Procédures sans réveil

1 696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de l'absence de réveil au modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale pour injecter des vecteurs viraux ou implanter une canule, des jeûnes répétés de 6 à 16 heures et des prélèvements sanguins à la queue répétés 6 à 10 fois, pour étudier des neurones impliqués dans la régulation du sucre. Le porteur relie ces travaux au diabète et à l'obésité, dont les retombées thérapeutiques restent au conditionnel. Sur le remplacement, il indique avoir utilisé des cultures cellulaires mais affirme qu'il n'existe "pas d'alternative non-animale" pour l'étude intégrée.

Objectifs

Au cours de la dernière décennie, il a été montré que le cerveau participe à l’équilibre métabolique et au maintien de la quantité de sucre circulant dans le sang (la glycémie), de façon importante. Un défaut dans ces processus de régulation assurés par le cerveau pourrait donc jouer un rôle majeur dans l'apparition de maladies ayant un grave impact sur nos sociétés occidentales telles que l'obésité et le diabète. En effet, l'obésité est fréquemment associée au diabète de type II et leur progression significative et synchrone depuis 30 ans fait de la pandémie mondiale de "diabesity" actuellement observée, un véritable enjeu de santé publique. Néanmoins, les mécanismes de contrôle du métabolisme et de la glycémie par le cerveau sont encore très mal connus. Nous savons que certaines molécules de l’organisme permettent aux neurones du cerveau de communiquer entre eux afin d’assurer ces fonctions de contrôle. Parmi ces molécules, certaines semblent être importantes car elles sont capables de modifier la sensation de faim, notamment chez les animaux obèses, et de modifier la quantité de sucre en circulation dans le sang. Le projet décrit ici, cherche à comprendre comment les neurones du cerveau communiquent entre eux pour réguler le métabolisme et la glycémie de l’organisme.

Bénéfices attendus

Si l’on parvient à comprendre la façon dont les neurones du cerveau communiquent entre eux et régulent le métabolisme et la quantité de sucre en circulation dans l’organisme, cela permettra d’identifier les mécanismes qui ne sont plus correctement régulés chez les personnes atteintes de diabète de type 2 et d’obésité. Des pistes seront alors ouvertes pour la prise en charge thérapeutique de ces maladies et l’identification de nouveaux médicaments.

Procédures

Les animaux seront soumis à divers type d'expérimentations et de prélèvements soit en conditions vigile, soit sous anesthésie. - Afin d'activer ou d'inhiber les neurones à 26RFa ou bien administrer des composés pharmacologiques dans le Système nerveux central, les animaux subiront une chrirugie visant à injecter des vecteurs viraux dans l'hypothalamus ou à implanter une canule d'injection dans les ventricules cérébraux. - Afin de suivre la glycémie, les animaux subiront des prélèvements sanguins à l'extrémité de la queue d'un volume total de l'ordre de 40 μL par expérimentation. Les expérimentations sont répétées 6 à 10 fois avec une semaine de repos minimum entre chacune d'entre elles. Certains prélèvements sanguins sont réalisés sous anethésie. - Afin de prélever des tissus à l'issue des tests physiologiques, les animaux seront profondément anesthésiés afin de réaliser une perfusion intracardiaque de PFA 4%, fixer les tissus et prélever le cerveaux. - Pour le suivi métabolique, les animaux seont hebergés en cage de calorimétrie indirecte afin d'évaluer les paramètres métaboliques.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à divers type d'expérimentations et de prélèvements soit en conditions vigile, soit sous anesthésie. - Chirurgie stéréotaxique visant à injecter des vecteurs viraux dans hypothalamus ou à implanter une canule d'injection dans les ventricules cérébraux. Nuisances prévues : douleurs post opératoires minorées par des antalgiques. - Mise à jeun de 6 à 16h avant chaque test physiologique. Nuisances prévues : Perte de poids consécutive à la mise à jeun dont le retour à la normale sera surveillé après chaque test, une semaine de repos minimum entre chacun d'entre eux. - Incision à l’extrémité de la queue. Nuisance prévue : douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique. - Cage de calorimétrie indirecte afin d'évaluer les paramètres métaboliques. Nuisance prévue : isolement des animaux à 1 animal/cage inhérent à ce suivi, minoré par un temps de test le plus court possible et une mise à mort qui suit immédiatement le test.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèver les organes.

Remplacement

Afin de comprendre la fonction du système peptidergique 26RFa, nous avons entrepris de caractériser l’effet de ce neuropeptide sur des lignées de cellules beta-pancréatiques et neuronales en culture. Cependant, la compréhension globale du rôle physiologique de ce neuropeptide dans la communication existant entre les différents systèmes de l’organisme (i.e. communication via le système nerveux et le système hormonal dans ce cas), n’est possible que in vivo. Il n’existe pas d’alternative non-animale. Dans ce contexte, la grenouille a été précédemment utilisée afin d’identifier le 26RFa. Par la suite, les études chez les mammifères ont révélé un rôle majeur du 26RFa dans la régulation du métabolisme énergétique. Ceci en fait une piste du choix en vue d'un développement thérapeutique dans le cadre du traitement de maladies métaboliques telles que le diabète de type 2. Une telle approche physiologique n’est rendue possible que par les études, sur des organismes modèles mammifères afin de s'approcher le plus possible de la physiologie humaine.

Réduction

Compte tenu de l'approche chémogénétique innovante utilisée dans ce projet, nous ne pouvons pas, a priori, modéliser la puissance statistique des tests que nous prévoyons de mener. Aussi, nous menerons nos procédures en subdivisant les effectifs des groupes prévus par lot de 3 animaux par condition et par test. Nous incrémenterons les résultats obtenus jusqu'à un maximum par avance fixé de 12 souris par condition de traitement. Cet effectif est en effet justifié par les données disponibles dans la litterature (dont nos propres expérimentations) indiquant que la variabilité inter-individuelle des processus physiologiques étudiés est prise en compte dans des groupes de 12 souris, dans le fond C57Bl6/J. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables (test ANOVA à un ou deux facteurs selon les conditions d’expérimentation réalisées, suivis d’un test post-hoc tel que Tukey ou Bonferroni). De plus, une partie des tests physiologiques prévus pour évaluer l’homéostasie glucidique sera réalisée successivement sur une même souris et chaque souris sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d’une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précédent et de stabiliser leur poids corporel. Pour les groupes dédiés au prélèvement des explants hypothalamiques ou cérébraux, les groupes de souris pourront être réduits à 10 animaux.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à minimum trois par cage pour éviter tout isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. La animaux devant subir plusieurs tests au cours d'une même procédure, chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d’une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précédent et de stabiliser leur poids corporel.

Choix des espèces

Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre de façon globale, le rôle des neurones à 26RFa/orexines dans la régulation hypothalamique de l’homéostasie glucidique et de comprendre les mécanismes d’actions de ces deux neuropeptides. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coût d’entretien réduits, fortes performances reproductives. Il s’agit d’un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques et chémogénétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude, la physiologie adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.

150 canaris vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Les mâles subissent des chirurgies intracérébrales de trois à sept heures pour y injecter des traceurs, poser des électrodes d'enregistrement ou provoquer des lésions, et sont tués pour prélèvement du cerveau, tandis que les femelles sont maintenues en vie et rendues à la colonie. Le porteur décrit un projet de recherche fondamentale sur les mécanismes cérébraux du chant, dont il rapproche l'organisation de celle du langage humain. Il affirme que l'imagerie ne permet pas la résolution nécessaire et que les enregistrements neuronaux sont impossibles chez l'humain.

Objectifs

L’organisation des signaux acoustiques (la syntaxe) est un aspect essentiel de la communication vocale animale. Les oiseaux chanteurs en particulier produisent des chants composés de suites d’éléments sonores appelés syllabes. Si chez certaines espèces, comme le diamant mandarin, les chants ont une organisation simple (linéaire) des syllabes, chez d’autres, telles le canari domestique, l’organisation des syllabes repose sur des règles complexes et notamment des dépendances à long terme (la probabilité de produire une syllabe précise peut dépendre de celles produites plusieurs secondes auparavant). Ces règles syntaxiques sont semblables à celles décrites chez les humains. Les canaris présentent par ailleurs une plasticité annuelle de leurs chants. Les canaris constituent donc un modèle idéal pour déterminer les mécanismes neuronaux de la production et de la variabilité de la syntaxe vocale. Le comportement de chant résulte d’un apprentissage sensorimoteur et met en jeu un réseau de structures cérébrales dédiées. Le contrôle neuronal de la production du chant est assuré par un ensemble de zones cérébrales "corticales" hiérarchiquement organisées et spécialisées dans le chant. Si des études ont mis en avant les mécanismes sous-tendant la variabilité acoustique des chants, ceux mis en jeu dans le contrôle de l'organisation des éléments constitutifs des chants restent méconnus. Notre objectif ici est de déterminer le réseau neuroanatomique impliqué dans le contrôle de la variabilité d'organisation des éléments du chant et d'en caractériser les propriétés neurophysiologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale bénéficera en premier à la communauté spécialisée dans le domaine de recherche de la neuroéthologie du chant des oiseaux. Il apportera aussi des connaissances essentielles pour mieux comprendre les potentiels déficits observés dans la parole humaine. En effet, de nombreusess études ont mis en avant les analogies du comportement de chant des oiseaux chanteurs et du langage humain. Ces analogies ont été identifiées d'un point de vue comportemental (l'acquisition du chant et du langage mettant en jeu les mêmes étapes) et neurobiologiques (analogies moléculaires et cellulaires). Par ailleurs, des lésions ou perturbations des structures cérébrales dédiées au comportement de chant induisent des déficits comportementaux semblables à ceux observés chez les humains, tels que des bégaiements ou des retards d'apprentissage. Nombre de ces déficits chez les oiseaux chanteurs rappellent les troubles de la parole observés chez les humains atteints de pathologies neurodégénératives touchant les ganglions de la base (maladie de Parkinson ou de Huntington par exemple). Enfin, les méthodologies d'étude et d'analyse déployées permettront des avancées technologiques en lien avec le traitement de grand jeu de données (big data) et pourront nourrir des projets de recherche computationnelle et de modélisation future.

Procédures

Un prélèvement sanguin (une à deux gouttes de sang) sera effectué sur tous les oiseaux, une seule fois par oiseau. Cette procédure ne dure que quelques minutes et ne nécessite pas l'anesthésie de l'oiseau. Les oiseaux seront soumis à diverses procédures chirurgicales intracérébrales. Chaque oiseau ne subira qu'un seul type d'intervention chirurgicale et qu'une seule fois. Suivant l'opération chirurgicale, effectuée sous anesthésie générale, la durée varie de 3 à 7h.

Impact sur les animaux

Ce projet impliquera de placer une partie des oiseaux utilisés pour les expériences dans des caissons d'isolation acoustique individuels afin d'enregistrer leurs vocalisations. Cette méthode est la seule permettant d'enregistrer les vocalisations des oiseaux avec la meilleure qualité possible pour mener nos études. Certains oiseaux subiront par ailleurs des chirurgies intracérébrales afin d'injecter des agents chimiques (traceurs neuronaux pour identifier les projections neuronales ou acide pour réaliser des lésions cérébrales), des électrodes d'enregistrement (pour enregistrer les activités des neurones) ou des électrodes de stimulation électrique (pour procéder à des stimulations électriques intracérébrales localisées).

Devenir

Pour l'ensemble des procédures de ce projet, tous les animaux identifiés comme femelles seront maintenus en vie et retourneront dans la colonie, ce projet ne portant que sur les mâles canaris. A l'issue des différentes procédures, tous les mâles seront euthanasiés. La collecte du cerveau à la fin de chacune de ces procédures est essentielle afin de 1/pouvoir identifier les projections entre les structures cérébrales d'intérêt, 2/ pouvoir identifier les points d'insertion des électrodes d'enregistrement ou de stimulation électrique, 3/pour caractériser l'étendue de la lésion cérébrale.

Remplacement

Le but de nos recherches est de déterminer les mécanismes neurobiologiques mis en jeu dans l’apprentissage, la production et la perception de vocalisations. Pour cela, les oiseaux constituent un remarquable modèle d’étude, leurs vocalisations présentant des points communs avec la parole humaine et un ensemble de structures cérébrales étant dédié à la perception, la production et au contrôle des vocalisations. Les technologies actuelles (IRM) ne permettent pas d'avoir un niveau de résolution suffisamment fin pour analyser l'activité de neurones à des échelles temporelles de l'ordre de la milliseconde. Mener ces expériences reposant notamment sur des enregistrements électrophysiologiques de l’activité neuronale et des stimulations intracérébrales, qui ne sont pas possibles chez le sujet humain (sauf dans certaines conditions particulières), permet d’avancer dans la compréhension des processus neurobiologiques en général et dans le comportement vocal des oiseaux en particulier.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux à utiliser et d’adapter le protocole expérimental, nous conduirons les expériences sur un seul oiseau à la fois. Cela nous permettra de traiter les éventuelles difficultés les unes après les autres. Par ailleurs, cela nous permettra de ne collecter que le nombre de données nécessaires pour obtenir suffisamment de puissance statistique. Lorsqu’un oiseau aura subi une opération chirurgicale, celui-ci sera maintenu seul dans une cage jusqu’à récupération (que nous estimons à 48h) mais de façon à ce qu’il puisse voir et entendre ses congénères. Des oiseaux stressés ou en souffrance ne vocalisant pas, ils seront contrôlés au quotidien. Un antalgique sera administré lors de l’opération chirurgicale et tant que l’oiseau montre des signes de douleur (inactivité, absence de vocalisations, posture prostrée).

Raffinement

Avant toute procédure chirugicale, les oiseaux reçoivent une administration d'un analgésique. La chirurgie s'opère sous anesthésie générale. Lorsqu’un oiseau aura subi une opération chirurgicale, celui-ci sera maintenu seul dans une cage jusqu’à récupération (que nous estimons à 48h) mais de façon à ce qu’il puisse voir et entendre ses congénères. Des oiseaux stressés ou en souffrance ne vocalisant pas, ils seront contrôlés au quotidien. Un antalgique sera administré lors de l’opération chirurgicale et tant que l’oiseau montre des signes de douleur (inactivité, absence de vocalisations, posture prostrée). Le point limite est atteint lorsqu’un oiseau montre une absence de réaction (absence d'envol lorsque l'oiseau est touché par l'expérimentateur) ou une réaction faible à l'expérimentateur (envol au touché de l’oiseau) sur 2 jours consécutifs.

Choix des espèces

Pour comprendre les processus sous-tendant le contrôle vocal, les oiseaux chanteurs constituent un modèle de choix. Ils présentent des capacités remarquables de modulation et de contrôle de leurs vocalisations. Ils possèdent un ensemble de structures cérébrales spécialisées dans ce comportement. Plusieurs parallèles avec l'apprentissage vocal chez l’humain existent (période sensible pour l'apprentissage, répertoire de gestes moteurs vocaux). Notons que si cette capacité d'apprentissage vocal est fréquente chez les oiseaux, elle est beaucoup plus rare chez les mammifères, et, en l'état actuel des connaissances, absente chez les invertébrés. Nous nous proposons d’étudier en particulier les canaris domestiques (Serinus canaria). Ces oiseaux produisent des chants variables constitués d'éléments acoustiques organisés suivant des règles de dépendance aussi identifiée dans le langage humain. Ils s’adaptent parfaitement à la vie en captivité. Enfin, le réseau de structures cérébrales mis en jeu dans leur comportement vocal est très précisément connu et décrit dans la littérature, permettant une comparaison fiable des données et une mise en perspective des résultats obtenus. Tous les animaux utilisés dans cette étude seront âgés d'au moins 100 jours. A cet âge, les canaris sont depuis longtemps sortis de leur nid et indépendant. Ils commencent à pratiquer leur chant à cet âge là, ce qui nous intéresse tout particulièrement dans cette étude.

1 384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à modéré. Elles subissent l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons focalisés et microbulles jusqu'à trois fois, des séances d'imagerie et, pour 380 d'entre elles, une perfusion intracardiaque mortelle, afin de tester une thérapie génique du syndrome du X fragile. Le porteur indique que la sonoporation pourrait endommager le cerveau si les paramètres ne sont pas adaptés, risque qu'il estime inférieur à 10 % d'après le projet précédent. Il décrit la souris FMR1KO comme le modèle le plus proche de la maladie et juge le recours à l'animal "fondamental" pour étudier l'effet à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Le syndrome du X fragile est une maladie génétique héréditaire où l'expression de la protéine FMRP, codée par le gène FMR1, est fortement inhibée. Cette protéine a un rôle très important de transport et de transcription des ARN messager dans les cellules neuronales et les astrocytes. Son absence dans cette maladie provoque un déficit intellectuel et des troubles du comportement. Il n'existe pas de thérapie à l'heure actuelle, les seuls traitements étant symptomatiques. Ce projet vise à proposer une nouvelle stratégie thérapeutique par thérapie génique, c'est-à-dire en réexprimant la protéine manquante dans la maladie, ici FMRP, via l'expression d'un transgène. Si la thérapie génique a déjà fait ses preuves dans de nombreuses pathologies, aucune n'a pour l'instant été approuvé pour des maladies génétiques cérébrales. Cela est dû à la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui bloque le passage du sang vers le cerveau de la quasi-totalité des vecteurs ou molécules thérapeutiques. Dans ce projet nous proposons de passer la BHE grâce à l'utilisation d'ultrasons focalisés associés à des microbulles de gaz, ces ultrasons faisant osciller les microbulles, provoquant l'ouverture de la BHE. Nous avons plusieurs objectifs dans ce projet. Nous souhaitons tout d’abord évaluer la sécurité, la reproductibilité et l'efficacité du passage dans le cerveau de vecteurs via des ultrasons focalisés combinés à des microbulles de gaz. Cette technique est connue sous le nom de sonoporation. Un second objectif dans ce projet consiste à analyser la biodistribution des molécules de vecteurs ainsi que des microbulles après la procédure de sonoporation. Nous souhaitons également suivre le niveau d’expression du vecteur dans le cerveau en fonction du temps. Enfin, nous souhaitons comprendre comment la restauration de l’expression du gène FMR1 peut modifier la communication neuronale et le comportement de la souris FMR1KO. Cela afin d'évaluer le potentiel de cette technique de thérapie génique pour traiter le syndrome du X fragile, dont les souris FMR1KO sont le modèle le plus proche et le plus utilisé. Ces souris sont génétiquement modifiées pour interrompre l'expression du gène FMR1 (dit Knock-out, ou KO pour le gène FMR1), reproduisant par conséquent plusieurs des phénotypes du syndrome du X fragile, dont les troubles de la sphère sociale et cognitive. Ce phénotype n'est pas dommageable car il ne génère aucune douleur et ces souris n'ont aucun problème pour se nourrir ou se reproduire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal apporté par ce projet sera la mise en place d’une preuve de concept d’un protocole de thérapie génique du syndrome du X fragile. Nous seront alors capable de faire exprimer un transgène dans le cerveau de manière sûre, reproductible et efficace pour restaurer les fonctions cognitives dans un modèle murin du syndrome du X fragile. Le syndrome du X fragile étant une maladie génétique qui provoque principalement une déficience intellectuelle. Cette avancée pourrait permettre dans le futur une avancée clinique pour le traitement de maladies cérébrales d’origine génétique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures de transfert de gène assisté par sonoporation, exclusivement sous anesthésie, durant 15 à 30 minutes, cette procédure pourra être subite jusqu’à 3 fois par animal. Ils seront également soumis à des procédures d'imagerie échographique, photoacoustique, et optique, non-invasive et réalisées sous anesthésie, durant 15 à 30 minutes, cette procédure pourra être répété jusqu’à 3 fois par semaine pendant 3 semaine suivant la procédure de sonoporation. Jusqu’à 380 souris pourront également être soumises à une procédure de chirurgie pour la perfusion intracardiaque nécessaire à la procédure d’immunohistochimie, intervention qui ne pourra être subite qu’une fois car il s’agit d’une mise à mort, le décès de l'animal par arrêt cardiaque est constaté au bout de 20 à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les seules nuisances attendues sont celles apportées par les injections et l'insertion du cathéter, ainsi que celles liées à l'anesthésie. Une simple gêne est ainsi induite au réveil au niveau de l'injection. Aucune nuisance liée à la sonoporation n’est attendue dans les conditions normales, cependant des dommages dans le cerveau pourraient être possibles dans le cas où les paramètres de la procédure ne seraient pas adaptés (de pression acoustique ou de dose d'Evans Blue principalement). Ces paramètres ont déjà étés déterminés sur le précédent projet sur des souris Balb/c et seront affinés de manière expérimentale, dans ce précédent projet cette nuisance n'est parvenue que dans moins de 10% des cas et nous estimons ce risque encore plus faible dans ce projet maintenant que nous avons gagné en expertise sur cette procédure.

Devenir

À la suite de la procédure de sonoporation, seuls les animaux devant être analysé ex vivo en immunohistochimie ou avec d'autres analyses moléculaires seront mis à mort afin de prélever leur cerveau. Tous les autres animaux seront gardés en vie pour suivre l'efficacité de transfection ou suivre le comportement. Les animaux pourront également être réutilisés une fois maximum pour suivre la procédure de sonoporation, à condition de l'absence de signes de souffrance et de l'absence d'expression du transgène. À la suite de la procédure de comportement, les animaux pourront également être réutilisés une fois maximum pour suivre la procédure de sonoporation, à condition de l'absence de signes de souffrance et de l'absence d'expression du transgène. À la fin du projet, ils seront mis à mort et leur cerveau sera prélevé afin d'être analysé en immunohistochimie ou avec d'autres analyses moléculaires.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental afin d'étudier l'impact de nos protocoles de thérapie génique au niveau de l'organisme entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico. De plus des études comportementales valideront l'efficacité du protocole thérapeutique, celles-ci ne peuvent être réalisées que chez l'animal vivant.

Réduction

Afin de réduire au maximum la quantité d'animaux utilisés des études in vitro ont été menées en amont du projet pour valider la technologie. En effet nous avons pu valider in vitro les propriétés de nos microbulles. Les caractéristiques de taille, de concentration et de formulation sont contrôlées au laboratoire, aucune toxicité n'a été observée sur ces agents lors des tests in vitro sur culture de cellules ou in vivo sur la souris WT (Wild-Type, c'est à dire des souris non modifiées génétiquement). Dans notre projet, un contrôle interne est présent dans chacune de nos expériences de sonoporation, nous permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux. En effet seule la partie du cerveau visée par les ultrasons focalisés exprimera le transgène, par conséquent les autres parties du cerveau serviront de contrôle négatif. Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Uniquement les expériences pertinentes seront répétées avec des animaux de groupes équivalents.

Raffinement

Les procédures seront réalisées sous anesthésie. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées par groupe de 5 maximum, avec de la nourriture, de l'eau, de la litière ainsi qu'un enrichissement de leur milieu afin de leurs assurer de bonnes conditions de vie. Afin de s'assurer de leur bien-être, les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel compétent. Une grille de score clinique sera renseignée pour les animaux en cours d'expérimentation prenant en compte l'aspect, le poids, et le comportement / la mobilité de l'animal. Des points limites seront mis en place si des animaux atteignent un point limite, ils seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle permettant une bonne représentation des phénotypes et a une similitude génétique importante avec l’Homme. De plus grâce à la faible épaisseur de son crâne, la souris est un bon modèle pour les études d’ultrasons thérapeutique dans le cerveau. Les outils génétiques développés chez la souris ont permis de générer la souris C57BL/6 Fmr1 KO, qui est le modèle le plus proche de la pathologie humaine. Il en reproduit plusieurs des phénotypes et c'est le modèle le plus utilisé pour étudier les phénotypes du syndrome du X fragile. Il s’agit du premier modèle à étudier avant de pouvoir passer à une étude sur de plus gros animaux. Ces souris ont un trouble de la sphère sociale et cognitive avec notamment de l'hyperactivité. Ce phénotype n'est pas dommageable car il ne génère aucune douleur et ces souris n'ont aucun problème pour se nourrir ou se reproduire. Nous utiliserons les souris au stade de jeunes adultes (8-10 semaines) où le comportement est supposé être stabilisé, et à un stade plus jeune (3-4 semaines). Cela nous permettra de déterminer l'efficacité de notre protocole à rétablir le phénotype sauvage à un stade avancé du développement et étudier le bénéfice d'un traitement au début du développement. En effet le syndrome du X fragile étant une maladie neurodéveloppementale nous voulons voir si la restauration du phénotype sera plus importante sur des souris jeunes.