Procédures modérées
Evaluation d’une nouvelle stratégie anti-tumorale visant la synthèse des protéines chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
240 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules humaines de cancer du sein triple négatif leur sont injectées sous la peau, la tumeur est suivie au pied à coulisse et des composés sont administrés par voie orale ou intrapéritonéale plusieurs fois par semaine. Le porteur indique que la littérature ne prévoit pas d'effet secondaire notable de ces composés et que les animaux ne développant pas de tumeur seront tués huit semaines après la greffe. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire in vitro la distribution du composé et l'organisation d'une tumeur, et conclut à la nécessité d'un recours aux animaux.
Objectifs
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent en France et représente la première cause de décès par cancer chez la femme. (Source : Santé publique France). Il existe plusieurs types de cancer du sein dont un appelé triple négatif. Peu de solutions efficaces sont disponibles pour le traitement du cancer du sein triple négatif, aussi le but de ce projet est d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour se développer les cellules cancéreuses ont besoin de ressources importantes et notamment de protéines. Récemment, plusieurs facteurs nécessaires à la synthèse des protéines ont été identifiés, et vis-à-vis desquels les cellules cancéreuses sont dépendantes. L'inactivation de ces facteurs bloque les propriétés tumorales des cellules cancéreuses et induit leur mort. Les cellules saines ne sont pas affectées par l'inhibition de ces facteurs. Ceci a été montré in vitro pour plusieurs cancers dont la prostate, le colon ou le mélanome. Un travail préliminaire a été mené qui étend cette approche au cancer du sein de type triple négatif en utilisant une dizaine de modèles cellulaires, par des approches in vitro de culture de cellules en 2 dimensions et en 3 dimensions. En particulier in vitro deux approches ont été validées, l'une par inhibition de l'expression de ces facteurs par des outils génétiques, l'autre par inactivation de ces facteurs à l'aide de composés chimiques, qui sont des candidat médicaments en cours d'évaluation clinique dans d'autres pathologies. Il est maintenant nécessaire de vérifier si un effet anti-tumoral est obtenu lorsque les cellules sont organisées en tumeur. Le modèle de choix utilisé est la greffe de tumeurs sous-cutanée de cellules tumorales humaines chez la souris immunodéprimée. La croissance des tumeurs sera suivie au cours du temps, puis les tumeurs seront collectées et analysées par histologie afin de déterminer l'impact des composés sur la prolifération et la mort des cellules tumorales.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anticancer en santé humaine. En effet, altérer la synthèse des protéines des cellules cancéreuses est une nouvelle approche thérapeutique anticancer qui semble très prometteuse selon les premiers essais cliniques. Afin d'évaluer le véritable potentiel thérapeutique de cette approche, la communauté scientifique fait face à deux enjeux : premièrement, déterminer les cancers qui bénéficieraient de cette nouvelle approche ; deuxièmement, identifier de nouveaux médicaments. Ainsi les bénéfices de ce projet seront précisément de : 1- Apporter des données in vivo pour finaliser une étude in vitro en cours sur le cancer du sein de sous-type triple négatif. 2- Démontrer que les composés utilisés n'ont pas d'effets secondaires notables chez la souris. 3- Disposer de résultats obtenus dans des modèles animaux qui seront nécessaires avant d'initier des études cliniques chez l'Homme.
Procédures
Des cellules humaines de cancer du sein seront injectées sous la peau des souris. Pour cela l’animal est maintenu environ 15 secondes sans stress. Une seule injection de 0,1 mL est réalisée par animal. Suite à cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée dans les 2 à 3 semaines qui suivent. Le développement tumoral sera suivi par simples mesures au pied à coulisse (3x/semaines), sur animal vigile maintenu immobile environ 20 secondes. Les composés seront administrés soit par voie orale (2x/semaine ; 15 secondes) ou par injection intrapéritonéale (5x/semaines ; 10 secondes).
Impact sur les animaux
Implantation des tumeurs : Les cellules seront injectées sur animal vigile, pour cela l’animal est tenu en contention sans stress. Le volume d’injection est faible (0,1 mL). Une seule injection par animal, durée 15 secondes. Suite à cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée dans un délai de 2 à 3 semaines, sans géner la mobilité des animaux. Suivi des greffes de tumeurs : Le développement tumoral sera suivi par mesures au pied à coulisse, sur animal vigile tenu en contention. Fréquence : 3x/semaine, 20 secondes. Traitements : Les souris seront traitées par voie orale (3x/semaine ; 15 secondes) ou par injection intrapéritonéale (5x/semaine ; 10 secondes). La littérature indique que ces composés n'induisent pas d'effet secondaire chez les souris. Un des objectifs du projet étant de confirmer ces données, les animaux bénéficieront d'une vigilance toute particulière dans la détection de signes de souffrance. Un des traitement sera administré dans l’eau de boisson. Celui-ci a un goût amer, donc pour que les souris s’hydratent correctement, 3% de sucre sont ajoutés dans l’eau de boisson.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de récupérer les tumeurs pour des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques. Si des animaux, ne développent pas de tumeur, ils seront mis à mort 8 semaines post-greffe. Les animaux ont subi une injection de cellules tumorales, ils ne peuvent pas être réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
L'efficacité des composés a été validée in vitro, sur des cellules en culture, par plusieurs approches complémentaires. Néanmoins, l'efficacité d'un composé médicament dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de la tumeur et de son environnement. Aujourd'hui, il n'est pas possible de reproduire in vitro la distribution et l'élimination du composé dans un organisme, ni de reproduire à l'identique l'organisation d'une tumeur (par exemple la vascularisation ou la surveillance anti-tumorale). Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux pour valider l'efficacité in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au minimum requis pour ces expériences. Une étude préliminaire de validation sera effectuée sur un petit nombre d'animaux (40 souris) avant d'engager l'étude principale. Les protocoles utilisés permettent d'effectuer l'ensemble des analyses sur une seule tumeur pour éviter de dupliquer les expériences et donc le nombre d'animaux. La procédure prévoit la collecte post-mortem de l'ensemble des tumeurs et des organes de plusieurs animaux afin qu'ils soient stockés et disponibles pour des analyses complémentaires qui pourraient être nécessaires (par exemple lors de l'expertise externe des résultats), et ce sans l'utilisation d'animaux supplémentaires. Le nombre d'animaux a été fixé à 10 par groupe, en prenant en compte les éléments suivants : - Les contraintes statistiques. - Disposer d'un nombre minimum de 8 animaux par groupe, prenant en compte que la greffe ne prendra pas chez 10% des animaux et le risque qu'un animal meurt dans chaque groupe au cours de l'expérience. - La croissance de tumeur présente une variabilité de 30% - Observer un écart d'au moins 30% de baisse de croissance entre les moyennes des deux groupes
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de 5 individus. Les analyses de croissance des tumeurs seront non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requiert pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. Sur la base de données disponibles, deux des trois composés seront administrés par voie orale. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris sera suivi par pesée des animaux et par une analyse histologique de plusieurs organes sur quelques animaux traités. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.
Choix des espèces
La souris immunodéprimée est le modèle de choix pour l'analyse de greffes de tumeurs humaines en oncologie. Les expérimentations seront effectuées sur des femelles immunodéprimées de 6 à 8 semaines, âge où la prise de greffe est la plus efficace et la plus homogène. De plus, les femelles présentent un caractère moins agressif que les mâles, ce qui permet un remaniement plus facile de la composition des cages lors de la constitution de groupes d'animaux.
Conséquences de micro-biopsies musculaires répétées sur la nage des poissons
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
60 poissons rouges vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Ils subissent deux micro-biopsies musculaires sous anesthésie à quinze jours d'intervalle, alors que le projet vise précisément à valider une méthode d'échantillonnage sans mise à mort. Le porteur décrit des risques d'infection des plaies et de stress, et indique que tous les poissons seront finalement tués pour caractériser les conséquences des biopsies et le fonctionnement mitochondrial. Il présente ce projet comme relevant des 3R et affirme que seule l'expérimentation sur animaux permet une étude intégrative de "l'ensemble de l'organisme".
Objectifs
Le but de ce projet est d’étudier les conséquences de micro-biopsies musculaires répétées chez le poisson. Le développement de ces méthodes moins invasives pour obtenir des échantillons utilisables à des fins expérimentales apparait comme nécessaire et indispensable. En effet, une fois validées, ces méthodes s’avèreront précieuses dans un contexte éco-physiologique, car elles permettront à terme, de réaliser 1) des protocoles expérimentaux longitudinaux, c’est-à-dire utiliser le même individu pour étudier les conséquences physiologiques de stresseurs environnementaux (par exemple), ayant pour finalité une réduction drastique du nombre d’individus expérimentés et 2)
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but principal de valider la méthode de punch biopsie chez les poissons pour réaliser des protocoles de bioénergétique musculaire, sans mise à mort des individus, ce qui permet de réfléchir à de nouveaux protocoles avec suivis longitudinaux sur les mêmes individus, ou sur de nouveaux modèles moins classiques (espèces sauvages). Les bénéfices attendus à court terme seront donc la validation cette méthode, tant au niveau de la fonctionnalité des échantillons biopsiés, qu’au niveau de la récupération des poissons ayant subi les biopsies. De plus, comme ce projet s’inscrit directement dans le contexte de la règle des 3 R, les bénéfices attendus se trouvent à différents niveaux : - Réduction du nombre d’individus : au niveau statistique, l’analyse par mesures répétées, où l’individu est son propre contrôle, permet d’augmenter la puissance des tests permettant ainsi de diminuer le nombre d’individus expérimentés, et de fait, cette méthodologie est tout à fait en accord avec le « Reduce » des 3 R en éthique animale (Sneddon et al., 2017). - Utilisation d’organismes non modèles : en évitant d’euthanasier les poissons, cela permettrait d’établir des protocoles portant sur la bioénergétique cellulaire sur des espèces sauvages ou avec des restrictions d’utilisation liées à un statut particulier. Cela permettra d’étudier les mécanismes cellulaires chez des organismes non issus d’élevage, et donc parfois plus pertinents pour répondre à des problématiques d’écophysiologie ou de conservation. - Suivi longitudinal des mesures de la bioénergétique cellulaire sur des espèces non-modèles : la combinaison des deux protocoles permettrait d’étudier plus finement la mise en place des variations métaboliques des poissons en réponse à des contraintes environnementales. - Raffinement de la méthode d’anesthésie : en évaluant les effets potentiellement positifs de la lidocaïne couplée à une anesthésie classique au MS222, ce projet pourrait grandement participer à améliorer la récupération post-chirurgie des poissons.
Procédures
Les poissons seront soumis à 2 micro biopsies musculaires sous anesthésie, réalisées à 15 jours d’intervalle.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de ces protocoles pourraient être l’apparition d’infections chez les poissons au niveau des plaies chirurgicales, une augmentation du stress entrainant une atteinte au niveau comportemental (diminution de l’activité, diminution de la prise alimentaire).
Devenir
Tous les poissons seront mis à mort, afin de caractériser les conséquences morphologiques de la biopsie (hématomes ?) et le fonctionnement mitochondrial final.
Remplacement
A ce jour, seule l’expérimentation sur animaux permet de réaliser une étude intégrative qui prend en compte l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques. Cela permet notamment de caractériser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour étudier de façon complète, les réponses métaboliques de l’animal face à son environnement.
Réduction
Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans cette étude. Il faut souligner le fait que cette étude a pour but, notamment de diminuer le nombre d’individus expérimentés. En effet, la validation de la méthode des micro-biopsies répétées permettra un suivi temporel du fonctionnement mitochondrial, où chaque individu deviendra son propre témoin et de fait la variation interindividuelle sera directement prise en compte au niveau statistique.
Raffinement
Les différentes phases du protocole (Anesthésies, et biopsies puis métabolisme in-vivo, performances de nage et bioénergétique cellulaire) sont bien établies chez les poissons et maitrisées au laboratoire. Lors des procédures de biopsie, les poissons seront anesthésiés soit au MS222 (selon les recommandations en vigueur), soit au MS222 + Lidocaïne hydrochloride (utilisé ici comme analgésique). Afin de favoriser une récupération rapide de la biopsie, une incision de la peau permettra au punch à biopsie d’attendre le muscle rouge sans enlever de peau au poisson. un pansement en poudre de type Orahésive sera appliqué sur l’incision ce qui favorisera une cicatrisation cutanée. De même, lors des protocoles non invasifs in vivo (mesure de la consommation d’oxygène associée aux performances de nage et tests comportementaux) un des principaux objectifs est de limiter au maximum la souffrance et le stress des animaux. Chaque geste contraignant (mesure et placement des poissons dans les tunnels de nage) sera réalisé sous anesthésie légère, suivi par un temps d’acclimatation de 12h. Les poissons seront à l’abri de toute nuisance visuelle et sonore pendant la récupération et les expériences. Cela permet d’obtenir des mesures physiologiques valides et fiables, qui ne sont pas influencées par un état de souffrance, stress ou agitation de l’animal. Au niveau des expériences de bioénergétique, les individus seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur avant de prélever des échantillons tissulaires. Tout au long de l’étude, les poissons seront surveillés quotidiennement et dès l’apparition de signes de mal-être, les individus seront sortis du protocole et remis en conditions standard d’élevage.
Choix des espèces
Le poisson rouge est un modèle pertinent pour cette étude expérimentale car il présente des avantages importants : - 1) facilité d’acquisition par un établissement éleveur et de stabulation en animalerie agréée. Cette espèce est déjà communément utilisée au laboratoire - 2) population homogène en termes de taille et d’âge permettant d’avoir des paramètres morphologiques également homogènes. Il permet d’utiliser différents outils expérimentaux, afin de caractériser les paramètres in vivo et d’avoir à disposition suffisamment de matériel biologique pour les études au niveau in vitro. - 3) modèle biologique couramment utilisé en recherche, d’où une ressource bibliographique très bien fournie. Les poissons utilisés seront de jeunes adultes, dont la taille sera adaptée à l’utilisation des tunnels de nage à disposition au laboratoire.
Tests précliniques sur des modèles de maladie du greffon contre l’hôte (GvHD)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur provoque chez des souris immunodéficientes ou au système immunitaire humanisé une réaction du greffon contre l'hôte, puis administre des composés par injection ou par gavage, pour tester des traitements au fil de cinquante études précliniques en cinq ans. Il indique que la maladie provoque une atteinte de la peau, une perte de poids, une prostration et des difficultés à se déplacer. Il affirme qu'aucun environnement in vitro ne reproduit cette pathologie et juge le modèle murin "indispensable".
Objectifs
La réaction du greffon contre l’hôte ou GvHD (Graft versus Host Disease) est un syndrome qui se développe à la suite d’une transplantation chez un patient (eg : moelle osseuse, cellules souches, organes, tissus). Les cellules immunitaires présentes dans le greffon du donneur identifient le receveur comme étranger et essayent de l’éliminer. Cela peut se manifester par des dommages au niveau de la peau, des muqueuses, du foie, du système digestif ou des poumons. La GvHD est fréquente dans les cas de transplantation allogénique (le patient receveur et le donneur diffèrent sur le plan génétique) et est associée à une forte morbidité, ainsi qu'à une forte mortalité. Le traitement standard de la GvHD est constitué de glucocorticoïdes (prednisone). Ces traitements ont des effets immunosuppresseurs pouvant être accompagnés d’importants effets secondaires. Par exemple, ils augmentent les risques d’infections et de cancers. Pour ce projet, la GvHD sera induite chez des souris immunodéficientes ou ayant un système immunitaire humanisé afin de mettre à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier cette pathologie et de développer des traitements potentiels.
Bénéfices attendus
En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier cette pathologie et de conduire des tests précliniques davantage prédictifs des effets qu'auront les candidats médicaments sur son utilisateur final : l'Homme.
Procédures
Injection intraveineuse ou intrapéritonéale des cellules mononucléaires d'une durée de 10 à 15 secondes. Prélèvements sanguins: la fréquence et les volumes d'administration seront déterminés sur base du poids de la souris. A titre d’exemple, le volume maximum prélevé sera de 100 μL par semaine pour une souris de 25 gr. La durée des prélèvements est de 10 à 15 secondes. L’administration de composés de recherche : réalisée par voie entérale (gavage, incorporation dans l’alimentation) ou parentérale (veineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intra-musculaire). Les volumes à administrer seront préétablis par le vétérinaire d’établissement et le comité de bien-être. A titre d’exemple, pour une souris de 20 g, la limite d’administration sera de 400 μL per os; 200 μL par voie sous-cutanée; 200 μL par voie intrapéritonéale; 50 μL par voie intramusculaire et 200 μL par voie intraveineuse. La durée des administrations est de 10 à 15 secondes.
Impact sur les animaux
Une fois développée, la GvHD induit un syndrome inflammatoire potentiellement douloureux, se manifestant notamment par une atteinte de l'intégrité de la peau, une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer. et des effets potentiellement toxiques de composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Ces effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les souris auront subi deux procédures modérées, une réutilisation n'est donc pas envisagée.
Remplacement
Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un environnement complexe permettant de mimer les différents composants du système immunitaire impliqués dans cette pathologie. Le modèle murin constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement de thérapies innovantes permettant de soigner la GvHD.
Réduction
Chaque étude préclinique visant a tester l'efficacité d'un candidat medicament doit comprendre un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif et au minimum deux doses des traitements à comparer) comprenant chacun de 5 à 10 animaux afin d’obtenir des résultats fiables. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus des molécules à visées thérapeutiques. Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études précliniques.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Un morceau de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. Les souris recevront une période d’acclimatation de 7 jours, minimum, avant l’entrée en projet, et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h - 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Cette dernière sera objectivée par un score clinique permettant de prendre en compte les effets de la GvHD sur la souris.
Choix des espèces
Nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire sur les souris NXG, NCG et NOG. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 6 et 8 semaines pour les animaux non humanisés et à partir de 16 semaines pour les animaux humanisés. Leur suivi pourra durer jusqu’à l’âge de 40 semaines pour permettre le développement de la pathologie.
Formation du personnel, entrainement et raffinement des techniques chirurgicales
- Formation professionnelle
Rats : 40
Hamsters dorés : 20
100 animaux non-humains, soit 40 souris, 40 rats et 20 hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur les opère sous anesthésie, non pour produire des connaissances mais pour entraîner quatre membres du personnel à des techniques chirurgicales, avant une mise à mort et une nécropsie. Il indique que des complications peuvent provoquer une mort prématurée pendant la chirurgie et des infections locales chez les animaux réveillés. Il présente ce recours comme du raffinement et de la réduction, en affirmant qu'il diminuera "à terme" le nombre d'animaux utilisés.
Objectifs
Le recours à différentes techniques chirurgicales est régulièrement nécessaire dans les différents projets de recherche. Ce recours n’est envisageable qu’après l’acquisition d’un niveau d’expérimentation animale (applicateur ou concepteur) et l’obtention d’un diplôme complémentaire en chirurgie expérimentale. Ces formations ne rendent pas directement opérationnel sur tous les types de chirurgie et il est important de continuer à se former et à pratiquer pour obtenir un geste bon et un bon taux de réussite. Cela va dans le sens du concept de raffinement, mais également de celui de réduction de la règle des 3R. Effectivement en acceptant d’utiliser des animaux à des fins de formations et d’entrainement on diminue à terme le nombre d’animaux utilisés dans les projets en améliorant de taux de réussite et le bien-être animal global. Ce projet a pour objectifs de former, d’améliorer, de raffiner les techniques chirurgicales des principales chirurgies déjà réalisées ou à venir dans d’autres projets de la société. Le public visé concerne le personnel disposant déjà des niveaux réglementaires (4 personnes). La formation permettra également de valider 2 jours de formation continue dans le cadre des 3 jours de formation continue à réaliser par fenêtre de 6 ans. La formation sera assurée par une formatrice vétérinaire spécialisée en chirurgie. Après ces 2 jours, le personnel continuera son parcours de formation en relation avec le responsable de chirurgie du site.
Bénéfices attendus
À la suite de ce parcours de formation, une attestation sera délivrée et de nouvelles personnes pourront être identifiées pour réaliser ces différentes techniques dans le cadre de projets de recherches spécifiques faisant l’objet d’autres demandes d’autorisation de projet. La formation permettra également de valider 2 jours de formation continue dans le cadre des 3 jours de formation continue à réaliser par fenêtre de 6 ans. L'amélioration des techniques chirurgicales apportera un bénéfice scientifique en améliorant le taux de réussite et une optimisation de la réalisation des chirurgies dans les projets à venir, mais également en diminuant le nombre d'animaux utilisés à terme et le bien-être animal global.
Procédures
Tous les animaux de ce projet recevront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse (air/isoflurane). La chirurgie durera entre 15 min à 1h. Le poids corporel sera évalué quotidiennement pour tous les animaux après leur réveil et pendant 7 jours.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, il est possible que des complications lors de la chirurgie entraine une mise à mort prématurée de l'animal (sous anesthésie). Pour les animaux qui seront réveillés, un amaigrissement normal avec reprise de poids sera attendu dans les 3 jours post chirurgie. Des infections locales pourraient également apparaitre (plaies de grattage au niveau du dispositif).
Devenir
A la fin des procédures les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d'autres projets. Pour cette raison, les animaux seront mis à mort et nécropsiés à la fin de chaque procédure. Cette nécropsie permettra également de de vérifier la bonne implantation des dispositifs chirurgicaux et la création d'Abaque participant ainsi au raffinement des techniques chirurgicales.
Remplacement
L’entrainement à la chirurgie élémentaire peut être pratiqué sur cadavres et/ou mannequins. Passé cette étape, seule la chirurgie sur animal avec réveil et récupération permet de valider la technique et habilité le personnel. Le recours à l’animal est donc indispensable.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été déterminé pour obtenir un bon compromis entre réduction maximale et maitrise des différentes techniques chirurgicales. En fonction de l'atteinte du critère de réussite de manière précoce, le nombre d'animaux pourra être davantage réduit. En utilisant des animaux à des fins de formation, de raffinement, on réduit à terme, le nombre d'animaux utilisés dans les autres projets nécessitant de la chirurgie.
Raffinement
Ce projet a pour objectif de raffiner les techniques chirurgicales en faisant intervenir un vétérinaire spécialisé dans le domaine pour la formation. Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale gazeuse (air /isoflurane) et un traitement analgésique sera mis en place tout au long des procédures chirurgicales pour une bonne prise en charge de la douleur. Les animaux sont hébergés par groupe de 2 ou 3 dans des cages avec enrichissement (matériel de nidification + tube rouge) et habitué pendant 1 semaine avant le début des protocoles.
Choix des espèces
Les souris, les rats et les hamsters sont les animaux que nous utilisons au sein de notre animalerie, dans nos différents projets et la majorité de ces chirurgies est déjà réalisée et maitrisée par une personne suivant la formation (responsable de chirurgie). Afin de raffiner les méthodes et de former d’autres personnes, il est nécessaire de recourir à l’utilisation des espèces utilisées dans nos projets habituels. Jeunes adultes (8 - 10 semaines), ce qui correspond à l’âge moyen auquel les animaux sont utilisés dans nos différents projets où ils sont susceptibles de recevoir une intervention chirurgicale.
Evaluation d’agent de contraste pour l’aide à la chirurgie par imagerie optique NIR-II
- Recherche appliquée
- Cancers
563 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur greffe des tumeurs à des souris immunodéficientes, teste des composés fluorescents censés guider la chirurgie, puis pratique une excision de la tumeur à la joue. Il indique comme nuisances des douleurs et le stress des injections, de la contention et des anesthésies. Il affirme que le projet peut déboucher sur des brevets ou une start-up et qu'il devient "nécessaire" de passer à l'animal après des essais sur œufs de poule embryonnés.
Objectifs
Nous voulons utiliser des composés fluorescents pour l'aide à la chirurgie des cancers. Nos objectifs sont donc de : - Valider le choix des fluorophores dans un modèle animal adapté; - Déterminer les conditions optimales d'utilisation des fluorophores (concentration, dose, délai entre injection et imagerie etc); - Comparer les propriétés des nouveaux fluorophores avec celles de fluorophores déjà utilisés chez l'homme - Réaliser la preuve de concept in vivo de l'aide à la chirurgie dans un modèle adapté.
Bénéfices attendus
Nous espérons démontrer l'intérêt et le potentiel des nouveaux fluorophores dans l'aide à la chirurgie des tumeurs, ainsi que leurs avantages par comparaison avec les standards utilisés en clinique. Cette preuve de concept pourrait entrainer de nouveaux brevets, ou favoriser la création d'une start-up basée sur cette technologie.
Procédures
Pour l'éude de pharmacocinétique : prélèvement sanguins sur animaux vigiles : maximum 7 prélèvements sur 24h, maximum 48h. (9 prélèvements au total dans le cas extrême). Pour l'étude de l'aide à la chirurgie: excision tumorale au niveau de la joue de l'animal; 1 seule fois, 15 minutes maximum d'opération.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sont : immunodéficience des souris, douleurs et conséquences des injections sous-cutanées, orthotopiques et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies.
Devenir
Euthanasie sous anesthésie générale gazeuse (Isoflurane 4%) de l'ensemble des animaux avec prélèvements de pièces anatomiques/organes/sang.
Remplacement
Ce projet a été initié au laboratoire en 2016. Afin de réduire le nombre de composés à évaluer, beaucoup d'essais visant à évaluer les propriétés optiques des composés ont été réalisés par imagerie de gouttes de solution. Nous avons ensuite réalisé des investigations in vitro ainsi que des essais sur des oeufs poule embryonnés. Ceci nous a permis de remplacer un certain nombre d'animaux. Cependant, le projet avance en maturation et nous devons évaluer chez l'animal l'apport de ces fluorophores sur l'aide à la chirurgie. Il devient nécessaire d'utiliser des animaux.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, nous étudierons seulement 3 fluorophores (seul ou couplés à un anti-EGFR ou à un anti-PD1) contre une dizaine initialement, et ceci sur une partie des animaux. Par la suite, un maximum de 2 de ces 3 fluorophores sera conservé pour les investigations.
Raffinement
Nous utiliserons des souris Nude, qui représentent le modèle le plus proche de la physiopathologie humaine, permettant le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, enrichi avec des tunnels en carton et morceaux de papier pour y faire un nid. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La croissance des tumeurs des voies aéro-digestives supérieures
Choix des espèces
Nous développons des composés pour le diagnostic et la thérapie des cancers. Les modèles animaux permettent d’avancer dans la mise au point de nouveaux agents de contraste et de nouvelles thérapies anti-tumorales, et procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. La souris nude immunodéficiente est le modèle le plus proche de la physiopathologie humaine, permettant le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. La méthode utilisée pour induire une tumeur est rapide et reproductible, et la bonne connaissance de ce modèle de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont connues (taille de la tumeur éthiquement acceptable...). C’est également le modèle expérimental robuste et adapté à l'aide à la chirurgie. Souris NMRI nude de 6 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale, avant le pic de production de leucocytes NK (Natural Killer) à l’âge de 8 semaines.
Etude du rôle d’une nouvelle protéine impliquée dans la sénescence et l’inhibition de l’initiation tumorale pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur les irradie à faible dose et suit le développement d'adénomes pulmonaires par scanner sous anesthésie, pour tester le rôle protecteur d'une protéine contre le cancer du poumon. Il indique que des difficultés respiratoires sont possibles mais prévoit la mise à mort avant que les lésions ne soient trop importantes. Il affirme qu'il est "nécessaire" de démontrer l'effet à l'échelle d'un "organisme entier" et développe en parallèle des organoïdes de poumon.
Objectifs
Le patrimoine génétique de nos cellules est constamment soumis à des stress qui induisent des anomalies. Les cellules se sont dotées d’un arsenal de molécules permettant de réparer ces anomalies. Ces molécules agissent en tant que barrière anti-tumorale. Au cours du processus par lequel une cellule devient tumorale, il est fréquent que plusieurs de ces molécules soient inactivées, et ceci permet l’émergence de mutations. Le but du projet proposé ici est de démontrer qu’un nouvel acteur de ces voies de réparation agit comme une barrière anti-tumorale pour protéger le tissu pulmonaire in vivo. Les résultats obtenus pourraient ouvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le cancer du poumon non à petites cellules reste un cancer fatal et la résistance aux traitements est fréquente. Découvrir de nouveaux acteurs impliqués dans les mécanismes de protection du patrimoine génétique des cellules et de nouveaux gènes suppresseurs de tumeur est donc primordial pour accroitre les connaissances et ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du cancer du poumon
Procédures
Les animaux seront imagés avec un scanner sous anesthésie gazeuse. La durée de l’acquisition au scanner est de 2 min et l’anesthésie de 5 min.
Impact sur les animaux
Les souris seront irradiées à des doses faibles ce qui réduira le risque d’affecter les épithéliums à fort taux de renouvellement tels que la muqueuse intestinale. Des difficultés respiratoires seront possibles du fait du développement d’adénomes dans le tissu pulmonaire mais le protocole prévoit une mise à mort pour analyse des tissus avant que les lésions ne soient trop importantes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyse des tissus pulmonaires.
Remplacement
Jusqu’à présent ce projet a été mené sur des lignées de cellules humaines in vitro. Afin de démontrer le rôle anti-tumoral du gène d’intérêt dans l’objectif de publier ces résultats, il est nécessaire de démontrer l’effet à l’échelle d’un organisme entier.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l’expérience sera suffisant pour permettre une interprétation statistique des résultats. L’utilisation d’un appareil d'imagerie de type scanner permettra de suivre l’évolution des lésions de manière longitudinale sur les mêmes groupes d’animaux et d’éviter le maintien inutile d’animaux en souffrance respiratoire. La mise en place de procédures pilotes contribuera à réduire le nombre d’animaux utilisés pour la phase expérimentale.
Raffinement
Une définition précise des points limites et une surveillance adaptée des souris permettra d'éviter toute souffrance, en particulier l'aspect des poils, la prostration, des difficultés respiratoires et l’isolement social seront les paramètres majeurs pris en compte. L’analyse par imagerie ainsi que les procédures d’inhalation seront réalisées sous anesthésie. De la nourriture hydratée sera fournie aux groupes de souris irradiées. Les expériences de détermination de la dose des irradiations à utiliser seront menées de façon séquentielle. Si la première dose donne des résultats satisfaisants, nous ne procéderons pas avec le 2ème test. En parallèle nous établissons des cultures organoïdes de poumon. Il s’agit de cellules primaires dérivées des animaux, maintenues et propagées en culture tridimensionnelle. Nous testerons si les réponses sont similaires in vivo et ex vivo. Le cas échéant, nos futures expériences pourraient être réalisées sur organoïdes.
Choix des espèces
La souris est le modèle mammifère comportant le plus grand nombre d'outils génétiques développés (technologie de transgénèse . Les modèles tumoraux pré́-cliniques sont bien établis. Les expériences seront réalisés sur des animaux adultes
Caractérisation d’un modèle de souris mutante de déficience intellectuelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur étudie une lignée porteuse d'une mutation liée à une déficience intellectuelle humaine, au moyen d'une batterie de tests comportementaux nommés, labyrinthe en Y, rotarod, mesure de la force musculaire, reconnaissance sociale et réponse à des stimuli sonores jusqu'à 110 décibels. Il indique comme effets un stress d'isolement et des douleurs modérées, avant une mise à mort par dislocation cervicale pour analyse du cerveau. Il affirme que le modèle souris est "nécessaire" pour étudier la mutation à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Les déficiences intellectuelles (DI) se caractérisent par des limitations significatives du fonctionnement intellectuel et des comportements inadaptés, qui impactent de nombreuses aptitudes sociales et pratiques quotidiennes. Ce handicap se manifeste avant l'âge de 18 ans et touche 1 à 3 % de la population générale. En France, cela représente environ 3,5 millions de personnes dont Le spectre des handicaps varie considérablement d'une personne à l'autre, allant de symptômes légers à sévères. L'apprentissage et la mémoire sont des processus nécessaires pour que les individus développent un fonctionnement intellectuel et un comportement adaptatif indispensables à une vie normale, ils sont associés à des processus moléculaires complexes au niveau des cellules nerveuses. Nos collaborateurs cliniciens ont identifié une mutation rare d’un gène chez des patients atteints de déficience intellectuelle. Les patients sont tous de sexe masculin et sont issus de familles consanguines. Ainsi, nous avons généré une lignée de souris avec la même mutation du gène humain et notre objectif est d’étudier les effets de cette mutation sur les cellules nerveuses ainsi que le comportement des souris, ce qui nous permettra de comprendre comment les effets cellulaires peuvent conduire au déficit intellectuel pour améliorer la compréhension de la maladie et permettre la découverte de nouvelles thérapies. Nous appliquerons, sur notre modèle de souris mutante, une large batterie de tests comportementaux pour évaluer les différentes fonctions cognitives et neurologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre comment la mutation de notre gène d’intérêt conduit à déficit intellectuel décrit chez l’homme. La caractérisation comportementale et moléculaire de la souris mutante sera essentielle pour identifier les déficits des circuits cérébraux causés par la mutation. À l'avenir, ce modèle pourrait être essentiel pour tester la pertinence thérapeutique des cibles moléculaires.
Procédures
Tous les animaux vont être soumis à l’ensemble des protocoles suivants selon l’âge: 9 semaines : implantation sous cutanée de puce pour identification de taille 2x12mm sous anesthésie générale. Durée : moins d’une minute 11 semaines : Etude de l'activité locomotrice dans des cages individuelles pendant 35 heures. 12 semaines : test du labyrinthe en Y, les souris explorent librement pendant 5 minutes. 13 semaines : Live mouse tracker, permet de mesurer le comportement individuel d’animaux en groupe par détection vidéo. Durée : 3 jours et 3 nuits. 14 semaines : *Analyse de l'apparence physique, du poids corporel, des réflexes neurologiques et des capacités motrices sensorielles. Durée : 5min. *Mesure de la force musculaire maximale des membres antérieurs et postérieurs avec une grille. Durée : moins de 5min. * Mesure de la capacité d'un animal à maintenir son équilibre sur un cylindre en rotation. Trois essais de 5min par souris, soit au total 15min. 15 Semaines : Reconnaissance sociale : évalue la préférence d'une souris pour un congénère par rapport à un objet placé dans un compartiment opposé. Le test est effectué pendant 2 jours consécutifs. La durée est de 10min le premier jour et 20min le 2eme jour. 16 Semaines : *Etude des possibles altérations des capacités de filtrage de l’information des animaux : différents stimuli sonores (entre 65 et 110dB) pour une durée maximale de 40ms sont aléatoirement émis et les réactions de l’animal sont enregistrées. La session dure environ 48min. *Etude des capacités de conditionnement aversif : Les animaux sont placés dans une enceinte avec des stimuli acoustique et visuel, d’une durée de 20 sec. La dernière seconde où les stimuli sont présentés, un choc électrique d’intensité modérée (1sec, 0.4mA) est délivré à la souris par le plancher. La durée est de 6min 20sec le premier jour et de 14min le deuxième jour. 17 semaines : *Etude de la sensibilité thermique : Placement de l’animal sur une plaque chaude, ne provocant pas de brulure, retrait de l’animal dès la première réaction de douleur d’une des pattes arrière (par exemple léchage ou soulèvement brusque…). Le temps maximum est de 30sec. * Etude de la sensibilité plantaire aux chocs électriques : détermination de la non-altération des capacités des souris à percevoir un choc électrique plantaire d’intensité modérée. Durée totale est de 4 à 5min par souris. 18 semaines : un prélèvement sanguin à la veine temporale superficielle sera appliqué à toutes les souris.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liées aux procédures expérimentales qui seront appliquées aux souris, et sont: le stress de l’isolement, douleurs modérées et contention et prélèvement sur animal vigile. La prise en charge de chaque nuisance est prévue.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale pour l'analyse histologique et moléculaire.
Remplacement
Une partie de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et est étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre du déficit intellectuel ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.
Réduction
Au total 24 animaux seront nécessaires à ce projet. Pour réduire le nombre d’animaux et éviter tout doublon, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les tests comportementaux et l'étude des structures cerebrales. Le nombre de souris utilisées dans cette étude a été calculé en tenant compte notamment de la variabilité inter-individus mais également pour l’application de tests statistiques adéquats : le test t de Student ou le test de MannWhitney selon la normalité des données.
Raffinement
Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seront euthanasiés pour éviter toute souffrance. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Une anesthésie gazeuse sera appliquée lors de la procédure d’identification des souris par puce électronique.
Choix des espèces
Le modèle souris est très pertinent et est necessaire pour étudier de la modification de notre gène d'intêret à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre du deficite intellectuel. Les animaux seront agèes de 9 semaines environ au début des tests comportementaux, afin d'étudier des animaux adultes.
Elevage d’un modèle murin de dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (projet multi-site 1/2)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
21 696 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie destinée aux croisements et à la production, les surnuméraires étant tués. Le porteur élève un modèle d'un nanisme héréditaire humain et génotype chaque animal par biopsie de la queue ou de l'oreille. Il indique qu'environ 30 % des souris homozygotes meurent dans les 48 premières heures de vie et 10 % développent des complications sévères comme une hydrocéphalie ou des troubles respiratoires, les survivantes pesant jusqu'à 30 % de moins que les autres. Il affirme qu'aucune démonstration n'est possible sans "modèle animal" de la maladie.
Objectifs
Le but de ce projet est de produire des lots d'un modèle murin de dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente. Ces lots seront utilisés afin de développer un traitement contre cette maladie. La SEDc est une dysplasie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée phénotypiquement par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de la rétine et d’une perte d'audition. Cette pathologie est due à des mutations perte de fonction dans le gène du collagène de type 2.
Bénéfices attendus
Ce projet aura des bénéfices pour l’homme à plusieurs niveaux. Actuellement, il n’existe pas pour cette maladie de traitements qui restaurent une croissance osseuse et qui permette donc aux patients de grandir mais surtout qui élimine les complications dues à cette pathologie. Ce projet pourra donc offrir à long terme un traitement pour soigner cette maladie. De plus, cette maladie étant encore peu connue, ce projet permettra à court terme de mieux comprendre sa physiopathologie grâce au modèle de souris malades.
Procédures
Les souris d’intérêt seront détectées par génotypage à partir d’une biopsie caudale (prélèvement de 1 à 3 mm) prélevée avant le sevrage des animaux (tissus moins ossifiés, réaction à la douleur moindre) ou d’une biopsie d’oreille prélevée après l’âge de 14 jours (fin de développement des oreilles). Chaque souris produite sera génotypée et ne subira donc qu'un prélèvement unique (2 prélèvements pourront être effectués maximum par animal en cas de problème de génotypage) ; nous procéderons donc à 21696 prélèvements pendant les 5 ans du projet.
Impact sur les animaux
Les souris hétérozygotes n’ont pas de phénotype apparent, contrairement aux souris homozygotes qui présentent un phénotype dommageable. Les complications surviennent de façon chronologique et si les animaux survivent les premières semaines, ils restent modérément atteints. Environ 30% des animaux homozygotes meurent dans les 48 premières heures de vie et environ 10% développent des complications sévères (hydrocéphalie, pectus excavatum, troubles respiratoires) dans les 3 premières semaines de vie. A la naissance, les souris homozygotes sont identifiables par leur petite taille et un tronc raccourci. A l’âge de 4 semaines, elles pèsent environ 20% de moins que les souris sauvages. A l’âge de 8, 12 et 16 semaines, leur poids est environ 30% inférieur à celui des souris sauvages. Une attention particulière sera apportée à chacun des animaux qui seront surveillés quotidiennement dès leur naissance. Les animaux seront évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids selon une grille d’observation spécifique à ce projet.
Devenir
Les animaux seront soit utilisés pour les expériences, soit pour les croisements, ou soit utilisés pour réaliser des fecondations in vitro. Les animaux restants seront sacrifiés (animaux surnuméraires, non utilisés pour les expérience, ou trop âgés).
Remplacement
Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de SEDc, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins finaux. Le nombre d’animaux est calculé selon les protocoles expérimentaux de manière à obtenir le minimum d’animaux par groupe permettant des résultats significatifs et homogènes. De plus, et afin de répondre à ces besoins, l’optimisation des croisements permettra d’utiliser peu d’animaux avec la garantie d’un rendement maximum et de résultats homogènes.
Raffinement
Les points limites sont observés pendant toute la durée du projet. Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille interne d’évaluation. Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant un enrichissement minimum (bâtons de bois et matériel de nidification).
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, relativement peu coûteux à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est largement bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de celui-ci un modèle de choix fiable pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats valables pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les demandes et les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi en expérimentation. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Pour la production d’animaux expérimentaux, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être utilisés dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être utilisées.
Programmation de bactéries comme agents thérapeutiques contre le cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur greffe des tumeurs sous la peau, dans le côlon ou dans la rate, puis les infecte par des bactéries modifiées censées libérer des molécules anticancéreuses au contact de la tumeur. Il indique que la greffe et la croissance tumorale peuvent provoquer perte de poids, prostration et perte de poils en fin d'étude. Il affirme qu'aucune alternative en laboratoire ne permet de faire croître une tumeur tout en conservant la diversité de ses cellules.
Objectifs
Le projet consiste en une étude chez la souris, d’utilisation de bactéries non pathogènes issues de la flore intestinale, comme agents thérapeutiques anti-cancéreux. Dans ce but, les bactéries sont modifiées afin de libérer au niveau de la tumeur des molécules chimiques anti-cancéreuses. Ce projet sera réalisé dans deux modèles tumoraux : cancer colorectal et le fibrosarcome. Dans le cadre de nos recherches, nous avons travaillé sur la modification de lactobacilles qui, par leurs caractéristiques, se présentent comme une thérapie prometteuse. Notre objectif est de réaliser une étude d’infection par ces modèles bactériens afin de démontrer que leur utilisation est possible pour atteindre différents types de tumeurs et développer des molécules thérapeutiques innovantes.
Bénéfices attendus
La biologie permet aujourd’hui de concevoir et construire de nouveaux outils qui peuvent être utilisés afin de produire des composés d’intérêt ou de détecter des molécules (marqueurs ou contaminants environnementaux), d’assainir l’environnement et de créer de nouvelles thérapies. Notre projet s’inscrit dans ce dernier domaine et a pour objectif de développer de nouveaux modes de thérapie anti-tumorale. Les résultats attendus sont : (i) la validation de bactéries non pathogènes en tant qu’agent thérapeutique, (ii) la démonstration de l’efficacité anti-cancéreuse des molécules libérées par les bactéries au site tumoral et (iii) l’absence d’effets secondaires tels que ceux observés lors de chimiothérapies ou immunothérapies.
Procédures
Les animaux vigiles pourront être soumis à 3 types de procédures : - Greffe sous-cutanée, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 1) ou - Greffe intra caecale, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 2) ou Greffe intra splénique, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 3).
Impact sur les animaux
La procédure de greffe, le développement tumoral ou encore l’induction de molécules anti-tumorales peuvent entraîner : une perte de poids ou des effets indésirables chez les animaux tels que : prostration, dos courbé, ou perte des poils. Ces signes ne devraient apparaitre qu’en fin d’étude. Les animaux faisant l’objet d’un dépassement des points limites ou présentant des signes de souffrance clinique irréversibles seront systématiquement euthanasiés et sortis de l’étude.
Devenir
Tous les animaux ayant fait l’objet d’une des procédures seront euthanasiés par inhalation progressive de CO2 ou par dislocation cervicale, réalisée par du personnel formé et compétent.
Remplacement
- « Remplacer » les modèles animaux : pour ce projet, l'utilisation d'animaux à des fins expérimentales est indispensable. Il n'existe en effet pas d'alternative en laboratoire permettant de faire croître une tumeur isolée à partir d’une lignée cellulaire tout en maintenant la diversité des cellules qui composent cette tumeur.
Réduction
« Réduire » le nombre d'animaux en expérimentation. Nous avons prévu prévu de réaliser une étude pilote puis d'utiliser un nombre minimum mais suffisant d’animaux pour garantir l’obtention de résultats pertinents et utilisables pour la génération de nouvelles thérapies bactériennes anti-cancer.
Raffinement
« Raffiner » la méthodologie utilisée, ce qui implique les notions d’élevage en milieu enrichi et de points limites (critères d'interruption de l’expérience). Afin d’améliorer la qualité de vie des souris, elles seront hébergées dans des cages d’une superficie de 500cm2. La litière sera enrichie avec des frisottis ou des carrés de cellulose. Nous porterons une attention particulière au bien-être de nos animaux qui feront l’objet d’un suivi quotidien. Pour les greffes de lignées de cellules cancéreuses, toutes les mesures d’asepsie, d’anesthésie, d’analgésie et de confort lors du réveil des souris, seront prises. Les souris seront ensuite traitées par les bactéries qui seront injectées par voie intra-tumorale, intraveineuse ou orale. L’évolution des traitements sera suivie par imagerie. .
Choix des espèces
L’étude de l’effet des thérapies bactériennes y compris sur le système immunitaire se fera sur des souris immunocompétentes C57Bl/6 greffées avec différents modèles tumoraux (colon et fibrosarcome). Les souris seront réceptionnées à l’âge de 4 semaines puis greffées 1 semaine plus tard (temps d’acclimatation minimum après réception).
Conception de modèles d’hémopathies malignes chez la souris immunodéprimée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur greffe à des souris immunodéprimées des cellules humaines rendues cancéreuses, puis suit la prise de greffe par des ponctions dans le fémur sous anesthésie chaque mois, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Il indique surveiller la perte de poids, une croissance tumorale pouvant s'accompagner de nécrose ou d'ulcère cutané. Il affirme avoir "besoin" d'un "organisme entier" pour étudier le développement des tumeurs et conclut que la souris n'est remplaçable par aucune autre méthode.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la conception de deux modèles de cancer du sang, associés a des altérations chromosomiques, chez des souris immunodéprimées. Pour cela les souris recevront des cellules humaines exprimant, après manipulation, des acteurs clés de la transformation d'une cellule normale en cellule cancéreuse. Ce projet se déroulera uniquement après validation in vitro du caractère cancéreux des cellules générées afin de limiter le nombre d'animaux nécessaires à ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra pour la première fois le développement de deux modèles de cancer du sang associés à des altérations chromosomiques. En mettant à jour le rôle clé de certaines molécules, iIl pourrait mettre en évidence de nouvelles combinaisons thérapeutiques. pour ces deux cancers.
Procédures
La greffe chez les souris recevant une injection par voie retro-orbitale sera suivie par ponction médullaire tous les mois. En pratique les souris sont anesthésiées sous anesthésie gazeuse, après désinfection à l'alcool de la patte, un trou est effectué dans le fémur, la ponction s'effectue par aspiration dans ce trou à l'aide de seringue . Au moment opportun les souris seront sacrifiées par dislocation cervicale pour être disséquées
Impact sur les animaux
La prise de greffe devra etre surveillée car elle peut engendrer une perte de poids importante et rapide et une modification du comportement des animaux. Une croissance tumorale en sous-cutanée peut etre également associée à une nécrose/ulcère de la peau. Ainsi, après toute application d'une procédure, les critères de surveillance généraux seront appliqués : une perte de poids atteignant les 20%, un comportement anormal grave, un arrêt d’alimentation, une baisse de la température corporelle ou un mutisme de plus de 24 h conduiront à un arrêt de l’expérimentation. Dans ce cas, l’animal sera immédiatement euthanasié.
Devenir
A la fin de l'expérimentation, euthanasie par dislocation cervicale.
Remplacement
La souris est le modèle expérimental le plus utilisé dans la littérature pour l’étude de la tumorigenèse et pour évaluer les effets de molécules anti-cancéreuses. En effet l'expérimentation in vivo est non substituable à aucune autre méthode car nous avons besoin d'un organisme complet pour étudier le développement des tumeurs. Les expériences sur les souris ne sont faites que après avoir testé in vitro les differents ARN non codants et la translocation NPM_ALK. Seuls les « acteurs » ayant un intérêt biologique seront testés sur l'animal. Cette étape est nécessaire en cancérologie car il est crucial de connaitre le devenir des cellules cancéreuses dans un organisme entier afin d'étudier les risques de genèse, de metastases ou de rechutes après traitement.
Réduction
Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée afin d'optimiser nos protocoles pour réduire au maximum le nombre d'animaux. Des études statistiques nous permettent également de déterminer le nombre minimum de souris nécessaires afin que l'expérience ait une valeur scientifique et n'est pas besoin d'être reproduite.
Raffinement
L'évaluation quotidienne de la souffrance nous permet de déterminer si l'expérience doit être arrêtée. Pour cela des points limites et une methode d'évaluation pour la prise en charge des animaux sont identifiés. Les experimentations seront réalisées sous anesthésie et avec utilisation d'analgésie.
Choix des espèces
La souris est le modèle expérimental le plus utilisé dans la littérature pour l’étude de la tumorigenèse et pour évaluer les effets de molécules anti-cancéreuses. En effet l'expérimentation in vivo est non substituable par aucune autre méthode car nous avons besoin d'un organisme complet pour étudier le développement des tumeurs. Ce modèle expérimental nécessite l’utilisation d’animaux immuno-déprimés (pour permettre la croissance des cellules humaines). La souches murine de référence pour l’implantation des cellules primaires humaine et les cancers hémathologiques est la souris NSG. Animaux adultes à partir de 6 semaines. L’utilisation d’animaux adultes est justifiée par le fait que les deux hémopathies malignes que nous étudions sont des cancers de l'adulte.
Analyse de l’activité et la physiologie de l’aorte descendante chez le rat chez la descendance suite à un régime hypercalorique maternelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
277 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie réutilisée pour d'autres projets et le reste tué pour prélèvements. Des rates sont soumises à un régime gras avant et pendant la gestation, puis leur descendance est suivie de la naissance au sevrage pour étudier les effets sur l'aorte et le métabolisme. Le porteur décrit des prélèvements de sang répétés à la queue et des mesures de pression artérielle, et fixe un point limite à 20 % de perte de poids chez les adultes. Il affirme qu'une culture cellulaire ne reproduirait pas la complexité de ce tissu et juge certaines expérimentations "absolument indispensables".
Objectifs
La programmation foetale est un concept qui montre la relation entre le faible poids de naissance et le développement de maladies métaboliques à l'âge adulte telles que les maladies cardiovasculaires, le diabète, le syndrome métabolique, l'obésité et l'hypertension. Les individus qui avaient un faible poids de naissance et qui sont restés petits au début de l'enfance ont rapidement développé une hypertension. Le rebond précoce de l'adiposité est fortement lié à un indice de masse corporelle élevé au cours de l'enfance qui s'est avéré être le facteur de risque du diabète de type 2. Bien que ces maladies ont une part génétique, il y a également une part environnementale. Un régime maternelle hypercalorique (enrichi en graisse) pendant la grossesse va avoir des conséquences sur la descendance. Ce régime aura des impacts directs sur l'ensemble des gènes de la descendance mais également lors de son développement par sa nutrition via le placenta en favorisant l'hyperméthylation du génôme. En effet, l’état nutritionnel de la mère pendant la gestation et/ou la lactation, sont des déterminants clés du développement foetal et postnatal. Dans notre étude nous allons utiliser un modèle de rates Wistar nourries en régime gras pendant 2 mois qui nous permettra d'étudier les conséquences fonctionnelles et métaboliques au niveau des vaisseaux sanguin pendant des périodes spécifiques de développement embryo-foetal. Le projet vise à répondre aux questions: un régime précoce en régime gras entraîne-t-il des modifications de la structure et de la physiologie de l’aorte ? Quels seraient les mécanismes moléculaires et tissulaires responsables de ces éventuelles modifications ? Existe-t-il des fenêtres d'exposition critique pour expliquer l'apparition des altérations moléculaires? L’objectif du projet est d’évaluer l’intégrité des fibres élastiques (élastogenèse et élastolyse) en tant que facteur déterminant des fonctions vasculaires chez la progéniture issue de mère nourie avec un régime riche en gras.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de la mise en place de la matrice extracellulaire vasculaire chez le rat et par extension à l'Homme. Ces connaissances fondamentales permettront d'appréhender de façon plus précoce les maladies cardiovasculaires d'un point de vue vétérinaire et humaine mais aussi d’identifier les phases d’exposition critique pour la descendance.
Procédures
Pour la procédure 1: dans la cadre d'une prévention la glycémie sera mesurée tous les 7 jours en prélevant 10 μl de sang par incision (< 2 mm) d’une veine de la queue. La glycémie devra être située entre 50 et 400 mg/dl. Les rats n'étant pas à jeun les valeurs sont plus élevées. Pour la procédure 2: la pression artérielle sera mesuré de manière non invasive sur animal vigile pour les ratons de 21jours. Cette mesure ne provoque aucune douleur ni prélévement.
Impact sur les animaux
L’objectif est d’obtenir un déséquilibre métabolique dont les conséquences chez les ratons nés de mères surnutri nous sont déjà connues : hypertrophie myocardique, stéatose hépatique, troubles du développement du système nerveux central, diabète... Pour les femelles surnutrie nous obtiendrons un surpoids et pas d’IRES (insulino-résistance) pour un régime de 2 mois.
Devenir
Pour les animaux sous régime HFD, Un retour a un état physiologique d'origine étant trop compliqué après un HFD. Les femelles progénitrices HFD (16 femelles/phase => 4 phases 21jours, 14jours, 7 jours et 24H => 64 femelles HFD) seront euthanasié et les organes seront prélévés. Les animaux sous régime normal (les males progéniteurs 13, 3-4/phase et les femmes progénitrice 40, 10femelles/phase) seront réutilisé pour d'autre projet de recherche ou enseignement. Les ratons témoin et HFD seront euthanasié pour prélèvements. Les ratons surnuméraires obtenus seront réutilisés pour d'autre projet de recherche ou enseignement.
Remplacement
Nous souhaitons étudier les conséquences d’une sur-nutritionnelle maternelle (régime riche en graisse HFD) sur le développement et la fonction de l’aorte descendante chez la descandance. Un modèle de cultures cellulaires ne permet pas d’étudier la complexité et la dynamique de ce tissu.
Réduction
Les procédures ont été réalisées afin de se limiter aux expérimentations jugées absolument indispensables pour cette étude. Une réflexion biostastistique (G-power) a été intégrée à la création de ce projet afin de réduire le nombre d’animaux tout en assurant la fiabilité scientifique. En raison de la petitesse des animaux et des approches biochimiques, moléculaires ou d'imagerie envisagées nécessitant une quantité certaine de matériels, nous constituerons des groupes d’étude à raison de 20 individus. De plus, entre chaque procédure, un système GO/NOGO sera mis en place afin d’utiliser le nombre d’animaux strictement nécessaire. Les analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un test Mann-Whitney.
Raffinement
En amont des procédures, les animaux seront hébergés dans des cages de dimensions réglementaires avec un enrichissement adapté. L’eau et la nourriture seront données de façon ad libitum. Les cycles de jour de 12h seront réalisés. Chaque protocole expérimental débutera par une période d'acclimatation de 2 semaines à nos locaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une procédure d’estimation de la douleur est mise en place (grille de score RAT GRIMACE SCALE). Le point limite est fixé à 20% de perte/prise du poids corporel (chez les adultes). En fin de protocole les animaux seront mis à mort et des prélèvements (sang aortes) seront effectués. D'autres tissus seront également prélevés et congelés pour d'autres projets scientifiques et pour l'enseignement. Les mâles reproducteurs et les femelles sous régime normal, seront replacés pour d'autres protocoles expérimentaux.
Choix des espèces
Le projet de recherche fait appel à des analyses physiologiques, biochimiques et moléculaires en lien avec des régimes nutritionnels spécifiques. Les rats Wistar sont classiquement utilisés dans la littérature scientifique pour ce type d’étude. Le projet se concentre sur les effets transgénérationnels dans les stades précoces de la vie du régime HFD responsable d'une hyperméthylation du génome de la descendance et vise en particulier à étudier les effets de cette hyperméthylation dans l'élastolyse, l'insuffisance cardiaque et le diabète. Nous regarderons donc les conséquences sur la descendance à 24h, 7J, 14J et 21J moment du sevrage. Les stades de développement utilisés sont: • Rats adultes pour le reproduction (13 males et 104 femelles) • Ratons nouveau nés maintenus à 21 jours, mise à mort de 20 ratons par groupe (HFD vs controle) • Ratons nouveau nés maintenus à 14 jours, mise à mort de 20 ratons par groupe (HFD vs controle) • Ratons nouveau nés maintenus à 7 jours, mise à mort de 20 ratons par groupe (HFD vs controle) • Ratons nouveau nés de moins de 24 heures, mise à mort de 20 ratons par groupe (HFD vs controle)
Mise en place d’un modèle de glioblastome opéré et validation par imagerie de bioluminescence. (EU porteur ; EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
28 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur greffe des cellules de glioblastome humain dans leur cerveau par chirurgie stéréotaxique, suit la tumeur par imagerie de bioluminescence sous anesthésie, puis pratique une ablation chirurgicale classée sévère. Il décrit un recours à des analgésiques et un hébergement en cage individuelle après l'opération, qui prive les souris de contacts directs. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne convient car le développement tumoral ne peut être appréhendé qu'in vivo.
Objectifs
Le projet se place dans le contexte clinique du traitement des tumeurs cérébrales très agressives : les glioblastomes. Si la tumeur est accessible, le traitement des glioblastomes commence par une ablation chirurgicale (ou exérèse), suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, l’ablation chirurgicale,ne permet dans la plupart des cas de n’enlever que partiellement la masse tumorale même si le bénéfice est indéniable. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet exploratoire se place dans un contexte de développement de modèles expérimentaux « in vivo » plus proches des conditions observées en clinique chez l’être humain. En effet, aujourd’hui, peu de modèles de glioblastome chez l’animal intègrent le traitement chirurgical de la pathologie. Nous souhaitons donc faire évoluer nos modèles pour nous rapprocher au mieux des stratégies thérapeutiques conduites chez l’Homme. Pour cela, notre laboratoire s’est doté d’un système d’imagerie original nommé « OptiMAX » permettant d’obtenir des images des tumeurs greffées chez la souris en « bioluminescence », c’est-à-dire par émission de lumière. En effet, nos cellules de glioblastome expriment la luciférase (lignées U87-Luc et U251-Luc ) et sont capables d’émettre un signal lumineux, que nous sommes capables de détecter et de quantifier grâce à notre appareil d’imagerie non invasive : ceci permet de suivre la croissance des tumeurs, et de détecter la présence de quelques cellules restantes. Cette technique a déjà été utilisée au laboratoire dans le cadre des projets précédents (Saisine APAFIS #22368-2019100915354084 v4 et Saisine APAFIS #26058-202006050946736 v5 pour les lignées respectivement U87-Luc et U251-Luc). Dans ce projet, l’imagerie par bioluminescence va nous permettre de suivre la première phase de croissance des tumeurs implantées et de définir le meilleur moment pour réaliser l’intervention chirurgicale, puis de valider la présence de cellules tumorales résiduelles après l’opération. Enfin, nous allons pouvoir ainsi caractériser la reprise de la croissance après chirurgie.
Bénéfices attendus
La transposition de la chirurgie d'exérèse (stratégie utilisée classiquement en clinique) et du phénomène de récidive sur modèle animal permettra de se placer dans les mêmes modalités qu'en clinique. La maitrise de cette technique est indispensable pour caractériser par la suite le phénomène de résurgence et évaluer l'implication de l'environnement tumoral dans ce phénomène. Une meilleure compréhension des processus associés à la résurgence tumorale sont indispensable pour le développement ultérieur de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
-Procédure 1: Xenogreffe intracérébrale stéréotaxique de cellules U87-Luc, U251-Luc : réalisé une fois au début de l'étude (durée de 1h) -Procédure 3 : Chirugie d'exerèse tumorale : réalisé une fois au milieu de l'étude (durée 1h)
Impact sur les animaux
Chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux (cf procédure 3) avec mise en place de soins post-opératoires rigoureux. Hébergement en cage individuelle après la chirurgie d'exerèse pouvant conduire à un stress des souris (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes.
Devenir
- Procédure 1 : Xenogreffe intracérébrale stéréotaxique de cellules U87-Luc, U251-Luc : animaux gardés en vie - Procédure 2 : Suivi par imagerie par Bioluminescence : animaux gardés en vie sauf si un des points limites cités précédemment a été atteint ou dans le cas d'un animal satellite mis à mort 3 jours après avoir retiré la tumeur en vue d'analyses histologiques - Procédure 3 : chirugie d'exérèse : animaux gardés en vie
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse à la chirurgie d’exérèse de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes (influence du microenvironnement tumoral, activation de la microglie et des astrocytes, envahissement du parenchyme cérébral, angiogenèse...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules endothéliales, stroma...). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Les données issues des études précédentes (Saisine APAFIS #22368-2019100915354084 v4 et Saisine APAFIS #26058-202006050946736 v5 pour les lignées respectivement U87-Luc et U251-Luc) nous ont permis de réaliser un premier suivi en imagerie de la croissance des lignées -Luc citées précédemment implantées en stéréotaxie, en l'absence de stratégie de traitement (groupe contrôle). Les données générées seront donc exploitées et permettront de réduire le nombre d'animaux utilisé dans les séries sans exérèse (5 souris par lignée au lieu des 8 nécessaires dans les séries avec exerèse)
Raffinement
La validation de la chirurgie d'exérèse partielle de la tumeur ainsi que le phénomème de résurgence par imagerie par Bioluminescence nécessite un suivi longitudinal des souris. Chaque animal sera son propre témoin ce qui constitue une stratégie permettant une utilisation judicieuse des animaux et assure une rigueur scintifique
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris athymiques présentant une lymphopénie T, sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines du fait leur immunodéficience, il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des souris femelles plus sociables, pour faciltier l'hébergement collectif. Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas de stéréotaxie de Paxinos et Franklin. George Paxinos, Keith B.J. Franklin, MA, PhD (eds). The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 3rd Edition. Elsevier Science Publishing Co Inc, (2007).