Procédures modérées

Des cellules de gliome sont injectées dans le tronc cérébral de souriceaux âgés de deux jours, puis la tumeur qui s'y développe est suivie sous anesthésie trois fois par semaine, vingt minutes à chaque fois. 1 000 souris fortement immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées pour que leurs tumeurs soient prélevées et analysées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste des associations de deux molécules contre un cancer pédiatrique du tronc cérébral aujourd'hui incurable. Le porteur affirme que les nuisances ont un effet limité parce que les souris sont manipulées sous anesthésie générale, et confie l'estimation de la souffrance au personnel de l'animalerie sans décrire de grille de score.

Objectifs

Ces travaux de recherche vise à étudier le gliome du tronc cérébral, un cancer pédiatrique toujours incurable. Aucun des traitements actuels ne prolonge la vie des enfants atteint de ce gliome. Dans ce contexte, il est nécessaire de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques mais aussi d’optimiser celles développées récemment afin que le traitement soit le plus efficace possible. Récemment, nos études sur les lignées cellulaires ont mis en évidence l’intérêt de plusieurs nouvelles combinaisons de deux composés chimiques et de nouvelles combinaisons sont en cours de développement. Certains aspects de nos projets vise aussi à optimiser l’efficacité de certaines combinaisons médicamenteuses. Des analyses moléculaires et de tissus seront réalisées sur les tumeurs après prélèvement afin d’apprécier l’action de chacune des deux produits et de la combinaison sur les cellules cancéreuses et sur certains gènes dans un contexte in vivo.

Bénéfices attendus

Démontrer que l’association de deux nouveaux médicaments bloque la formation de tumeur chez la souris. Etudier l’effet des deux composés, seuls ou en association, au niveau moléculaire et sur les tissus tumoraux.

Procédures

Injection sous anesthésie de cellules dans le tronc cérébral (une fois, 5 minutes ). Suivi du poids et du développement tumoral sous anesthésie (3 fois par semaine, 20 minutes)

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec la greffe de cellules tumorales dans le tronc cérébral et la formation de tumeur dans le cerveau. Dans certaines conditions du projet, des agents anticancéreux seront administrés aux animaux afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à cette nouvelle thérapie. Les nuisances attendues sont la manipulation des cages et des souris lors des expériences, un léger stress thermique dû à l'anesthésie qui est pris en charge par l'utilisation d’un tapis chauffant et une douleur due à l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille. Comme les souris sont manipulées sous anesthésie générale, toutes ces nuisances ont un effet limité sur les animaux.

Devenir

Les 1000 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse pas des approches cellulaires, moléculaires et des analyses de tissus.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris ayant un système immunitaire à capacité limitée). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Nous utiliserons des mâles comme des femelles. Nos résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés en tenant compte du nombre d’animaux par lot qui est de 10.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids en papier crépon. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera euthanasié sans attendre.

Choix des espèces

1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tumeurs se développent chez elles après induction d'un transgène, avec douleurs et lésions attendues, 60 souris subissant quatre prélèvements sanguins par ponction rétro-mandibulaire sur deux mois et 30 une administration intraveineuse. Le porteur annonce comme retombée d'ouvrir "une nouvelle voie d'exploration pour d'éventuelles thérapies", quand l'objectif immédiat est de montrer qu'une enzyme mutagène favorise l'apparition de tumeurs chez l'animal vivant. Il justifie le recours à la souris par le "besoin" d'observer la tumorigénicité dans le cadre d'un "organisme entier", malgré les modèles in vitro dont il dispose.

Objectifs

Une source importante de mutations observées dans les génomes de nombreux types de tumeurs est liée à certaines enzymes. L’objectif de ce projet est dans un premier temps de montrer que certaines enzymes (A3A) peuvent-être impliquées dans la survenue de cancers in vivo. Nous disposons de données obtenues en culture montrant que l’enzyme A3A peut muter des gènes impliqués dans la carcinogenèse. Ce projet nous permettra de montrer directement au sein de l’animal l’implication de A3A et d’autres molécules dans la survenue des cancers ou dans un début de pathologie tissulaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence l’activité mutagène de A3A in vivo. Nous espérons montrer également que d’autres molécules pourront contrecarrer l’effet mutagène de A3A chez l’animal. Le but du projet est d’améliorer la connaissance des mécanismes de tumorigénèse et l’implication de A3A dans ce processus. Ceci ouvrirait une nouvelle voie d’exploration pour d’éventuelles thérapies.

Procédures

Prélèvements sanguins de sang veineux par ponction dans la veine rétro-mandibulaire (sur 60 souris), quelques secondes par prélèvements ; et 4 prélèvements quinzomadaires/souris (pendant 2 mois) ; un antibiotique sera ajouté dans l’eau de boisson des souris. Administration intraveineuse,1 unique administration par souris (sur 30 souris) ; durée de l’acte : quelques secondes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sur les animaux seront principalement la douleur et les lésions dues à la genèse des tumeurs. L’apparition des tumeurs suite à l’expression du transgène par l’administration de l’inducteur est liée à une douleur en principe de sévérité modérée, qui peut comporter une diminution d’activité seulement de quelques jours et une diminution de poids ne pas dépassant 20% si pas d’atteinte de points limites. Etant donné les caractéristiques de l’étude, nous évaluerons mieux la condition des animaux par la grille de Body Condition Score (BCS) (plus fiable et a adaptée pour ce type d’étude que le Body Weight (BW) due à l’ éventuelle apparition de tumeurs qui peut fausser ce dernier paramètre) A son tour, les prélèvements sanguins rétromandibulaires ou l’administration de substances via la veine de la queue peut induire une douleur et un inconfort léger de courte durée liés à l’introduction de l’aiguille.

Devenir

Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront mises à mort pour analyse tout au long de chaque procédure à des points définis ou en fonction de l’état des souris (signes cliniques de détresse/souffrance suite à survenue de tumeurs). En tout cas à la fin des procédures toutes les souris restantes seront mises à mort et les organes cibles prélevés pour analyse.

Remplacement

Malgré disposer de quelque modèle in vitro, le recours à la souris pour ce projet se justifie par le besoin d’avoir accès aux effets de tumorigénicité en présence des transgènes d’intérêt dans le cadre de l’organisme entier (affectation différents organes, circulation des exosomes par voie sanguine)

Réduction

Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire est basé sur notre expérience préalable et corroboré par l’avis des biostatisticiens pour être surs d’utiliser le nombre minimum d’animaux nécessaire, avec le maximum d’information par animal, afin d’attendre l’objectif fixé avec des résultats fiables. Quand cela sera possible, les animaux seront leur propres témoins (i.e. point a 21 jours). Pour la production d’exosomes à utiliser dans la deuxième procédure, nous utiliserons du sang de certains animaux de la première procédure. Nous utilisons males et femelles afin de réduire le nombre d’individus en considérant qu’il ne devrait pas y avoir un biais de sexe quant à la formation tumorale

Raffinement

Nous suivrons quotidiennement les animaux sous traitement avec l’antibiotique ainsi que leurs contrôles. Nous serons particulièrement attentifs à tous les signes de détresse susceptibles de survenir afin de réduire/éliminer la souffrance des animaux, les signes cliniques externes (prostration, poils hérissés, jaunissement, corps dur à la palpation, perte de poids). Les animaux seront mis à mort quand cela sera nécessaire en fonction de leur état et en suivant des grilles d’observation de souffrance et les points limites spécifiques et précoces définis (évaluation du Body Condition Score (BCS) problèmes posturaux prolongés, corps dur à la palpation abdominale pouvant être associé à une tumoration/hepatomégalie). En cas de souffrance et avant la mise à mort au plus tard au bout de 24h après confirmation des signes cliniques externes, nous aurons recours au besoin de la nourriture humidifiée / gel hydrique, la réhydratation sous-cutanée ou le chauffage des animaux si hypothermie associée.

Choix des espèces

La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui montre 90% d’homologie avec le génome humain, d’où l’intérêt majeur en recherche fondamentale et création de modèles pour des maladies humaines. Les souris utilisées seront des souris adultes de 2-6 mois car l’étude d’apparition de tumeurs porte sur les adultes et est longue.

60 souris vont être privées de nourriture pendant vingt-quatre heures, puis tuées pour qu'on prélève leurs îlots pancréatiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jeûne fait baisser leur activité, leur température corporelle et leur poids. L'objet est de séquencer les noyaux de leurs cellules pancréatiques pour repérer les gènes dont l'expression change avec le jeûne, dix souris étant utilisées par point de séquençage. Le porteur écrit à deux reprises qu'un jeûne de vingt-quatre heures ne met "en aucun cas" en danger des souris en bonne santé, pour des procédures qu'il déclare lui-même de gravité modérée.

Objectifs

Le maintien de la balance énergétique dépend de l'équilibre entre les apports et les dépenses énergétiques. Il existe des systèmes de régulation de la prise alimentaire qui permettent un équilibre entre les apports énergétiques, les dépenses et le maintien du poids corporel. Une dérégulation de ce système peut conduire à l'obésité et aux maladies métaboliques qui lui sont associées, comme le diabète. Au laboratoire, nous étudions le développement de l'obésité et ses altérations métaboliques. Dans cette nouvelle étude, nous nous proposons d'analyser la réponse des tissus actifs en réponse au jeûne. Le jeûne est connu pour induire des changements significatifs dans l'expression génique des tissus tels que le cerveau, le pancréas, le foie, les muscles et le tissu adipeux, qui jouent un rôle crucial dans la régulation énergétique et métabolique. Notre objectif est de caractériser ces changements au niveau moléculaire pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels le jeûne influence la balance énergétique et le métabolisme global. En utilisant des technologies de nouvelle génération, nous chercherons à identifier les gènes dont l'expression est modifiée par le jeûne et à élucider les voies de signalisation impliquées. Les résultats de cette recherche pourraient fournir des informations précieuses pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à améliorer la santé métabolique et à prévenir les maladies associées à une dérégulation de l'équilibre énergétique telles que l'obésité et le diabète.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette recherche pourraient fournir des informations précieuses pour améliorer la santé métabolique et prévenir les maladies associées à une dérégulation de l'équilibre énergétique. Bénéfices attendus pour ce projet : nous pourrons identifier de nouvelles cibles potentielles pour des interventions thérapeutiques visant à traiter ou prévenir les maladies métaboliques telles que l'obésité et le diabète.

Procédures

60 animaux seront mis à jeûn durant 24H.

Impact sur les animaux

Un jeûne prolongé de 24H sera nécéssaire avant le prélèvement des tissus des souris. Ce jeûne va entrainer de nombreux effets, notamment metaboliques, sur le systeme digestif, immunitaire, etc, mais ne met en aucun cas en danger les animaux. Un jeûne de 24H pour une souris en bonne santé tel que dans notre cas peut entrainer une baisse de son activité, de sa température corporelle et une légère perte de poids.

Devenir

Après la période de jeûne de 24H qui ne met pas en danger les animaux, les animaux seront euthanasiés et une préparation d'îlots pancréatiques sera faite afin de recueillir les noyaux des cellules, et de les séquencer. Il en sera de même pour les animaux contrôle qui n'auront pas jeûné.

Remplacement

La régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris. Les modèles in vitro ou d'organismes inférieurs ne permettent pas de reproduire l'intégralité de ces interactions physiologiques complexes. Ainsi, l'utilisation de la souris est essentielle pour obtenir des résultats pertinents et transposables aux mécanismes chez les mammifères, y compris les humains. Nous utiliserons des tissus de souris afin de réaliser des séquençages spécifiques. Cette approche permet d'obtenir des données détaillées sur l'expression génétique à l'échelle cellulaire.

Réduction

Nous utiliserons un total de 60 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Une préparation d'îlots pancréatiques provenant d'une souris permet de recueillir environ 30 000 noyaux. Étant donné que 300 000 noyaux sont nécessaires pour réaliser un point de séquençage, 10 souris seront nécessaires pour chaque point de séquençage. Nous prévoyons de réaliser 6 expériences indépendantes, nécessitant ainsi un total de 60 souris. Cette approche nous permet de maximiser les informations obtenues tout en minimisant le nombre total d'animaux utilisés, en conformité avec les principes de réduction. Nous déterminerons si la distribution des échantillons suit une loi normale. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour déterminer le nombre optimal d'animaux à utiliser et pour analyser les données obtenues.

Raffinement

Les cages seront étiquetées pour cette procédure et les animaux seront surveillés par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort, cependant un jeûne de 24H ne met en aucun cas en danger des souris en bonne santé. Les animaux conservent leurs congénères et leurs conditions d'hébergement avec accès à l'eau de boisson et un carré de chanvre est mis à leur disposition permettant la fabrication d'un nid utile pour préserver leur température corporelle, pendant ces 24H.

Choix des espèces

Pour étudier le métabolisme, la souris est le modèle animal de référence. Ce choix est justifié par plusieurs raisons : Similitudes physiologiques et génétiques avec l'humain : La souris partage de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec l'humain, ce qui permet de transposer plus facilement les résultats obtenus chez la souris aux humains. Cela est particulièrement pertinent pour les études sur le métabolisme et les maladies métaboliques telles que l'obésité et le diabète. Historique de recherche étendu : Il existe une vaste base de données et une longue histoire d'utilisation des souris dans la recherche biomédicale, fournissant un contexte riche et des outils bien développés pour l'analyse des résultats. Les souris sont donc bien caractérisées en termes de biologie et de réponses métaboliques, facilitant les comparaisons et l'interprétation des données. Les souris seront utilisées à l'âge de 10 semaines pour plusieurs raisons importantes: À l'âge de 10 semaines, les souris ont atteint un stade de développement où leur physiologie, y compris leur métabolisme, est généralement stable. Cela permet de minimiser les variations dues à la croissance et au développement, assurant ainsi une plus grande cohérence des résultats expérimentaux. L'utilisation de souris âgées de 10 semaines offre une combinaison optimale de maturité physiologique, de stabilité métabolique, de standardisation des conditions expérimentales et de comparabilité avec la littérature existante, ce qui en fait un choix approprié pour notre étude sur les mécanismes métaboliques en réponse au jeûne.

Capturées en rivière, anesthésiées trois à cinq minutes, mesurées, pesées, puis incisées sur trois à cinq millimètres au ventre pour y glisser un transpondeur, 1 000 truites communes sauvages sont maintenues hors de l'eau jusqu'à une minute avant d'être remises à l'eau vivantes. Les procédures sont classées en souffrance modérée et aucune truite n'est tuée, le porteur indiquant qu'une pommade antiseptique est appliquée sur l'incision et que le réveil est surveillé dans un vivier. L'effectif tient compte des marques perdues dans les semaines qui suivent et de celles que les femelles expulsent lors de la fraie, pour garantir un minimum de redétections. Ce que le suivi mesure, c'est le fonctionnement d'une passe à poissons construite sur un barrage, les truites étant utilisées comme moyen de vérifier l'ouvrage.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer le franchissement par les truites d’un barrage sur une rivière de montagne. La truite, espèce caractéristique sur ce cours d’eau, réalise en effet une migration automnale avant sa reproduction et peut être bloquée. Une passe à poissons a été récemment aménagée pour permettre aux poissons de franchir ce barrage et de remonter la rivière. Le suivi biologique mis en œuvre dans ce projet permettra de vérifier son bon fonctionnement. La méthodologie proposée implique l’implantation de transpondeur électroniques (PIT tags) », dans des truites sauvages. Des dispositifs de détection fixes seront installés à l’entrée et à la sortie de la passe à poissons, et le suivi sera réalisé sur deux années minimum pour prendre en compte la variabilité des conditions environnementales. Si le quota d’animaux marqué n’est pas atteint, le projet prévoit le report des marquages l’année suivante.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en lumière la « transparence » du barrage à la migration des truites, c’est à dire le bon franchissement de la passe à poissons pour les différentes classes de tailles des truites et l’absence de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour permettre à cette espèce de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1000 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, comme l’indiquent les retours d’expériences lors des recaptures.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire de l’espèce considérée, dans le cas présent la truite de rivière. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval de l’ouvrage étudié. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des comportements, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l’ouvrage aménagé. Il est adapté au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Le taux de détection attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : -L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera fréquemment renouvelé pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours < 19°C (température de stress pour la truite commune, espèce la plus exigeante) et pour éviter l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie. Les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. L’expérience du personnel permet de réduire le temps global de manipulation à moins d’une minute. La taille des PIT tags sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière.

Choix des espèces

L’espèce cible est la truite commune. Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. Pour les truites, seuls les individus subadultes et adultes seront marqués, à l’aide de PIT tags adaptés à leur taille. Les individus plus petits que 120 mm seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

7 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une administration du composé et trois prélèvements sanguins. Les prélèvements se font par ponction de la veine caudale et par ponction sous la mandibule, et les composés sont administrés par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou par gavage, avec les risques que le porteur énumère lui-même : perforation d'organes internes, œdèmes, hématomes, perforation de l'œsophage, passage du liquide dans les poumons. L'objet reste en amont de tout traitement, il s'agit de mesurer comment cinq variantes d'une protéine antidiabétique se répartissent dans le corps selon la dose et la voie d'administration. Le porteur affirme par ailleurs que trois animaux par condition suffisent, sans que le passage de ce chiffre à 7 560 souris soit détaillé.

Objectifs

Notre recherche porte sur le diabète de type 1 (DT1), une maladie caractérisée par la destruction des cellules du pancréas qui produisent de l'insuline. Cela entraîne des hyperglycémies chroniques pouvant provoquer de graves complications vasculaires. Nous avons identifié une protéine capable de régénérer ces cellules et développé cinq variantes de cette protéine, que nous avons testées sur des souris diabétiques. Nos résultats préliminaires montrent que ces protéines peuvent stimuler la prolifération des cellules productrices d'insuline, ce qui pourrait en faire des traitements prometteurs pour le DT1. Pour développer un médicament antidiabétique, nous souhaitons analyser le comportement de ces nouvelles protéines dans le corps (pharmacocinétique) afin de déterminer la meilleure dose et la meilleure méthode d'administration. Chaque variante de la protéine étant unique, nous devons tester différentes combinaisons de méthodes et de doses pour comprendre leur fonctionnement. Nous testerons donc cinq concentrations différentes avec quatre méthodes d'administration (intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse et orale) sur trois modèles de souris : des souris saines pour garantir des résultats représentatifs des réponses physiologiques normales ; des souris diabétiques pour évaluer l'efficacité des composés dans le contexte du DT1 ; et des souris génétiquement modifiées pour mieux simuler les humains. Notre approche sera séquentielle et hiérarchisée : si l'une des protéines candidates montre de bons résultats avec une méthode et une dose spécifiques, nous pourrons écarter les autres options, réduisant ainsi le nombre de souris nécessaires. Au total, nous prévoyons d'utiliser 7 560 souris pour ce projet, tout en respectant strictement les principes des 3R : Remplacement (l'étude du diabète nécessite l'utilisation d'animaux, car cette maladie ne peut pas être entièrement reproduite en laboratoire), Réduction (nous utiliserons le minimum d'animaux nécessaires et ajusterons les expériences selon les résultats), et Raffinement (une grille de score évaluera la souffrance et le stress des animaux, avec des seuils adaptés).

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude seront essentiels pour déterminer la dose et la voie d’administration qui assurent la meilleure exposition du composé antidiabétique dans les tissus et le sang. Ces données guideront les conditions expérimentales des futures études sur l'efficacité à long terme et la pharmacodynamique du composé candidat. En combinant ces études complémentaires, nous maximiserons les chances de succès dans le développement thérapeutique pour le diabète de type 1 (DT1).

Procédures

Trois prélèvements sanguins seront effectués sur chaque animal, selon les modalités suivantes : deux prélèvements seront réalisés par ponction de la veine caudale (l'un au début de la procédure et l'autre à la fin; durée de l'intervention : 30 secondes) ; et un prélèvement sera effectué par ponction submandibulaire (soit à 0 min, avant administration du composé, soit à 30 min, 60 min, 120 min, 24 h, ou 48 h après l’administration ; durée de l'intervention : 1 minute). Une injection ou une administration du composé sera effectuée sur chaque animal (durée pour les injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et orales : entre 30 secondes et 1 minute).

Impact sur les animaux

Une partie des souris utilisées dans cette étude constitue un modèle classique pour l'étude du diabète de type 1 (DT1), présentant généralement une hyperglycémie modérée. Le prélèvement submandibulaire, réalisé en prélevant du sang sous la mandibule avec une aiguille ou une lancette, peut provoquer du stress et un inconfort local. Il y a également un risque de formation d'œdème autour du site de ponction et d'infection si les conditions d'asepsie ne sont pas rigoureusement respectées. La ponction de la veine caudale, qui implique l'extraction de sang de la veine située dans la queue, peut entraîner une douleur ou un inconfort, avec un risque d'infection si le site n'est pas correctement aseptisé. L'administration par voie orale (ou gavage) peut causer du stress et de l'inconfort, avec des risques de perforation ou de blessure de l'œsophage, ainsi que d'aspiration du liquide dans les poumons, entraînant des difficultés respiratoires si la sonde n'est pas correctement insérée. Les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV) peuvent entraîner des risques d'inconfort et de douleur au site d'injection. Pour les injections IP, il existe également un risque de perforation des organes internes. Concernant les injections SC, les risques incluent la formation d'œdèmes ou d'hématomes si l'injection est trop rapide. Pour les injections IV, les risques comprennent des saignements et des dommages veineux. Dans tous les cas, des infections peuvent survenir au site d'injection si les conditions d'asepsie ne sont pas strictement respectées.

Devenir

À la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre des analyses post-mortem.

Remplacement

Dans notre étude, les composés développés présentent des caractéristiques pharmacocinétiques uniques qui ne peuvent être correctement évaluées que dans des systèmes biologiques complexes, comme ceux des souris. L'étude in vivo est indispensable pour déterminer avec précision comment ces molécules sont absorbées, distribuées, métabolisées et éliminées dans l'organisme, car ces processus ne peuvent pas être simulés de manière fiable par des méthodes in vitro ou par modélisation informatique.

Réduction

Nous utiliserons un nombre minimal d'animaux pour nos expériences. Des tests statistiques sur des échantillons préliminaires ont montré que trois animaux par condition suffisent pour obtenir des résultats exploitables sans nécessiter de répétition supplémentaire. Certaines souris peuvent ne pas développer d’hyperglycémie, mais elles ne seront pas écartées, car elles présentent une infiltration lymphocytaire significative, un indicateur préclinique important du diabète de type 1 (DT1). Ainsi, notre étude inclura les souris diabétiques et prédiabétiques pour obtenir des données complètes et fiables sur la pharmacocinétique de nos composés. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous adopterons une approche séquentielle et hiérarchisée. Si un composé montre un profil d’exposition optimal avec une voie d’administration spécifique et une concentration donnée, les autres conditions expérimentales pourront être écartées. Nous ajusterons les expériences en fonction des résultats obtenus, conformément aux principes de réduction des 3R.

Raffinement

La glycémie sera mesurée par prélèvement d'une goutte de sang de la veine caudale. Avant l'incision, une crème analgésique contenant de la lidocaïne sera appliquée sur le bout de la queue pour une anesthésie locale. La ponction sera effectuée rapidement et avec précision pour minimiser le stress, et une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement et prévenir les hématomes. Le prélèvement submandibulaire sera réalisé par un opérateur expérimenté pour garantir rapidité et précision, réduisant ainsi l'inconfort. Des lancettes ou aiguilles stériles seront utilisées pour minimiser le risque d'infection ou d'œdème. Après le prélèvement, une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement. Pour les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV), une désinfection locale sera effectuée avant et après chaque injection pour réduire le risque d'infection. Des aiguilles de petit calibre seront utilisées pour diminuer la douleur et les traumatismes tissulaires. Avant une injection IV, la queue de la souris sera réchauffée dans de l’eau tiède pour dilater les vaisseaux sanguins, facilitant l'injection et réduisant les tentatives. Les volumes administrés seront limités afin d'éviter tout inconfort. Pour l'administration orale (ou gavage), des sondes d’alimentation appropriées seront utilisées pour minimiser le risque de perforation de l’œsophage ou de blessures internes. Les animaux seront surveillés pour tout signe de détresse ou difficulté respiratoire. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi et en groupes sociaux, dans des portoirs ventilés. Ils auront accès à de l'eau stérilisée et des aliments irradiés pour minimiser les risques de contamination. Durant toute la procédure, les animaux seront surveillés à l’aide d'une grille de score pour évaluer et objectiver les éventuelles souffrances, avec des points limites précoces et des mesures correctives adaptées.

Choix des espèces

Une partie des souris utilisées dans cette étude constitue un modèle classique pour l’étude du diabète de type 1 (DT1), car elles développent spontanément la maladie par des mécanismes similaires à ceux observés chez l'humain. Leur phénotype et les étapes de progression du DT1 sont bien documentés, ce qui permet de mener des études précises et reproductibles. Dans notre recherche, ces souris sont essentielles pour évaluer l’efficacité de nos composés dans le contexte du DT1. Une autre partie des souris de cette étude est dite "humanisée" ; elles ont été modifiées génétiquement pour exprimer un gène humain, ce qui permet de mieux prédire les réponses humaines aux composés étudiés. Des souris non modifiées seront également utilisées afin d’obtenir des données fiables sur le comportement des composés dans un contexte physiologique normal. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 20 semaines pour examiner comment les différents composés se comportent dans le corps. Cet âge correspond à la période adulte, où leur métabolisme est stabilisé, garantissant ainsi des réactions plus prévisibles aux traitements. À ce stade, les souris ont un métabolisme bien développé, ce qui nous permettra d’obtenir des résultats plus fiables et applicables, tout en réduisant les variations liées à la croissance ou au sevrage.

Trois heures d'anesthésie et une chirurgie du crâne sans réveil pour 100 d'entre elles : 466 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 318 subissent des cycles répétés d'anesthésie gazeuse, des injections et des contrôles de numération à la queue avant un prélèvement terminal de sang à l'aorte, et 18 un temps de saignement mesuré à la queue pendant quinze à trente minutes. L'objet est de comprendre comment se forme le réseau de membranes internes qui donne naissance aux plaquettes sanguines, le porteur indiquant que ce réseau reste sous-développé en culture cellulaire, ce qui l'amène au modèle animal. Sur les 466 souris, 448 sont tuées parce que les expériences sont terminales et 18 sont réutilisées pour un prélèvement d'organes.

Objectifs

Les plaquettes sanguines sont produites par les mégacaryocytes (MKs) dans la moelle osseuse et sont vitales pour l'arrêt des saignements. Les MKs possèdent la caractéristique unique de contenir un réseau complexe de membranes internes (DMS). Ce réseau joue un rôle essentiel dans la production journalière de plaquette puisqu’il forme les futures plaquettes. Ainsi, la production par chaque MK d’environ 2000 plaquettes nécessite une production abondante et régulée de ce réseau membranaire. Un développement anormal est associé à une diminution du nombre de plaquettes circulantes dans certaines maladies héréditaires hémorragiques. A ce jour, les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement des membranes internes sont encore largement méconnus. De façon remarquable, nous avons récemment observé la présence de jonctions serrées au niveau de ces membranes internes. Nous avons précédemment montré la présence d'une protéine particulière à ce niveau. Notre hypothèse est que cette protéine est un acteur clé du développement normal de ces membranes, en relation avec les protéines présentes autour des MKs dans la moelle elle jouerait un rôle clé dans la libération des plaquettes vers la circulation sanguine. Nous savons que ce réseau de membranes est sous-développé dans les MK en culture. C'est la raison pour laquelle le modèle animal est choisi dans le but de reproduire, le plus fidèlement possible, l'environnement de la moelle osseuse. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées n’exprimant plus cette protéine d'intérêt spécifiquement dans la lignée MK, qui sont disponibles au laboratoire, et ne présentent pas de phénotype dommageable.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre la biogénèse du réseau de membranes internes du MK (DMS), une étape clé et indispensable de la formation des futures plaquettes sanguines. Sur le plan clinique, une meilleure compréhension de la formation des plaquettes permettra de mieux comprendre la régulation du nombre de plaquettes produites par MK, et à plus long terme, de contribuer à faire avancer les traitements chez les patients thrombopéniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 différents types d'interventions : 1- Anesthésie générale par voie injectable et prélèvement terminal à l'aorte : 30 souris. 2- Anesthésie gazeuse de 5 minutes au masque pour injection des traitements pharmaceutiques et suivi de la numération à la queue, puis anesthésie générale par voie injectable pour le prélèvement terminal de sang à l'aorte : 318 souris. 3- Anesthésie générale longue de 3h au maximum, par voie injectable, et chirurgie du crane pour 100 souris, la chirurgie est sans réveil. 4-Anesthésie gazeuse de 15 à 30 minutes pour la réalisation d'un temps de saignement à la queue : 18 souris. Total : 466 souris

Impact sur les animaux

Les injections et prélèvements de sang répétés présentent un risque modéré de douleurs à la queue et de saignements légers : nuisances légère. Les protocoles liés aux traitements pharmaceutiques ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids : nuisance légère . En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux : nuisance modérée. En ce qui concerne les expériences par microscopie intravitale, nous anticipons un risque d'hypothermie, un dessèchement oculaire et un risque de douleur liée à la durée de l'anesthésie de longue durée : nuisance modérée.

Devenir

Lors de ce projet, sur les 466 animaux : 448 seront mis à mort puisque les expériences auquelles ils sont soumis sont terminales, et 18 animaux seront réutilisés (prélèvement d'organes).

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, à l’état homéostatique, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la compléxité du vivant et en particulier la circulation sanguine. Nous avons par ailleurs remarqué que la morphologie, en particulier notre sujet d'étude, le DMS, diffèrent fortement dans des MKs en culture par rapport à ceux observés in vivo

Réduction

A la fin des expériences les animaux seront mis à mort et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultrastructurales ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris est réduit au minimum mais déterminé afin d’obtenir des résultats statistiques solides dans les différents génotypes et traitements. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).

Raffinement

Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme, enrichi et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Les expériences intravitales et les prélèvements à l'aorte ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées. - Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage. A la fin de l’expérimentation, les animaux sont mis à mort avant leur réveil. Une fiche de suivi avec les points limites définis sera mise en place afin de pouvoir contrôler l’état des animaux tout au long du protocole expérimental. Une attention particulière est apportée à l’animal et une décision est prise : augmentation de l’enrichissement, soins, euthanasie. Concrètement, lors de la surveillance quotidienne des animaux, nous observerons attentivement l’aspect des souris pour s’assurer de l’absence de signes extérieurs d’infection tels que des lésions cutanées ou des écoulements nasaux ou oculaires. Une attention particulière sera apportée au niveau des sites d’injection des substances pour s’assurer qu’il n’y a pas d’infections.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine en particulier pour la production de plaquettes. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Les souris seront utilisées sans distinction à un stade de développement adulte de 8 à 35 semaines.