Procédures modérées
Etude des effets rénaux de la protéine Claudine-10b chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Un score sur quatre critères, chacun noté de 0 à 3, décide de la mise à mort anticipée : trois sur un seul critère ou six au total y suffisent. 160 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'autre moitié anesthésiée et tuée sans réveil, avec exérèse des deux reins. Quatre-vingts d'entre elles passent dix jours en cage à métabolisme individuelle, quarante avec un régime appauvri en sel, ce qui peut entraîner perte de poids, angoisse et lésions de la peau des pattes par station prolongée sur la grille. Le syndrome rénal humain visé reste incurable et le porteur présente son travail comme "un préalable sur le chemin" d'un futur traitement.
Objectifs
Une maladie humaine, appelée syndrome HELIX (Hypohidrose, anomalies Electrolytiques, Hypolacrymie, Ichtyose, Xérostomie) est caractérisée par une perte urinaire de chlorure de sodium et une insuffisance rénale progressive. Cette maladie est due à une anomalie de la protéine d'intérêt, située une partie spécifique du rein. Normalement, la présence de cette protéine permet de conserver le sodium évitant sa fuite dans l'urine. Actuellement, cette maladie est incurable. Un modèle murin de la maladie, obtenu par inactivation de la protéine d'intérêt, a été créé mais la caractérisation du modèle a été incompléte et les propriétés de la partie du rein exprimant ou n’exprimant pas le gène d'intérêt n’ont pas été définies. Nos objectifs sont donc - de déterminer si l’inactivation complète du gène d'intérêt (codant pour la protéine d'intérêt) entraine une fuite rénale de chlorure de sodium chez la souris et une réaction hormonale adaptative sous la forme d'une augmentation de production d'aldostérone- de quantifier la facilité avec laquelle le sodium peut passer entre les cellules du rein, en présence et en absence de la protéine d'intérêt, ainsi que les conséquences de l'absence de la protéine d'intérêt sur le fonctionnement des cellules du rein.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de déterminer le rôle de la protéine d'intérêt dans le fonctionnement du rein des mammifères terrestres. Plus généralement, cette étude apportera des éléments permettant de mieux comprendre les mécanismes de transport du sodium dans divers épithéliums. Cette étape est un préalable sur le chemin devant permettre de développer un traitement efficace du syndrome HELIX et de prévenir les complications délétères (insuffisance rénale et troubles métaboliques). Le projet permettra 1. de connaitre précisément l'impact de l'inactivation de la protéine d'intérêt sur la capacité à maintenir normales les valeurs des elctrolytes dans le sang 2. de comprendre l'adaptation du rein à la perte de fonction de la protéine d'intérêt, et de comprendre les conséquences sur l'organisme dans son ensemble.
Procédures
Voici la liste des interventions réalisées chez les animaux. Quatre vingt (80) animaux sont soumis à un hébergement en cage à métabolisme individuelle pendant 10 jours non consécutifs pour recueil d'urine (80 animaux, 10 jours répartis en 4 jours, puis 2 jours, puis 4 jours) ; parmi ceux-ci, 40 sont soumis à un régime appauvri en chlorure de sodium (NaCl) (4 jours, 40 animaux). Les 80 animaux subissent un prélèvement sanguin, unique par ponction veineuse chez l'animal vigile (80 animaux, 2 minutes). Finalement tous les animaux du projet subissent une anesthésie et analgésie terminale par injection intrapéritonéale pour exérèse des 2 reins (160 animaux, 1 minute).
Impact sur les animaux
Les effets ci-dessous ne sont pas tous attendus mais ils sont possibles. L'hébergement en cage à métabolisme peut induire les effets indésirables suivants : perte de poids transitoire, toujours inférieure dans notre expérience à 10 pour cent du poids initial, angoisse et intolérance à l'hébergement en cage à métabolisme, lésions de la peau des pattes par station prolongée sur la grille de la cage. Le prélèvement sanguin peut induite les effets indésirables suivants : saignement, douleur lors de la ponction transcutanée. L'anesthésie peut, rarement, induire les effets indésirables suivants : réaction allergique à l'anesthésie, défaillance circulatoire ou respiratoire, douleur lors de la ponction transcutanée.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés selon une méthode réglementaire, avant le prélèvement de tissus et analyse ultérieure.
Remplacement
La complexité des déterminants des transports ioniques à travers les épithéliums et de leurs conséquences systémiques est telle que le remplacement n'est pas possible puisqu'il s'agit d'étudier les conséquences d'une mutation génétique sur un organisme entier, avec toute sa complexité et ses capacités d'adaptation. Il n'y a pas d'alternative à cette étude, les modèles cellulaires existant ne permettant pas de rendre compte de la complexité du fonctionnement de l'organisme intact.
Réduction
Cent soixante (160) animaux seront utilisés dans cette étude. Le nombre d’animaux par groupe est déterminé de façon à assurer des observations fiables et utilisables. Les mesures réalisées dans la domaine de l'homéostasie tiennent compte de l'état de l'art de manière à avoir la meilleure performance des mesures réalisées et réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été calculé en tenant compte de la variabilité des paramètres d’intérêt en fonction des conditions expérimentales; les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés en s’appuyant sur un calcul de puissance ; les comparaisons des résultats entre les groupes se feront grâce à des tests statistiques validés.
Raffinement
Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Par procédure le nécessitant, est définie toute procédure générant une douleur ou une souffrance supérieure à une piqure transcutanée par une aiguille. Dans la mesure du possible, en fonction des contraintes des procédures, les animaux bénéficient d’un environnement enrichi (l’environnement est enrichi par des tunnels en carton et/ou des abris en plastique, et des boules de ouate) et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Des points limites (changement du poids corporel, apparence physique, comportement, saignement) ont été définis et les animaux font l'objet d'une surveillance au cours des différentes procédures exposées dans la demande. Entre leur sevrage et leur entrée en procédure, les animaux sont hébergés en zone Expérimentation Souris, selon les procédures de cette zone : la stabulation des animaux est conventionnelle. Les animaux reçoivent une alimentation définie ad libitum ainsi que l'eau par abreuvement automatique. Des périodes d'hébergement en cage à métabolisme étant nécessaires à l'étude, une période d'acclimatation de 4 jours est prévue. Les deux périodes expérimentales en cage à métabolisme sont définies au plus court, et sont séparées l'une de l'autre. Des points limites ont été définis. Nous avons mis en place un score prenant en compte 4 critères. Chaque item est noté de 0 à 3. Un score de 3 pour un item et/ou un score de 6 pour la somme des items justifie l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle d'inactivation génique de la protéine d'intérêt a été développé chez la souris. Les animaux sont utilisés à partir de l'âge de 8-9 semaines. Les animaux ont alors terminé leur phase de croissance rapide et sont considérés comme matures. Leur taille permet la réalisation des manoeuvres expérimentales.
Etude des agonistes des récepteurs B-adrénergiques dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une molécule irritante instillée dans le rectum sous anesthésie, ou une bactérie pathogène administrée par gavage, déclenchent chez elles une inflammation intestinale : 110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever le colon. La moitié relève d'un niveau de souffrance modéré, l'autre d'un niveau sévère, avec prostration, saignements rectaux, diarrhée prolongée et perte de poids pouvant dépasser 20 % du poids initial. L'objet déclaré est de vérifier chez la souris un effet anti-inflammatoire déjà observé sur des macrophages en culture. Sur la réduction du nombre d'animaux, le porteur promet une planification minutieuse et des évaluations régulières de ses pratiques, sans donner d'effectif par groupe ni de calcul.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont des pathologies chroniques entrecoupées de période de phase aigüe. A l’heure actuelle, seule la phase aigüe est prise en charge sans pour autant induire un effet curatif. En effet, les traitements proposés jusqu’à présent, visent surtout à améliorer le bien-être du patient. Par ailleurs, le traitement le plus répandu (qui est basé sur l’utilisation des corticoïdes) ne peut pas être utilisé chez l’enfant. Enfin, les MICI peuvent au bout d’un certain temps, entraîner la survenue du cancer colorectal Il est donc important de mettre en place des traitements qui peuvent agir sur la phase chronique et sur la phase aigüe et capables de prévenir la survenue d’une phase aigüe. Dans ce contexte d’inflammation chronique de l’intestin, qui est une véritable gêne pour le patient, nous voulons voir si les ligands des récepteurs du stress peuvent permettre la diminution de cette inflammation. En effet, nous avons réussi à montrer dans les modèles in vitro et grâce à l’analyse de différents marqueurs, basé sur des lignées primaires de macrophages, qu’un traitement par ces ligands permettait une modification du phénotype des macrophages primaires d’un type pro-inflammatoire vers un type anti-inflammatoire et pourrait à ce titre avoir un effet anti-inflammatoire global. Notre projet vise à confirmer l’effet anti-inflammatoire des ligands des récepteurs du stress dans un modèle murin d’inflammation intestinale aigüe et au cours de la phase chronique de la maladie pour répondre au besoin de traiter les patients en phase chronique de la maladie. L’ensemble de ces résultats nous permettra de déterminer si les ligands des récepteurs du stress ont des effets bénéfiques in vivo dans un contexte inflammatoire.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mettre en évidence l’intérêt thérapeutique d’une stimulation des récepteurs du stress pour la prise en charge des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Nous pourrons également évaluer si les traitements présentes des effets toxiques et définir les doses de traitement qui pourront ensuite servir à des études de toxicité ou de disponibilité.
Procédures
La procédure expérimental 1 nécessite l’anesthésie des souris pour l’injection intrarectale. L’anesthésie gazeuse sera pratique une seule fois (au moment de l’induction de l’inflammation) et durera 5 min maximum. La pesée quotidienne des souris durera moins d’1 minute et les injections intrapéritonéales prévues tous les 2 jours dureront également moins d’1 minute. La procédure expérimentale 2 nécessite un gavage des animaux. Ce geste technique durera moins d’1 minute. Les pesées (quotidiennes) et les injections intrapéritonéales (tous les 2 jours) dureront moins d’1 minute.
Impact sur les animaux
Nous supposons que la procédure expérimentale classée sévère engendrera de la douleur chez les animaux et de la diarrhée. Nous pouvons nous attendre à avoir des animaux prostrés, peu mobiles, des saignements rectaux, une diarrhée prolongée, ou une perte de poids supérieure à 20% du poids initial. Concernant le modèle expérimental chronique, classé en procédure modérée, nous supposons que l’infection des souris par un pathogène puisse induire des selles molles voir des diarrhées et une perte de poids mais aucune autre souffrance. La littérature ne rapporte pas de saignements rectaux dans ce modèle et nous ne nous attendons pas à en retrouver.
Devenir
Les animaux devront tous être mis à mort afin de pouvoir collecter le colon.
Remplacement
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont des pathologies chroniques entrecoupées de période de phase aigüe. A l’heure actuelle, seule la phase aigüe est prise en charge sans pour autant induire un effet curatif. En effet, les traitements proposés jusqu’à présent, visent surtout à améliorer le bien-être du patient. Par ailleurs, le traitement le plus répandu (qui est basé sur l’utilisation des corticoïdes) ne peut pas être utilisé chez l’enfant. Enfin, les MICI peuvent au bout d’un certain temps, entraîner la survenue du cancer colorectal Il est donc important de mettre en place des traitements qui peuvent agir sur la phase chronique et sur la phase aigüe et capables de prévenir la survenue d’une phase aigüe. Dans ce contexte d’inflammation chronique de l’intestin, qui est une véritable gêne pour le patient, nous voulons voir si des molécules qui reconnaissent les récepteurs de stress peuvent permettre la diminution de cette inflammation. En effet, nous avons réussi à montrer dans les modèles in vitro et grâce à l’analyse de différents marqueurs, basé sur des lignées primaires de macrophages, qu’un traitement par ces molécules permettait une modification de la réponse inflammatoire et pourrait à ce titre avoir un effet anti-inflammatoire global. Notre projet vise à confirmer l’effet anti-inflammatoire de ces molécules ciblant les récepteurs du stress dans un modèle murin d’inflammation intestinale aigüe et au cours de la phase chronique de la maladie pour répondre au besoin de traiter les patients en phase chronique de la maladie. L’ensemble de ces résultats nous permettra de déterminer si ces molécules ont des effets bénéfiques in vivo dans un contexte inflammatoire.
Réduction
Notre projet s'engage à réduire autant que possible l'utilisation d'animaux dans l'expérimentation à des fins de recherche, tout en garantissant des normes élevées de bien-être animal et d'intégrité scientifique. Le développement des modèles in vivo est fondé sur des recherches scientifiques approfondies et un protocole expérimental bien défini. Avant de commencer toute expérience, nous réaliserons une planification minutieuse pour nous assurer que chaque animal est utilisé de manière pertinente. Enfin, nous évaluerons régulièrement nos protocoles et pratiques pour identifier de nouvelles opportunités de réduction et d'amélioration.
Raffinement
Les souris disposeront d’une phase d’habituation à la manipulation par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris seront examinées tous les jours pour surveiller leur inconfort (contrôle des fèces, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections intrarectales se feront sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour limiter le stress sur un tapis chauffant pour limiter la perte de chaleur durant l’anesthésie. Les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence d’éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés dans la cage pour prévenir le manque de mobilité possible de certains animaux. Également, des points limites spécifiques de chaque modèle seront appliqués.
Choix des espèces
L’étude du rôle des ligands du récepteur de stress β3 dans la prévention de l’inflammation intestinale in vivo nécessite l’utilisation de modèles murins, dont les similarités des caractéristiques cliniques et histo-pathologiques avec l’homme permettent l’extrapolation à l’homme. C’est donc une approche validée par la communauté scientifique dans notre domaine d’étude. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines correspondant à un stade de développement adulte, stade auquel le système digestif murin est bien en place afin d’étudier le potentiel anti-inflammatoire des agonistes des récepteurs. Le modèle murin induit de MICI, obtenu par l’utilisation de molécules chimiques irritantes en intrarectal est très utilisé car il est relativement simple à mettre en œuvre et car dès le début, la durée et la sévérité de l’inflammation sont contrôlables. Le modèle murin d’infection du tractus gastro-intestinal par une bactérie pathogène de la souris est un modèle de référence pour l’étude de l’inflammation chronique et est très documenté dans la littérature. Enfin, les quantités de ligands du récepteur de stress utilisées chez la souris sont faibles et permettent de diminuer les coûts tout en obtenant des résultats pertinents.
Différences sexuelles dans l’inflammation cutanée de la face induite par le CFA chez le rat mâle et femelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injection sous la peau de la face d'un adjuvant qui déclenche une inflammation douloureuse, puis quatre jours de contentions au chiffon, jusqu'à trois par jour, le temps de photographier les grimaces : 12 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur retient six mâles et six femelles et se sert du côté non enflammé de leur face comme témoin, pour comparer expressions faciales et lésions selon le sexe. Il écrit ne pratiquer aucun test comportemental afin de limiter le stress lié à l'injection, et affirme que les résultats obtenus jusqu'ici ne montrent pas d'effets indésirables. Au quatrième jour, les rats sont profondément anesthésiés et mis à mort pour prélever les tissus.
Objectifs
Ce projet comporte deux objectifs : 1) Évaluer les différences sexuelles dans les expressions faciales et dans la lésion inflammatoire de la peau, avant et après l'induction de l'inflammation ; et 2) Évaluer les différences histologiques suite à l'induction d'un modèle de douleur inflammatoire au niveau de la peau de la face chez le mâle et la femelle.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le dimorphisme sexuel dans l'inflammation et d'améliorer sa mesure au laboratoire. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique s'intéressant aux douleurs chroniques.
Procédures
Les animaux recevront une injection sous-cutanée sous anesthésie générale (durée < 5 minutes). De brèves contentions à l'aide d'un chiffon seront réalisées (quelques secondes) pendant 4 jours, avec un maximum de 3 contentions par jour. Nous ne ferons pas des manipulations autres que celles necessaires pour prendre la face en photo (pas de test de comportement). Le jour 4, ils recevront une injection intrapéritonéale d'un mélange anesthésique (durée de l'intervention < 1 minute ; durée de l’anesthésie = terminale). Les injections sont effectuées par du personnel compétent, conformément aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale.
Impact sur les animaux
Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse de la region injectée. Afin de diminuer le stress lié à cette injection, nous ne ferons pas des manipulations autres que celles necessaires pour prendre la face en photo (pas de test de comportement). Les résultats obtenus jusqu'à present ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux.
Devenir
A la fin de la procedure, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus afin de réaliser une analyse histologique.
Remplacement
L’intégration de la douleur suite à l'induction de l'inflammation implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tous ces éléments. C’est pourquoi, il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.
Réduction
Le nombre de 6 rats /sexe est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif en sachant que nous utilison le cote de la face sans inflammation comme temoin. Egalment, afin de limiter le nombre d'animaux, l'etude observationel (photographique) et histologique est realisé sur les memes animaux.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé. L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 1 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée après une période d’adaptation. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation et seront mis à mort.
Choix des espèces
Le rat adulte est un des modèles les plus couramment utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les différents types de douleur inflammatoire sont majoritaires chez les adultes.
Etude des fluctuations de la fréquence cardiaque dans le contrôle des émotions
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
2 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec pour certaines une chirurgie de deux heures pour implanter un émetteur de télémétrie et une autre d'une heure quarante-cinq pour poser une fibre optique dans le cerveau. Ces implants peuvent provoquer des douleurs pendant et après l'opération, et les souris opérées sont ensuite isolées. Viennent les tests comportementaux, dont un test aversif par groupe, sur quatre jours et jusqu'à une heure par séance, pour mesurer comment la fréquence cardiaque module la réponse à un signal de danger. L'effectif est justifié par "un logiciel statistique" et par l'expertise des deux équipes, sans qu'aucun chiffre de calcul ne soit donné pour ces 2 660 animaux.
Objectifs
Les parties centrales et périphériques du système nerveux autonome jouent un rôle clé dans la modulation de la fréquence cardiaque, cette dernière fluctuant en fonction de l’état émotionnel. Ainsi, des études cliniques suggèrent qu’une fréquence cardiaque augmentée (tachycardie) est fréquemment associée à des niveaux d’anxiété élevés. Cependant, nous ne disposons que de très peu d’information sur les mécanismes neuronaux sous-tendant la communication cœur-cerveau et la manière dont celle-ci influence les réponses comportementales associées à des signaux prédictifs de situations dangereuses ou « menaçantes ». Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant la communication cœur-cerveau, ce qui constitue une première étape importante pour le développement d’approches alternatives pour le traitement de troubles anxieux généralisés. La réalisation de ce projet nécessite l'utilisation de souris mâles et femelles non génétiquement modifiées ainsi que de différentes lignées de souris transgéniques ayant une fréquence cardiaque augmentée (tachycardie) ou diminuée (bradycardie) afin de déterminer l’impact de la modulation de la fréquence cardiaque dans le contrôle des émotions.
Bénéfices attendus
A ce jour, les études visant à étudier l’impact de l’altération transitoire ou persistante de la fréquence cardiaque sur le traitement de stimuli prédictifs de menaces restent très parcellaires. De plus, la plupart des études ont été réalisées sur les mâles, alors que le dimorphisme sexuel cardiaque n’est plus à démontrer. Il est donc nécessaire de prendre en compte l’existence de ce dimorphisme sexuel cardiaque dans l’étude de l’impact de la fréquence cardiaque sur l’influence des réponses comportementales associées à des signaux prédictifs de situations « dangereuses ». Cette étude va nous permettre à la fois de mieux comprendre certains des mécanismes qui sous-tendent l’apparition de troubles anxieux, mais aussi de proposer de nouvelles approches thérapeutiques se basant sur une régulation de la fréquence cardiaque pour contrôler des réponses émotionnelles associées à des stimuli aversifs.
Procédures
La procédure prévoit : - Des injections intrapéritonéales (une injection par jour de comportement, 30secondes) - Des tests comportementaux dont certains sont aversifs : durée 45min à 1h sur 4jours (1 seul test aversif par groupe de souris) - Des actes chirurgicaux : implantation de transmetteurs pour la télémétrie (2h) ainsi que la mise en place de fibre optique dans des régions précises du cerveau (1h45)
Impact sur les animaux
La procédure prévoit actes chirurgicaux avec pose d’implants pouvant entrainer des douleurs per et post-opératoires (interventions modérées). Il sera aussi effectué des tests comportementaux pouvant entrainer un stress léger chez l’animal (interventions légères) Enfin la manipulation des animaux peut entrainer une gêne chez ces derniers (interventions légères).
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tissus pour analyses cellulaires et moléculaires de nos différentes lignées
Remplacement
Notre projet repose sur la caractérisation des mécanismes neuronaux et moléculaires associés à la fois aux modifications de la fréquence cardiaque et aux comportements adoptés face à des situations de danger/menace. Nous ne pouvons donc pas valider notre étude sur des modèles in vitro, l'utilisation d'animaux demeure la seule option à ce jour. La souris est l'organisme modèle le plus pertinent pour cela. En effet la bibliographie disponible montre que les souris fournissent un excellent modèle pour étudier à la fois la fréquence cardiaque et les réseaux neuronaux.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé grâce à la fois à un logiciel statistique et à l’expertise acquise par les deux équipes. Cela permet d’allier réduction du nombre d’animaux et validité statistique des expériences. Les souris vont suivre consécutivement différents tests afin de diminuer à la fois le nombre d’animaux utilisé et d’obtenir un suivi longitudinal de l’étude
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans des environnements enrichis (paille en carton, igloo ou maison en carton). Les souris seront isolées suites aux différents actes chirurgicaux. Afin de diminuer le stress, les souris seront manipulées quotidiennement par les expérimentateurs avant chaque procédure expérimentale. Un suivi régulier sera appliqué dès le début de nos expériences. Une grille de score avec des points limites sera mise en place dès l’apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies. Si l’animal atteint un des points limites il sera euthanasié. Cependant si l’animal montre des signes de « faiblesse » : la fréquence d’observation des animaux sera augmentée et un traitement adapté à la situation sera administré (désinfectant ou analgésique). Si aucune amélioration du bien être de l’animal n’est observé il sera alors ensuite euthanasié
Choix des espèces
Les souris fournissent des excellents modèles pour l'étude des réseaux neuronaux et des changements de fréquence cardiaque à la fois chez les mâles et les femelles. Nous disposons aujourd'hui de nombreux modèles murins transgéniques qui nous permettront d'atteindre les objectifs de notre projet. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes d’un point de vue médical. Nos études seront réalisées avec des souris adultes (entre 8 semaines et 24 semaines), ce qui permettra de travailler sur une système cérébral stable, mature, qui n'évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs semaines
Evaluation d’éventuels changements neurologiques induits par un candidat médicament et sa pharmacocinétique chez le rat
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 100 d'entre eux pouvant être réutilisés dans un autre projet après accord vétérinaire, les 400 autres tués pour des prélèvements d'organes et de fluides. Ils reçoivent un candidat médicament par voie orale, chaque jour pendant trois mois ou jusqu'à deux fois par jour pendant six mois, avec jusqu'à huit prises de sang par jour sur six jours. Ils passent deux tests de mémoire et un test d'anxiété que le porteur ne nomme pas, un test où ils doivent s'accrocher à un axe en rotation et huit séries d'observations neurologiques. Le but est de vérifier que des composés agissant sur certaines cellules du cerveau ne provoquent pas de troubles dégénératifs ou psychiatriques, avant un premier passage chez l'humain que le porteur décrit comme une étape "indispensable". Il range aussi parmi les bénéfices une amélioration des connaissances scientifiques "pour le rat", alors que 400 des 500 rats sont tués à l'issue.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets sur la mémoire, l’anxiété, le comportement général de l’animal, l’activité locomotrice, la coordination motrice, les différents réflexes neurologiques, sur la température corporelle et le poids chez le rat d’un candidat médicament induisant des modifications au niveau des cellules spécifiques du cerveau. Ces cellules fournissent un mécanisme contre les blessures et les infections, mais l'activation chronique ou excessive est considérée comme préjudiciable et a été impliquée dans de nombreux troubles dégénératifs et psychiatriques.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de vérifier que des composés activant les cellules spécifiques du cerveau n’induisent pas de troubles dégénératifs et psychiatriques en fonction des expositions dans le sang.. Ce projet permettra également de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour le rat grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Les animaux seront administrés avec les composés à tester par voie orale (-2 min par administration généralement 1 administration / jour pendant 3 mois et jusqu’à 2 administrations par jour pendant 6 mois au maximum) puis auront 2 tests de mémoire d’une durée maximale de 40 min et 4 fois par test en 6 mois. Les animaux seront évalués d'un point de vue neurologique par une série d'observation pour une durée maximum d’1h et 8 fois en 6 mois. Enfin, l’anxiété sera évaluée pour une durée maximum de 5 minutes et 4 fois en 6 mois. Des prélèvements de sang sur animal vigile ou anesthésié pourront être effectués (2 minutes par prélèvement) avec un maximum de 8 prélèvements par jour et 6 jours non consécutifs sur 6 mois et des prélèvements de tissus pourront être réalisés sur animaux anesthésiés en fin d'expérience.
Impact sur les animaux
La manipulation lors du passage en cage d’hébergement aux arènes de test ou pour induire l’anesthésie ou lors de l’administration du composé à tester pourra induire un stress mineur de courte durée. Lors de certaines administrations nécessitant une aiguille, telles que l'induction de l'anesthésie, ainsi que lors des prélèvements, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. L'administration par voie orale qui se fera sur plusieurs mois pourra induire un léger stress de courte durée à chaque administration. L’anesthésie peut induire un stress à l’endormissement. Dans le test de coordiantion motrice, les animaux pourraient ressentir un léger stress par le fait de devoir s’accrocher à un axe en rotation. Ils pourront également resssentir un stress léger lié à la chute de l’axe ou de l'arène surélevée. Les effets potentiellement indésirables du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Les effets potentiellement indésirables feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'établissement d'une lésion ou d'un dysfonctionnement du système nerveux central ou périphérique. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques : 60 (30 mâles et 30 femelles) / par groupe. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (manipulation des animaux, habituation à la contention et habituation aux arènes expérimentales)• L'utilisation d'anesthésie adaptée associée à une analgésie pour la réalisation des prélèvements
Choix des espèces
Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur la mémoire, l'anxiété et les potentiels effets secondaires d'un produit sur le système nerveux central, la coordination motrice, l'activité locomotrice spontannée du fait des homologies entre le comportement humain et de ce rongeur et des homologies structurelles entre le système nerveux humain et de ce rongeur. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Détermination de la fenêtre temporelle optimale pour l’observation du manganèse dans le cerveau d’ovin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
20 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune anesthésiée trois fois en quatre ou cinq jours pour des séances d'IRM de deux heures à deux heures trente. Elles reçoivent aussi, sous anesthésie générale, une injection de manganèse dans la cavité abdominale, un métal neurotoxique à forte dose selon le porteur, et trois injections dans la veine jugulaire pour déclencher les anesthésies. Le porteur prévoit jusqu'à 20 brebis plutôt que 12 "pour pallier les pertes éventuelles liées aux longues anesthésies successives". Toutes sont tuées sous anesthésie après les acquisitions, le porteur expliquant qu'elles ne peuvent être réutilisées faute de savoir combien de temps le manganèse reste dans leur corps. Le projet se limite à caler la fenêtre d'imagerie avant de futures études sur les circuits cérébraux des interactions sociales et sexuelles chez les moutons, et ses mises au point "bénéficieront à des appels à projet ultérieurs", écrit-il.
Objectifs
L’objectif est de mettre en place la technique d’Imagerie par Résonnane Magnétique du manganèse in vivo à l'échelle du cerveau entier chez l’ovin. Les propriétés paramagnétiques du manganèse (Mn2+) permettent son utilisation comme agent de contraste pour l'IRM (MEMRI : IRM du ManganEse). C’est un composé qui pénètre et s'accumule dans les neurones actifs, donc sa concentration intracellulaire est le reflet direct de l'activité neuronale. Cette technique permet de visualiser les changements du cerveau en réponse à des stimulis. La dynamique du Mn2+ (biodisponibilité, pharmacocinétique) dépend de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin. Une première expérience pilote a été réalisée sur 5 animaux ; cette expérience nous a permis de déterminer la dose minimale de Mn2+ à utiliser. Nous avons également observé les zones de diffusion du Mn2+ 24h post administration. Il est nécessaire de compléter et d’affiner ces résultats, notamment en analysant des points de cinétique qui manquent à notre analyse : les temps 48, 72 et 96 heures post-administration de manganèse.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir la fenêtre temporelle optimale pour l’acquisition du meilleur contraste en IRM MEMRI. Après injection, la concentration du manganèse augmente graduellement dans les tissus du cerveau, puis sa détection atteint un plateau, persiste pendant plusieurs heures et ensuite décroit. C’est la fenêtre correspondant au plateau qu’il s’agit de déterminer chez l’ovin. Une fois cette fenêtre temporelle définie, nous pourrons réaliser les expériences d’IRM fonctionnelle. Les mises au point des conditions de dose et temps dans cette expérimentation préliminaire bénéficieront à des appels à projet ultérieurs. Ce projet est une étape clé dans la mise en œuvre des études d’IRM fonctionnelle chez les ovins en utilisant une approche MEMRI par réhaussement de manganèse.
Procédures
Entre 12 animaux et 20 animaux subiront les gestes techniques, 20 est un nombre maximal prévu pour pallier les pertes éventuelles liées aux longues anesthésies successives. Les animaux subiront 3 anesthésies sur une durée de 4 jours pour 6 à 10 animaux maximum, et 5 jours pour 6 à 10 animaux maximum, pour passage à l'IRM. La 1ère anesthésie durera 2h30, les 2 autres 2h. Ils recevront également une injection intra-péritonéale sous anesthésie générale. Ils subiront 3 injections par voie intraveineuse à la jugulaire pour induire les anesthésies (durée totale contention comprise d'une minute).
Impact sur les animaux
Bien qu’il soit un élément nécessaire au bon fonctionnement de l’organisme, le manganèse est cependant neurotoxique à forte dose. Chez l’homme, il provoque maux de tête, insomnies, pertes de mémoire, instabilité émotionnelle, dystonie, tremblements, troubles du langage et des troubles de la marche. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse.
Devenir
A la suite des acquisitions, tous les animaux seront mis à mort toujours sous anesthésie générale. En effet, ils ne pourront pas être réutilisés car nous ne savons pas combien de temps le manganèse reste dans l'organisme des animaux.
Remplacement
Cette étude d‘imagerie cérébrale permettant de déterminer la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste IRM ne peut être réalisée qu’in vivo. Il est en effet impossible d’étudier ou de reproduire ces expériences in vitro et encore moins in silico. Ce projet est un prérequis pour développer l’approche d’imagerie MEMRI qui permettra, ultérieurement, de mettre en place des projets longitudinaux, avec des nombres restreints d’animaux expérimentaux.
Réduction
Ce projet, qui concerne 12 animaux expérimentaux (20 animaux maximum) est nécessaire car il complétera et affinera les résultats obtenus lors d’une précédente expérience. L’évolution temporelle de la concentration de Mn2+ dans le cerveau d’ovins a été déterminée 24h, 72h et 120h après son administration. Les points 48h et 96h n’ont pas été étudiés et sont indispensables pour déterminer la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste. Nous avons planifié l’expérience de manière à acquérir des images IRM à deux temps post-administration de Mn2+ pour chaque animal, ce qui réduit considérablement le nombre d’animaux. Nous pensons qu’avec 4 temps d’analyse post-administration de Mn2+ et 6 animaux (10 animaux maximum) par temps (6 animaux imagés aux temps 24h et 72h et 6 animaux imagés aux temps 48h et 96h post-administration de Mn2+), la disponibilité du manganèse dans le cerveau des ovins au cours du temps pourra être modélisée par un ingénieur expert en pharmacologie. La taille de nos effectifs (6 individus par traitement expérimental) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances (tests paramétriques ou non paramétriques).
Raffinement
Pour limiter les stress liés à la manipulation des brebis, les 12 brebis (20 maximum) seront regroupées pour rester ensemble toute la durée de l’expérience et former ainsi un groupe social stable. Deux semaines avant les expériences, les manipulateurs iront quotidiennement approcher les brebis, les toucher et évoluer parmi elles pour établir un contact et lors de chaque visite, nous leur donnerons à chacune une poignée de granulés comme renforcement positif, ce qui participera à leur habituation. Nous n’avons pas observé d’effet néfaste de l’administration intra péritonéale de manganèse à la dose utilisée lors de l’expérience pilote, néanmoins, les brebis feront cette fois aussi, l’objet d’une surveillance accrue dans la période qui suivra l’administration de Mn2+, et ce jusqu’à l’anesthésie pour l’imagerie suivante. Au cours de cette période, l’apparition de tremblements, les difficultés de déplacement, la prise alimentaire seront particulièrement surveillés. Nous serons attentifs à la survenue de signes de mal être (position des oreilles, port de la tête, prostration). Dans le cas où de tels signes apparaitraient, un traitement analgésique sera administré. Nous avons opté pour une administration sous endoscopie du manganèse qui permet de nous assurer de la qualité de l’injection en intrapéritonéale ainsi que de la progressivité de l’injection : sous anesthésie générale, nous pouvons adopter une vitesse d’injection réduite susceptible de limiter l’apparition d’effets indésirables. Les animaux expérimentaux seront maintenus dans des conditions adaptées aux herbivores, litière de paille et foin ad libitum. Ils seront manipulés dans le calme par des agents expérimentés. Les animaux arriveront sur la plateforme 3 jours avant le début de l’expérimentation, pour s’habituer à l’environnement. Avant l’anesthésie, et pour réduire la météorisation et assurer quand même leur confort, ils auront accès à du foin de bonne qualité en quantité limité avec abreuvement adlibitum. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé.
Choix des espèces
L’espèce ovine sera utilisée dans ce protocole car cette approche d’imagerie MEMRI sera utilisée pour étudier les circuits cérébraux impliqués dans les interactions sociales et sexuelles dans cette espèce. Un lot homogène de brebis de 18 mois sera utilisé, car nous souhaitons que cette approche soit validée dans les conditions où les animaux ont terminé leur développement. Dans un premier temps, cette approche sera développée chez les brebis car ce sont elles qui sont présentes majoritairement en élevage. Elle sera ensuite transférable (dose de MnCl2+ et temps de diffusion de manganèse jusqu’à la phase plateau) chez les béliers. Un essai avec quelques individus sera réalisé plus tard pour la validation chez les mâles. Aucune différence dans la distribution cérébrale du manganèse dans le cerveau entre les mâles et les femelles n’est cependant attendue.
Etude du rôle de la SUMOylation dans la régénération intestinale.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une substance ajoutée à l'eau de boisson provoque chez elles une inflammation de l'intestin : 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur table sur une régénération complète de l'épithélium intestinal en trois jours et sur une expérience arrêtée une semaine après l'administration, et n'attend donc ni perte de poids ni effet prolongé. Le poids, la consistance des selles, la diarrhée et la présence de sang sont pourtant surveillés deux fois par jour au titre des points limites. La mise à mort sert à prélever organes et sang, avec l'annonce qu'un maximum d'analyses sera tiré des échantillons récoltés.
Objectifs
Cette étude est la continuité d’un autre projet : Il vise à déterminer l'importance d’un processus appelé "SUMO" pour "Small Ubiquitin-like Modifier" dans la régénération de l'épithélium intestinal après lésions. Dans un contexte pathologique où des lésions mal réparées de l’épithélium conduisent à des maladies intestinales chroniques, telles que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, ce projet participera également dans le futur à contribuer à l’avancée des recherches pour l’élaboration de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux déterminer le rôle de la molécule appelée SUMO dans la régénération intestinale. En effet, on sait que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) sont dues à des lésions de la paroi intestinale qui ne sont pas réparées efficacement et qui conduisent ainsi à une inflammation chronique de l’intestin. Mais les mécanismes exacts à l’origine de ces maladies sont encore mal compris et les traitements actuels, qui soignent uniquement les symptômes, ne permettent pas de guérir réellement les patients. Comme il a déjà été montré que SUMO agit sur le maintien de l’identité cellulaire et que sa diminution favorise la plasticité des cellules, notre étude nous permettra de valider également du processus appelé « SUMOylation » comme un mécanisme important impliqué dans la régénération intestinale. Cette étape permettra in fine l’élaboration de nouvelles thérapies ciblant des patients atteints de MICI.
Procédures
Les animaux seront soumis à un traitement par le DSS dans l’eau de boisson .
Impact sur les animaux
Pour l’étude de la régénération intestinales, nous induisons des lésions intestinales en administrant un produit dans l’eau de boisson des souris. Le mode d’administration par l’eau de boisson n’induit pas de douleurs au moment de l’ingestion. Le produit entrainera ensuite une inflammation de l’intestin qui peut occasionner des effets indésirables de nature modérée. Il est possible que les animaux puissent souffrir d'une légère colite, dérivée de la perte transitoire de la capacité d'absorption de l’intestin. Cependant, l'épithélium intestinal a la capacité de se régénérer complètement en seulement 3 jours à la suite d’une blessure, de telle sorte que les animaux ne subiront pas d'effets indésirables sur une durée prolongée. De plus, les animaux étant maintenus en expérience seulement une semaine au maximum après l’administration du produit, nous n’attendons donc pas de perte de poids des animaux ni d’effets secondaires additionnels durant cette courte période.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour pouvoir prélever les organes et sang nécessaires à nos analyses et évaluation de l’inflammation. Un maximum d’analyses sera effectué à partir des échantillons récoltés.
Remplacement
Il n'existe pas et il ne peut y avoir d'alternatives non animales dans l'étude du processus de régénération de l'épithélium intestinal, car il s'agit d'un processus auquel participent une multitude d'organes et de types de cellules, ainsi que le microbiote lui-même, présent à l'intérieur de la lumière de l'intestin, qui joue un rôle clé. Pour cette étude, des animaux vivants sont nécessaires car le maintien de l'ensemble du microenvironnement intestinal est essentiel, afin d'établir le rôle de chaque élément dans le dit processus.
Réduction
Les animaux auront le même fond génétique pour limiter les variations entre les lignées. - Le plus grand nombre d'analyses possible sera effectué sur chaque animal, afin d'éviter d'en utiliser inutilement. - Chaque expérience sera réalisée 3 fois de manière indépendante les unes des autres pour assurer la reproductibilité des expériences. Cependant, si les deux premières expériences génèrent des résultats identiques, la troisième ne sera pas effectuée. -La deuxième procédure ne sera faite que si la première confirme un rôle du processus appelé « SUMOylation » dans la régénération intestinale. - Les analyses statistiques seront effectuées en prenant en compte la structure des données (cages et répétitions principalement) en utilisant des modèles statistiques à effets mixtes. Les animaux contrôles seront comparés aux animaux traités par groupes de 10 (5 mâles + 5 femelles), ce qui permettra de mettre en évidence les effets attendus (d~1, effets importants) avec suffisamment de puissance (80%). - La deuxième répétition d'une expérience ne sera réalisée que si les effets néfastes sur l'animal sont minimes. En cas de découverte d'effets secondaires sévères au cours d’une expérience, le traitement sera interrompu. Les animaux ne peuvent pas être réutilisés car ils seront mis à mort au cours du processus.
Raffinement
Les symptômes attendus sont ceux de la colite. Tout au long de l’étude, les animaux seront donc surveillés tous les jours deux fois par jour pour les points limites spécifiques dans le cas de la colite (poids corporel, consistance des selles, présence de sang dans les selles et diarrhée). Afin de minimiser la douleur liée à la colite, -Du gel hydrique sera mis à disposition dans la cage pour éviter la déshydratation et faciliter le rétablissement des animaux.
Choix des espèces
La souris de laboratoire est l’espèce indispensable dans la réalisation de ce projet. Il s'agit tout d’abord d'un mammifère, dont le système digestif est essentiellement composé des mêmes structures et des mêmes types de cellules que ceux de l’Homme. L’étude de la régénération intestinale dans cette espèce est donc tout appropriée. De plus, la création de lignées génétiquement modifiées est un processus établi et relativement facile à mettre en place. Elle génère ainsi des modèles spécifiques pour étudier par exemple des types cellulaires donnés, ici cellules épithéliales intestinales et cellules souches, nous permettant ainsi de répondre à plusieurs questions. Les souris sont également faciles à entretenir et à manipuler et se reproduisent relativement rapidement. Toutes ces caractéristiques font de la souris de laboratoire un modèle idéal pour nos besoins. De jeunes souris adultes (entre 8 et 12 semaines) seront utilisées car il est nécessaire que le développement et la maturation de l'animal soient terminés, afin qu'ils n'interfèrent en aucune façon dans l'obtention de résultats, et avec un âge inférieur ou égal à 12 semaines de sorte que, de la même manière, le processus de vieillissement n’interfère pas.
Rôle d’une molécule dans la progression tumorale et étude d’une thérapie ciblant cette molécule dans des modèles murins
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 180 d'entre elles et sévère pour 840. Une partie reçoit une greffe de cellules de tumeur cérébrale par injection directe dans le crâne sous anesthésie, puis un suivi par imagerie une à deux fois par semaine pendant trente-deux semaines au maximum, avec les symptômes neurologiques, les céphalées et la perte de poids que le porteur associe à ce cancer. D'autres portent une tumeur greffée sous la peau du flanc, mesurée au pied à coulisse deux à trois fois par semaine. Le porteur décrit des cultures de cellules en trois dimensions "largement utilisées en parallèle", seules les thérapies efficaces sur ces organoïdes passant chez la souris, et conclut néanmoins que les tests précliniques sur animaux sont "indispensables".
Objectifs
Une protéine a été identifiée dans la survenue, la survie et la résistance des tumeurs du cerveau, cancers très agressifs et invasifs. Il sera vérifié ici les rôles de cette protéine en la supprimant ou en l’ajoutant au cours du développement des tumeurs. De plus, dans le but de développer un anticorps thérapeutique ciblant cette protéine, des nouveaux anticorps seront marqué par fluoresence afin de suivre leur capacité à ne cibler que les tumeurs exprimant la protéine.
Bénéfices attendus
Le cancer du cerveau étudié dans cette étude est l’une des plus fréquentes tumeurs originaires du cerveau, et en dépit des efforts de la recherche, cette pathologie reste incurable. Les traitements actuels sont très délétères et la survie des patients après diagnostic est de 12-18 mois. Cette étude déterminerait l’intérêt d’une nouvelle cible thérapeutique et participerait au développement d’un traitement supplémentaire pour la prise en charge de ces patients.
Procédures
Les souris recevant une greffe de cellules tumorales dans le cerveau subiront une seule injection intra-crânienne, sous anesthésie gazeuse et injection d’anti-douleurs en sous-cutanée (1 fois 30 minutes) en début de protocole afin d’induire le développement des tumeurs chez les souris. Ensuite elles subiront des manipulations pour les prises de poids (manipulation totale/souris = 1 minute, 2 à 5 fois par semaine) ou pour les suivis de croissance tumorale par imagerie sous anesthésie gazeuse et avec 1 injection d’une molécule permettant la visualisation (manipulation totale/souris = 10 minutes environ 1 à 2 fois par semaine) pendant toute la durée du protocole (maximum 32 semaines). Les souris recevant une greffe de cellules tumorales en sous-cutané sur le flanc subiront une injection (1 fois 40 secondes). A la suite de cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée. Ensuite elles subiront des manipulations pour les prises de poids (manipulation totale/souris = 1 minute, 2 à 3 fois par semaine) ou pour les suivis de croissance tumorale par des mesures au pied à coulisse (2 à 3 fois par semaine, 2 minutes de manipulation maximum donc 30 secondes d’immobilisation). L’anticorps sera administré par injection intraveineuse dans la veine de la queue (1 seule fois, 2 minutes de manipulation dont 3 secondes d’injection). Des prélèvements sanguins sont réalisés (5 fois, 2 minutes dont 2 secondes d’insertion de l’aiguille de la seringue dans la queue).
Impact sur les animaux
Toutes les souris prévues dans le protocole subiront différentes manipulations chaque semaine pouvant engendrer un stress pour des prises de poids et le suivi de la croissance tumorale. Les souris subiront également une injection intra-crânienne unique à 8 semaines, pour induire les tumeurs. Ces nuisances sont diminuées par la mise en place de précautions spécifiques à chaque geste. En particulier, l’injection intra-crânienne sera faite sous anesthésie et avec des antidouleurs adaptés. Ces animaux développeront des tumeurs avec les nuisances liées aux cellules tumorales de cancer du cerveau (symptômes neurologiques, des céphalées et une perte de poids). Certaines souris subiront des injections intraveineuses dans les veines de la queue qui pourraient entrainer un inconfort ou des inflammations au site d’injection.
Devenir
Tous les animaux porteurs de tumeurs seront mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet afin de pouvoir récolter les cerveaux ou les tumeurs pour des analyses biologiques. Les animaux non porteurs ne pourront pas être réutilisés et devront également être mis à mort afin d'éviter un développement de tumeurs de manière tardive.
Remplacement
Des travaux sur des cultures de cellules cancéreuses pour lesquelles notre protéine d’intérêt a été préalablement bloquée entrainent la mort de ces cellules. Les cancers du cerveau nous intéressent pour la diversité des cellules qui les composent ainsi que toutes les interactions entre elles = microenvironnement tumoral. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension de l’impact de notre protéine d’intérêt. D’après les publications scientifiques, cette diversité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires (qui contiennent en général un nombre très limité de types cellulaire différents) mais uniquement dans les tumeurs chez la souris où l’on retrouve un microenvironnement tumoral complet avec tous les types cellulaires comme les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires, les cellules des tissus touchés par ce type de cancer. Les test-précliniques sont aussi indispensables pour valider la capacité d’un nouvel outil thérapeuthique à atteindre la tumeur et pas d’autres sites dans le corps. Mais ce protocole reste complémentaire à des tests sur des cellules en culture en 3 dimensions appelés organoïdes largement utilisées en parallèle puisque seuls les thérapies ayant montré un effet significatif sur ces cellules tumorales en culture seront testées chez la souris.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, dans les expériences de suivi de la croissance tumorale les lignées seront testées selon des go/no go. En effet, les lignées seront testées une par une et dès que 3 lignées parmi les 9 auront répondu à l’inhibition de la protéine, les lignées restantes ne seront pas testées. Dans l'expérience d'imagerie des anticorps par fluorescence, les souris seront utilisées pour différents temps d’imagerie (15 min, 1h45, 6h et 24h).
Raffinement
Les souris ont une période d’habituation aux expérimentateurs qui vont suivre le protocole. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, avec un milieu enrichi pour améliorer leur bien-être (maison en carton, coton). Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux (pesées, suivi de la croissance tumorale etc.) plusieurs fois par semaine permettra la recherche de tout signe de souffrance. Des points limites adaptés sont mis en place au-delà desquels, si aucun moyen de correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. L’implantation intra-crânienne, les injections et le suivi de croissance tumorale sont réalisés par du personnel qualifié afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux avec au besoin anesthésie et anti- douleurs adaptées.
Choix des espèces
La souris sera le modèle dans ce protocole, nous utiliserons des femelles à 8 semaines pour induire la formation de tumeurs d’une manière proche à ce type de tumeurs chez l’Homme, puis nous suivrons cet avancement chez les mêmes individus. La souris est utilisée car elle permet de maintenir la diversité cellulaire dans les tumeurs qui est nécessaire à l’étude de notre protéine d’intérêt. De plus cette protéine n'est pas exprimée dans toutes les espèces mais on retrouve une forte ressemblance entre la forme humaine et murine, justifiant encore l'usage des souris. En dernier lieu, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils destinés à l'analyse des tumeurs qui n'existent pas tous pour d'autres espèces que l'homme et la souris.
Effet des opiacés sur les neurones à orexine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris utilisées ont été construites pour perdre leurs neurones à orexine, ce qui reproduit chez elles les symptômes de la narcolepsie humaine, cataplexie comprise. 36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la moitié et modéré pour l'autre. Elles reçoivent une injection de morphine par jour pendant quatorze jours, dont le porteur indique qu'elle provoquera une tolérance ou une hyperalgésie, et il précise que la nature même de l'étude interdit de leur administrer un antalgique. Il affirme par ailleurs qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer ce protocole, sans dire laquelle il a examinée.
Objectifs
La narcolepsie de type 1 (avec cataplexie) est une maladie neurologique rare qui se caractérise par une hypersomnolence pendant la journée, une intrusion de composantes du sommeil paradoxal (SP) pendant l’éveil et des attaques de cataplexie. Les épisodes de cataplexie sont des pertes de tonus musculaire induites pendant l’éveil, lors d’un contexte émotionnel positif fort, provoquant souvent la chute de la personne. Les chutes peuvent être brutales et conduire à des blessures. Nous avons montré que cette pathologie est la conséquence de la dégénérescence des neurones à hypocrétine aussi connus sous le nom d’orexine. Les souris déficientes en orexine montrent l’ensemble des symptomes observés chez les patients. L’hypothèse actuelle est que la mort des neurones à orexine serait due à une attaque autoimmune ciblée. Les données en post-mortem montrent que 5-10% des neurones à orexine persistent chez les patients narcoleptiques, et que le nombre de neurones à orexine persistant semble être plus important sous l’effet de traitements de type morphinique. Du fait de l’implication de l’orexine dans différentes fonctions et de la diversité des symptômes et co-morbidités observés, nous avons récemment étudié l’hétérogénéité moléculaire des neurones à orexine. Notre objectif est aussi de comprendre pourquoi certains neurones à orexine sont épargnés et survivent à la condition autoimmune. Dans cette étude, nous avons mis en évidence 3 sous-populations de neurones sur la base de leur expression génique. L’objectif de ce projet est de déterminer quelle(s) sous-population(s) de neurones à orexine est(sont) sensible(s) à la morphine et si elle est susceptible d’être épargnée par une attaque autoimmune ou en condition de neuro-inflammation
Bénéfices attendus
La perte des neurones à orexine est la cause de la narcolepsie. Une meilleure connaissance de ces neurones et de leur diversité permettra de mieux appréhender la pathologie et ses comorbidités.
Procédures
Les souris vont soit recevoir 1 injection i.p./jour pendant 14 jours de morphine (ou de liquide physiologique). Les injections se feront sur animal vigil sous contention légère (environ 2 seconde).
Impact sur les animaux
Les souris vont soit recevoir 1 injection/jour pendant 14 jours de morphine (ou de liquide physiologique), qui va provoquer une tolérance ou une hyperalgésie à la morphine qui n’empêche pas les mouvements de l’animal.
Devenir
A la fin de la procédure ou en cas d’atteinte du point limite, les souris seront mises à mort. Le cerveau de toutes les souris sera prélevé pour des études histologiques.
Remplacement
Il n’y a pas de méthode alternative permettant de remplacer ce protocole
Réduction
Le nombre de groupes de souris et le nombre de souris par groupe sera réduit au maximum tout en préservant une puissance statistique significative. Le nombre de souris par groupe a été déterminé sur la base des études précédentes en tenant compte que des souris mâles et femelles seront incluses et que le taux de perte neuronale chez les souris orex-HA est variable d’une souris à l’autre. Ainsi le calcul de puissance à 80% indique un nombre de 8 à 10 souris par groupe (contrôle/traités, sauvage et orex-HA respectivement) pour observer une différence de 50% entre les animaux contrôles et les animaux traités.
Raffinement
Par le fait même de sa nature, l’étude ne permet pas d’administrer d'antalgiques. Les animaux sont hébergés dans des cages standards, bénéficiant d’un enrichissement social et environnemental adapté avec visites quotidiennes. Toute observation (visites au moins 1 fois par jour) de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue)…mettrait fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort. Pour limiter l’angoisse due aux tests pratiqués, une habituation de minimum une semaine est réalisée au cours de laquelle les animaux sont placés dans la pièce expérimentale pendant minimum 1h puis ensuite sont exposés aux différents tests sans appliquer le stimulus. Cela permet aux animaux de s’habituer à l’environnement et à l'expérimentateur limitant ainsi l’impact du stress lié à la procédure expérimentale.
Choix des espèces
La souris orexin-HA est le seul modèle animal de narcolepsie autoimmune existant. Elle exprime l’ensemble des symptômes observés chez l’homme et montre une perte très signficative mais pas totale des neurones à orexine. Il s’agira de souris adultes (10-12 semaines au début de la procédure) ayant atteint leur maturité cérébrale, possédant déjà un système locomoteur mature, un cycle circadien et ultradien veille-sommeil stabilisé et consolidé, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et d’une manière générale dans la littérature chez la souris dans ce domaine des neurosciences.
Programme d’immunisation de poules pour la génération d’anticorps polyclonaux
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.
Procédures
5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole
Raffinement
Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)
Choix des espèces
La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.
Modélisation de l’interaction dynamique entre la production de méthane, l’efficience alimentaire et la résilience chez la chèvre en lactation
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Enfermées seules pendant 72 heures dans une enceinte close qui mesure le méthane qu'elles émettent, avec traite manuelle deux fois par jour, 160 chèvres en lactation vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un séjour pouvant provoquer vocalisations, baisse d'ingestion, perte de poids transitoire et agitation, et reconnaît que l'hébergement individuel est un facteur stressant. Il écrit pourtant que la procédure "n'implique aucune mesure invasive sur les animaux". Les chèvres retournent ensuite à l'élevage, où leur efficience alimentaire et leur résilience continuent d'être mesurées, les données servant à nourrir des modèles mathématiques de réduction du méthane.
Objectifs
Chez les ruminants, La dégradation des aliments se produit principalement dans le rumen (estomac) grâce à l'action d'une communauté microbienne complexe. Ce microbiote est responsable de la fermentation des aliments dont les produits principaux sont les acides gras volatils, le gaz carbonique et le méthane. La réduction des émissions de méthane des ruminants est un défi majeur pour le secteur de l'élevage. La conception de stratégies optimales de réduction de méthane nécessite la prise en compte des éléments de productivité et de résilience animale. En effet, une stratégie de réduction des émissions ne doit peut pas défavoriser la santé et la production (e.g. production du lait des chèvres laitières dans notre cas). Dans ce contexte, ce projet associe la modélisation mathématique et l’expérimentation animale pour contribuer à une meilleure compréhension des interactions entre caractères clés. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la dynamique de production de méthane de chèvres dont les caractéristiques et les capacités de résilience et d’efficience alimentaire sont connues. Les données résultantes seront utilisées pour le développement de modèles mathématiques. Par efficience alimentaire, on entend le rapport entre les produits animaux et les ressources mobilisées. Ce ratio résulte de la capacité des animaux à transformer les ressources alimentaires en produits (lait, viande). Par résilience, nous entendons la capacité à court terme de l'animal à faire face aux perturbations environnementales. Notre hypothèse est que des animaux présentant des différences en termes de leur efficacité ou robustesse pourraient présenter des différences dans leur dynamique de production de méthane. Nous espérons que ce travail produira des connaissances permettant la conception de stratégies de réduction de la production du méthane tout en conservant résilience animale et des productions optimales. Ce projet s’appuie sur des projets en cours et futurs de notre équipe autour de l’efficience alimentaire et la résilience.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des liens entre émissions de méthane par des ruminants et caractères d’intérêt clés, comme leur production de lait et leur santé ou bien-être Cette approche globale est centrale pour la conception des stratégies durables pour la réduction d’émission de méthane dans l’atmosphère. Le projet fournira, de plus, des données clés (cinétiques d’ingestion couplées aux cinétiques de production de méthane) pour les travaux de modélisation portés par notre équipe. Ces modèles prédictifs s’intègrent dans une démarche d’élevage de précision en produisant des outils d’aide à la décision pour le suivi de l’élevage et la formulation de stratégies alimentaires durables. En plus, les modèles mathématiques résultants sont des outils qui pourraient aider à réduire le besoin d'expérimentations animales pour prédire les réponses des animaux aux changements alimentaires, ce qui répond aux principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner).
Procédures
Pour toute la durée de la procédure, les animaux serons soumis à un hébergement individuel pendant 72 heures dans des enceintes fermées permettant la mesure de la production de méthane. Pendant le séjour dans les enceintes, les animaux serons soumis à une traite manuelle 2 fois par jour, pour un totale de 6 traites d’une durée d’environ 3 minutes chacune.
Impact sur les animaux
Les séjours (3 jours) dans les enceintes peuvent entraîner un stress en raison de l’hébergement individuel des animaux. Le séjour dans les enceintes peut conduire certains animaux à vocaliser et à diminuer leur ingestion, ceci conduisant à une perte de poids transitoire. Le séjour pourrait avoir un impact sur l’activité de l’animal (excrétions excessives, agitation ou immobilisation).
Devenir
La procédure de mesure de méthane n’implique aucune mesure invasive sur les animaux. Les chèvres retournent dans l’élevage à la fin.
Remplacement
Les modèles mathématiques résultants de ce projet seront des outils permettant d’étudier des alternatives durables pour la réduction de méthane. La construction des modèles doit impérativement reposer sur des données expérimentales obtenues in vivo, en prenant en compte la spécificité de l’animal (i.e. son comportement alimentaire et son niveau de production). Des systèmes in vitro existent pour étudier la production de méthane. Néanmoins, les conclusions basées sur ces études in vitro sont limitées car ce type de système ne tient pas compte des facteurs physiologiques importants de l’hôte, comme par exemple l’absorption des acides gras volatils à niveau du rumen. Pour ce projet, l’expérimentation animale est donc essentielle et irremplaçable. Le but est que, dans l’avenir, les modèles résultants du projet constituent une alternative à l’expérimentation animale dans certains cas spécifiques.
Réduction
La procédure impliquera l’utilisation de chèvres dont le comportement alimentaire, l’efficience alimentaire ou la résilience auront déjà été caractérisées dans des expérimentations précédentes ou à venir. L’objectif est de déterminer la production de méthane chez des animaux avec des profils d’efficience et résilience variés pour permettre d’évaluer notre hypothèse. Pour éviter des conditions environnementales d'inconfort (température, humidité), nous avons décidé de n'utiliser le dispositif qu'au printemps et à l'automne. Pour chaque saison, nous caractériserons la production de méthane d'animaux avec deux niveaux différents de résilience ou efficience alimentaire. L’expérimentation en 2 saisons nous permettra évaluer 2 stades de lactation. Nous utiliserons 4 animaux par traitement (16 animaux par saison, par an) afin de tenir compte de la possibilité que certains animaux ne réussiront pas la phase d'habituation et sortiront de l’expérimentation sans passer par la phase de mesure de production de méthane. Les animaux à utiliser seront sélectionnées en connexion avec des protocoles précédents permettant la caractérisation de leur résilience ou de leur efficience alimentaire. La procédure a une durée de 5 ans pour permettre élargir le phénotypage d’un nombre important des animaux dans notre installation expérimentale. Ces animaux auront une caractérisation en termes de leur résilience/efficience dans des expériences à venir dans le cadre de projets de recherche de l’équipe. La consolidation d’une base des données important intégrant des données de production de méthane, résilience et efficience alimentaire sera un atout pour le développement de modèles mathématiques de notre équipe.
Raffinement
L’hébergement individuel est un facteur stressant pour les animaux. Pour réduire les nuisances sur le bien-être animal, une phase d’habituation sera mise en place pour minimiser le stress dans les enceintes. Dans cette phase d’habituation, les animaux seront exposés à l’hébergement individuel de manière graduelle. Les enceintes sont équipées d’un matelas qui laisse passer l’urine pour améliorer le confort de l’animal. Des brosses et des petites chaines seront installées comme enrichissement. La présence de parois transparentes (qui permettent la visibilité avec leurs congénères et de la présence humaine) et la présence d’une veilleuse pour la nuit pendant les phases d’habituation et de mesures réduiront le stress. Les animaux seront observés régulièrement pendant toute la durée du protocole d’habituation et pendant les mesures. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Une caméra vidéo enregistrera en continu les comportements des 4 chèvres durant la période de mesures pour surveiller et détecter un éventuel changement de comportement. Les vidéos seront sauvegardées et visionnées systématiquement le lendemain matin par les animaliers. Si un animal présente des comportements anormaux durant la nuit, il sera sorti du dispositif. Une étape en amont des essais sera effectuée pour sélectionner des animaux qui, potentiellement, auront moins de stress. Cette sélection sera faite sur l’observation des comportements. L’observation de la production de lait et de la mamelle sera aussi prise en compte pour choisir des animaux ave une bonne conformation des trayons pour faciliter la traite manuelle.
Choix des espèces
Ce projet s’intègre dans le programme de recherche de l’équipe. Il utilisera l’animal modèle de l’unité : la chèvre laitière. Nous allons utiliser des chèvres en lactation dans des conditions similaires à l’élevage conventionnel de chèvres laitières .pour avoir des résultats représentatifs du contexte de production des élevages commerciaux. Nos travaux de modélisation suivent une approche mécanistique générique qui peut être appliquée aux autres espèces de ruminants y compris les bovins.
Restauration de l’odorat par implant olfactif chez la brebis anosmique site 3-4
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Jusqu'à trois chirurgies crâniennes sous anesthésie générale par animal, plus vingt séances d'entraînement à associer une odeur à une récompense : 20 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs bulbes olfactifs. Une électrode leur est implantée dans le bulbe olfactif, la stimulation est ensuite testée sur animal vigile pendant trente minutes, puis une IRM fonctionnelle est réalisée sous anesthésie. Une muselière rotative portant la partie externe de l'implant leur est fixée. Le porteur affirme que le recours aux brebis est "irremplaçable" pour évaluer la tolérance du dispositif et justifie le choix des ovins par des dimensions de bulbe olfactif proches de celles de l'humain et par un crâne encore assez fin entre 12 et 18 mois, ce qui rend les chirurgies plus rapides.
Objectifs
L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.
Procédures
10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4) .10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2). • 1 euthanasie (EU1)
Impact sur les animaux
Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.
Remplacement
Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.
Réduction
Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).
Raffinement
Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.
Choix des espèces
Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.