Procédures sans réveil
Rôle des enzymes du métabolisme des phosphoinositides dans l’hémostase primaire et la thrombose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 84 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Selon les groupes, elles subissent des sections répétées du bout de la queue pour chronométrer le saignement, des prélèvements de sang à la veine cave, des lésions provoquées de la carotide ou de la jugulaire et une ligature de la veine cave, sous anesthésie pour les actes chirurgicaux. Le porteur affirme que les composés injectés ne sont ni irritants ni délétères et que les souris génétiquement modifiées n'ont pas de phénotype dommageable. Il étudie le rôle d'enzymes plaquettaires dans la coagulation et juge le modèle murin "irremplaçable" faute d'approche in vitro.
Objectifs
Les plaquettes sont des acteurs essentiels du maintien de l’intégrité vasculaire. Elles sont les premiers éléments cellulaires à intervenir dans l’arrêt du saignement lors d’une blessure vasculaire en participant à la formation d’un thrombus, ceci constituant l’hémostase physiologique dite primaire. Les plaquettes représentent cependant des cibles majeures en clinique dans la prévention de pathologies cardiovasculaires comme les maladies artérielles thromboemboliques, l'athérosclérose ou la resténose après angioplastie (première cause de mortalité dans les pays industrialisés). De nombreux anti-thrombotiques efficaces sont utilisés en clinique mais ils ont généralement des effets relativement drastiques pouvant entraîner des complications hémorragiques. Des problèmes de saignements plus ou moins graves peuvent aussi être dus à des défauts de production plaquettaire. Ainsi, la mise en évidence de cibles pharmacologiques et/ou de biomarqueurs plaquettaires est nécessaire pour une meilleure prise en charge des thromboses et des syndromes hémorragiques chez le patient. Le rôle des phosphoinositides et des enzymes régulant leur taux dans les diverses étapes qui sous-tendent la production et l’activation des plaquettes reste encore mal étudié. Pourtant, ils ont un rôle majeur à jouer dans les plaquettes sanguines car ils occupent une place de plus en plus centrale dans la régulation spatiotemporelle de la signalisation cellulaire, la dynamique cellulaire notamment le remodelage du cytosquelette et des membranes et le trafic vésiculaire, processus majeurs dans la production et les fonctions plaquettaires. Ainsi, ce projet vise à mettre en lumière comment le métabolisme de phosphoinositides régulent la physiopathologie des plaquettes sanguines.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra un meilleure compréhension du rôle des différents phosphoinostides et de leur métabolisme dans un contexte intégré visant à identifier de potentiels biomarqueurs et/ou cibles pharmacologiques dans les syndromes hémorragiques et thrombotiques dûs à des défauts de plaquettes sanguines.
Procédures
Pour la procédure 1, une coupure (de 3 secondes) de 3 mm du bout de la queue de la souris anesthésiée par injection IP (intra-péritonéale) est réalisée. Le temps d'arrêt de saignement (évalué à 50μl maximum de sang avant l’arrêt du saignement) sera évalué jusqu’à 20 minutes maximum. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé au niveau de la veine cave inférieure après anesthésie par injection IP . La prise de sang dure 1-2 minutes et un volume de sang de 800 à 1000 μl est prélevé. Pour la procédure 2, la souris est anesthésiée par anesthésie gazeuse et injectée en IP avec un anti-douleur pour un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) suite à une coupure de 1 mm (de 3 secondes). Nous réalisons ensuite une injection IP du composé d’intérêt inoffensif et non irritant. Six prélèvements sanguins à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute), suite à une coupure de 1 mm (durée de 3 secondes) est réalisé après anesthésie gazeuse et injection d’un anti-douleur sur une durée de 280h. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut. Pour la procédure 3, une injection d’un composé inoffensif et irritant est réalisé en intra-veineux durée de 10 secondes sur souris anesthésiée en IP. 1 heure après l’injection, puis toutes les 24 heures pendant 4 jours, un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) par coupure de 1 mm (durée de 3 secondes), est réalisé sur l’animal sous anesthésie gazeuse et injecté en IP avec un anti-douleur. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut. En fonction des résultats obtenus , les procédures 4, 5 et 6 seront effectuées sur certains ou tous les groupes. Pour la procédure 4, la souris est anesthésiée par injection IP pendant toute la procédure. L’acte expérimental d’induction d’une lésion thrombogène à la carotide dure 10 minutes et l'enregistrement dure 30 minutes. Pour la procédure 5, la souris est anesthésiée et traitée par injection IP d’un anti-douleur . L’acte de ligature partielle de la veine cave dure 10 minutes. La souris est ensuite retraitée par injection IP d’un anti-douleur . Pour la procédure 6, la souris est anesthésiée et traitée par injection IP d’un anti-douleur . L’acte expérimental d’induction d’une lésion thrombogène à la jugulaire dure 15 minutes. Toutes les injections IP dure 10 secondes et se font sur animaux vigiles. Les autres actes expérimentales se font sur animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
Les modèles génétiquement modifiés ne présentent pas de phénotypes dommageables de la vie à la mort. Pour les actes expérimentales, les composés injectés ne sont pas irritables ou/et délétères. Aucune données n'existent quant à des conséquences néfastes des produits injectés qui ont déjà été utilisés par différents laboratoires, dont le notre, sans aucun effets indésirables. Chaque acte expérimentale de chaque procédure est maitrisée par les responsables du projet et est réalisée sous anesthésie/analgésie sauf pour les injections intra-péritonéales qui sont des actes rapides de moins de 10 secondes sur animaux vigiles.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort car toutes les procédures nécessitent des prélèvements de sang et/ou d'organes.
Remplacement
Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexicité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré d’hémostase et thrombose non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation des modèles génétiquement modifiées.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum : en suivant des protocoles expérimentaux déjà établis dans le laboratoire, en tenant compte d’expériences déjà réalisées dans l’équipe qui nous ont montré que nous pouvons obtenir des résultats statistiquement corrects en faisant des groupes de 12 souris selon la procédure réalisée. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables en évitant la répétition d’études antérieures déjà réalisées et/ou publiées et en fonction des résultats obtenus au cours des différentes procédures expérimentales. En effet, le nombre de souris sera diminué en fonction des résultats obtenus lors des procédures expérimentales 1 à 3, en réalisant ou pas les procédures expérimentales 4 à 6. Nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 4 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes, qui si elles existent seront statistiquement affinées avec des groupes de 12 souris selon la procédure réalisée.
Raffinement
Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson avec du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois dans la cage. Une observation quotidienne des souris est réalisée par les zootechniciens en terme de comportement général (prostration, activité anormale, isolement) et d'apparence (poils hérissés, plaies/blessures, amaigrissement anormal). Toutes les procédures expérimentales se font sur souris anesthésiées et analgésiées par inhalation ou injection de composés. Un contrôle permanent de l'état d'anesthésie des souris sera réalisé par les expérimentateurs tout au long de la procédure. Tout au long des procédures, les animaux seront surveillés par les zootechniciens et les expérimentateurs. En cas de blessure, l'animal sera isolé et la blessure sera nettoyé 2 fois par jour pour favoriser une cicatrisation propre. Une mise à mort rapide de la naissance à la mort ou lors d'une procédure expérimentale sera effectuée.
Choix des espèces
Les effets pléiotropes dans un contexte d’hémostase et thrombose font intervenir des fonctions et types cellulaires multiples dans l’organisme non modélisables à ce jour par des approches in vitro. Le recours à l’expérimentation animale est donc l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans un contexte intégré. Nous utilisons des souris car les mécanismes d’hémostase et thrombose sont transposables de la souris à l'homme mais aussi car nous disposons de modèles murins génétiquement modifiées invalidés pour nos protéines d'intérêt car il n'existe pas à ce jour d'inhibiteurs pharmacologiques. Stade adulte de 8 à 24 semaines car de part et d'autre de cette fourchette d'âge les réponses fonctionelles en hémostase et thrombose peuvent être modifiées.
Caractérisation d’un nouveau modèle murin d’autisme et évaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 48 étant tuées sans réveil. Elles reçoivent un traitement dans l'eau de boisson puis passent une batterie de tests comportementaux mesurant locomotion, apprentissage, mémoire, anxiété, coordination et interactions sociales, avant prélèvement du cerveau, une partie subissant une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le porteur affirme que ces tests ne provoquent qu'un léger stress et utilise des souris génétiquement modifiées comme modèle d'autisme. Il étudie un gène et un traitement par modulateurs endocannabinoïdes, retombées cliniques présentées au conditionnel, et affirme qu'il n'existe pas de modèle informatique des comportements complexes.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont doubles : Le premier objectif est d'étudier la contribution d'un gène muté dans le trouble du spectre autistique. Nous explorerons son rôle dans l'apprentissage et la mémoire et l'activation des circuits cérébraux. Nous analyserons l'activité des régions cérébrales suite à un test de reconnaissance d'objet et explorerons les populations neuronales impliquées chez des souris invalidées pour le gène d'intérêt comparées aux souris sauvages. Le deuxième objectif est d'évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à administrer des modulateurs du système endocannabinoïde aux souris transgéniques modèles d'autisme. Nous étudierons leur capacité d'améliorer ou corriger les déficits comportementaux et au niveau des synapses observés chez les souris transgéniques.
Bénéfices attendus
L'étude dans des modèles murins des conséquences neurobiologiques de l'absence des gènes mutés dans l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux est une étape clé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans ces maladies, afin de permettre à terme de développer des approches thérapeutiques adaptés. Ces expériences devraient permettre de déterminer le rôle du gène d'intérêt dans l'activité des circuits cérébraux lors de l'apprentissage et la mémoire, contribuant ainsi à mieux comprendre son implication dans l'autisme et la déficience intellectuelle. Par ailleurs, l'évaluation d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à administrer des modulateurs du système endocannabinoïde aux souris modèles d'autisme pourrait mener à terme à des essais cliniques chez les personnes atteintes.
Procédures
Certaines souris recevront un traitement chronique, administré par voie orale dans l'eau de boisson, pendant 1 mois. Après 7 jours de prétraitement, les souris seront testées séquentiellement dans une batterie de tests comportementaux, effectués à 1-3 jours d'intervalle ; pendant les tests elles continueront à recevoir le traitement. Nous évaluerons l'activité locomotrice (1 jour), l'apprentissage et la mémoire (4 jours), l'anxiété (2 tests, chacun 1 jour), la coordination locomotrice (5 jours) et le comportement social (1 jour). La durée de l'ensemble des tests est de 3 semaines. A la fin des expériences, le cerveau sera prélevé post-mortem afin de réaliser des analyses pour comprendre le mécanisme d'action du traitement. Dans d'autres expériences, les animaux subiront une perfusion intracardiaque avec un agent fixateur, sous anesthésie profonde, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques.
Impact sur les animaux
L'administration par voie orale des traitements n'engendre pas d'effets secondaires. Les expériences de comportement réalisées ne provoquent pas de gêne particulière sauf un léger stress dû à la manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau. L'injection intrapéritonéale d'un anesthésique avant la perfusion intracardiaque peut causer de la douleur.
Devenir
Tous les animaux traités avec des modulateurs du système endocannabinoïde seront euthanasiés à la fin des expériences, afin de prélever le cerveau et le sang pour effectuer des analyses. Dans d'autres expériences, les animaux seront perfusés avec un agent fixateur à la fin, afin de fixer le cerveau et effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs puisque nous étudions des mécanismes pathologiques complexes associés à l’autisme et la déficience intellectuelle tels que des déficits cognitifs et moteurs et l'activité des circuits neuronaux intacts. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre les conséquences de l'inactivation des gènes d'intérêt dans le cerveau et développer de nouvelles approches thérapeutiques. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 1148 souris. Ce nombre des souris s'explique par la nécessité d'étudier des souris génétiquement modifiées et de souris normales de deux sexes traitées avec différents composés administrés à plusieurs doses. Les groupes d’animaux nécessaires afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement dans les expériences de comportement doivent se situer entre 12-15 par condition étudiée. En effet, la variabilité interindividuelle élevée observée lors des tests comportementaux nécessite de groupes de taille relativement élevée. La taille des groupes est déterminée sur la base de la littérature scientifique et notre propre expérience dans ce type d'analyses. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux à utiliser dans les expériences d'administration chronique des traitements, les souris seront testées séquentiellement dans une batterie de tests comportementaux, effectués à 1-3 jours d'intervalle. De plus, à la fin des expériences de comportement, nous récupérons le cerveau des souris, afin d'étudier l'effet du traitement et doser le taux des substances administrées. Enfin, lors des études explorant les effets des nouveaux traitements, nous effectuons toujours une étude pilote de taille réduite, afin de déterminer la nécessité de réaliser des études dose-réponse utilisant un grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de gêne possible. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance est exclue du protocole. Les souris sont hébergées à raison de 2 à 5 animaux par cage dans une animalerie de stabulation (température 19–21°C, cycle jour–nuit 12h–12h), avec accès libre à l’eau et aux croquettes. La litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Une semaine avant les expériences, les souris sont manipulées quotidiennement par l'expérimentateur pendant 5 min afin de les habituer et réduire le stress. De plus, avant le test de reconnaissance d'objet, les souris sont exposées au champ ouvert plusieurs fois, d'abord en groupe et ensuite individuellement, afin de réduire le stress engendré par l'environnement nouveau. 24-72 h de repos sont réservées entre les procédures comportementales. A la fin de certaines expériences nécessitant de prélever le cerveau avec fixation pour des analyses histologiques, les souris sont anesthésiées avant d'être perfusées, leur évitant toute détresse.
Choix des espèces
Le système nerveux de la souris présente des analogies avec celui de l’être humain. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé pour les études neurobiologiques et comportementales en rapport avec l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux. Enfin, on a accès à des souris transgéniques afin d’étudier le rôle des gènes d’intérêt, ce qui permet d’aborder leur fonction dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (2-6 mois). L'autisme étant un trouble qui persiste toute la vie, nous avons choisi d'étudier les conséquences de la perte du gène chez l'adulte, une fois que l'ensemble du système nerveux est développé.
Mise au point du modèle d’ischémie/reperfusion cérébrale chez la souris : Rôle de nouveaux gènes et identification de cibles thérapeutiques d’intérêt dans l’ischémie cérébrale.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 230 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chez ces dernières, un monofilament siliconé bouche une artère cérébrale pendant une heure pour provoquer un accident vasculaire, avant 24 heures de reperfusion puis la mise à mort pour mesurer la zone du cerveau détruite. Le porteur décrit une paralysie possible, une prostration et une hypothermie, les souris les plus atteintes selon l'échelle neurologique étant alors tuées, et 40 autres subissent un prélèvement de sang terminal sans réveil. Il affirme que les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier le rôle des gènes dans un "système intégré" et juge le recours à la souris "indispensable".
Objectifs
En France, les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la première cause de handicap acquis de l’adulte et la seconde cause de démence. Dans plus de 80% des cas, les AVC résultent de l’obstruction d’une artère cérébrale par un caillot sanguin ou thrombus. On parle alors d’« AVC ischémique » ou « infarctus cérébral ». La principale cause de ces AVC reste l'athérosclérose qui se définit comme une accumulation de dépôts de cholestérol sur les parois des artères. Ces dépôts durcissent et forment des plaques d'athérome qui favorisent la formation du caillot. L’élimination du caillot devient alors une priorité pour limiter la privation d’oxygène dans le cerveau et les séquelles neurologiques qui en découlent. La pathologie ischémique cérébrale reste une pathologie complexe à explorer chez l’homme. Les modèles in vivo ont pour objectif de reproduire, chez l'animal, l'ischémie cérébrale humaine dans son étiologie, ses conséquences anatomiques, métaboliques, cellulaires et fonctionnelles. Cette proximité avec la pathologie humaine permet alors de pouvoir tester plus facilement des hypothèses physiopathologiques et déterminer des stratégies thérapeutiques potentielles pour les patients atteints d’accident vasculaire cérébral. Pour ce projet, nous allons donc utiliser un modèle mis en place et développé chez le rat puis adapté à la souris. Ce modèle, reconnu pour être fiable et reproductible, est un modèle d’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne (tOMCA), par insertion, pendant 1 h, d’un monofilament siliconé au niveau de l’artère cérébrale moyenne. Après 24 h de reperfusion, la taille de l’infarct sera évaluée. La mise au point et la validation de ce modèle nécessiteront l’utilisation de 80 souris au maximum. Nous pourrons ensuite étudier le rôle de différents gènes potentiellement impliqués dans la formation du thrombus (jusqu’à 5) en mesurant la taille de la zone cérébrale infarcie dans des souris avec délétion ou mutation des ces gènes d'intérêt. Nous prévoyons d’utiliser 30 souris par mutation, soit 150 souris pour 5 gènes. Les premières mutations étudiées portent sur des gènes jouant un rôle important dans la régulation de l’agrégation plaquettaire. Des prélèvements sanguins seront donc réalisés pour évaluer cette fonction chez nos souris (besoin de 40 souris). Pour la réalisation de ce projet, 270 souris au maximum seront donc utilisées
Bénéfices attendus
Les accidents vasculaires cérébraux ischémiques (80% des AVC) résultent de l’occlusion d’une artère cérébrale par un thrombus (caillot sanguin) qui empêche le cerveau d’être alimenté en oxygène par une circulation sanguine normale. Ce type d’accident vasculaire est favorisé par les facteurs de risque cardio-vasculaires comme le tabagisme, l’hypercholestérolémie ou le diabète. Les accidents ischémiques cérébraux provoquent des dommages cérébraux parfois irréversibles, pouvant conduire, lorsque les lésions sont étendues, au décès. Il s’agit donc d’une urgence médicale absolue : le caillot doit être éliminé le plus rapidement possible pour limiter la privation d’oxygène dans le cerveau et les séquelles neurologiques qui en découlent. La pathologie ischémique cérébrale, en dépit de sa grande fréquence, reste une pathologie complexe à explorer, de par son hétérogénéité clinique mais aussi de par ses interactions possibles avec les nombreux facteurs de risque cardio-vasculaires. Ceci explique les difficultés à aborder, chez l'homme, les nombreux mécanismes physiopathologiques et/ou à identifier des cibles pharmacologiques potentielles de la pathologie ischémique cérébrale. Ces faits ont conduit à développer de nombreux modèles expérimentaux d'ischémie cérébrale chez le rat dans un premier temps, pour les adapter ensuite à la souris transgénique. Les modèles in vivo ont donc pour objectif de reproduire chez l'animal, dans un contexte physiologique proche de celui de l'homme, l'ischémie cérébrale humaine dans son étiologie, ses conséquences anatomiques, métaboliques, cellulaires et fonctionnelles. Cette proximité avec la pathologie humaine permet ainsi de tester des hypothèses physiopathologiques et d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Procédure 1: prélèvement terminal de sang en veine cave sur animaux anesthésiés (40 souris au maximum). Procédure 2: modèle d'ischémie/reperfusion réalisé sur 230 souris. L'ischémie transitoire est induite pendant 1h et la reperfusion se fait sur 24h. A l'issue, les animaux sont sacrifiés pour évaluer la taille de la zone infarcie.
Impact sur les animaux
Ce modèle d'occlusion transitoire induit des infarctus plus ou moins sévères qui se traduisent par une mortalité importante si le temps d’occlusion de l’artère est supérieur à 3h. Dans notre étude, le temps d’occlusion n’excèdera pas 1h, limitant ainsi la taille de l’infarct et les éventuelles complications. Les déficits neurologiques seront évalués à 1h et 24h après la reperfusion . Cette évaluation confirme le succès de la tMCAO post-AVC et détermine l'efficacité de la tMCAO post-reperfusion. Pour une occlusion d’1h, les souris devraient présenter au moins un léger enroulement cohérent (neuroscore 2) et selon la littérature, les déficits neurologiques sont généralement stables jusqu'à 72 heures. Un neuroscore de 4 ou 5 entrainera une mise à mort de l’animal par injection IP d’un bolus d’Euthasol. Les principales complications liées à ce modèle expérimental sont : risque d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, déplacement du fil induisant un risque d’hémorragie sous-arachnoïdienne par rupture vasculaire ou encore reperfusion diminuée liée à l’altération de la paroi carotidienne. La souris , prostrée, dos voûté, poils hérissé, et probablement en hypothermie, sera alors mise à mort. Pour les autres souris, la taille de l'infarct sera évaluée histologiquement après 24h de reperfusion.
Devenir
Procédure 1: Prélèvement de sang en veine cave: procédure sans réveil car nous avons besoin d'une grande quantité de sang pour étudier l'agrégation plaquettaire. Procédure 2 d'ischémie/reperfusion: les souris sont gardées en vie pendant 24h. Après 24h de reperfusion, l'animal est mis à mort pour prélever le cerveau et évaluer la taille de la zone infarcie
Remplacement
Les modèles in vitro disponibles à ce jour ne permettent malheureusement pas l’étude de l’implication de gènes dans un système intégré. Le recours au modèle animal reste ici indispensable pour nous permettre de cibler rapidement et efficacement les gènes ayant un impact positif sur la taille de l’infarctus.
Réduction
Quand ce sera possible, les souris contrôles serviront à l’étude de plusieurs gènes. Le modèle sera alors mis en place par des personnes expérimentées et un protocole analgésique adapté sera mis en place sur toute la durée du protocole pour limiter toute souffrance de l’animal.
Raffinement
Les animaux sont stabulées dans des conditions standards d’animalerie, avec dans la cage nourriture à volonté et milieu enrichi (frisottis ou dôme). Les déficits neurologiques seront évalués à 1h et 24h , selon une échelle en 6 points. Si l’atteinte neurologique est trop importante, l’animal sera alors exclu de l’étude.
Choix des espèces
Ce modèle d'AVC ischémique a tout d’abord été mis au point chez le rat. En raison de la disponibilité de souris génétiquement modifiées permettant d'analyser le rôle physiopathologique et/ou l'intérêt thérapeutique de gènes candidats, ce modèle a également été développé chez la souris. Pour l'étude de la physiologie et la physiopathologie du système cérébro-vasculaire, il est fondamental de prendre en compte l’ensemble des systèmes régulateurs de façon intégrée. Malheureusement, il n’existe pas, à ce jour, d’approche expérimentale in vitro ou in silico apportant le même degré et la même qualité d’informations scientifiques ne faisant pas appel à l’expérimentation animale. Nous choisissons donc de travailler sur la souris, cette dernière nous permettant plus facilement de mettre en œuvre l’étude des gènes identifiés en amont. De plus, nous disposons déjà du modèle de souris Arhgef1, premier gène que nous étudierons dans le cadre de ce projet Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes âgés entre 2 et 4 mois.
Enregistrement du nerfs splanchnique et renal (sympatique) chez le rat paraplegique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
27 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 20 opérés sous anesthésie puis tués avant tout réveil et 7 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ces 7 rats subissent une lésion de la moelle épinière puis quinze jours de paraplégie avant l'enregistrement de nerfs du système nerveux autonome, les 20 autres ne subissant que la chirurgie finale. Le porteur affirme que réveiller les animaux après la pose d'électrodes autour des nerfs sympathiques ne serait pas éthique, ce qui justifie leur mise à mort. Il décrit des tests préliminaires menés in vitro sur des moelles de ratons mais indique que l'enregistrement des nerfs ne peut se faire que sur un système intégré vivant.
Objectifs
Les lésions spinales (SCI) sont parmi les atteintes les plus invalidantes et répandues dans le monde, avec une incidence de 15 à 52,5 cas par million (soit 12000 nouveaux cas par an aux Etats-Unis d’Amérique et 40000 patients en France), affectant majoritairement des individus jeunes et en bonne santé (80% sont des hommes âgés entre 15 et 35 ans), avec un impact dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne. En plus des effets sur le système sensori-moteur bien connus et identifiés (paralysie, insensibilité), les sujets SCI présentent une détérioration importante de l’activité de leur système nerveux autonome, système nerveux en charge des grandes fonctions de l’organisme (rythmes respiratoire et cardiaque, pression artérielle, thermorégulation…) entrainant des troubles cardiovasculaires majeurs (atteinte du rythme cardiaque et de la régulation de la pression artérielle). Le but de notre projet de recherche est d’élucider les dysfonctions cardiovasculaires chez l’animal lésé médullaire. Lors d’une lésion spinale, les commandes envoyées par le cerveau vers la moelle sont perdues. Des travaux ont proposé que pour partie, le contrôle du tonus vasculaire pouvait être réalisé par un système « décentralisé », localisé dans la moelle épinière. En accord avec ces données, il a été découvert récemment l’existence d’un circuit rythmogène au sein de la moelle épinière qui réaliserait le couplage entre les activités somatique (qui achemine les informations provenant des organes sensoriels) et sympathique (qui permet une réponse adaptée du corps). De plus, les résultats in-vivo d’une étude faite sur l’activation pharmacologique d’un couplage sympathico-somatique au sein de la moelle épinière est porteuse de perspectives de traitements afin de réduire la gravité des symptômes vasculaires chez les patients lésés
Bénéfices attendus
Ce projet éthique fait partie d'une étude visant à identifier de nouvelles molécules permettant le rétablissement des ondes de Mayer (oscillation de la pression artérielle de nature vasomotrice). Cela pourra être une avancée dans le traitement des dysreflexies autonomes (épisodes soudains et brutaux d’hypertension et de bradycardie, déclenchés par des stimuli nociceptifs) survenant chez les personnes présentant des lésions hautes de la moelle épinière. Ce projet en particulier a pour but de définir si l'oxotremorine joue un rôle sur dans l’activation sympatique de la moelle épinière.
Procédures
7 animaux subiront une lésion haute de la moelle épinière (chuirurgie d'environ 1 heure). Ils resteront paraplégiques pendant 15 jours avant d'être endormis une dernière fois et permettre l'enregistrement de certains nerfs du système nerveux autonome (système nerveux qui régulent de façon automatique - sans en être conscient (maximum 2h30 avec la chirurgie et l'enregistrement du nerf) – les grandes fonctions de notre corps telle que la respiration, la pression artérielle, le rythme cardiaque…). 20 autres animaux subiront uniquement la dernière chirurgie sans réveil (enregistrements des nerfs).
Impact sur les animaux
Les animaux tout comme les humains présentant des lésions de la moelles épinières présentent des difficultés locomotrices du train arrière pouvant être largement compensées par les pattes avant et une cage d'hébergement adaptée en hauteur.
Devenir
Le placement d'électrodes autour des nerfs sympatiques peuvent les abimer. Il n'est donc pas éthique de réveiller ces animaux dont les fonctions vitales pourront être impactées.
Remplacement
Des tests préliminaires à cette grosse étude, ont été faits sur des moelles épinières de rats nouveaux nés in vitro avant d’envisager des études in-vivo. Concernant l'enregistrement des nerfs sympathiques (nerfs du système nerveux autonome - défini précédemment - qui induisent des augmentations de fréquence cardiaque, respiratoire, sécrétion d'adrénaline ou encore diminution de l'activité digestive), il n'est pas possible de faire cette étude ex-vivo car l'enregistrement de l'activité des nerfs est la résultante d'un système intégré
Réduction
Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux par lots (n=5) afin de pouvoir finaliser une grosse étude sur les lesions hautes de la moelle épinière. Nous utiliserons les tests de Mann-Whitney pour comparer nos résultats.
Raffinement
(alimentation semi-liquide pour pallier au ralentissement de la vidange gastrique), ajout de paraffine dans celle-ci (pour pallier au ralentissement de la motricité intestinale), cage sur tapis chauffant (pour pallier aux problèmes de thermorégulation), vidange de la vessie plusieurs fois par jour par des expérimentateurs expérimentés, alimentation et eau au fond de la cage (cage avec un biberon bas et des coupelles d'aliment posées au sol. Le tunnel est en plastique rouge rainuré pour permetre une meilleur mobilité dedans, tapis aggripant au fond de la cage (pour facilité la mobilité). De même, le protocole analgésique a été validé par 2 vétérinaires. Seul un nombre minimum de personne (1 ingénieur - niveau concepteur et chirurgie et 1 chercheur - niveau concepteur et chirurgie - 1 animalier - niveau expérimentateur + le vétérinaire en cas de besoin) seront amenés à rentrer dans la pièce où se trouveront les animaux afin de s'assurer que les animaux soient manipulés par peu de personne (personnes habituées à leur conditions particulières, pouvant s'adapter aux problématiques éventuelles).
Choix des espèces
Les premières études de ce projet ont été faites sur des rats sprague-dawley. Le choix initial de l'espèce est lié à la taille de l'animal facilement hébergé dans une animalerie mais pas trop petit comme la souris afin de pouvoir facilement pratiquer la lésion de la moelle épinière. Nous gardons la même espèce ici dans un soucis de continuité de projet. Nous utiliserons des rats adultes d'environ 300gr (âge : 70 à 80 jours)
Formations réglementaires à l’expérimentation animale « Espèces aquacoles » Niveaux concepteurs (Niveau 1) et applicateurs (Niveau 2)
- Formation professionnelle
16 daurades royales vont être utilisées, manipulées puis tuées sans réveil, dans le cadre d'une formation réglementaire à l'expérimentation animale. Chaque stagiaire s'exerce sur un poisson aux gestes de base, préhension à l'épuisette, anesthésie, marquage, prélèvement de sang et mise à mort. Le porteur justifie la mise à mort par la nécessité d'une autopsie et l'absence d'usage ultérieur, non par un objectif de connaissance. Il qualifie d'"indispensable" le recours à l'animal vivant pour reproduire les conditions de terrain.
Objectifs
Les formations règlementaires à l’expérimentation animale « Espèces aquacoles » (pour les chercheurs et pour les techniciens de laboratoire) sont approuvées par le Ministère de l’Agriculture (agrément obtenu pour 5 ans par l’établissement organisateur). Ces formations ont comme objectif d’assurer la formation spéciale complémentaire obligatoire à tout personnel réalisant des études utilisant l’animal de laboratoire vivant. Ces formations suivent un programme règlementaire validé par la Commission Nationale de la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques avec des conférences (CM), des travaux dirigés (TD) et des travaux pratiques (TP).
Bénéfices attendus
L’objectif de ces formations est d’améliorer la pratique quotidienne des stagiaires afin qu’ils puissent appliquer les principes du raffinement dans leurs expérimentations (meilleur choix des modèles animaux et des procédures expérimentales, meilleure prise en charge du bien-être animal), et ainsi obtenir une meilleure efficacité notamment une meilleure reproductibilité dans les résultats ce qui aboutit à une réduction du nombre d’animaux utilisés pour atteindre les objectifs scientifiques.
Procédures
Les poissons (Daurade royale - Sparus aurata) sont utilisés pour réaliser l'apprentissage de gestes expérimentaux de base, tels que : - la préhension douce avec une épuisette. La capture à l’épuisette est effectuée avant l’anesthésie, et après l’anesthésie. Elle permet dans tous les cas une préhension douce de l’animal dans son milieu. - l'anesthésie dans un aquarium - la contention et la manipulation de l'animal anesthésié avec une épuisette puis sur la table d'expérimentation - le marquage avec une marque externe. Le marquage est effectué, après désinfection du site, avec un pistolet qui effectue un agrafage d’une marque externe. Le poisson est sorti de l’eau et placé sur un linge humide - le prélèvement de sang se fait au niveau de la veine caudale, avec une aiguille bleue 23G préconisée pour une utilisation "intramusculaire enfant" et "intraveineuse", en se positionnant en direction de la veine caudale (position présentée pendant la séance d’anatomie sur animal mort). Le geste du prélèvement de sang est supervisé par un encadrant avant toute action invasive sur l’animal. - l'euthanasie par immersion dans un bain avec surdosage de produit anesthésiant (benzocaine).
Impact sur les animaux
Animaux euthanasiés.
Devenir
Le choix d’euthanasier les animaux est lié à plusieurs aspects : - Nécessité de réaliser une autopsie pour identifier les éventuelles lésions provoquées par les actes expérimentaux effectués pendant la formation - Nécessité de pratiquer une procédure d'euthanasie conforme - Réalisation de divers prélèvements d’organes, une fois l’animal euthanasié, afin de montrer la démarche de laboratoire pour ces prélèvements - Absence de justification d’utilisation ultérieure de ces animaux par le laboratoire.
Remplacement
Le recours aux animaux vivants s'effectue après un premier apprentissage sur mannequin ou matériel inerte. L'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour se placer dans les mêmes conditions que les conditions de terrain en phase expérimentale, afin d'appréhender au mieux le déplacement du poisson lors de sa préhension, d'exercer l'anesthésie, le marquage, le prélèvement et l'euthanasie.
Réduction
En matière de réduction, le nombre d’animaux utilisés est restreint au minimum, à savoir un poisson par stagiaire (soit 16 au total), pour que chaque stagiaire ait effectué à minima un ensemble de manipulation. D'un point de vue pédagogique, les stagiaires fonctionnent en binômes, chacun étant donc une fois manipulateur et une fois observateur et assiste/participe ainsi à deux ensembles complets de manipulations.
Raffinement
En matière de raffinement, les protocoles d’anesthésie-analgésie (benzocaine) sont adaptés de manière à éviter toute douleur ou souffrance aux animaux lors de leur manipulation. Les dosages d'anesthésiant sont proportionnés en fonction de l'espèce et du poids des individus. La concentration en oxygène dissous dans les bassins d'accueil est contrôlée, et si besoin, maintenue à un niveau suffisant pour ne pas générer de stress. Par ailleurs, les bassins utilisés lors des manipulations sont à fond noir, afin maintenir les poissons dans un environnement non stressant. Les individus sont contrôlés de façon continue pendant toute la durée de la formation afin d'identifier précocement tous signes de stress.
Choix des espèces
Les stagiaires concernés par les espèces aquacoles travaillent principalement sur des poissons de bassin ou de pleine mer. Deux espèces cibles sont maintenues sur le site et sont les sujets quotidiens des activités des stagiaires : Denti (Dentex dentex) et Corb (Sciaena umbra). La daurade royale (Sparus aurata) sélectionnée pour la réalisation de cette formation est une espèce animale de taille moyenne qui se rapproche assez des poissons utilisés en routine dans le laboratoire demandeur ; par ailleurs, la daurade bénéficie d'une disponibilité aisée en élevage. C'est aussi une espèce qui facilite les premières étapes de l’apprentissage et dont l’approvisionnement et l’hébergement ne sont pas trop contraignants dans la région concernée. Animaux jeunes adultes d'un poids suffisant pour permettre les actes expérimentaux de base et faciliter les manipulations, de l'ordre de 200 à 300 g de poids corporel.
Formation pratique aux activités d’évaluation d’agents hémostatiques sur modèle porcin
- Formation professionnelle
20 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans des procédures menées sous anesthésie générale. Chacun subit une chirurgie du rachis, laminectomie ou abord par laparotomie, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des neurochirurgiens à maîtriser les saignements. Le porteur justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de reproduire un flux artériel réel sur simulateur. Il résume les bénéfices à une formule brève, "importants pour les futurs patients".
Objectifs
Le projet a pour objectif de former les chirurgiens (neurochirurgiens) aux techniques permettant de limiter les saignements en cours de procédure et à l’utilisation d’agents hémostatiques limitants le saignement peropératoire.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de permettre aux chirurgiens de se former à l’utilisation d’agents hémostatiques. Les bénéfices sont importants pour les futurs patients.
Procédures
La veille du traitement, les animaux seront mis à jeun pour la nuit. Le jour du traitement, les animaux seront placés sous anesthésie générale et sous antalgiques. le premier animal sera opéré dans les conditions d’une laminectomie dorso-lombaire, et le deuxieme animal sera opéré selon un abord antérieur du rachis lombaire par laparotomie ou lombotomie . Au cours de ces deux interventions, la démonstration des différentes techniques destinées à maitriser les saignements peropératoires telles que le tamponnement ou la coagulation bipolaire mais aussi le recours possible à certains agents hémostatiques en cas de saignement plus difficile à contrôler sera faite.
Impact sur les animaux
La procédure se déroulera sous anesthésie générale et aucune nuisance ou effet indésirable n’est attendu pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Pour l'apprentissage de la gestion de l'hémostase, il est nécessaire de travailler dans des conditions réelles de flux artériel qui sont actuellement impossibles à reproduire sur simulateur.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux impliqués dans les formations, plusieurs techniques sont appliquées sur chaque animal.
Raffinement
Les porcs arrivent sur place une semaine avant la procédure pour leur permettre de s’habituer aux lieux et ainsi de diminuer leur stress. Pour leur bien-être, ils sont hébergés ensemble dans un box d’une superficie de 5,3m², agrémenté de jouets, sur une litière de copeaux de bois ou de paille. En cas de température inférieure à 10 degrés dans l’animalerie, un système de chauffage individuel est activé. Durant la procédure, les animaux sont sous anesthésie générale (AG) et sous antalgiques pour éviter des souffrances à l’animal.
Choix des espèces
Le modèle choisi est le porc, car l'anatomie et la physiologie de leur rachis est comparable à celle de l'homme. Les porcs utilisés seront des animaux de 50 kg environ (soit entre 3 et 4 mois) pour leur proximité anatomophysiologique avec l’homme.
Système nerveux autonome
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
300 rats vont être utilisés, dont 250 opérés sous anesthésie et tués sans réveil et 50 réutilisés après avis vétérinaire, dans des procédures impliquant selon les cas un niveau de souffrance modéré. On leur pose un cathéter dans la carotide ou un implant de télémétrie dans l'aorte, puis on provoque à plusieurs reprises une chute de tension par basculement brutal de leur position, pour tester des médicaments contre l'hypotension orthostatique. Le porteur affirme ces modèles "nécessaires" à la mise sur le marché de nouveaux médicaments et juge qu'ils "ne peuvent pas être remplacés" par des méthodes alternatives. L'impact du produit lui-même est déclaré faible, l'atteinte venant surtout de la chirurgie et des manipulations.
Objectifs
L’hypotension orthostatique est définie comme une chute brutale de la pression artérielle qui survient lors du passage de la position couchée à la position debout. Par gravité, le passage en position debout résulte en une accumulation sanguine dans le pool veineux (jambes) qui en retour induit une diminution transitoire du retour veineux, du débit cardiaque et de la pression artérielle. Chez le patient sain, la pression artérielle revient rapidement à des valeurs normales grâce au mécanisme réflexe sympathique. Toutefois, certains médicaments, tels que les antagonistes des récepteurs adrénergiques ou les vasodilatateurs (les antagonistes des récepteurs à l’angiotensine II par exemple), diminuent ce réflexe sympathique, aggravant l’hypotension orthostatique et pouvant ainsi conduire à l’étourdissement et la perte de connaissance. Ces effets secondaires peuvent réduire considérablement le champ d’application thérapeutique de ces médicaments et limiter leur utilisation clinique. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments (par la réduction de cette hypotension) ou de s'assurer qu'ils n'induisent pas eux-mêmes une hypotension orthostatique pouvant conduire à une syncope.
Bénéfices attendus
Les modèles décrits dans ce projet sont nécessaires à la découverte et à la mise sur le marché de nouveaux médicaments efficaces pour traiter les problèmes d'hypotension orthostatiques, ou à la recherche de tels effets secondaires de certains traitements (pour les caractériser voire pour aider à affier leur champ d'application).
Procédures
Dans le modèle anesthésié, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure (sans réveil). Un cathéter est positionné dans une artère carotide pour la mesure en continue de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque. L'hypotension orthostatique est provoquée (en plusieurs occasions) par un changement abrupte de position de l'animal qui passe d'une position horizontale à une position inclinée. Pour les besoins de l'étude, des prélèvement de sang peuvent être réalisés (sous anesthésie) pendant le test et/ou en fin de test (immédiatement avant la mise à mort). La procedure (sous anesthésie) n'excède pas 2 heures et les animaux sont immédiatement mis à mort (sans reveil préalable). Dans le modèle éveillé, les animaux sont dans une première phase équipé (sous anesthésie) d'un implant de télémétrie qui permet l'enregistrement en continue de la pression artérielle (par cathétérisme de l'aorte abdominale) et de la fréquence cardiaque. Après réveil et une période de récupération (généralement une semaine au minimum), l'hypotension orthostatique est provoquée (sous anesthésie gazeuse légère et transitoire) par un changement abrupte de position de l'animal (appelé procédure de Tilt) qui passe d'une position horizontale à une position inclinée. Cette procédure de Tilt peut-être répétée en plusieurs occasions et à des jours différents. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang peuvent être réalisés (sur animal vigile ou anesthésié au gaz isoflurane) pendant le test et/ou en fin de test.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Dans le modèle chez le rat éveillé, certaines périodes d'hébergement en cage individuelle (avec enrichissement) sont cependant nécessaires: 1) pendant la phase de récupération post-chirurgicale, afin d'éviter que les animaux ne retirent les agrafes/sutures de leurs congénères (généralement pour un période d'une semaine maximum); 2) pendant les mesures (généralement un peu plus de 24h), car le système de télémétrie ne fonctionne qu'avec une fréquence d'émission des signaux. Un hébergement groupé ne permet donc pas d'identifier la source d'émission d'un signal (interférence entre les implants).
Devenir
Pour les procédures modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour les procédures sans réveil, les animaux ne sont pas réutilisable.
Remplacement
Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la capacité de régulation du système nerveux autonome. Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la capacité de régulation du système nerveux autonome, l'intégrité du système nerveux autonome ne pouvant être respecté que chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif. Dans la procédure mise en place chez l'animal anesthésié et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal, réduisant aisni le nombre d'animaux utilisés. Dans la procédure mise en place chez l'animal éveillé et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal à des jours différents, réduisant aisni le nombre d'animaux utilisés. Nos analyses statistiques (basées sur des analyses de variances et test de Dunnett) indiquent qu’un effectif de 8 animaux par groupe (nombre de groupes variables, 2 en standard) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Dans le but de réduire le nombre d’animaux (dans l’application de la règle des 3R), certains animaux issus du modèle chez le rat éveillé (étude par télémétrie) peuvent également être réutilisés aux strictes conditions qu’ils n’aient pas subi de procédures sévères et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le système nerveux autonome du rongeur est prédictif de leur efficacité en clinique. Principalement rats sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques, à la bibliographie scientifique.
Émulsifiants alimentaires synthétiques et infection gastro-intestinale eucaryote: effets sur l’homéostasie intestinale et le bien être de l’hôte
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
5 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, l'une menée sous anesthésie sans réveil. Elles sont infectées par le parasite Blastocystis puis soumises à une distension colorectale, avant d'être tuées pour prélèvement de tissus, afin d'étudier l'hypersensibilité digestive du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur indique qu'une souris atteignant 20 % de perte de poids ou présentant une douleur trop forte serait mise à mort de façon anticipée. Il juge "indispensable" de travailler sur des animaux pour établir un lien de causalité avec le parasite.
Objectifs
De nombreuses études épidémiologiques ont rapporté une forte prévalence de Blastocystis chez des patients atteints de différentes pathologies, plus particulièrement au niveau du tractus intestinal (syndrome de l'intestin irritable (SII), maladies inflammatoires...). Il est donc important de mieux comprendre les causes et conséquences de la prévalence de ce parasite chez les patients souffrant de SII. Un modèle reproductible d'infection chronique à Blastocystis chez le rat a déjà été mis en place et a permis de mettre en lumière le lien entre ce parasite et l'hypersensibilité viscérale d'origine colique (HSVC) non inflammatoire, la dysbiose intestinale ou encore le comportement anxio-dépressif. Dans l’optique de la transposition des données à l’espèce humaine, le passage au modèle souris apparait nécessaire afin d'étudier les mécanismes d'actions de Blastocystis et d'envisager des cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes des douleurs associées au SII afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettraient d’envisager une étude clinique grâce à une collaboration avec les services de gastroentérologie d'un CHU. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.
Procédures
Suite à l'infection par Blastocystis, des feces seront prélevés afin de s'assurer de l'implantation du parasite au niveau intestinal de la souris. De plus les procédures 3, 4 et 5 seront effectuées une seule fois après une infection de 4 semaines
Impact sur les animaux
L’infection par Blastocystis induira chez les animaux les symptômes associés au SII-PI à savoir une hypersensibilité colique. Le développement de ce symptôme nous permettra d’étudier les mécanismes mis en jeu dans les douleurs et les atteintes centrales afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les animaux seront cependant surveillés quotidiennement par l'expérimentateur et si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera mis à mort par overdose d’isoflurane suivie d’une dislocation cervicale.
Devenir
Pour l'ensemble des procédures, les animaux seront maintenus en vie. A l’issue de la procédure 5 (Distension colorectale), les animaux seront mis à mort pour effectuer différents prélèvements de tissus.
Remplacement
Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de Blastocystis sur la sensibilité colique, le comportement et le microbiote intestinal. De plus, une étude comparant des données de métagénomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec Blastocystis. Ce type d’étude n’est envisageable que chez l’animal. D’autre part, nous voulons également évaluer les conséquences physiologiques sur la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale, pour lesquelles il n’existe pas d’autre alternative.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique GraphPad Prim 9.0 et les principales analyses, notamment de suivi du poids seront effectuées grâce à des test ANOVA one-way ou two-way suivi d'un post test adéquat en fonction du résultat.
Raffinement
Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type petite maisonnette de chez Genobio ainsi que du coton.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce "souris" a été fait pour ce projet pour 2 raisons : (1) il est connu que cet espèce est résistante à une infection par Blastocystis ST4 et (2) qu'un traitement chronique par des émulsifiants déstabilise le microbiote intestinal et la barrière de mucus. Ainsi, ce projet permettra de définir si une perturbation de l'homéostasie intestinale par des émulsifiants (largement utilisés dans les pays industrialisés) favoriserait l'implantation du parasite Blastocystis et entrainant d'autres perturbations du "Bien-être" de l'hôte. De plus, malgré le modèle d'étude déjà publié chez le rat, des études complémentaires sont indispensables afin de transposer chez la souris les données précédemment obtenues chez le rat. Ainsi, les outils génétiques accessibles uniquement chez la souris (principalement les animaux KO pour un gène d'intérêt) pourront nous permettre de mieux comprendre par quel récepteur ou mécanisme physiopathologique le parasite Blastocystis parvient à s'implanter et induire des troubles du comportement chez son hôte. Les souris seront utilisés au stade de jeune adulte. En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.
Etude des effets d’un candidat médicament dans un modèle d’Ischémie-reperfusion aigue chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 750
1 125 rongeurs, 375 souris et 750 rats, vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ils reçoivent un candidat médicament par gavage ou injection jusqu'à deux fois par jour pendant trois semaines, avant une chirurgie provoquant une ischémie du cœur pouvant entraîner saignements et arythmies. Le porteur agit comme prestataire de services pour des laboratoires pharmaceutiques, l'espèce étant choisie selon la demande du client. Il justifie le recours aux rongeurs par la mesure sur "organe entier" de la taille de l'infarctus.
Objectifs
L'infarctus du myocarde (IM) se définit comme la nécrose d'une partie du muscle cardiaque suite à l'obstruction d'une artère coronaire. Le défaut de vascularisation est alors responsable d'une diminution (occlusion partielle) voire un arrêt (occlusion totale) de l'apport d'oxygène (hypoxémie) et de nutriment au tissu cardiaque. On parle alors d'ischémie myocardique. La taille du territoire ischémié et la durée de l'occlusion ont un impact direct sur l'étendue des lésions nécrotiques appelées "lésions ischémiques" et la seule option pour limiter leur progression est de rétablir la circulation sanguine dans les artères coronaires, c'est la reperfusion. En l'absence de reperfusion, l'ensemble de la zone ischémiée va finir par nécroser. La revascularisation va permettre de réoxygéner et de réapprovisionner les tissus en nutriments. Cependant, cette revascularisation va être à l'origine de "lésions de reperfusion" qui vont venir s'ajouter aux lésions ischémiques déjà présentent. D’un point de vue thérapeutique, malgré la diversité des stratégies médicamenteuses et non médicamenteuses qui peuvent être mises en place, elles n’apportent pas à ce jour une réponse totalement satisfaisante (effets secondaires, pas efficaces chez tous les patients). Un des axes de recherche consiste à développer des traitements visant à limiter l'apparition des lésions ischémiques et/ou de reperfusion. Cela passe par la réalisation de tests effectués sur des modèles animaux aussi prédictifs que possible. L'un des modèles les plus classiquement utilisés pour tester l'efficacité de candidats médicaments est le modèle d'ischémie-reperfusion (I/R) in-vivo chez le rongeur (rat + souris) qui est le sujet de ce projet.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, en tant que prestataire de services pour différents laboratoires pharmaceutiques développant des candidats médicaments, nous sommes responsables de la partie in-vivo, à savoir l’administration du composé, la procédure d'ischémie reperfusion sur animaux anesthésiés ainsi que de l'estimation de la taille d'infarctus après prélèvements du myocarde sur ces mêmes animaux. L’ensemble de ces expérimentations sont réalisées dans le but de tester et d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces nouveaux composés au cours d’études pré-cliniques et ainsi d’obtenir des preuves de concept quant à leurs possibles efficacité et bénéfice pour la santé humaine.
Procédures
Lors de ce projet, les animaux seront possiblement traités avec le candidat médicament par des voies d’administration nécessitant le recours à des contentions manuelles (gavage, intra-péritonéale, sous-cutanée) ou en tunnels de contention (intra-veineuse), une anesthésie générale gazeuse (intra-veineuse) et l’usage dans certains cas d’aiguilles (intra-péritonéale, sous-cutanée, intra-veineuse). Les traitements pourront être administrés jusqu'à 3 semaines (maximum) avant la procédure d'ischémie-reperfusion à raison de 2 fois par jour pour les gavages et les administrations intra-péritonéales et sous-cutanées et 4 à 5 administrations intra-veineuses pourront être réalisées. L’évaluation de l’efficacité des nouveaux traitements se fera lors d’une procédure chirurgicale effectuée sous anesthésie générale chimique à l’issue de laquelle l’animale inconscient sera mis à mort.
Impact sur les animaux
Lors des traitements, les animaux seront maintenus en contention, ce qui peut s’avérer stressant pour les animaux. Certains traitements nécessiteront l’usage d’aiguilles pour effectuer les injections ou encore une anesthésie générant également un stress. A l’issue du projet, un protocole d'ischémie/reperfusion sera réalisé au cours d'une procédure chirurgicale sans réveil efféctuée sous anesthésie générale pouvant êrte à l'origine de saignements et d'arythmies importantes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure 1.
Remplacement
De nombreuses études expérimentales sur l'infarctus du myocarde utilisent les rats et souris. En effet, ces espèces possèdent un système cardiaque similaire à celui de l'homme et l'ensemble des paramètres mesurés lors d'une procédure expérimentale d'I/R sont identiques à ceux mesurés chez le patient humain. Ces espèces développent des lésions cardiaques reproductibles, ce qui en fait un modèle préclinique de choix. Son utilisation a permis de développer et de tester de nombreux candidats médicaments ayant donné lieu à des essais cliniques. L'espèce choisie lors de la procédure dépend exclusivement de la demande des laboratoires pharmaceutiques. L’espèce choisie correspond à celle préalablement sélectionnée pour les données pharmacologiques et sur laquelle est présente l'expression de la cible thérapeutique. L'objectif du projet étant d'obtenir une preuve de concept d'efficacité de ces nouveaux composés in vivo l'utilisation de rongeurs est nécessaire afin d'évaluer l'effet sur un organe entier (taille d’infarctus) et les conséquences fonctionnelles (pression artérielle, fréquence cardiaque).
Réduction
Les données préalables obtenues sur ce modèle ont permis d'établir les effectifs d'une série expérimentale à 75 animaux répartis en 5 groupes de 15 animaux. Le nombre d'animaux par groupe a pu être fixé à 15 sur la base de notre expérience passée et de nos données antérieures sur ce modèle ainsi que sur le retour d'expérience des responsables de projet. L'étude d’efficacité d’un composé constitue une série expérimentale. A raison de 15 séries expérimentales réparties sur 5 ans, le nombre total d'animaux pour ce projet est de 1125. L'analyse des données, notamment la quantification des tailles d'infarctus, sera effectuée en aveugle (sans connaissance des groupes) par une seule personne pour éviter tout biais dans l'évaluation de l'infarctus. Les données obtenues seront soumises à des tests statistiques adéquats (paramétriques ou non paramétriques) après un test de normalité des données. Des t-tests et/ou des ANOVA une voie seront réalisés entre les différents groupes afin d'évaluer l'efficacité du composé testé.
Raffinement
Les animaux sont hébergés pendant leur durée d'acclimatation dans des cages aux dimensions conformes aux recommandations en vigueur et ceci jusqu'au protocole sans réveil. Des enrichissements multiples sont placés dans les cages. À réception, les animaux sont collectivement hébergés (3 ou 2 rats par cage selon le poids et 6 souris par cage). L'eau et la nourriture sont données ad libitum et les animaux ont accès à différents types d’enrichissements (cubes de bois, carrés de cellulose, rouleaux de carton). Lors de la chirurgie, les animaux seront profondément anesthésiés avec un mélange d’anesthésiques et analgésiques chimiques. Une analgésie centrale sera également administrée avant la procédure chirurgicale. L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent, formé et entraîné et une attention toute particulière sera porté au suivi des animaux afin de prévenir et de remédier au plus vite à toute apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites seront également fixés avant le début des expérimentations.
Choix des espèces
La grande partie des études expérimentales sur l'étude du développement de l'infarctus du myocarde utilisent les rats et souris. En effet, ces espèces possèdent un système cardiaque similaire à celui de l'homme et l'ensemble des paramètres mesurés lors d'une procédure expérimentale d'I/R sont identiques à ceux mesurés chez le patient. Ces espèces développent des lésions cardiaques reproductibles, ce qui en fait un modèle préclinique de choix. Son utilisation a permis de développer et de tester de nombreux candidats médicaments ayant donné lieu à des essais cliniques. L'espèce choisie lors de la procédure dépend exclusivement de la demande des laboratoires pharmaceutiques l’espèce choisie correspond à celle préalablement sélectionnée pour les données pharmacologiques et sur laquelle est présente l'expression de la cible thérapeutique. Des rongeurs adultes (à partir de 5 semaines) au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés dans ce modèle. -Rats de souche Wistar ou Sprague Dawley -Souris de souche C57BL/6J ou BalbC En tant que prestataire de services, le choix des animaux et des espèces utilisées pour chaque série expérimentale dépend de la demande des laboratoires pharmaceutiques. Les animaux utilisés seront nécessairement choisis parmi la liste ci-dessus.
Délivrance intracérébrale d’un médicament par ultrasons chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
300 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles reçoivent une injection intraveineuse de particules, une séquence d'ultrasons puis un traceur, avant une perfusion intracardiaque terminale, pour établir une preuve de concept d'une délivrance de médicaments dans le cerveau par ultrasons. Le porteur décrit le stress lié à la contention et à l'anesthésie et une hypothermie limitée par une couverture chauffante. Il indique avoir mené des essais in silico et in vitro et conclut que le modèle animal ne peut être remplacé à cette étape.
Objectifs
Etablir la preuve de concept de l’efficacité d’une nouvelle stratégie de délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons.
Bénéfices attendus
Validation de notre nouvelle stratégie ultrasonore de délivrance intracérébrale de médicaments
Procédures
Procédure 1 : Evaluation de la capacité de la séquence ultrasonore US1 et des particules P1 à accumuler un traceur vasculaire, le bleu d’Evans, dans le cerveau : 1- Injection intraveineuse de particules P1 – anesthésie gazeuse – 80 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 30 s 2- Application de la séquence ultrasonore US1 – anesthésie gazeuse – 80 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 5 min 3- Injection intraveineuse d’une solution de bleu d’Evans – 80 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 30 s 4- Perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde – 160 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 20 min Procédure 2 Evaluation de la capacité des séquences ultrasonores US1 et US2, et des particules P1 et P2 à accumuler un fluorophore, DiD, dans le cerveau 1- Injection intraveineuse de particules P2 – anesthésie gazeuse – 40 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 30 s 2- Co-injection intraveineuse de particules P1 et P2 – anesthésie gazeuse – 80 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 30 s 3- Application de la séquence ultrasonore US2 – anesthésie gazeuse – 40 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 5 min 4- Application de la séquence ultrasonore US1 – anesthésie gazeuse – 40 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 5 min 5- Application des séquences ultrasonores US1 et US2 – anesthésie gazeuse – 20 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 5 min 6- Perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde – 140 animaux- pour chaque animal 1 seule fois – 20 min
Impact sur les animaux
Le stress est minimisé par l'implication d'un personnel qualifié à l'expérimentation animale (niveau concepteur). Les souris sont facilement stressées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage. Les nuisances ou effets indésirables des procédures 1 et 2 seront évalués par le personnel de zootechnie et par les responsables de l’étude. La respiration, la température et le poids seront mesurés.
Devenir
Procédures 1 et 2 : A la fin de l’étude, une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde et un prélèvement du cerveau sera réalisé.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons réalisé des expériences in-silico et in-vitro dont les résultats sont particulièrement encourageants et nécessitent d'être validés in-vivo. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in silico.
Réduction
Grâce à un plan d’expérience, les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 20 souris (10 mâles et 10 femelles). Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si notre nouvelle stratégie ultrasonore permet une accumulation efficace du bleu d’Evans et du DiD dans le cerveau (Puissance de test : Two-way ANOVA, 80%, Seuil de risque : 0.05).
Raffinement
Les souris seront hébergées en présence d'un objet d'enrichissement (morceaux de carton et/ou tube plastique) en groupe. Les souris sont facilement stressées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage. Afin de limiter l’hypothermie induite par l’anesthésie générale, principale nuisance des procédures 1 et 2, les souris seront placées sur une couverture chauffante pendant ces procédures.
Choix des espèces
Dans la littérature, les stratégies de délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons sont réalisées chez la souris Balb/c de 6 semaines environ pour un poids de 20 g.
Etude des effets antagonistes du sélénium sur la toxicité au mercure chez les géniteurs de truite arc-en-ciel.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
5 778 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère, une partie mise à mort sous anesthésie sans réveil. Reproductrices et alevins sont nourris pendant plusieurs semaines avec un aliment contenant du méthylmercure à quatre fois la limite légale, pour étudier l'effet protecteur du sélénium sur cette contamination. Le porteur revendique des retombées pour la santé humaine et pour la valorisation de coproduits de thon dans l'élevage de la truite. Il affirme que l'étude des mécanismes chez la descendance ne peut être menée sur lignée cellulaire ni par modélisation.
Objectifs
L’objectif de ce projet sera de mieux comprendre et caractériser l’antagonisme du sélénium vis-à-vis du méthylmercure dans l'alimentation des géniteurs de truite arc-en-ciel, principale espèce aquacole produite en France, sur son métabolisme, sa détoxication, ainsi que sur les paramètres antioxydants et la réponse pro-inflammatoire chez la descendance.
Bénéfices attendus
Ces travaux auront ainsi des répercutions en santé humaine en améliorant les connaissances sur les conséquences qu’entraînent une exposition, par l’alimentation parentale, au méthylmercure sur la descendance. Cette expérimentation permettra aussi d’évaluer la possibilité d’utiliser des coproduits de thon comme ingrédient alternatif pour l’élevage de la truite arc-en-ciel.
Procédures
Trois prélèvement de sang au maximum de 2 mL chez les géniteurs de truites d'un poids moyen compris entre 0,6 et 1 kg anesthésiés dans un bain de benzocaïne (durée : environ 1 minute pour chaque prélèvement de sang). Alimentation pendant 6 mois de plusieurs lots de géniteurs de truite (90 animaux au total) avec un aliment contenant 2 ppm de méthylmercure. Alimentation pendant 3 semaines de plusieurs lots d'alevins de truite (1800 animaux au total) issus des géniteurs utilisés dans le projet avec un aliment contenant 2 ppm de méthylmercure.
Impact sur les animaux
La limite légale de mercure et de sélénium dans les aliments aquacoles est de 0,5 mg/kg, donc la dose la plus haute représente ici 4 fois la limite légale pour le mercure et 8 fois la limite légale pour le sélénium. Ces concentrations ont été choisies suite à un premier essai nutritionnel réalisé chez des truites juvéniles ainsi qu’une étude bibliographique des effets du sélénium et du mercure chez les poissons au stade géniteur (Penglase et al., 2014 ; Khadra et al., 2019). Ces doses assurent l’observation d’un challenge pro-oxydant et inflammatoire par le mercure, tout en évitant une non métabolisation de ce dernier ainsi qu’un blocage de la reproduction ou une mortalité certaine des poissons. Une légère baisse de la croissance transitoire avait été observée chez les juvéniles et pourrait également être observée chez les géniteurs ou alevins, en plus de l'observation au niveau métabolique d'un stress oxydant et pro-inflammatoire limité.
Devenir
L’ensemble des animaux de l’expérimentation sera euthanasié et destiné au prélèvement d’échantillons pour analyses
Remplacement
S’agissant d’un essai nutritionnel chez des géniteurs de truite et dans le but d’étudier les mécanismes physiologiques et moléculaires qui en découlent chez la descendance, l’étude ne peut donc pas être réalisée sur des lignées cellulaires ou par des calculs et des modélisations informatiques.
Réduction
Le nombre de poissons mis en expérimentation est calculé a minima compte-tenu de la variabilité individuelle observée dans des études antérieures avec dix femelles et cinq mâles par bassin pour pouvoir obtenir suffisamment de pontes simultanées dans chaque lot pour la deuxième partie de l’essai sur la descendance. Avec 6 régimes testés chacun dans deux bassins, le nombre de géniteurs de truite mis en expérimentation sera de 6x2x15=180. A J0, 9 poissons n’ayant pas encore reçu de régime expérimental seront prélevés pour les analyses, soit un total de 189 géniteurs utilisés pour cet essai sur les géniteurs.
Raffinement
Les procédures sont raffinées avec des conditions d’élevage optimisées énoncées ci-dessus. Les animaux seront nourris à satiété visuelle afin d’assurer leur bien-être et ne pas polluer le milieu par une trop grande distribution d’aliment qui ne serait pas consommé. Les effectifs seront limités afin de réduire les rejets dans l’eau. La supplémentation en mercure organique sera testée car mieux assimilée que la forme inorganique, donc potentiellement plus toxique pour l’animal mais moins polluante au niveau environnemental. Les doses minimales à partir desquelles un effet est visible ont été choisies. Le mercure sera ajouté avant extrusion de l’aliment afin de limiter sa potentielle dissolution dans le milieu aquatique. Un mélange attractant sera ajouté dans l’aliment végétal afin de maximiser la prise alimentaire. Des analyses de mercure seront réalisées en cours d’essai afin de vérifier l’absence de pollution de l’eau. Si tel était le cas, l’essai serait stoppé.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est la première espèce piscicole produite en France et a donc un poids agronomique et commercial important, ce qui en fait un choix privilégié pour cet essai, en plus de son intérêt scientifique : espèce à gros œufs avec alevins contenant de larges réserves vitellines issues des dépôts maternels. Les animaux utilisés seront des géniteurs de truites femelles et mâles avec un ratio 2/1, afin d’être dans les conditions optimales de reproduction et pouvoir étudier l’effet de l’alimentation parentale : maternelle et paternelle (en particulier pour les effets épigénétiques) chez la truite arc-en-ciel.
Rôle de l’Amphiréguline dans la fuite capillaire associée au syndrome de réponse inflammatoire systémique secondaire à un choc cardiogénique post-arrêt cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
458 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant de l'anesthésie sans réveil ou un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est posé sous anesthésie, puis un arrêt cardiaque de huit minutes est provoqué et suivi d'une réanimation, certaines étant tuées une heure après pour prélèvements, d'autres suivies pour évaluer leur survie. Le porteur soutient, littérature à l'appui, que le coma consécutif à l'arrêt cardiaque n'entraîne pas d'inconfort, et prévoit une analgésie préventive. Il présente le contrôle de la fuite capillaire comme répondant à un "besoin médical majeur".
Objectifs
Ce projet de recherche fondamentale vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire (fuite de plasma au travers des vaisseaux) au cours des états de choc cardiogénique chez l’homme. Les états de choc constituent un enjeu de santé publique. Les admissions pour états de choc représentent un tiers des admissions en réanimation (environ 20.000 patients par an), et la mortalité associée reste de l’ordre de 40% actuellement. Il existe au cours des états de choc une fuite capillaire importante). Cette fuite capillaire est due à une augmentation de la perméabilité des vaisseaux du fait de l’activation de l’inflammation (syndrome de réponse inflammatoire systémique : SRIS). Lorsqu’elle est généralisée, cette fuite capillaire aggrave l’insuffisance circulatoire du fait de la baisse du volume sanguin, et participe à l’apparition de lésions sur l’ensemble des organes (syndrome de défaillance multiviscérale). Le contrôle de la fuite capillaire s’est avéré très bénéfique dans plusieurs modèles de choc chez l’animal. Cependant, les déterminants de cette fuite capillaire au cours des états de choc restent très peu connus chez l’homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons isolé plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire chez 19 patients atteints de SRIS. Cette étude a permis en particulier d’identifier l’amphiréguline comme cible d’intérêt particulier du fait de son tropisme vasculaire. L’association entre la concentration plasmatique d’AMPHIREGULINE et la fuite capillaire a été confirmée dans une cohorte indépendante de 77 patients. Notre objectif est de fournir la preuve de concept que la modulation de l’activité de l’AMPHIREGULINE permet de diminuer la fuite capillaire et la mortalité au cours du SRIS.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de caractériser le rôle de l’AMPHIREGULINE dans la fuite capillaire associée au choc cardiogénique post-arrêt cardiaque, et le potentiel intérêt de sa modulation. Le contrôle de la fuite capillaire au cours de ce syndrome est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, l’arrêt cardiaque restant associé à plus de 50% de mortalité actuellement, et la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients.
Procédures
Chaque animal ne sera inclus que dans une procédure. Ces procédures comprendront : - la pose d'un abord vasculaire (cathéter veineux) qui sera réalisé sous anesthésie générale après une analgésie prophylactique. - un arrêt cardiaque long (8min) puis une réanimation cardiopulmonaire - une surveillance de l'animal après cardiaque avec soit une euthanasie à 1h de l'arrêt cardiaque pour quantification de la fuite capillaire, soit une évaluation de la survie. - une surveillance continue du bien être animal avec si nécessaire une analgésie supplémentaire L'ensemble de l'intervention dure entre 1 et 24 heures en fonction de la procédure.
Impact sur les animaux
L’arrêt cardiaque induisant une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (coma), les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Ceci est confirmé par notre suivi des animaux au cours de la mise au point du modèle (DAP 23817). Un suivi attentif d’un potentiel inconfort sera néanmoins mis en place : Pour diminuer au maximum l’inconfort potentiel des souris au cours de ces cinq procédures, une antalgie prophylactique sera systématiquement réalisée avant le début de la procédure. Pour les procédures 2, 3 et 5, l’état de conscience sera systématiquement dépisté après levée de la sédation toutes les heures pendant 7 heures (soit jusque H+8 de l’arrêt cardiaque puis toutes les 4 heures le jour et toutes les 8h la nuit.) L’inconfort sera dépisté par une échelle validée et un traitement antalgique sera administré en cas de besoin.
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sérum et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du SRIS. La fuite capillaire est en effet d’origine multi-factorielle et l’AMPHIREGULINE régule de nombreuses voies physiologiques. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats. Le nombre d’animaux nécessaires est calculé a priori. - Procédure 1 : Effectif fixé à 117 souris - Procédure 2 : Effectif fixé à 92 souris - Procédure 3 : Effectif fixé à 40 souris - Procédure 4 : Effectif fixé à 117 souris - Procédure 5 : Effectif fixé à 92 souris Le plan expérimental a été optimisé de façon à combiner les données obtenues pour chaque animal et réduire l’effectif nécessaire - Une analyse échographique sera couplée à l’analyse lors de la procédure 1 - Les analyses sanguines et histologiques seront effectuées sur le sang et les organes non prélevés 3) Notre équipe poursuit une veille bibliographique continue sur le sujet et le modèire : le, de façon à ne par duppliquer d’éventuelles nouvelles données. De la même façon, l’ensemble des résultats du projet sera publié, pour les rendre accessibles aux autres équipes.
Raffinement
Nous tendrons vers les objectifs préconisés de raffinement. L’arrêt cardiaque induisant une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (coma), les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Un suivi attentif d’un potentiel inconfort sera néanmoins mis en place : - Pour diminuer au maximum l’inconfort potentiel des souris au cours de ces cinq procédures, une antalgie prophylactique sera systématiquement réalisée avant le début de la procédure. - L'ensemble de la procédure de pose d'abord vasculaire sera réalisée sous anesthésie générale - Les procédures 1 et 4 sont entièrement réalisées sous anesthésie générale - Pour les procédures 2, 3 et 5, l’état de conscience sera systématiquement dépisté après levée de la sédation toutes les heures pendant 7 heures (soit jusque H+8 de l’arrêt cardiaque puis toutes les 4 heures le jour et toutes les 8h la nuit. - L’inconfort sera dépisté par une échelle validée et un traitement antalgique sera administré en cas de besoin. - Les euthanasies seront réalisées sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car le protocole précis de SRIS secondaire à un arrêt cardiaque est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de notre cible d’intérêt dans ce modèle. Ces expériences permettront de définir si le gène d’intérêt peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du SRIS chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de SRIS étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement, ainsi que lors de nos expérimentations préliminaires sur ce modèle (APAFIS#23817)