité.
Réduction
Afin de limiter l'utilisation d'animaux, les molécules testées auront été préalablement testées in vitro. De par l'utilisation d'un modèle adapté à la génération de grandes quantités de cellules tueuses naturelles dysfonctionnelles, nous pourrons réaliser la plupart des analyses à partir des mêmes échantillons et donc sur un même animal. Cela contribue à réduire l'utilisation inutile d'animaux supplémentaires. Au cours d’une procédure pilote, nous déterminerons l'efficacité de ces molécules in vivo, la dépendance des cellules tueuses naturelles ainsi que la concentration optimale d'utilisation dans ces modèles tumoraux, ce qui permettra de calibrer l'utilisation de ces molécules dans ce projet. Cela permettra de réduire la quantité d'animaux utilisés lors de l'ensemble de ce projet. En se basant sur les données de la littérature ainsi que sur notre expérience, des groupes de 5 animaux maximum seront requis par groupe pour les tumeurs injectées par voie intraveineuse (ou 3 pour des technologies de pointe à l’échelle de la cellule unique). Afin de prendre en compte la variabilité de pousse des tumeurs sous-cutanée, des groupes de 10 animaux maximum seront nécessaires. Si et seulement si les expérimentations tendent à montrer une différence biologique avec l'utilisation des immunothérapies , alors elles seront répétées 2 fois (pour un total de trois expérimentations) afin d'assurer la fiabilité, la robustesse et la significativité des résultats pour publication dans une revue scientifique. Les molécules ne montrant pas d’efficacité dans la procédure pilote seront éliminées dans le reste du projet, ce qui pourra contribuer à réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de réduire le stress des animaux, un temps d'acclimatation minimum d'une semaine sera respecté après l'arrivée des animaux à l'animalerie avant le lancement de toute procédure expérimentale. Toutes les procédures expérimentales du projet seront réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des règlementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animal et le vétérinaire référant de notre établissement. Un suivi journalier des animaux sera effectué par les expérimentateurs puis une surveillance accrue, matin et soir, sera réalisée les 3 jours précédents la date de mise à mort des animaux dans le but d'anticiper le moindre signe de souffrance. La connaissance approfondie du modèle étudié que nous avons développé, nous permet de prédire les jours auxquels nous obtenons des cellules tueuses naturelles dysfonctionnelles tout en limitant au maximum la souffrance des animaux. Nous nous baserons sur un tableau de notation relatif à la douleur des animaux permettant de déterminer des points limites précis afin d'éviter toute dégradation sévère de l'état général des animaux. Pour cela nous suivrons des signes précoces tels que l'apparence, le comportement, l'aspect ou le volume de la tumeur, la perte de poids, des troubles locomoteurs (agrippement). Si le score cumulé est compris entre 0 et 3, aucune mesure ne sera prise témoignant de l’absence de souffrance. Si le score cumulé est compris entre 3 et 8 alors des mesures correctives seront prises. Ces mesures correctives seront adaptées à la situation et comprennent l’introduction d'enrichissements supplémentaires, une surveillance accrue, une mise à disposition de nourriture humidifiée ou gélifiée, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique sur les lésions cutanées ou une mise à mort précoce. Si l'un des paramètres observés atteints le plus haut degré d'évaluation ou que le score cumulé est supérieur à 9 alors les animaux seront mis à mort. Certains gestes seront réalisés sous anesthésie gazeuse pour limiter le stress et la douleur (injection sous-cutanée ou prélèvement sanguin). Les injections intraveineuses et intrapéritonéales réalisées sur animaux vigiles seront effectuées par du personnel compétent et expérimenté de réduire au maximum le stress et la douleur liés à ces gestes techniques.
Choix des espèces
Les cellules tueuses naturelles ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, les souris sont choisies comme modèle in vivo de par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l'Homme. Bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes réalisées chez la souris sont transposables à l'Homme. De plus, les outils et les structures disponibles pour la manipulation des souris, couplé au temps de gestation et de sevrage courts, en font un modèle de choix. Enfin, la richesse des souches murines génétiquement modifiées et des réactifs disponibles permet une compréhension approfondie des phénomènes mis en jeu et ce du niveau moléculaire au niveau de l'organisme entier. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l'étude, âge auquel le système immunitaire de l'animal est décrit comme mature.
Rôle des lymphocytes T dans la fonction anti-bactérienne du foie dans le modèle souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Toutes tuées pour la collecte de leurs organes, 412 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 112 d'entre elles et modéré pour les 300 autres. Elles reçoivent une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie, certaines une seconde dix semaines plus tard, et une partie subit une irradiation totale du corps suivie d'une greffe de moelle osseuse. D'autres ingèrent pendant sept jours une molécule qui déclenche une inflammation intestinale, avec diarrhées et perte de poids, puis reçoivent des bactéries. Le porteur reconnaît que des données humaines et des expériences in vitro existent déjà, mais conclut que le modèle animal reste "nécessaire" à ce stade pour établir le rôle des lymphocytes T du foie.
Objectifs
Les lymphocytes T sont des cellules immunitaires qui jouent des rôles centraux dans les défenses contre les agents pathogènes, mais aussi dans les interactions symbiotiques avec les bactéries commensales colonisant les muqueuses et la surface du corps. Dans ce projet de recherche fondamentale, nous nous intéressons à une population de lymphocytes T reconnaissant des composés (aussi appelés antigènes) bactériens fabriqués par de nombreuses bactéries intestinales. Ces lymphocytes présentent un fort interet car ils sont très abondants chez l'humain et sont impliqués dans de nombreuses maladies telles que les infections, l’obésité, la sclérose en plaque, le diabète, les maladies inflammatoires de l’intestin et le syndrome métabolique. Leur rôle dans le foie, où ils représentent jusqu'à 40% des lymphocytes T, reste inconnu à ce jour. Le foie a notamment comme fonction d'éliminer les bactéries commensales qui ont atteint le système sanguin, en particulier lors d'une rupture de la barrière intestinale. Ce projet vise à tester l'hypothèse que les lymphocytes T du foie contribuent à cette fonction pare-feu en éliminant les bactéries commensales présentes dans la circulation sanguine.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le role dans le foie de lymphocytes T très abondants chez l'humain et impliqués dans de nombreuses pathologies. Le projet peut donc conduire à de nouvelles opportunités thérapeutiques pour améliorer le traitement de pathologies telles que le diabete, l'inflammation intestinale chronique ou encore l'obésité.
Procédures
Les animaux recevront une injection intra-veineuse par voie rétro-orbitale sur animaux anesthésiés par inhalation (environ 1 minute, 1 fois au cours de l'expérience). Certains animaux recevront une irradiation totale suivie d'une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sur animaux anesthésiés par inhalation (environ 1 minute). Certaines souris recevront une deuxième injection rétro-orbitaire après anesthésie par inhalation (1 minute environ) 10 semaines après la première injection. Certains animaux recevront une molécule dans l’eau de boisson pendant 7 jours, suivi d'une administration orale sur animaux vigiles (geste d'environ 10 secondes réalisé une fois au cours de l'expérience).
Impact sur les animaux
L’inflammation intestinale peut causer des diarrhées entrainant une perte de poids. Le poids initial est retrouvé 2-7 jours après la fin du traitement. Le développement d'une immunodépression induite par l'irradiation peut engendrer une perte de poids. Le poids initial est retrouvé environ 1 semaine après administration de moelle osseuse. L'administration de E. coli non-pathogène peut entrainer une perte de poids. Le poids initial est retrouvé environ 4 jours plus tard. Le développement de suppurations des yeux peut apparaitre suite aux injections rétro-orbitales. En cas d'apparition, un gel anti-septique sera immédiatement appliqué.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses.
Remplacement
Les données obtenues chez l'humain montrent une fréquence élevée de lymphocytes T dans le foie. In vitro, les lymphocytes T sont activés par différentes lignées de cellules du foie en présence d'E. coli. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant à la réponse des lymphocytes T et quant à l'identité des cellules qui les activent in vivo en présence de E. coli. Le rôle des lymphocytes T dans la clairance de bactéries commensales ne peut pas non plus être déterminé dans des modèles in vitro ou ex vivo. Le modèle animal reste donc nécessaire à ce stade.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique (t-test de student). Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Le projet est conçu en 2 phases: certaines procédures ne seront réalisées qu'en fonction des résultats obtenus, de façon à réduire le nombre d'animaux au minimum. Enfin, une étude pilote est prévue pour s'assurer de la bonne re-constitution du compartiment hématopoeitique (et notamment des lymphocytes T dans les tissus) après greffe de moelle.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux et non isolés. Ils bénéficieront de matériel d’enrichissement (igloos, tunnels). L’inflammation intestinale est induite par administration de produits chimiques et peut causer des diarrhées. En cas de déshydratation, les souris seront réhydratées par voie intra-péritonéale et un gel hydratant sera placé dans la cage. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptés aux signes cliniques associés à l’inflammation intestinale.
Choix des espèces
La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes MAIT ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour l’étude de l’inflammation intestinale et des réponses immunes associées, du fait de l’existence de modèles bien définis, de la similarité de la flore intestinale, et de la parenté génétique avec l’humain. -Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 à 14 semaines). -Nous utiliserons des souris adultes car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire et un microbiote matures.
Rôle du cil primaire dans les maladies rénales chroniques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Pour étudier le rôle du cil primaire des cellules rénales dans les maladies rénales chroniques, 17 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de tissus. Elles reçoivent un antibiotique dans l'eau de boisson pendant vingt-quatre heures ou deux semaines, subissent l'ablation chirurgicale d'un rein ou son obstruction permanente sous anesthésie, parfois suivie d'une réversion chirurgicale quatre jours plus tard, et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales. Le porteur indique que la maladie peut entraîner à un stade avancé une baisse de l'appétit, un amaigrissement et une diminution de l'activité, et que les souris atteignant les points limites sans possibilité de soulagement sont tuées. Ce chiffre de 17 320 n'est adossé qu'à la mention d'un test statistique comparant les groupes deux à deux.
Objectifs
Les maladies rénales chroniques sont des pathologies génétiques ou acquises caractérisées par une détérioration de la fonction et de la structure du rein avec l’apparition de multiples kystes rénaux ou l’accumulation de cellules immunitaires et cicatricielles. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter l’évolution vers l’insuffisance rénale terminale. Ce projet a pour objectif d’étudier le rôle du cil primaire, une extension filiforme de la membrane des cellules rénales dans les maladies rénales. Le cil primaire joue un rôle important dans ces maladies en régulant la forme et les propriétés mécaniques du rein ainsi que le recrutement de cellules qui participent à la destruction du rein. En permettant une meilleure compréhension des mécanismes à l’origine de la destruction du rein, ce projet va servir de base à l’élaboration de nouveaux traitements à destination des patients atteints de maladies rénales chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but une meilleure compréhension des maladies rénales chroniques kystique et fibrosante pour lesquelles nous ne disposons pas de traitement actuellement, afin d’améliorer les traitements et la prise en charge des patients.
Procédures
-Induction d’une maladie rénale chronique par administration d’antibiotique dans l’eau de boisson en continu sur animaux vigiles. Cette intervention dure 24 heures ou 2 semaines et est réalisée une seule fois. -Ablation chirurgicale d’un des deux reins sous anesthésie générale et analgésie. Cette intervention dure 5 minutes et est réalisée une seule fois. -Obstruction permanente chirurgicale d’un des deux reins sous anesthésie générale et analgésie. Cette intervention dure 5 minutes et est réalisée une seule fois. -Obstruction chirurgicale d’un des deux reins sous anesthésie générale et analgésie (5 minutes) suivi d’une réversion chirurgicale de cette obstruction 4 jours plus tard également sous anesthésie générale et analgésie (20 minutes). Ces interventions sont réalisées une seule fois. - Injections intrapéritonéales de molécule induisant la perte des cellules mutantes dans le rein sur animal vigile : les injections durent 10 à 20 secondes. 1 à 5 injections sont réalisées à 24 heures d’intervalle. -Prélèvement de sang sous anesthésie générale. Cette intervention dure 2 minutes et est réalisée une seule fois.
Impact sur les animaux
La contention peut provoquer un stress chez l’animal. L’ajout d’antibiotique dans l’eau de boisson peut induire un goût amer. La maladie rénale chronique peut entraîner à un stade avancé une baisse de l’appétit, un amaigrissement et une diminution de l’activité́. La chirurgie induit une douleur modérée et passagère. Le prélèvement sanguin sous anesthésie peut occasionner une douleur passagère. Les injections intra-péritonéales induisent une douleur légère et passagère.
Devenir
Tous les animaux utilisés seront mis à mort à la fin de l'étude pour prélèvement de tissus.
Remplacement
La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro (y compris les organoïdes rénaux) ne permettent pas l’étude d’un rein in vitro ayant une vascularisation, un flux urinaire, et l’ensemble des populations cellulaires observées in vivo. Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire complet, il n’est pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'obtention d'un résultat significatif déterminé par une approche statistique en utilisant un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux. De plus, lors des chirurgies, un seul rein sera manipulé, permettant de conserver le rein controlatéral comme contrôle interne.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Pour diminuer l’amertume liée à la prise d’antibiotique, du sucre est ajouté dans l’eau de boisson. Afin de réduire la douleur associée à la chirurgie, une anesthésie générale est réalisée. Un antalgique et un analgésique seront administrés en pré- et post-opératoire. Dans l’attente de leur réveil, les souris opérées sont placées sur une table chauffante jusqu’aux premiers signes de réveil puis transférées dans une cage propre avec de la nourriture à disposition. Le prélèvement sanguin est réalisé à l’aide d’un mini-capillaire sous anesthésie générale. A l’issue des procédures, les souris seront mises à mort sous anesthésie générale préalable. Des points limites spécifiques à chaque procédure ont été définis. Tout animal en souffrance recevra un antalgique et/ou des compléments alimentaires. Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyse ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons (unités fonctionnelles du rein) fixés après la fin du développement rénal. Les maladies rénales chroniques étudiées dans ce projet affectent majoritairement les patients adultes. L’induction de la maladie sera effectuée sur des souris âgées de 4 semaines afin que la maladie se développe progressivement à l’âge adulte entre 12 et 18 semaines.
Evaluation du profil pharmacocinétique d’un candidat-médicament par des prélèvements d’échantillons biologiques chez le porc
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
128 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 110 d'entre eux étant destinés à une réutilisation dans d'autres projets et les autres tués pour des prélèvements terminaux. Ils reçoivent un candidat-médicament par plusieurs voies, dont une administration par endoscopie sous anesthésie d'environ une heure, subissent jusqu'à cinq biopsies de peau par temps de prélèvement et jusqu'à trois biopsies d'organes en vingt-quatre heures, avec pose chirurgicale d'un cathéter ou d'une chambre implantable et séjours en cage à métabolisme pouvant atteindre quarante-huit heures. Les bénéfices annoncés, la mise sur le marché de médicaments à effets secondaires réduits, sont renvoyés à la suite du développement, l'objet immédiat restant de mesurer la concentration du produit dans le sang, l'urine et les tissus. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution pour évaluer la pharmacocinétique, et compte parmi les bénéfices pour le porc l'amélioration des connaissances sur sa propre espèce.
Objectifs
Les études de pharmacocinétique sont essentielles pour étudier le devenir d'un candidat-médicament dans l'organisme. Le projet consiste à évaluer le profil phamarcocinétique d'un futur candidat-médicament chez le porc après son administration grâce à des prélèvements d'échantillons biologiques (sang, urine, tissus). Ces prélèvements permettront de mesurer la concentration du produit ainsi que d'éventuels marqueurs biologiques dans les différents échantillons à différents temps post-administration.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (porc) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Les animaux seront administrés avec les composés à tester par différentes voies en vigile (environ 2min) ou anesthésié par endoscopie (environ 1h). Des prélèvements de sang seront enuite réalisés sur l'animal vigile (environ 2min). Des biopsies de peau (maximum 5 prélèvements par temps avec un temps de récupération minimum de 10j) sous anesthésie locale (environ 15min) ou des biopsies d'organes (maximum 3 sur 24h) sous anesthésie générale (environ 2h) pourront être réalisées. Les animaux pourront être placés dans des cages pour le recueil de l'urine (durée maximum 48h avec un temps de détente à 24h). Une chambre implantable ou un cathéter pourront être posés pour réaliser des prélèvements ou une administration (chirurgie de moins de 2h) et ensuite retirés si nécessaire lors d'une chirurgie également (environ 30min). Les animaux pourront également être mis à jeun (maximum 24h) avant les chirurgies et avant l'administration du composé. Les animaux pourront être hébergés individuellement pour favoriser leur récupération post-opératoire (durée maximale de 10jours).
Impact sur les animaux
Les conséquences éventuellement indésirables des produits ne peuvent pas être anticipés au début du projet. Par conséquent, des discussions seront engagés avec les responsables du bien-être animal pour ajuster les méthodes d'observation des animaux, en vue de préparer des traitements pour d'éventuels symptomes cliniques. Dans le cadre de ce projet, les animaux pourraient éprouver un stress en raison de la restriction alimentaire avant chirurgie ou avant l'adminsitration du composé, de l'induction de l'anesthésie ainsi que durant la période post-opératoire. Ils pourraient également connaitre une douleur équivalente à la piqure d'une aiguille lors de l'administration du produit et des prélèvements sanguins. Ils pourraient également subir un stress lié à leur hébergement individuel en cage à métabolisme pour la collecte d'urine ou suite à une chirurgie.
Devenir
Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire. Certains animaux pourront être euthanasiés en fin de projet pour réalisation de prélèvements terminaux ou si leur état général ne permet pas d'envisager de réutilisation.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le porc car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer la pharmacocinétique d’une nouvelle molécule. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le porc est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 3 ou 4/ par groupe à raison de 8 études par an. Pour obtenir un nombre suffisant de données scientifiques, le nombre d’animaux qui sera utilisé est notifié dans le paragraphe portant sur le nombre estimé d'animaux utilisés. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole d'analgésie adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Animaux sevrés en croissance et animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Caractérisation des paramètres ultrasonores optimaux pour une neurostimulation sélective pour le traitement de la douleur chronique
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
84 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 72 recevront chacune cent stimulations ultrasonores d'une milliseconde, chaque tir visant une zone de peau différente. Les douze autres reçoivent une injection intrapéritonéale et une injection intradermique, qui peut enflammer le site de piqûre. Le porteur indique que la stimulation peut provoquer une sensation de douleur au réveil de l'anesthésie, l'objectif étant d'activer sélectivement des neurones sensoriels pour préparer de futurs dispositifs contre la douleur chronique. Entre dix minutes et deux heures après la neurostimulation, chaque souris est tuée pour le prélèvement de ses ganglions rachidiens et de sa moelle épinière.
Objectifs
La neurostimulation par ultrasons focalisés est une technique alternative prometteuse pour le traitement de la douleur chronique. Comparé à la stimulation électrique standard nécessitant l’implantation d’électrodes par chirurgie, les ultrasons ont l’avantage d’être non-invasifs, de pouvoir pénétrer jusqu’à plusieurs centimètres dans le corps et de permettre une grande précision spatio-temporelle. Nous avons récemment démontré grâce à des expériences in vitro sur les neurones des ganglions de la racine dorsale (DRG) de souris qu’il était possible d’activer les neurones sensoriels de différents sous-types. En particulier, il a été montré que les neurones nociceptifs jouant le rôle de senseurs de la douleur ainsi qu’une sous-population de neurones sensoriels du toucher identifiés comme de puissants modulateurs de la douleur induite par lésion, sont particulièrement sensibles aux stimulations ultrasonores. L’activation sélective de ces neurones sensoriels du toucher est susceptible de constituer une cible de choix, mais encore inexplorée, pour le traitement des douleurs chroniques pathologiques. L’objectif de ce projet est d’étudier l’activation sélective de neurones sensoriels induite par les ultrasons chez la souris in vivo et d'identifier les voies spinales et cérébrales activées par les stimuli ultrasonores. Ce projet devrait permettre d’ouvrir la voie à une nouvelle génération de dispositifs thérapeutiques à ultrasons pour le traitement de la douleur chronique.
Bénéfices attendus
Les douleurs chroniques touchent jusqu'à 20% de la population mondiale, et sont de fait un problème majeur de santé publique. Une sous-population de neurones sensoriels spécialisés dans le toucher ont été identifiés comme de puissants modulateurs de la douleur induite par lésion tissulaire et représentent par conséquent une cible de choix, mais encore inexplorée, pour le traitement de la douleur chronique pathologique. Comprendre les conditions de stimulation par ultrasons in vivo pourra à long terme ouvrir la voie à de nouvelles modalités de thérapies pour les douleurs chroniques, à la fois non invasives et plus efficaces que les traitements par stimulation électrique. D’autre part, le chemin pris par le signal nerveux lors de la stimulation de ces neurones sensoriels du toucher n’a jamais été identifié.
Procédures
Dans une première procédure, 12 souris recevront une injection intrapéritonéale et une injection intradermique de quelques secondes chacune. Dans une deuxième procédure, 72 autres souris recevront une série de 100 stimulations ultrasonores d’une milliseconde maximum chacune, chaque stimulation ciblant une zone de peau distincte des précédentes. Au total, cette procédure durera au maximum 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’injection intradermique peut causer une légère inflammation au niveau du site d'injection. La stimulation ultrasonore peut provoquer une sensation de douleur lors de la phase de réveil de l'anesthésie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car le prélèvement des tissus (ganglions rachidiens et la moelle épinière) est indispensable pour réaliser des études histologiques permettant de confirmer l’activation des neurones sensoriels après la stimulation par ultrasons.
Remplacement
Le recours à l’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour appréhender l’étude du système nerveux sensoriel dans sa globalité, de la stimulation en périphérie au niveau de la peau jusqu’à l’intégration du signal nerveux dans le cerveau.
Réduction
Des études préliminaires in vitro ont permis d’identifier une gamme de paramètres ultrasonores pour la stimulation des neurones sensoriels, réduisant le nombre paramètres à utiliser pour l’étude in vivo et donc le nombre d'animaux. Nous mettons en place une première procédure qui est une étude pilote et qui va permettre de localiser la zone à stimuler par ultrasons lors d'une deuxième procédure, permettant une réduction significative du nombre de souris à tester. Lors de la deuxième procédure, nous réaliserons le plus de marquages possibles sur des mêmes tissus afin de minimiser le nombre de souris nécessaires. Nous ne stimulerons par ultrasons qu’un seul côté de la souris afin que l’autre côté serve de contrôle et qu’il n’y ait pas besoin de souris contrôle supplémentaires. Après application de ces stratégies, les effectifs ont été calculés avec un outil informatique de calcul statistique pour être ramenés au minimum tout en permettant d'avoir un effet significatif.
Raffinement
Pour la première procédure, les souris seront anesthésiées avant l'injection pour éviter le stress et leur température sera maintenue constante avec un tapis chauffant jusqu'à leur réveil. Le protocole prévoit une surveillance quotidienne de leur état de santé par le personnel compétent. Des points limites sont définis pour encadrer la surveillance, s’assurant que toute souffrance excessive est rapidement détectée et prise en compte. En cas de détection d’un signe de détresse, une concertation est menée avec la Structure chargée du Bien-Être des Animaux de l’établissement pour décider de la conduite à tenir (par exemple administration d’un anti-inflammatoire non-stéroïdien). Si un animal atteint un état de souffrance non compatible avec une amélioration rapide, la procédure sera interrompue et l’euthanasie envisagée. Pour la seconde procédure, les expérimentations seront menées intégralement sous anesthésie générale gazeuse pour éviter le stress de l'animal et pour que la stimulation possible de neurones de la douleur ne provoque pas de sensation douloureuse pendant la stimulation ultrasonore. La température corporelle des souris sera maintenue constante avec un tapis chauffant. Après la neurostimulation, les souris seront replacées dans leur cage et leur état de santé sera surveillé par le personnel compétent de la phase de réveil de l’anesthésie jusqu’à l’euthanasie qui aura lieu entre 10 minutes et 2 heures plus tard. D’autres points limites sont définis pour encadrer cette surveillance. En cas de détection d’un état de souffrance non compatible avec la poursuite de la procédure, celle-ci sera interrompue et l’euthanasie envisagée.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, différents tissus impliqués dans l'intégration nociceptive sont parfaitement décrits chez la souris : la peau, les neurones sensoriels et la moelle épinière. Nous utiliserons des individus ayant atteint leur maturité sexuelle et âgés de 8 semaines. A ce stade du développement, le système sensoriel primaire arrive à maturation avant tous les autres, aussi c'est à ce stade que nous avons choisi de réaliser nos expériences.
Traitement de l’encéphalopathie par administration de produits par voie entérale, parentérale ou sous forme de dialyse péritonéale chez le rat BDL
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
Le canal biliaire ligaturé au cours d'une laparotomie de quinze minutes, 760 rats reçoivent ensuite jusqu'à cinquante-six administrations de composés, par gavage, sous la peau, en intraveineuse ou dans le nez, ou quatre séances de dialyse péritonéale suivies de drainages, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués pour l'examen du foie, des reins et du cerveau. Le porteur qualifie le modèle de modéré parce qu'il "ne va pas jusqu'au seuil critique" de l'encéphalopathie hépatique, tout en énumérant des vocalises spontanées, une incapacité à se retourner, une absence de réflexe pupillaire et une pâleur prononcée qui "conduiront à la mort des animaux". Il annonce aussi un volume de liquide de dialyse "beaucoup plus important que celui recommandé", et renonce aux tests comportementaux poussés au profit d'une simple observation de la léthargie et de l'ataxie.
Objectifs
L'encéphalopathie hépatique (EH) est un problème cérébral qui survient à cause d'une maladie du foie, qu'elle soit aiguë ou chronique. Elle peut se manifester par des changements de comportement ou des troubles de l’esprit, allant de symptômes légers à un coma. Cette maladie est sérieuse et peut entraîner des complications graves, nécessitant des soins médicaux importants. Bien que l’on ne comprenne pas encore complètement les causes de l'EH, on sait qu’elle est liée à des substances inflammatoires et toxiques dans le corps, comme l’ammoniaque. L’ammoniaque provient en grande partie du métabolisme des protéines par les bactéries dans l’intestin. Normalement, le foie transforme l’ammoniaque en une autre substance, l’urée, qui est ensuite éliminée par les urines. Mais lorsque le foie ne fonctionne pas bien, il ne peut plus effectuer cette transformation correctement. En plus de la transplantation du foie, il existe des traitements comme le lactulose ou la rifaximine, mais ils peuvent avoir des effets secondaires, et certains patients ne répondent pas bien aux traitements. Ce projet vise à reproduire cette maladie dans différents modèles expérimentaux, afin de tester de nouveaux traitements pour l’encéphalopathie hépatique, quel que soit le mode d’administration (par voie orale, intraveineuse, par injection dans l’abdomen, ou même par dialyse péritonéale).
Bénéfices attendus
La prévalence de l’encéphalopathie hépatique (EH ou HE) clinique concerne 30 à 45 % des patients cirrhotiques avec une incidence de 20 % par an. La prévalence de l’EH minime est plus difficilement estimable mais elle pourrait toucher plus de 2/3 des malades. La prévalence de la cirrhose est d’environ 2000 à 3500 cas par million d’habitants, soit en France 700000 cas avec 10 à 15 000 décès par an. Le passage d’une cirrhose compensée vers une cirrhose décompensée est associé à une diminution de la survie à court terme (3-5 ans). La survenue d’une EH constitue un facteur majeur de mauvais pronostic. En effet, le développement d’un premier épisode d’EH au cours de la cirrhose est un facteur de risque indépendant de mortalité avec un taux de survie cumulée à 1 an et 3 ans de respectivement 42 % et 23 %. Ce projet vise donc à bloquer et reverser le processus qui conduit à la mise en place de l’encéphalopathie hépatique et de lui permettre d’avoir accès à une transplantation hépatique (seul recours actuel à la décompensation hépatique).
Procédures
La chirurgie passe par une laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale avec couverture analgésique pré et post opératoire (durée 15 minutes). Un prélèvement de sang (durée 1 minute) de randomisation sous anesthésie à l'isoflurane (durée 3 minutes).cas de la dialyse : 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes) et 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. Autres types de traitement : au maximum 56 administrations par gavage, en sous-cutanée, en intraveineuse, en intranasale (durée une minute) ou en administration intraveineuse lente (durée 30 minutes). 6 prélèvements de sang intermédiaires (durée 1 minute) sous anesthésie (durée 3 minutes) . Un prélèvement de sang final (durée 1 minute) sous anesthésie (durée 3 minutes).
Impact sur les animaux
Les modèles d’étude ne présentent pas de douleur ou d’inconfort pendant la phase d’induction de la fibrose ou de la cirrhose. Sur cette phase, le seul inconfort serait l’intervention chirurgical associée à la ligature des voies biliaires, celui-ci est géré par l’utilisation préventif d’un analgésique et en curatif pendant les deux jours qui suivent la période post-opératoire. L’encéphalopathie est une pathologie très lourde pouvant conduire au décès du patient. La décompensation « spontanée » peut inéluctablement conduire à la mort. Nous reproduirons ces évènements qui surviennent chez les patients cirrhotiques qui décompensent spontanément. Des signes comme des vocalises spontanées, des difficultés respiratoires, une incapacité à se retourner, une absence de réflexe pupillaire, du larmoiement et une pâleur prononcée conduiront à la mort des animaux et à un réajustement du modèle. Il est cependant à noter que l'administration du liquide de dialyse devra être réalisée par des personnes maitrisant parfaitement le geste (dans les règles de l'art). IL est aussi à noter que dans ce cadre le volume d’administration est beaucoup plus important que celui recommandé. Ce volume a déjà été testé dans une précédente autorisation et n’a entrainé ni douleur ni inconfort.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
Les modèles développés et décrits dans ce projet tentent de reproduire une cascade d’événements conduisant à la défaillance successive de plusieurs organes comme cela se produit chez le patient cirrhotique en phase de décompensation. Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire la globalité ni la chronologie de la progression de la rupture multi organe. Les premières étapes du programme de recherche seront réalisées dans des tests in vitro pour évaluer les activités intéressantes sur des paramètres connus jouant un rôle dans l’évolution de la pathologie étudiée (par exemple l’inflammation, le stress oxydatif, ou la prolifération ou mort cellulaire etc.).
Réduction
Le nombre d’animaux estimé pour chaque procédure tient en compte de l’hétérogénéité associée aux modèles d’induction de la défaillance hépatiques. Cette estimation s’appuie sur nos expériences antérieures durant de nombreuses années du modèle BDL chez le rat et de l’hétérogénéité de variance de nos paramètres d’efficacité (biomarqueurs plasmatiques circulants qui sont assez labiles). A l’aide de ces données, un calcul de puissance et la déduction par le calcul théorique des effectifs est possible. Un test statistique est réalisé pour permettre de définir cet effectif théorique permettant d’atteindre la significativité recherchée. Cette approche statistique permet d’affiner les plans d’expérience pour lesquelles une étude pilote préalable par exemple a permis d’approcher un résultat très proche de la significativité.
Raffinement
L’encéphalopathie hépatique à son stade terminale est une pathologie sévère, qui chez l’humain entraîne de nombreux décès dans un délai de 1 à 3 ans. Notre modèle expérimental ne va pas jusqu’au seuil critique de la pathologie et est donc modéré. Un certain nombre de signes cliniques sans gravité associés à la mise en place de la pathologie seront observés. Sans mettre en place de tests comportementaux poussés, des changements notables seront observés chez les animaux : léthargie, apathie (perte progressive de l’exploration , de la curiosité à l’ouverture de la cage), une diminution de la prise alimentaire (sans risque pour l’état général de l’animal), des altération de la coordination (ataxie). D’autres signes nous conduiront à une plus grande vigilance dans l’observation tels que des crises de tremblements légers ou des spasmes musculaires, des réactions excessives aux stimuli extérieurs, de l’agitation. Ces signes individuellement ne seront pas des critères de mise à mort des animaux, mais nous permettront de juger de l’évolution de la pathologie. Certains signes cliniques comme l’absence de réaction ou des crises de convulsions seront par contre des points limites à nos études. La liste de ces points limites pourra être réajustée au fur et à mesure de nos observations, afin d’éviter toute souffrance non nécessaire à l’établissement des résultats. Les procédures se feront avec un hébergement adapté au bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, tunnel et éléments de nidification). Au cours des procédures, nous appliquerons pendant les périodes qui suivent les prélèvements sanguins, un apport d’aliment gélifié enrichi qui favorise la récupération des animaux suite à l’anesthésie. Une partie des observations étant de nature comportementale, les études requiert l’utilisation d’animaux et ne peuvent être remplacées par des expérience in vitro.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour de développer une encéphalopathie associée à une atteinte hépatique et donc de valider l’efficacité d’un traitement dans cette pathologie. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce Rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Les études seront réalisées sur des jeunes adultes Les traitements induits aux animaux affectent essentiellement la fonction hépatique et produisent des modifications métaboliques. Il est nécessaire de les appliquer sur un organisme développé, qui puisse mettre en place des mécanismes de réparation et de défense. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent (microbiote bien établi) et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer notre modèle expérimental. Les études seront réalisées sur des animaux de 6 semaines (250-275 gr) à l'arrivage afin de permettre une phase d'habituation et d’avoir des animaux d'environs 400g au moment de la chirurgie. Pour les études dont la chirurgie sera faite en externe, nous utiliserons des animaux de 8 semaines (375-400 gr) au moment de la chirurgie.
Chirurgies d’implantations de dispositifs d’administration ou de mesures pour les études de toxicologie et pharmacologie règlementaire.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Chiens : 250
Ouistitis et tamarins : 320
Macaques à longue queue : 225
Anesthésiés puis opérés pendant 30 minutes à 2 heures selon l'espèce, 2 400 rats, 250 chiens, 320 ouistitis et tamarins et 225 macaques à longue queue, des primates, soit 3 195 animaux non-humains, reçoivent un système d'enregistrement de paramètres physiologiques ou un cathéter veineux. Après l'opération, ils restent isolés jusqu'à 24 heures et reçoivent des antidouleurs pendant 2 à 3 jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des risques d'infection, d'inflammation et de douleurs post-opératoires. Les chiens sont inclus dès 6 mois, les ouistitis dès un an, les macaques dès deux ans, et des juvéniles peuvent être opérés, à titre exceptionnel, pour des produits à visée pédiatrique. Une fois implantés, ils sont intégrés à des projets de toxicologie et de pharmacologie précliniques, dans ce que le porteur décrit comme une "utilisation continue des animaux" sur des projets liés à la même question scientifique.
Objectifs
L’objectif du projet est de réaliser des chirurgies d’implantation de système de mesure, d’administration ou de prélèvements de différents paramètres physiologiques, produits d’études ou fluides biologiques. Ces systèmes sont nécessaires à la réalisation d’études de toxicologie et pharmacologie réglementaire suivant les lignes directrice ICH/EMA afin d’évaluer la sécurité, l’efficacité et la toxicité de candidats médicaments ou substances chimiques chez différentes espèces animales avant leur utilisation chez l’humain ou l’animal.
Bénéfices attendus
Ces chirurgies permettent de : - Faciliter et sécuriser le traitement des animaux et donc diminuer leur stress induit par des manipulations invasives répétées. - Faciliter les prélèvements de sang et limiter le nombre de site de prélèvement - Evaluer de manière fiable certains paramètres physiologiques comme la fréquence cardiaque, des bio-potentiels comme l’électroencéphalogramme, des températures comme la température corporelle ou l’activité motrice. - Collecter des données sur la sécurité, l’efficacité et/ou la toxicité, de candidats médicament avant administration chez l’Homme ou chez l’animal.
Procédures
Les animaux se verront implantés par chirurgie un système d'enregistrement des paramètres physiologies et/ou un système de cathétérisation veineuse afin de pouvoir administrer des molécules testés dans le cadre d'essais pré-cliniques de développement de médicaments. La pose de ces implants prends de 30 minutes à 2h, selon l'espèce. Si un prélèvement sanguin est nécessaire, il est fait vigile, en quelques minutes.
Impact sur les animaux
La chirurgie représente un risque de nuisance modérée pour les animaux. Les risques sont une inflammation ou un gonflement des zones de chirurgie, d’infection, de douleurs opératoires et post opératoire. L’isolement post opératoire, bien que limité à 24h maximum, représente aussi une source de stress pour les animaux.
Devenir
Les procédures décrites dans ce projet permettront d'intégrer les animaux dans des projets de toxicologie et pharmacologie pré-cliniques dans le cadre du développement de médicaments. Cette intégration se fait dans le cadre d'une utilisation continue des animaux sur des projets liés à la même question scientifique.
Remplacement
Les chirurgies préparatoires menées dans le cadre de ce projet permettent la réalisation d’études règlementaires évaluant l’efficacité, la sécurité et la toxicité de candidats médicament ou de substances chimiques en vue de leur mise sur le marché. Ces études réglementaires sont des prérequis aux essais cliniques de phase I, II et III et sont réalisées en suivant des guidelines nationales et internationales (ICH/EMA). Selon ces guidelines, ces études doivent être effectuées sur des modèles animaux, il n’est donc pas possible actuellement de remplacer les modèles in vivo par des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Une fois les animaux implantés ils participent à plusieurs études, ce qui permet d’en réduire le nombre nécessaire. De plus, pour les études réglementaires le nombre d’animaux est réduit au minimum pour permettre la détection d’effet indésirables/toxicologique/pharmacologique en accord avec les lignes directrices ICH/EMA.
Raffinement
Afin de réduire les nuisances liées à la chirurgie, un protocole anesthésie/analgésie est avec une prémédication (qui permet de rendre plus rapide et plus stable l’anesthésie et d’apporter une analgésie), une application d’anesthésique locale avant l’incision et générale en fin de chirurgie et une anesthésie générale gazeuse avec inhalation d’isoflurane sont mis en place pour permettre une chirurgie et un réveil rapide et sans douleur. Le suivi post-opératoire sera quotidien, et inclus l’administration d’analgésie injectable et/ou par voie orale systématiquement durant 2 à 3 jours. Des points limites ont été définies afin de mettre en place des actions correctives afin d'éviter tout souffrance.
Choix des espèces
Toutes les espèces retenues pour ce projet sont des espèces reconnues pour leur aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de candidats médicament ou substances chimiques. Les lignes directrices requièrent deux espèces (rongeurs et non rongeurs) selon la nature du produit à tester (molécule chimique de synthèse, peptide, protéine, anticorps monoclonal ou produit de thérapie génique ou cellulaire). Ce projet utilise des rongeurs à partir de 6 semaines, des chiens à partir de 6 mois, des macaques à partir de 2 ans et des marmousets à partir d’un an. Exceptionnellement, ce projet pourra être menées sur des animaux juvéniles pour des produits à visée pédiatrique afin de révéler des effets toxiques dépendant de l’âge (retard de croissance, effet sur la maturation sexuelle, effet toxique lié à l’immaturité de certaines fonctions physiologiques). La ligne directrice suivie est : “guideline on the need for non-clinical testing in juvenile animals of pharmaceuticals for paediatric indications - EMEA/CHMP/SWP/169215/2005”.
Étude de la biologie du parasite responsable du paludisme et développement de vaccins anti-paludéens à l’aide de modèles murins (Modification 2)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes infectées par des parasites du paludisme, et chez certaines une goutte de sang est prélevée au bout de la queue jusqu'à chaque jour pendant 20 jours consécutifs. Le parasite leur est injecté dans le coussinet plantaire, dans la veine ou dans la peau de l'oreille, ou transmis par des piqûres de moustiques infectés. D'autres actes s'ajoutent pour une partie d'entre elles : une ouverture de l'abdomen sous anesthésie pour une imagerie du foie suivie de la mise à mort sans réveil, ou une chirurgie avec réveil pour implanter un anneau en titane dans l'abdomen, retirer la rate ou greffer de la peau humaine. Toutes sont tuées avant la phase symptomatique, et le travail porte d'abord sur les interactions entre parasite et hôte, le vaccin préérythrocytaire restant ce que le porteur désigne comme son "but ultime".
Objectifs
L’ajout de 204 animaux nécessite une 2eme demande de modification. Notre but majeur est la compréhension fonctionnelle des interactions parasite-hôte qui surviennent lors de cette phase initiale de l’infection palustre dans le but ultime de développer un vaccin anti-paludique pré-érythrocytaire. A cet effet, nous utilisons une combinaison d’outils de génétique moléculaire, de biologie cellulaire et d’imagerie intra-vitale afin de comprendre comment l’animal est infecté et comment il monte une réponse immunitaire protectrice contre le parasite. Tous ces sujets doivent être abordés in vivo, en utilisant l'expérimentation animale, car la complexité de l'infection et de l'immunité ne peut être reproduite in vitro. Par conséquent, en utilisant principalement P.berghei et P.yoelii dans un modèle murin de paludisme, notre travail se décline selon trois axes majeurs : 1. Imagerie fonctionnelle de la phase pré-érythrocytaire de l’infection. 2. Compréhension de la mise en place de la protection contre la phase pré-érythrocytaire 3. Développement préclinique d'un vaccin pré-érythrocytaire contre le paludisme.
Bénéfices attendus
Dans ce projet nous espérons (i) mieux comprendre les premières étapes de l’infection en utilisant des approches de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que la microscopie intra-vitale pour identifier les composants essentiels du parasite susceptibles de constituer des cibles pour de nouveaux médicaments et vaccins, (ii) mieux comprendre comment une immunité protectrice contre le parasite peut se développer et identifier de nouvelles cibles vaccinales, et (iii) développer pré-cliniquement un vaccin plus efficace contre le paludisme.
Procédures
Afin d’identifier et d’évaluer l’activité protectrice de nouvelles cibles vaccinales ou de nouvelles approches vaccinales et d’élucider leur mécanisme d’action, les souris impliquées dans cette procédure expérimentale pourront être soumises à des injections sous-cutanées (15 sec), intrapéritonéales (15 sec), intramusculaires (15 sec) ou intraveineuses (30 sec) ainsi qu’à des prélèvements sanguins et un ou plusieurs challenges infectieux par des parasites de Plasmodium. Bien que susceptibles d’être répétées, ces manipulations sont toutes considérées de sévérité légère et seront, de plus, suffisamment espacées dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux. Pour infecter les souris vigiles, le parasite sera micro-injecté dans le coussinet plantaire (15 sec) ou par la voie intraveineuse (30 sec). Les souris anesthésiées seront infectées par micro-injection dans la peau du pavillon auriculaire (15 sec) ou par des piqûres de moustiques infectés. Après infection, la parasitémie des animaux est contrôlée par frottis sanguins ou cytométrie en flux, à partir d’une goutte de sang prélevée à l’extrémité de la queue (30 sec). Pendant la phase de croissance exponentielle du parasite, qui se produit normalement entre le 3ème et le 6ème jour post-infection. Alternativement, l’infection hépatique sera mesurée de manière non invasive dans le foie disséqué. Des souris anesthésiées seront soumises à un acte chirurgical sans réveil (20 min) pour réaliser l’imagerie à court terme dans le foie ou la rate. Des souris anesthésiées et analgésiées seront soumises à un acte chirurgical avec réveil pour l’implantation abdominale d’un anneau en titane (imagerie longitudinale – foie, rate) (45 min), pour une splenectomie (45 min), ou pour la greffe de la peau humaine (30 min) (imagerie longitudinale de Plasmodium falciparum – peau).
Impact sur les animaux
Le rongeur vigile pourra souffrir de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, intraveineuse), par la micro-injection dans la peau, ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue, au menton ou à la joue. Bien que susceptibles d’être répétés, les prélèvements seront suffisamment espacés dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux : les prélèvements de sang au niveau d’un même site (joue, menton, veine caudale) seront espacés au minimum d’une semaine et les prélèvements d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue pourront être répétés au plus quotidiennement pendant 20 jours consécutifs mais en aucun cas le volume prélevé n’excèdera le maximum par période glissante de 7 jours. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort avant l'apparition des symptômes du paludisme expérimental. Le rongeur anesthésié pourra être exposé à des injections intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, ou intraveineuse, ainsi que à de micro-injection dans la peau et à de piqûre des moustiques. Toutes ces procédures sont classifiées comme étant de sévérité légère. Pour l’imagerie intravitale du foie à court terme sans réveil, la souris anesthésiée sera soumise à une laparotomie avant la séance d’imagerie. Pendant la séance d'imagerie la souris sera maintenue constamment anesthésiée jusqu'à sa mise à mort à la fin de l'expérience. Pour l’imagerie intravitale à long terme du foie, de la rate, ou de la peau humaine greffée, l'intervention chirurgicale pour l'implantation d'un anneau d'imagerie ou de la greffe sera réalisée sur des souris anesthésiées. Des analgésiques seront utilisés pendant l’opération et les soins post-opératoires. Pendant la séance d'imagerie les souris seront maintenues constamment anesthésiées. Les procédures impliquant un acte chirurgical avec réveil sont classifiées comme étant de sévérité modérée.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans les procédures expérimentales seront infectées par des parasites type Plasmodium. Il ne sera donc pas possible de les maintenir en vie ou les reutiliser. Les souris seront mises à mort avant la phase symptomatique du paludisme. Seulement méthodes de mis à mort validées par le comité etique seront utilisées.
Remplacement
Les processus conduisant à l'infection de l'hôte par les différents stades parasitaires ou à la protection de l'hôte contre ces stades par le biais de la vaccination sont extrêmement complexes. Dans la phase initiale de l’infection, ils impliquent des interactions multiples et dynamiques entre le parasite et plusieurs types cellulaires dans la peau, les ganglions, les vaisseaux, le sang, la rate et le foie, qu'il est impossible de répliquer dans leur ensemble dans un système in vitro. L’étude approfondie de cette phase nécessite donc l’utilisation de modèles animaux pour appréhender cette incroyable complexité. Depuis les années 1950, les espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, P. berghei et P. yoelii, sont devenues les espèces de choix pour étudier cette phase, et ont notamment permis la découverte des candidats vaccins les plus importants contre le paludisme. Pour évaluer les activités cellulaires des sporozoïtes (motilité, traversée cellulaire, infection cellulaire), et les effets neutralisants des effecteurs immunitaires ou antipaludiques, les expériences seront effectuées in vitro. Malheureusement, certains effets observés in vitro ne correspondent pas à ce qui est observé in vivo, nous obligeant à valider les résultats obtenus in vitro dans des modèles expérimentaux animaux.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum possible d’animaux pour nos expériences calculé à l'aide du logiciel SHADE qui compare deux moyennes de groupes non jumelés à l'aide d'un test bilatéral paramétrique, en tenant compte des données expérimentales. Pour l’analyse statistique de nos expériences, nous appliquerons un test ajusté pour comparaison multiple. Nous normaliserons les tests statistiques sur un effet "répétition/cage" grâce à l'utilisation de modèles mixtes. Également, nous rechercherons toujours à réduire ce nombre en améliorant les procédures, par exemple, en développant des méthodes d'imagerie intravitale non invasive pour diminuer le nombre de souris utilisées dans les études longitudinales.
Raffinement
Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés. Les souris auxquelles sont inoculées les espèces de Plasmodium adaptées aux rongeurs de laboratoire sont suivies quotidiennement durant la phase sanguine de l’infection afin de déterminer leur niveau de parasitémie. Les animaux sont mis à mort avant que n’émergent des symptômes signant des dommages systémiques – prostration, aspect du pelage, perte de poids - et témoignant du développement asexué non contrôlé du parasite dans le sang. Il est important de souligner que la phase de l’infection que nous analysons est asymptomatique, et que lorsque les procédures expérimentales nécessitent d’atteindre la phase érythrocytaire de l’infection, les animaux sont sacrifiés avant la survenue de symptômes ou complications létales- neuropaludisme, anémie prolongée. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses sont gérées par l'utilisation d’anesthésiques et antalgiques.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei et P. yoelii sont des espèces de rongeurs sauvages (Grammomys, Thamnomys) d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’Homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou informer la recherche chez l’Homme n’est plus à faire. Nous privilégions l’utilisation de souris dans nos études car la plupart des concepts issus des modèles souris, en particulier dans le domaine de la vaccinologie anti-palustre, se sont révélés exacts chez l’Homme. De plus, la disponibilité de diverses souris transgéniques rend cette espèce adaptée aux études fonctionnelles des voies impliquées dans l'infection et la protection de l'hôte. Les inoculations de parasites aux souris seront réalisées sur de jeunes adultes de 4 semaines car ils ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l’infection par le parasite. Les expériences d’imagerie in vivo seront réalisées sur des souris de 4-12 semaines. Les expériences sur les réponses immunitaires seront réalisées sur des souris adultes immunocompétentes âgées de plus de 6 semaines.
Impact environnemental et sanitaire d’une exposition à des nanoparticules chez la grenouille Xenopus laevis
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Issus de l'élevage interne du laboratoire, dix couples de xénopes adultes reçoivent chacun deux injections hormonales dans les sacs lymphatiques pour déclencher la ponte, puis retournent aux aquariums quatre mois au moins avant d'être réutilisés, jusqu'à trois fois par an. Leur descendance fournit les 11 938 œufs, larves et juvéniles exposés pendant quatre jours à deux mois à des graphènes et à des nanopesticides au cuivre, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce mettre "à l'étude" la culture d'organoïdes pour remplacer un jour ces animaux. Les vingt adultes sont les seuls à rester en vie, les larves et les juvéniles n'étant pas réveillés, un même individu servant à mesurer la toxicité sur plusieurs organes.
Objectifs
L'augmentation rapide de l'utilisation des nanoparticules dans divers domaines industriels et technologiques soulève des questions sur leur impact environnemental, notamment sur les écosystèmes aquatiques. Ce projet explore les interactions environnementales et les risques associés à deux types de nanoparticules : les graphènes et les nanopesticides à base de cuivre. Les graphènes, grâce à leurs propriétés exceptionnelles comme la conductivité électrique et la résistance mécanique, sont de plus en plus utilisés. Cependant, leur interaction avec les organismes aquatiques peut induire des effets toxiques, perturbant la survie, la croissance et la reproduction de ces organismes. Les nanopesticides à base de cuivre, innovants en agriculture, augmentent l'efficacité des pesticides tout en réduisant les doses nécessaires. Toutefois, le cuivre, toxique à haute concentration, peut exacerber ses effets toxiques. Les nanoparticules de cuivre peuvent s'accumuler dans les sédiments, perturbant les communautés microbiennes et les cycles biogéochimiques, nécessitant une évaluation rigoureuse de leur écotoxicité et de leur comportement environnemental.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la réalisation du projet sont de déterminer les impacts sur la société et l'économie, en invitant les industriels, gestionnaires et consommateurs à protéger l'environnement des rejets de contaminants émergeants tels que les nanoparticules, avec la prise en compte du concept « une seule santé » résumant l'idée que la santé humaine et la santé animale sont interdépendantes et liées à la santé des écosystèmes dans lesquels l'homme et l'animal co-évoluent. Selon les résultats obtenus dans le présent projet, des préconisations d'emploi des graphène et nanopesticides pourront être données par le biais d'une approche "Sécurité dès la conception" et pourraient permettre de faire avancer la réglementation en matière de nanoparticules et notamment auprès des industriels et des consommateurs. D'un point de vue de l'évaluation réglementaire des risques au sein des agences françaises et internationales, des prérogatives pourront également être apportées pour mettre à jour ces recommandations "nano" dans le cadre de la mise en place des essais d'évaluation de la toxicité.
Procédures
Les animaux adultes sont soumis à une injection hormonale (adultes). L'injection hormonale chez un adulte dure de quelques secondes à quelques minutes en prenant en compte la prise en main. Il y a 10 couples et 2 injections par animal (dans les 2 sacs lymphatiques) donc 20 injections chez les mâles et autant chez les femelles. Tous les autres animaux, œufs, larves ou juvéniles de 3-6 mois, seront exposés par groupe aux différents graphènes et nanopesticides pour une gamme de concentration et à différents temps de traitement : cela représente 1320 larves (procédure 2 ; durée 12 jours), 3520 larves (procédure 3 ; durée 21 jours), 1350 larves (procédure 4 ; durée 12 jours), 4500 œufs (procédure 5 ; durée 2 mois), 750 larves (procédure 6 ; durée 4 jours), 498 juvéniles (procédure 7 ; durée 12 jours).
Impact sur les animaux
Chez l'adulte, les nuisances ou effets indésirables peuvent être le stress liée à leur capture dans la paume de la main de l'expérimentateur au moment de l'injection hormonale et l'injection elle-même (nuisances légères). Chez les larves, les nuisances ou effets indésirables, sont liées au stress potentiel lors de leur capture pour réaliser les différents lots et la durée de leur exposition (quelques jours à 21 jours) en présence de nanoparticules et nanocomposites. Les procédures sont effectuées sur larves euthanasiées. S'agissant d'une évaluation du risque des nanoparticules et nanocomposites, seuls les résultats des analyses des biomarqueurs étudiés chez ces animaux exposés pourront renseigner des effets potentiels avérés, à l'issu du projet (possiblement, les nanoparticules et nanocomposites induiront des effets sur les marqueurs physiologiques, génétiques et sur le microbiote intestinal). Afin de réduire le nombre d’adultes xénopes, les expérimentations seront regroupées autant que possible sur les individus issus d'une même ponte. De plus, pour réduire le nombre de têtards, les conditions témoins seront mises en commun dans la mesure du possible. Des essais de toxicité chez les invertébrés daphnies (ou limnées) permettront de définir les gammes de concentrations à utiliser lors des expositions des larves de xénopes, en visant des concentrations subléthales pour éviter toute mortalité aigüe des têtards. Les concentrations environnementales auxquelles nous travaillerons étant qualifiées de faibles, aucune toxicité aiguë particulière n'est attendue.
Devenir
Les adultes reproducteurs sont réintégrés à l'élevage et se reposent au moins 4 mois avant d'être réutilisés pour réaliser une nouvelle fécondation. Les larves et les juvéniles ne sont pas réveillés car pour réduire le nombre d'animaux, on utilise le même animal pour étudier la toxicité sur les organes.
Remplacement
L’objectif de notre projet est d’analyser les effets toxiques des nanoparticules et nanocomposites au cours du développement et sur l’axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien. A l’heure actuelle, il n'existe pas d'approche alternative permettant le remplacement du modèle animal dans notre contexte expérimental. Les gammes de concentration utilisées pour chaque procédure chez le xénope seront préalablement établies par des tests de toxicité des nanoparticules et des nanocomposites réalisés chez la daphnie et/ou la limnée (un crustacé et un mollusque). Parallèlement, la faisabilité de la culture d’organoïdes pour tester l’effet des composés (nanoparticules et nanocomposites) sera mise à l’étude dans le but de remplacer l’utilisation des animaux dans le futur.
Réduction
Les reproducteurs utilisés proviennent d'un élevage interne et les larves issues des pontes seront utilisées dans différentes procédures ==> Pas d'importations supplémentaires de nouveaux géniteurs d'où une réduction du nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'individus utilisés dans chaque procédure est calculé selon un minimum requis pour pouvoir conclure statistiquement sur de potentiels effets délétères, avec des tests statistiques permettant d’étudier les données, leur cohérence et les différences entre les conditions expérimentales. Au cours des expositions des larves, les lots d’animaux témoins seront mutualisés autant que possible pour l’analyse des résultats obtenus avec les différentes nanoparticules testées. Enfin, seules les concentrations sans toxicité aiguë obtenues seront mises en œuvre grâce aux résultats des essais sur invertébrés daphnies et/ou limnées qui permettent donc également une réduction du nombre de xénope.
Raffinement
Les reproducteurs qui sont injectés en vue de la reproduction servent au maximum 3 fois par an (période de récupération > 4 mois). Le laboratoire dispose de son propre élevage, ce qui rend la gestion de reproduction très facile et donc limite le stress aux animaux (une seule et même personne réalise les injections et réalise la maintenance des xénopes du stade œuf au stade juvénile). Dans le but de réduire le stress des reproducteurs, les conditions d'élevage ont été raffinées. Des refuges aquatiques de type tuyau de cachette en céramique ont été installés depuis de nombreuses années au sein de chaque aquarium. Plusieurs mesures seront également prises pour minimiser les souffrances et douleurs aux larves et juvéniles : les milieux d'exposition seront renouvelés pour éviter une désoxygénation trop importante ainsi que toute accumulation de déchets azotés toxiques (nitrates, nitrites, ammoniaque), des filtres en ouate sont intégrés à chaque aquarium et renouvelés régulièrement pour limiter la toxicité potentielle des composés azotés formés.
Choix des espèces
Les larves et juvéniles de grenouilles xénope sont particulièrement pertinents pour les études écotoxicologiques pour plusieurs raisons. Premièrement, le xénope est un modèle bien établi en écotoxicologie en raison de sa sensibilité aux polluants et à divers stress environnementaux. Les amphibiens aquatiques, comme les larves de xénope, ont une peau perméable fine et très vascularisée, ce qui les rend particulièrement vulnérables aux contaminants présents dans les milieux aquatiques. De plus, leur développement relativement rapide et bien caractérisé permet de détecter les effets toxiques à différents stades de leur croissance. Les juvéniles, quant à eux, offrent une opportunité d’étudier les effets à plus long terme des contaminants, incluant des impacts potentiels sur la survie, la croissance et la reproduction. Ils sont utilisés ici en raison de leur mode d’alimentation (carnivore, alors que la larve est herbivore) qui permet d’étudier les effets trophiques d’une contamination. Enfin, les xénopes sont faciles à élever en laboratoire, permettant des études contrôlées et reproductibles. Leur élevage est parfaitement codifié. Le xénope est pertinent dans le cadre de notre projet car il possède un taux d'éclosion élevé, une disponibilité tout au long de l'année après un traitement hormonal des reproducteurs, un développement embryonnaire puis larvaire rapide et l'alimentation des larves est facile. Ces caractéristiques font des larves et juvéniles de xénope des modèles idéaux pour évaluer les effets écotoxicologiques des nanoparticules et autres contaminants dans les environnements aquatiques. Les reproducteurs xénopes seront utilisés au stade adulte, sexuellement mâtures tel que le nécessite la reproduction. Les larves sont utilisées 2 à 3 semaines après l'éclosion pour la plupart d'entre eux et d'autres au stade oeuf (48 h après l'injection). Les juvéniles seront âgés de 3 à 6 mois. Les larves sont utilisées à ces stades précis pour différentes raisons : les stades larvaires sont particulièrement sensibles à la présence de polluants, car directement exposés à l'environnement aquatique via l’alimentation par apport d’eau et via les branchies et la peau, ces stades larvaires 50-51 sont facilement repérables car ils correspondent à l'apparition du bourgeon de la patte postérieure et l'anesthésie n'est pas nécessaire pour le visualiser.
Augmenter la diffusion des molécules thérapeutiques dans les tumeurs cérébrales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Jusqu'à vingt et une injections par animal et une opération de quinze minutes : 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour des analyses post-mortem. L'objet est d'ouvrir temporairement la barrière hémato-encéphalique pour faire entrer davantage de médicaments dans les glioblastomes, décrits comme les tumeurs cérébrales les plus agressives. Sur ce que subissent les souris, le porteur s'en tient à des "douleurs légères et de courte durée" liées aux injections et à des "nuisances et douleurs liées à la présence de tumeurs cérébrales". Ni le mode d'implantation des tumeurs ni la répartition des 880 souris entre les procédures ne sont précisés.
Objectifs
Les glioblastomes sont les tumeurs cérébrales les plus agressives. La faible diffusion des médicaments au travers de la barrière hémato-encéphalique limite fortement leurs efficacités. Ainsi, le développement de stratégies thérapeutiques sur-mesure conçues pour augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique constitue un besoin clinique majeur. Des travaux ont mis en évidence le rôle de protéines impliquées dans l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Une molécule ciblant ces protéines a été développée et induit une ouverture transitoire de la barrière hémato-encéphalique. Cette molécule peut être utilisée pour augmenter la diffusion et l’efficacité des médicaments contre les tumeurs cérébrales.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus au cours de ce projet permettront de mieux comprendre les processus d’administration et de diffusion des molécules thérapeutiques dans les tumeurs cérébrales, ainsi que d’augmenter leurs efficacités
Procédures
Maximum de 21 injections (< 1 minute par injection) par souris, avec un intervalle entre deux injections allant de 24h à 72h en fonction des traitements. Maximum de 1 procédure chirurgicale par souris (15minutes).
Impact sur les animaux
Douleurs légères et de courte durées liées aux injections intrapéritonéales ou intraveineuses. Nuisances et douleurs liées à la présence de tumeurs cérébrales
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.
Remplacement
Des études préliminaires in vitro de perméabilité sur cellules endothéliales cérébrales ont été réalisées. Cependant, la complexité de la barrière hémato-encéphalique ne peut pas être entièrement répliquée in vitro. Cette complexité se retrouve conservée entre humains et souris, faisant de la souris un modèle nécessaire pour cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. La taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats a été déterminée à partir de données collectées au cours d’expériences précédentes, ainsi que par utilisation de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Pour éviter le stress et la douleur, les injections seront réalisées sous anesthésie générale associée en amont à une analgésie. Nous avons mis en place des points limites adaptés à chaque procédure.
Choix des espèces
La souris est un modèle nécessaire pour cette étude de part : 1- La complexité de la barrière hémato-encéphalique qui ne peut pas être entièrement répliquée in vitro, mais qui est conservé entre humain et souris 2- L’existence de modèles de souris génétiquement modifiées avec une barrière hémato-encéphalique perméable ou imperméable. Des souris adultes entre 2 et 8 mois seront utilisées pour l’étude des effets de la barrière hémato-encéphalique sur la diffusion et l’efficacité́ des molécules thérapeutiques visant les tumeurs cérébrales.
Evaluation de biocompatibilité et d’efficacité biomécanique d’implants en titane chez le lapin
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Améliorer les implants dentaires et les prothèses de hanche pour l'industrie médicale : 60 lapins néo-zélandais blancs mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun reçoit jusqu'à quatre implants en titane vissés dans ses deux fémurs et ses deux tibias au cours d'une chirurgie d'une heure, puis trois administrations de marqueurs fluorescents sur animal conscient. Le porteur indique que la douleur postopératoire peut être aiguë ou chronique, que la mobilité réduite empêche les lapins de se toiletter pendant deux à trois jours, et qu'une fracture osseuse ou une luxation du genou reste possible. Il présente le lapin comme le "gold standard" de la recherche sur les implants osseux et annonce un transfert des connaissances vers l'industrie médicale.
Objectifs
Ce projet vise à réduire les problèmes liés aux implants métalliques utilisés dans les os, comme les implants dentaires ou les prothèses de hanche. Ces implants servent à remplacer une articulation, combler des pertes osseuses ou stabiliser des fractures. Actuellement, les échecs d'implants sont encore trop fréquents et difficiles à prévoir. Ces échecs nécessitent des opérations supplémentaires qui présentent des risques, causent de la douleur et entraînent des coûts importants. Premier objectif : Améliorer les implants. Il est important de travailler sur l'amélioration de la surface du titane (un métal compatible avec le corps) pour que les implants s'intègrent mieux dans l'os. Les implants actuels présentent certaines limites qui doivent être surmontées. Deux modifications de la surface des implants sont étudiées : • L'ajout de polymères qui réduisent le risque d'infection • Un revêtement en diamant pour augmenter la durée de vie des implants. Avant d'utiliser ces implants chez les humains, leur efficacité doit être confirmée. Deuxième objectif : Mieux comprendre la régénération osseuse. Aujourd'hui, il n'est pas possible de reproduire par ordinateur la façon exacte dont l'os interagit avec l'implant. Pour concevoir de meilleurs implants, nous devons étudier comment ils se comportent dans des conditions réelles. En développant des modèles informatiques il est possible d’identifier les facteurs qui déterminent le succès d'un implant. Pour vérifier que ces modèles sont corrects, il est nécessaire d’avoir des données expérimentales fiables.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer les connaissances sur le comportement des implants en titane dans l'os et à produire des bénéfices pour les patients, les hôpitaux, l'industrie médicale et les services publics. Trois avancées principales sont attendues: 1. Faire progresser la recherche fondamentale en implantologie osseuse. En tant que chercheurs, il est important de comprendre pourquoi certains implants en titane s'intègrent bien dans l'os et d'autres non. À court terme, ce projet permettra d'identifier les facteurs qui déterminent le succès d'un implant, comme le contact avec l'os et la résistance à l'arrachement. À moyen terme, ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des cellules osseuses dans la zone autour de l'implant et l'importance de certaines protéines, ainsi que l’évolution des propriétés mécaniques pendant que l'os se remodèle autour de l'implant. À long terme, cette recherche pourrait permettre de développer des méthodes qui réduisent le besoin de tests sur les animaux, et les connaissances seront transférées vers l'industrie médicale. 2. Améliorer la conception et les performances des implants. Ce projet va tester deux nouveaux types d'implants avec des avantages précis : créer des implants qui durent plus longtemps, ce qui réduit le besoin de les remplacer et améliorer les propriétés qui combattent les bactéries pour diminuer le risque d'infection autour de l'implant. Ces améliorations auront des effets positifs pour les patients - moins d'opérations supplémentaires seront nécessaires - et également le système de santé - les coûts des soins médicaux seront réduits. À long terme, ce projet permettra de transférer les découvertes vers les entreprises qui fabriquent des implants médicaux. Cela encouragera l'innovation dans la conception des implants et dans les méthodes de fabrication. 3. Développer des outils pour aider les chirurgiens. À court terme, les résultats de ce projet pemettront de fournir aux chirurgiens des informations précises pour choisir les implants les plus adaptés à chaque situation. À moyen terme, ces travaux aideront au développement de techniques pour suivre l'intégration des implants, comme l'échographie qui permet d'évaluer la stabilité de l'implant. À long terme, ces avancées devraient contribuer à réduire les dépenses de santé publique liées aux complications des implants.
Procédures
Implantation de max 4 implants dans les 2 fémurs et les 2 tibias sous anesthésie générale et locale une fois, durée 60 min. Administation de marqueurs flurorescents sur animal vigile, 3 fois (à 2 semaines puis 4 semaines d’intervalle), durée 3 min à chaque fois.
Impact sur les animaux
Les potentielles nuisances associées à cette procédure sont les suivantes : Concernant l'alimentation, les animaux peuvent présenter une diminution d'appétit due à la douleur, au stress généralement limitée au 24h post-chirurgie. La mobilité peut également être réduite limitant l'accès à la nourriture et à l'eau. Cette mobilité réduite peut également limiter la capacité des lapins à se toiletter correctement, notamment les membres postérieurs dans les 2-3 jours post-chirurgie. En termes de confort, les lapins peuvent ressentir des douleurs post-opératoires aiguës ou chroniques. Une infection de la plaie, une fracture osseuse ou une luxation articulaire au niveau du genou restent possibles bien que rares. Enfin, les manipulations, les interventions pré et post-opératoires, l'anesthésie et le réveil peuvent provoquer de l'anxiété, du stress ou de la peur de façon transitoire chez les animaux.
Devenir
Afin de caractériser la cicatrisation osseuse, la mise à mort de l'ensemble des animaux du projet est nécessaire afin de prélever les os et les implants impliqués.
Remplacement
Cette recherche sur les implants médicaux accorde une priorité à la limitation du nombre d'animaux utilisés et à la réduction de leur souffrance en privilégiant les méthodes alternatives disponibles. Toutefois, certains aspects essentiels de la recherche sur les biomatériaux nécessitent encore le recours à des modèles animaux pour garantir la sécurité et l'efficacité des dispositifs développés. En amont de l’expérimentation animale des tests in vitro sont systématiquement réalisés, incluant la caractérisation physico-chimique des implants, des cultures cellulaires pour évaluer la cytotoxicité et des tests de biocompatibilité avec des cellules osseuses. Cependant, ces méthodes ne peuvent reproduire la complexité des interactions biologiques d'un organisme vivant comme la réponse immunitaire ou les processus d'intégration tissulaire. Des modèles numériques prédictifs du remodelage osseux et des propriétés mécaniques sont également développés, mais leur validation nécessite des données biologiques fiables. Les tests sur os isolés s'avèrent inadaptés car ils ne permettent pas d'observer le remodelage du tissu osseux vivant, essentiel à l’évaluation des implants. Pour les analyses biomécaniques, les échantillons synthétiques sont privilégiés, mais la cicatrisation et la formation osseuse autour de l'implant ne peuvent être fidèlement répliquées en laboratoire. Enfin, bien que prometteuses, les technologies émergentes comme les organes sur puce ou les bioréacteurs ne sont pas encore applicables à l'interface os-implant à cette échelle, même si de nombreuses recherches sont actuellement en cours pour développer ces alternatives.
Réduction
Cette étude sur les implants osseux met en œuvre plusieurs stratégies pour réduire significativement le nombre d'animaux utilisés tout en préservant la rigueur scientifique. Des études pilotes ex vivo ont permis d'affiner la sélection de revêtements de surface avant les tests in vivo. Des études pilotes in vivo réalisées précédemment ont confirmé la biocompatibilité de l’approche de greffage de polymère sur un nombre d’animaux restreint. Le protocole expérimental a été optimisé pour réduire le nombre d'animaux nécessaire, notamment en utilisant des implants de petite taille permettant de tester plusieurs conditions sur le même animal. Chaque lapin recevra plusieurs implants, avec à la fois des implants contrôles et des implants modifiés, ce qui renforce la puissance statistique. Enfin, les protocoles d'analyse des échantillons explantés sont conçus pour maximiser les informations obtenues à partir d'un même échantillon, permettant de corréler plusieurs propriétés biomécaniques sans nécessiter d'essais supplémentaires.
Raffinement
La procédure chirurgicale d’insertion d’implants osseux chez le lapin intègre plusieurs mesures pour assurer le bien-être animal et limiter la douleur. Pendant les interventions, les lapins sont installés sur des matelas chauffants pour maintenir leur température corporelle. Les protocoles d'anesthésie et d'analgésie sont spécifiquement adaptés à cette espèce animale pour une gestion optimale de la douleur. En période post-opératoire, le suivi bi-quotidien de chaque animal permet d’adapter les mesures de prise en charge de la douleur grâce à une échelle de douleur adaptée au lapin, attribuant un score pour chaque animal. Des points limites spécifiques au projet sont définis et appliqués pour garantir que les animaux ne souffrent pas.
Choix des espèces
Le lapin Néo-Zélandais blanc mâle, jeune adulte représente le "gold standard" pour la recherche sur les implants osseux. Anatomiquement, son fémur et son tibia offrent des dimensions adaptées aux implants testés, avec une architecture osseuse similaire à celle de l'humain. Son métabolisme osseux est 3-4 fois plus rapide que chez l'humain, permettant d'observer l'intégration complète en quelques semaines. À ce stade de développement, la maturité squelettique est atteinte, offrant un équilibre optimal entre formation et résorption osseuse.
Rôle des folates dans les modifications de l’expression génique dans un modèle de souris avec hépatocarcinome
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Parce que ce modèle "garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie", 90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès les premiers jours de vie, chaque souriceau est séparé de sa mère et reçoit une injection d'antibiotique sous la peau, puis, à partir de la quatrième semaine, un régime riche en graisses plus ou moins chargé en vitamine B9. Toutes sont tuées après six ou quatorze semaines pour prélever leur foie. Le porteur écrit que ce régime, qui fait passer les souris d'un foie gras à un cancer du foie, se déroule "sans douleur".
Objectifs
La maladie dite du « foie gras » peut évoluer en cancer du foie, une des principales causes de décès par cancer dans le monde. Un manque en vitamine B9 pourrait favoriser le développement de cette maladie et le cancer du foie. Cependant, son rôle exact n’est pas encore clair et les mécanismes impliqués ne sont pas bien compris. Le but du projet est donc de voir si la vitamine B9 peut influencer cette maladie et le cancer, et par quels mécanismes. Pour répondre à ces questions et étudier l’évolution de la maladie du « foie gras » en cancer, il n’est pas possible d’utiliser de cellules en culture. Par contre, des souris nourries avec un régime gras et traitées avec un antibiotique spécifique développent la maladie comme chez l’humain : d’abord une accumulation de graisse, puis une inflammation et des cicatrices, et enfin un cancer du foie. Pour déterminer si la vitamine B9 joue un rôle dans cette évolution, ces souris recevront soit une quantité insuffisante, soit une quantité excessive de cette vitamine. On pourra ainsi étudier quels sont les mécanismes mis en jeu et qui sont influencés par la présence ou l’absence de vitamine B9.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à comprendre comment le cancer du foie se développe lorsque l’alimentation est riche en gras, et comment un manque ou trop de vitamine B9 peut y contribuer. Nous espérons pouvoir identifier de nouveaux mécanismes de régulation de l’expression des gènes liés au cancer et donc mieux comprendre comment l’expression de certains gènes est mal régulée lors du développement du cancer du foie. Nous pourrons aussi savoir si cette vitamine peut protéger ou aggraver la maladie, ce qui aidera à proposer des conseils alimentaires pour les personnes à risque (comme celles atteintes de la maladie du « foie gras »). A plus long terme, les résultats pourraient contribuer à la découverte de nouveaux outils pour diagnostiquer ou traiter ce cancer.
Procédures
Les interventions seront effectuées sur les 90 souris : • Injection d'un antibiotique rapidement après la naissance, durant quelques minutes • Isolement de la mère pendant quelques minutes • Alimentation avec un régime riche en graisses avec une quantité normale, faible ou forte en vitamine B9 à partir de la 4 ème semaine jusqu'à la mise à mort de l'animal (après 6 semaines ou 14 semaines selon le groupe).
Impact sur les animaux
- Douleur liée à l’injection sous-cutanée de l'antibiotique. - Stress lié à la séparation du souriceau de la mère. - Une alimentation enrichie en graisses favorise la progression de la maladie du foie gras vers un cancer du foie dès la semaine 16, un processus potentiellement influencé par un manque de vitamine B9 ou par son enrichissement dans le régime alimentaire.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude. Le foie sera récupéré, afin d’étudier les mécanismes qui régulent l’expression des gènes.
Remplacement
Nous avons mené des études préliminaires sur des cellules de cancer du foie, cultivées avec ou sans vitamine B9. Nous avons trouvé que l’expression de certains gènes était modifiée quand il n’y avait pas de vitamine B9. Par contre, nous ne pouvons pas étudier avec ces cellules le développement de la maladie, tel qu’il se produit chez l’humain, avec la progression d'un foie gras vers le cancer. Seul le modèle animal permet de l'étudier.
Réduction
Pour cette étude, nous allons travailler avec 9 groupes de souris, en testant 3 types d’apport en vitamine B9 (normal, avec peu de B9, avec beaucoup de B9) à différents moments (3). Pour garantir des résultats fiables, nous avons calculé à l’aide de tests statistiques qu’il nous faut 10 souris par groupe, soit 90 au total.
Raffinement
À leur arrivée, les souris auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement avant de commencer les accouplements. Elles seront hébergées dans une animalerie répondant à tous leurs besoins (température, humidité, air filtré) et installées dans des cages ventilées avec des matériaux pour construire des nids. Les nouveau-nés recevront une injection unique d’antibiotique, réalisée par un expert, sans anesthésie car elle est rapide et peu invasive. Pour tout signe d'abandon ou d'isolement de plus d'une journée, l'animal sera placé avec une autre mère pour adoption. Si l'isolement persiste avec la nouvelle mère, l'animal sera mis à mort. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur bien-être, avec un suivi précis de leur état de santé et des pesées régulières. Après le sevrage, les souris seront nourries avec un régime riche en graisses qui provoque une progression de la maladie vers le cancer du foie, sans douleur. Elles seront regroupées par cinq dans des cages enrichies avec des objets pour jouer, se cacher, ronger et explorer, comme des tunnels, des dômes, et des bûchettes non toxiques. Tout est pensé pour leur assurer le meilleur confort possible. Si des signes de souffrance sont détectés et persistants, ou qu'une perte de poids trop importante est notée, les animaux souffrants seront mis à mort.
Choix des espèces
Les principaux modèles de maladie du foie gras ont été validés à l’échelle internationale sur des souris ou des rats. Nous avons choisi de travailler avec des souris car ce modèle, utilisé par nos collègues, garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie. Les souris utilisées proviendront de femelles gestantes, et les souriceaux débuteront le protocole avec l’injection d’un antibiotique rapidement après la naissance, qui permet d’instaurer un pré-diabète, une condition typique de la maladie du « foie gras ». Selon leur groupe, les souris seront suivies jusqu’à 4, 10 ou 18 semaines, correspondant respectivement aux étapes d’un foie normal, d’un « foie gras », et d’un cancer du foie. Ce protocole nous permet d’étudier les différentes étapes de l’évolution de la maladie du « foie gras » vers le cancer.