Procédures sans réveil

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de trente minutes sous anesthésie pour l'injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires et un prélèvement terminal. Le porteur indique que les tumeurs peuvent, comme chez l'humain, provoquer une compression intracrânienne, des maux de tête et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision, mais estime que le suivi hormonal évitera ces stades avancés. Il affirme ne pas pouvoir remplacer le modèle murin par des approches in vitro et présente cette greffe intra-hypophysaire comme plus représentative que la greffe sous-cutanée.

Objectifs

Les tumeurs hypophysaires humaines ont une incidence élevée (1 personne/1500). Ces tumeurs bien que bénignes provoquent des maux de tête, des troubles visuels et peuvent être invasives dans certains cas. Elles répondent mal aux traitements thérapeutiques, il est donc indispensable de trouver de nouvelles molécules pouvant limiter leur développement. Malgré leur fréquence importante chez l’homme, il existe peu d’outils d’étude pour caractériser le comportement de ces tumeurs, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester de nouveaux traitements cliniques. Leur étude est donc tributaire de modèles précliniques qui soient représentatifs des tumeurs hypophysaires humaines. Bien que le nombre de lignées tumorales soit limité et la mise en culture de cellules dérivées de tumeur soit délicate, la greffe de ces différents modèles sous la peau des souris constitue actuellement la seule possibilité de modèle préclinique pour mettre au point et valider de nouveaux traitements thérapeutiques. Les greffes sous-cutanées sont toutefois peu représentatives du contexte intracrânien dans lequel se développent et évoluent ces lésions tumorales chez l’Homme. Notre projet vise donc à tester la faisabilité et à développer un modèle expérimental de greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour disposer de modèles précliniques relevant qui permettront : i) d’étudier le comportement et la biologie de différentes lignées et cellules tumorales hypophysaires dans leur environnement naturel de développement et ii) de valider de nouveaux modèles précliniques pour évaluer l’effet de drogues thérapeutiques qui sont actuellement uniquement testées in vitro. La mise en place et la validation de ces nouveaux modèles de greffes intra-hypophysaires seront réalisées par le biais d’une micro-injection automatisée dans l’hypophyse de souris sur des animaux profondément endormis. Nous avons identifié les coordonnées d’injection dans l’hypophyse sur une cohortes d’animaux de réforme déjà morts. Notre projet visera à confirmer que ces coordonnées sont adaptées et ne varient pas si elles sont utilisées pour des injections sur animaux anesthésiés. Nous testerons ensuite l’efficacité de prise de greffe des 5 lignées tumorales hypophysaires de rongeurs disponible mais également de 20 suspensions cellulaires issues de tumeurs humaines issues de 2 sous types tumoraux. Les tumeurs seront collectées pour étude et mises en culture pour établir de nouveaux outils cellulaires

Bénéfices attendus

Notre projet vise à développer de nouveaux modèles précliniques pour l’étude biologique et le développement d’outils thérapeutiques dédiés aux atteintes tumorales de la glande hypophysaire. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité de ces tumeurs particulièrement fréquentes dans la population (1 cas / 1500) et mieux saisir l’impact de leur niche environnementale naturelle (i.e. l’hypophyse antérieure) sur leur comportement et leur évolution. Notre projet devrait également permettre d’engendrer de nouvelles lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche et ainsi limiter à long terme l’usage de modèles animaux.

Procédures

Lors de l’injection des cellules tumorales dans leur hypophyse, les animaux subiront une chirurgie de 30 minutes maximum sous anesthésie générale et sous analgésie. Cette acte n’aura lieu qu’une fois. Un prélèvement de sang sera ensuite réalisé sur ces animaux chaque semaine afin d’identifier toute augmentation d’hormone qui pourrait suggérer un développement tumoral. Une variation trop importante (supérieur à 35% ) des concentrations circulantes d’hormones mesurées avant la greffe conduirait alors à un arrêt immédiat de l’expérimentation. Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin de chaque procédure, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.

Impact sur les animaux

Un acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie pour injecter les cellules dans l’hypophyse. La greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse entrainera le développement de lésions tumorales intracrânienne. Ces lésions pourront comme chez l’homme entrainer une compression intracrânienne, conduisant à des maux de têtes et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision. Grâce au suivi des hormones produites par ces tumeurs, les souris ne devraient toutefois jamais atteindre ces stades tumoraux avancés qui sont fréquemment retrouvés chez l’homme et sont déclencheurs d’une chirurgie. Après injection, un prélèvement sanguin de 50 à 100uL sera également réalisé chaque semaine par une ponction à la veine caudale sous contention chez les animaux greffés afin d’assurer le suivi de la progression tumorale par un dosage hormonal. L’utilisation d’un ciment biologique pour colmater le site d’injection ne devrait pas entrainer de gêne.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procedures experiemntales réalisées. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages d’hormones et de molécules secrétées par les lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les tumeurs collectées post-mortem, Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats. Les tumeurs collectées derivé de patients seront également mise en culture pour générer de nouveaux outils cellulaires qui nous permettront de travailler in vitro et limiter ainsi nos besoins d’expérimentation sur l’animal.

Remplacement

Les modèles de greffes tumorales dans les tissus où se développent naturellement les tumeurs greffées représentent actuellement les modèles précliniques les plus convaincants, car ils permettent d’étudier le comportement des cellules tumorales (pousse tumorale, remodelage du microenvironnement, réponse à certains traitements, …) dans leur environnement cellulaire natif. En raison de la nature complexe de la recherche proposée, qui vise à évaluer la prise de greffe et l’impact de l’environnement hypophysaire sain sur la progression tumorale de cellules injectées, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro.

Réduction

Afin de nous conformer à la règle de réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre le taux de succès de nos greffes et l’obtention d’un nombre suffisant de tumeurs dont nous pourrions étudier les caractéristiques moléculaires. Afin de limiter l’utilisation d’animaux, nous avons au préalable mis au point toute notre procédure d’injections sur des animaux morts de réforme. Dans le cadre des travaux proposés, 9 souris par sexe devraient nous permettre d’aboutir à l’obtention de 7 tumeurs dont les traits moléculaires pourront être étudiés et comparés entre eux. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale ni de test statistique, notre procédure se limitant à la mise au point d’un nouveau modèle préclinique. La greffe de 400 souris au maximum sur 5 ans nous permettra de confirmer la faisabilité et la reproductibilité de nos modèles de greffes de lignées cellulaires et étudier la prise éventuelle de plusieurs greffes humaines parmi les injections des cellules issues des 20 tumeurs humaines qui seront utilisées.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, comportement erratique, altération des constantes hormonales, …). L’identification de ces signes entrainerait alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir : i) la reproductibilité des greffes réalisées et ii) d’évaluer le nombre d’animaux statistiquement nécessaires qui devront être étudiés en cas de test de molécules thérapeutiques à venir. Les analyses post-mortem que nous réaliserons sur le matériel biologique collecté nous permettrons de valider l’intérêt de ce modèle en comparaison des greffes sous-cutanées et de dériver d’éventuels nouveaux modèles cellulaires de lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche.

Choix des espèces

Le modèle de souris Rag2KO, possède un système immunitaire appauvri. Il s’agit d’un modèle indispensable pour greffer du tissu humain ou des lignées rongeurs de fonds génétiques mixtes afin qu'il n'y ait pas de rejet du greffon. Le modèle Rag2KO est de plus un modèle réceptif aux lignées choisies et aux tumeurs humaines hypophysaires que nous avons déjà pu greffer avec succès en sous-cutané. Nous y avons mis au point les coordonnées stéréotaxiques pour cibler l’hypophyse. Il est donc idéal pour les greffes dans l’hypophyse que nous souhaitons faire et il nous permettra également l’étude du microenvironnement et de l’interaction entre la tumeur et son environnement. Les protocoles d’injection seront réalisés sur des souris âgées de 12 à 16 semaines. Ce sont à ces âges que nous avons validé nos 70% d’efficacité d’injection avec les coordonnées définies.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié sous anesthésie sans réveil et l'autre en gravité modérée. Chaque souris subit une ou plusieurs chirurgies stéréotaxiques du cerveau de deux à six heures pour l'injection d'un virus, d'un traceur ou une stimulation optogénétique, le réveil s'accompagnant de stress, d'hypothermie et de difficultés à se déplacer et se nourrir dans les premières heures. Les animaux sont tués en fin de procédure pour prélever leur cerveau. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative satisfaisante et mentionne une collaboration avec des théoriciens développant des modélisations à partir de ses travaux.

Objectifs

Le système ocytocinergique n’a jamais été étudié dans le cervelet. Ce projet pilote vise à établir la présence d’ocytocine et de ses récepteurs dans le cervelet de souris, ainsi qu’à en déterminer l’origine. Il pose les bases d’un projet global, qui décrit et caractérise la physiologie et le rôle du système ocytocinergique cérébelleux dans le fonctionnement cérébral L’ocytocine est une hormone dont la fonction principale, au niveau cérébral, est de contrôler les liens sociaux. Ainsi, on a recherché les voies ocytocinergiques principalement dans les circuits cérébraux impliqués dans les interactions sociales, le système de récompense et de gestion des émotions, mais pas dans les régions comme le cervelet. En réalité, les fonctions de l’ocytocine sont plus complexes et les travaux récents indiquent qu’elle aurait plutôt pour rôle d’adapter finement les comportements et réactions physiologiques à l’environnement social. Le cervelet étant une structure clef pour ces adaptations, nous avons entrepris de déterminer s’il existe un système ocytocinergique dans le cervelet de souris. A l’aide de techniques d’immunohistochimie et de traçage des voies neuronales, nous mettrons en évidence et caractérisons la présence de récepteurs à l’ocytocine. Nous testerons également la présence et l’origine de l’ocytocine dans le cervelet de souris adulte

Bénéfices attendus

Des recherches récentes ont étendu les fonctions de l'ocytocine (OXT) et du cervelet bien au-delà de leurs rôles traditionnels attendus. Le neuropeptide OXT est devenu une molécule de grand intérêt en neurosciences en raison de ses effets pro-sociaux et de son potentiel prometteur en tant que nouvelle cible thérapeutique. Les données les plus récentes ont étendu le rôle de l'OXT au-delà de ses effets positifs célèbres. L’OXT régule la confiance, l'empathie, l'agressivité, l'excitation sexuelle, le sommeil, le stress, l'anxiété, la douleur et le système sensoriel, tout au long de la vie et chez les deux sexes. Pour donner une cohérence à ces effets génétique multi-caractériel, on peut proposer que l’OXT permet aux individus d'adapter leurs interactions avec leur groupe de manière flexible et dépendante du contexte. Une conséquence de ces travaux est que le système OXT a été largement étudié dans les régions cérébrales des réseaux sociaux et émotionnels ; mais pas dans le cervelet, ce dernier n’étant pas considéré comme faisant partie de ces réseaux. Pourtant, les recherches des quinze dernières années ont révélé le rôle du cervelet ne se limite pas au contrôle moteur. Il contribue aux systèmes cognitifs et émotionnels, ainsi qu'aux comportements addictifs et sociaux. En effet, en raison de sa large connectivité au cortex cérébral, le cervelet pourrait amorcer ou biaiser le traitement cortical des informations motrices, sensorielles, émotionnelles et cognitives dans des directions contextuellement pertinentes. Cette fonction pourrait expliquer la contribution du cervelet à certains troubles cognitifs et émotionnels (dyslexie, syndrome cérébelleux cognitif-affectif) ainsi qu’à des troubles neurodéveloppementaux (troubles du spectre autistique, schizophrénie, troubles déficitaires de l’attention). Le cervelet étant une structure clef pour ces adaptations, nous avons entrepris de déterminer s’il existe un système oxyctocinergique dans le cervelet de souris et son rôle. Plusieurs articles indiquent la présence d’ocytocine et de ces récepteurs dans le cervelet humain et de rongeur (rat et souris). Cependant, aucune donnée ne le démontre, et surtout, il n’est pas prouvé que ce système soit fonctionnel. Nous devons donc récolter, via ce projet préliminaire, les preuves qu’un système ocytocinergique fonctionnel existe bel et bien dans le cervelet de souris afin de proposer son étude et sa caractérisation détaillée dans la suite de nos travaux.

Procédures

- 44 Souris seront utilisées pour une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale et locale d’une durée totale entre 2 et 4h pour une injection de virus rAAV, 22 jours plus tard le même groupe de 22 souris seront utilisées pour une chirurgie stéréotaxique pour la stimulation optogénétique pour une durée totale entre 2 et 4h - 16 souris seront utilisées pour une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale et locale d’une durée totale entre 1et 2h pour une injection de traceur anatomique - 60 souris seront utilisées pour une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale et locale d’une durée totale entre 3 et 6h pour l'enregistrement neuronal après injection d'ocytocine

Impact sur les animaux

-Stress du au réveil de l’animal pendant quelques minutes -Hypothermie du au réveil de l’animal après l’anesthésie -Difficulté pour se déplacer se nourrir et s’abreuver dans les 2 premières heures suivant le reveil

Devenir

Procédure n°1, Injections stéréotaxiques de virus AAV ou d’une solution de liquide céphalo-rachidien artificiel avec stimulation optogénétique : Les 44 souris de la procédure seront mises à mort en fin de procédure pour prélevement d'organe Procédure n° 2 Injection stéréotaxique d’un traceur neuroanatomique Les 16 souris de la procédure seront mises à mort en fin de procédure pour prélevement d'organe Procédure n° 3 Chirurgie stéréotaxique pour enregistrement neuronal avec injection d’ocytocine (voie intrapéritonéale, Intra cérébrale et élacridar IV) Les 60 souris de la procédure seront mises à mort par surdosage d’anesthésie chimique à la fin de la procédure chirurgicale, ces animaux ne pourront pas être ré utilisés par la suite pour d’autres études, cette procédure fait partie d’une étude préliminaire et les cerveaux seront prélevés pour des analyses anatomiques

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences ex vivo et in vivo sur l’animal), car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu, de ce fait et pour répondre aux nombreuses questions de l'effet de l'oxycitocine par la communautée scientifique des lignées de souris transgénique ont été crées, nous utiliserons l'une d'elle, dont la modification transgénique entraîne la suppression de la séquence flanquée dans les neurones exprimant l'oxytocine. Néanmoins, nous avons une collaboration avec des chercheurs théoriciens qui vont développer des modélisations sur la base de notre travail

Réduction

Ce projet est une étude pilote utilisant un petit nombre d’animaux, les données preliminaires vont nous permetre d’affiner, d’arrêter ou de continuer les études dans le furur pour un projet plus global Pour réduire le nombre d’animaux et optimiser nos résultats, les animaux serviront à plusieurs mesures, chaque fois que possible. Par exemple, les animaux utilisés pour le traçage seront également étudiés par immunohistochimie. Grâce à des rAAV vecteurs simultanés de la ChR2 et de marqueurs fluorescents, les animaux utilisés en procédure N°1 serviront également à des études de traçage avec des techniques d’immnuhistochime Les différentes procédures expérimentales ont été pensées et élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Nous utiliserons des tests de puissances statistiques paramétriques (Mann-Whitney, Wilcoxon, t-test, ANOVA), avec indices de confiance fixés à 5%. Comme il s'agit d’expériences pilotes, nous ne connaissons pas les paramètres statistiques des populations testées. Nous ne pouvons donc pas déterminer a priori le nombre exact d’animaux nécessaires pour une puissance statistique cible. Nos estimations sont donc basées sur nos connaissances approfondies de la physiologie du cervelet et sur la littérature. Afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux nécessaires, la puissance statistique de nos tests sera évaluée régulièrement. Nous cesserons les expériences dès que les données collectées permettront d’atteindre une puissance de 80% et obtenir un resultat significatif, cela dépendra de l’amplitude, de la fréquence et de la variance des effets testés, ainsi que du nombre d’éléments (n). Afin de réduire n (et donc, le nombre d’animaux), nous utiliserons des méthodes et outils déjà caractérisés, des conditions réduisant au maximum la variabilité des données, et des effets aussi facilement détectables que possible (bonne sensibilité).

Raffinement

Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés après induction gazeuse sans contention. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé quotidiennement et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin Dans la mesure du possible les procédures n’auront pas lieu le vendredi ou veille de vacances/ jour férié pour éviter toute défaillance de surveillance, et si besoin une personé qualifier sera désignée pour la surveillance Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant /anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition ad libitum.

Choix des espèces

La souris est le modèle standard pour l'étude des reseaux et échanges neuronaux et de la mémoire dans le cerveau des mammifères. L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et l'électrophysiologie du cerveau des rongeurs sont bien caractérisés. Il existe une vaste littérature sur la physiologie du cervelet de souris, les comportements, l'apprentissage et la mémoire. La souris constitue un modèle animal les plus classiques pour les études en laboratoire, et plus particulièrement chez la souris génétiquement modifiée Du fait de la disponibilité de souches connues. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Par ailleurs, les techniques de génétique, de marquage anatomique et d'immunohistochimie sont rendues possible du fait de la disponibilité de nombreux produits utilisables chez la souris Dans le cadre de ce projet pilote, nous utiliserons de jeunes adultes (40 à 50 jours) en raison de l’abondance des données disponibles sur cette gamme d’âge dans la littérature (tant ocytocine que cervelet) et de la plus grande facilité d’expérimenter à ces âges. Les protocoles d’anesthésie sont plus efficaces et plus sûrs, et les techniques d'électrophysiologie in vivo produisent plus rapidement des données en utilisant des animaux ayant atteint leur taille adulte et de jeune âge. Ceci permettra d’accélérer la collecte des données préliminaires et d’affiner nos stratégies ultérieures pour étudier des animaux plus jeunes

110 rats vont être utilisés, tués à l'issue, la plupart sous anesthésie sans réveil et vingt en gravité modérée. Une partie court sur un tapis roulant motorisé, une autre reçoit un bêta-bloquant pendant vingt-quatre heures, puis les animaux sont tués pour prélever leur cœur et l'étudier en montage isolé perfusé ou en biochimie. Le porteur affirme qu'aucun modèle de substitution in vitro n'existe pour évaluer l'effet d'un étirement sur la fonction cardiaque et conclut que le recours à l'animal est "indispensable". Il retient le rat au motif que la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l'humain.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle du monoxyde d'azote et de la s-nitrosylation des protéines mitochondriales et myofilamentaires dans la régulation de la réponse du coeur à un stress mécanique.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux identifier les voies de signalisation impliquées dans la réponse du coeur à un stress mécanique. En effet, il est bien connu qu'un stress mécanique transitoire peut aboutir à une adaptation bénéfiques du coeur alors qu'un stress chronique peut conduire à un remodelage cardiaque défavorable. Néanmoins, à ce jours, les mécanismes cellulaires permettant d'expliquer qu'un même stimulus puisse aboutir à des réponses adaptatives différentes n'ont jamais été identifié.

Procédures

Les animaux de la procédure 1 seront traités avec un Beta-bloquant afin de réduire le stress adrénergique cardiaque au moment de leurs manipulations. Les animaux de la procédure 2 seront soumis à un protocole d'exercice physique sur tapis roulant motorisé.

Impact sur les animaux

Certaines expérimentations necessiteront de faire courir des animaux sur tapis roulant motorisé. Le laboratoire possède une grande expérience de ce type d'expérimentation. Par ailleurs, les animaux sont surveillés tout au long de leur course par un personnel habilité et formé pour ce type d'acte expérimental. Certains animaux seront traités avec un beta-bloquant pendant 24h00 avant leur euthanasie. Les autres expérimentations seront réalisées sur des organes, des cellules, des myofilaments isolés et necessiteront l'euthanasies des animaux avant le prélèvement des tissus.

Devenir

A la fin des deux procédures, les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement du coeur. Celui sera utilisé soit dans un protocole de coeur isolé perfusé de Langendorff soit pour réaliser des analyses biochimiques.

Remplacement

Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer d'un stress d'étirement (stretch) sur la fonction cardiaque et sur la réponse contractile du coeur. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient. Par conséquent l'utilisation de modèles animaux apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole.

Réduction

Un grand nombre d'expérimentations seront réalisées sur des organes ou des cellules isolées. Cette approche permet, en contrôlant un grand nombre de paramètres (facteurs circulants, conditions de charge cardiaque, fréquence cardiaque) et ainsi en réduisant la variablité d'une expérience à l'autre, de limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus, la taille du coeur du rat permet de collecter une grande quantité de matériel biologique et permettra, à partir d'un même coeur de réaliser diffrentes évaluations (microscopie électronique et biochimie à partir d'un même prélèvement cardiaque).

Raffinement

Les animaux sont stabulés une semaine après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un animalier formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites (pièce jointe).

Choix des espèces

Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation des même tissus (coeur) ex vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte (rats de 12-15 semaines) afin de pouvoir travailler sur un système cardiovasculaire mature et sans facteurs de complications.

80 cochons vont être utilisés pour la formation de personnels à l'anesthésie et à la chirurgie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Une moitié, employée aux travaux pratiques d'anesthésie, est réveillée puis réutilisable, l'autre subit des gestes chirurgicaux lourds comme une trachéostomie, une hépatectomie ou une splénectomie et est mise à mort sous anesthésie sans réveil. Un même animal sert à deux ou trois stagiaires. Le porteur affirme que la mise en condition réelle sur grands animaux reste "essentielle" et "fondamentale" pour l'apprentissage.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de proposer des formations pratiques pour les personnels travaillant spécifiquement sur les gros animaux, avec un enseignement des principes de l’anesthésie et de la chirurgie sur le porc comme modèle. Les instruments et équipements utilisés sur les grandes espèces sont en effets différents de ceux utilisés chez les rongeurs et des formations adaptées aux grandes espèces sont nécessaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices apportés par l’utilisation d’animaux en TP sont liés la mise en situation réelle des apprenants pour la gestion de l’anesthésie, démonstrations de l’intérêt de l’oxygénation par exemple pour limiter les effets depresseurs d’une apnée, réanimation, gestes chirurgicaux dans un organisme vascularisé, rapports anatomiques spécifiques. Ceci permet d’apprendre et de mémoriser les bases et réflexes adaptés. Les techniques de chirurgie mini-invasive enseignées sont transposables à d’autres espèces de grande taille. Ce TP permet donc aussi de former les utilisateurs de gros animaux autres que le porc.

Procédures

Des procédures sur animaux anesthésiés sont enseignées sous la supervision de moniteurs qualifiés, dans le cadre de 2 TP (impliquant des animaux différents) : - Un TP anesthésie qui dure 2 à 3 heures, avec les gestes suivants : sédation par injection intramusculaire, pose de catheter sur veine périphérique, perfusion, intubation, monitoring per opératoire, oxygénation et apnée, prise de sang. Les animaux sont ensuite réveillés sous surveillance vétérinaire et réintègrent leur groupe social en animalerie. - Un TP chirurgie qui dure 4 heures durant lesquelles plusieurs gestes chirurgicaux sous anesthésie générale sont enseignés sur un même sujet (afin d’utiliser moins d’animaux) : pose de catheter central sous guidage échographique, trachéostomie, drain thoracique, chirurgie laparoscopique (coelioscopie) et sutures intra-abdominales, laparotomie, hépatectomie, gastrectomie ou splénectomie. A la fin du TP chirurgie, les animaux sont euthanasiés par injection de barbituriques, sans réveil de l’anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les animaux sont utilisés à but d’apprentissage de gestes, sous anesthésie avec analgésie, et avec euthanasie en fin d’intervention pour ceux soumis à des procédures chirurgicales. Les nuisances éventuelles sont liées à des incidents à l’anesthesie (difficultés à l’intubation, hématome lors de la pose de cathéter sur veine périphérique, réveil plus long) ou en cas de geste chirurgical mal maitrisé (saignement, atteinte d’organe vital…).

Devenir

Les animaux inclus dans la première procédure (TP anesthésie) ne subissent pas de dommages, ils sont réveillés et peuvent réintégrer l’animalerie avec leurs congénères. Après un temps de repos et sur avis vétérinaire, ils peuvent être réutilisés dans un autre projet. Les animaux inclus dans la deuxième procédure (TP chirurgie) ne sont pas réveillés, ils sont mis à mort sous anesthésie générale à la fin de l’intervention.

Remplacement

La plupart des apprentissages sont dispensés sans l’utilisation d’animaux vivants, en particulier pour l’initiation aux gestes techniques de base qui peuvent être expliqués sur video et enseignés sur organes isolés ou simulateurs. Tous les efforts sont faits pour remplacer l’animal par d’autres méthodes pédagogiques dès lors qu’elles permettent la même courbe d’apprentissage. La mise en condition réelle reste néanmoins encore essentielle pour l’apprentissage de l’anesthésie (contention, prémédication, pose de voie veineuse, intubation,perfusion, monitoring et réanimation) et de certains gestes de base en chirurgie (gestion per opératoire de l’animal, gestion intra corporelle des mouvements et saignements). La mise en condition sur grands animaux est une aide fondamentale dans l’apprentissage des conditions réelles de travail pour les personnels concernés.

Réduction

Un seul animal est utilisé pour 2 à 3 stagiaires, ils réalisent plusieurs gestes chirurgicaux sur un même sujet (mis à mort en fin de TP), ceci permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum nécessaire à l’atteinte de nos objectifs pédagogiques.

Raffinement

Les porcs utilisés pour les TP sont hébergés en groupe social dans de larges box, avec des conditions environnementales contrôlées en termes de température et d’hygrométrie. Ils disposent d’un abreuvement à volonté et de jeux à pousser, mâchouiller (balles, étoiles). Ils ont une période d’acclimatation avant d’être anesthésiés : ils sont lavés à l’eau tiède, contrôlés et nourris quotidiennement, ils reçoivent des récompenses pour être familiarisés à la présence humaine et aux manipulations (pesée, prise de température, palpation des toutes les parties du corps…). Toutes les interventions chirurgicales se feront sous anesthésie générale et analgésie, des points-limites ont été établis, en fin de TP chirurgie les animaux anesthésiés profondément ne sont pas réveillés, ils sont mis à mort par injection de barbituriques

Choix des espèces

Le choix de l’espèce porc répond à un besoin de formation spécifique émanant des personnels travaillant sur les grands animaux de laboratoire. L’adaptation des techniques et la réalisation d’interventions sur de grandes espèces (taille des instruments de chirurgie, matériel d’anesthésie…) nécessitent d’entrainer spécifiquement les manipulateurs. Les animaux utilisés en TP sont des porcs charcutiers de 3 à 5 mois, soit de 25 à 50 kg. Ils doivent être assez âgés pour supporter une anesthésie, de taille suffisante pour répondre aux objectifs pédagogiques et démontrer les gestes chirurgicaux dans de bonnes conditions.

1 310 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, pour l'entraînement de chirurgiens à la microchirurgie, une partie des procédures étant menée sous anesthésie sans réveil. Jusqu'à 60 rats servent à mettre au point un modèle d'anévrisme de l'aorte, les autres à des séances de formation, dix chirurgiens réalisant chacun vingt-cinq séances par an sur cinq ans. Les animaux sont euthanasiés par surdosage anesthésique intracardiaque, et le porteur déclare n'attendre "aucune nuisance". Il affirme que la pratique sur le vivant est "indispensable" et qu'un "organisme entier et vivant" est nécessaire, le calibre des vaisseaux du rat se rapprochant de celui des vaisseaux humains.

Objectifs

Le Diplôme d’Université (DU) de microchirurgie a pour objectif de former des chirurgiens et/ou internes voulant acquérir et maîtriser les techniques de microchirurgie nécessaires à certaines spécialités chirurgicales (en discipline humaine : chirurgie des lambeaux, chirurgie de la main, neurochirurgie, chirurgie de la face, chirurgie pédiatrique, notamment et aussi dans les disciplines vétérinaires). Dans le cadre de cette formation (DU de microchirurgie), nous souhaitons également mettre en place une procédure supplémentaire et nouvelle au DETERCA pour l’entrainement de nos apprenants : le modèle anévrisme. Il s’agit d’induire sur l’artère aorte du rat un anévrisme (malformation artérielle) dont les caractéristiques sont très proches de celui de l’anévrisme des artères cérébrales chez l’Homme. Ce modèle est connu, déjà utilisé dans d’autres centres. Il permet d’entrainer un apprenant à la prise en charge microchirurgicale d’un anévrisme.

Bénéfices attendus

En effet, afin reproduire les techniques chirurgicales en conditions réelles et pouvoir vérifier ces dernières, il est nécessaire d’avoir un organisme entier et vivant. Le choix du modèle rat est dû au fait que le calibre des vaisseaux du rat correspond au calibre des vaisseaux humains nécessitant des techniques de microchirurgie pour être appréhendés. Ainsi les chirurgiens peuvent s’entrainer sur les artères fémorales, l’aorte ou encore la carotide du rat. Pour cette formation, nous aurons deux types de procédures, une première afin de mettre au point le modèle anévrisme et une seconde pour le DU microchirurgie en général. Le modèle anévrisme est une nouveauté que nous souhaitons intégrer aux techniques déjà existantes du DU microchirurgie.

Procédures

Pour la mise au point du modèle anévrisme, les rats subiront une intervention chirurgicale afin de créer l'anévrisme. Le tout sous anesthésie et analgésie adaptée afin de réduire au maximum la souffrance de l'animal. Ceci concerne au maximum 60rats (procédure 1). La durée maximale de l'intervention est de 3h.

Impact sur les animaux

Aucune nuisances ou effets indésirables sont attendus sur les animaux pour ces procédures.

Devenir

A la finalité des deux procédures, les animaux seront euthanasié par surdosage anesthésique en intracardiaque.

Remplacement

Nous n'avons pas les moyens techniques, à ce jour, pour remplacer cette formation par des méthodes in vitro ou artificielles. La pratique sur le vivant est indispensable pour acquérir et maîtriser les techniques de microchirurgie, nécessaires dans de nombreuses spécialités chirurgicales pour pouvoir ensuite, une fois le diplôme obtenu, les appliquer sur l‘humain. L'anatomie vasculaire du rat est un critère important afin de rendre la procédure la plus réaliste possible. Ces animaux sont opérés sous anesthésie générale.

Réduction

: Pour la mise au point du modèle anévrisme, nous prévoyons un total de 60 rats sur 5 ans. Nous procéderons par série afin de mettre au point ce modèle en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, si un nombre de rats inférieur à ce qui est prévu nous permet d’obtenir ce modèle anévrisme, nous utiliserons les animaux restants pour la formation au DU microchirurgie. Le nombre total d’animaux prévu pour le Diplôme d’Université est calculé sur 5 ans avec au maximum de 10 chirurgiens inscrits par an. Cette formation est composée de 25 séances d’entrainement par chirurgien par an. Soit pour 5 ans : 10x25x5 = 1250 rats. Ainsi un nombre total de 1310 rats au maximum seront utilisé pour ces deux procédures. Ceci a été calculé de sorte à réduire au maximum l’effectif tout en ayant un nombre suffisant d’étudiants pour ouvrir cette formation. Ce nombre sera revu à la baisse et uniquement à la baisse en fonction du nombre de chirurgiens inscrits. De plus, n’ayant pas de critère génétique, d’espèce ou de sexe (l’anatomie reste la même), nous utilisons au maximum des animaux de réforme, ayant servis pour d’autres recherches. Toujours dans l’objectif de réduire le nombre d’animaux, les chirurgiens peuvent réaliser plusieurs techniques sur un même rat anesthésié.

Raffinement

Les rats utilisés pour cette formation proviennent d’un éleveur agrée et sont hébergés par groupe social de quatre. Chaque cage dispose à minima d'un tunnel comme enrichissement. Lors de la chirurgie, les rats sont sous couverture anesthésique et analgésique chimique adaptée. Ceci, dans le but de proscrire la souffrance et douleur de l’animal. En effet, du personnel qualifié suit la profondeur de l’anesthésie et la qualité de l’analgésie durant toute l’intervention. De plus, des tapis chauffants permettent de maintenir la température corporelle de l’animal lors des chirurgies et au réveil. Pour la procédure de création de l’anévrisme, l’animal est réveillé avec un suivi analgésique post-opératoire (analgésie, réhydratation…). A la fin du TP de microchirurgie l’animal n’est pas réveillé.

Choix des espèces

Le calibre des veines et des artères du rat est proche de celui des vaisseaux de petite taille chez l'homme. La carotide du rat est, par exemple, proche de l'artère digitale de l'homme, indispensable pour la chirurgie reconstructrice de la main (réimplantation de doigts). Dans l’idéal, nous utilisons des jeunes adultes de 300gr environ. Mais l’anatomie vasculaire étant presque similaire d’un jeune rat à un rat plus âgé, cela dépend plus principalement des rats de réforme qui nous sont proposés (nous avons déjà utilisé des rats plus mature pesant environ 700gr).