Procédures sévères

Détecter le potentiel nauséeux d'un candidat médicament avant son premier passage chez des volontaires humains : 1 500 rats vont être utilisés pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous seront tués à l'issue. Le comportement dit pica, la consommation d'une substance non nutritive, sert d'indicateur des nausées chez une espèce qui ne vomit pas. Chaque rat est hébergé seul sur grille, reçoit jusqu'à trois administrations par jour d'une substance émétisante ou du produit testé, jeûne jusqu'à seize heures en fin de procédure et peut subir jusqu'à douze prélèvements de sang. Le porteur justifie la mise à mort par la sévérité de la procédure et par le stress lié à l'hébergement, et conclut que les tests in vitro déjà réalisés ne reflètent pas la complexité du système digestif humain, ce qui rend selon lui les modèles animaux "indispensables".

Objectifs

Les nausées sont des sensations désagréables souvent accompagnées de vomissements (expulsion orale forcée du contenu du tractus gastro-intestinal supérieur), et sont couramment rencontrées dans la pratique clinique. Ces symptômes sont associés à diverses pathologies, notamment les troubles gastro-intestinaux, les infections virales ou bactériennes, les maladies métaboliques comme le diabète etc. D’autre part, les nausées sont l'un des effets secondaires les plus fréquemment signalés des médicaments prescrits et sont particulièrement redoutés des patients sous chimiothérapie. Ces symptômes sont également les plus rencontrés lorsqu’une nouvelle entité chimique est administrée pour la première fois à des volontaires sains. Une méthode de reconnaissance précoce des nausées et des vomissements est donc nécessaire avant qu'un nouveau médicament potentiel n'entre sur le marché et ne fasse l'objet d'essais chez l'homme. Enfin, l'identification des mécanismes et cibles impliqués nauséeux et émétique donneront également des indications importantes sur les nouvelles approches en matière de potentiel médicaments contre la nausée et les vomissements.

Bénéfices attendus

Ces études ont pour objectifs d’une part d’évaluer l’efficacité d’un traitement contre les nausées et les vomissements induit par une substance de référence ou d’autre part d’identifier les potentiels effets secondaires nauséeux causées par l’administration d’un candidat médicament.

Procédures

Les substances d'essais peuvent être administrées par bolus (durée de quelques secondes) ou par perfusion lente de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent, 1 administration par jour pendant la durée du test avec au maximum 3 adminsitration par jours), et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Les animaux sont acclimatés aux conditions d’hébergement du test pendant 3 jours. Le comportement PICA des animaux est évalué sur en mesurant la consommation individuelle d'une substance non nutritive sur une période de 4 jours au maximum (soit uen durée maximale du test de 7 jours incluant la periode d'habituation). Par ailleurs, les animaux peuvent recevoir au préalable du test une substance réactive (administration unique ou répétée , 2 fois par jours maximum) pour évaluer l’effet l’efficacité anti-émétique des candidats médicament. Enfin, si nécessaire et selon l’objectif de l’étude des prélèvements sanguins (durée de quelques secondes, 6 maximum par jours avec un maxium de 12 prélévements au total) pourront être réalisés.

Impact sur les animaux

Un stress lié à l'hébergement individuel sur grille et à la répétition de cet hébergement tout au long de la procedure ( i.e. acclimatation et sessions test) ainsi qu'a une mise à jeun (n’excédant pas 16 h) en fin de procedure peut être ressenti. Par ailleurs, certaines substances testées peuvent provoquer une gêne ou un inconfort liés à la sensation de nausée.

Devenir

La procédure est sévere, de plus les animaux sont soumis à un stress lié à la modification des condition d'hebergement durant la procédure ils seront donc euthanasiés à l'issue de la procédure.

Remplacement

Dans le cadre du développement des médicaments testés des tests in vitro ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité du système gastro-intestinal humain qui est en constante interaction avec le système nerveux central chez l’Homme. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Nos données historiques indiquent qu’un effectif de 8-10 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.

Choix des espèces

Le comportement pica chez le rat est médié par les même mécanismes de vomissement chez l’Homme. Par ailleurs, le comportement pica est assimilable aux vomissements observables chez d’autres espèces. Tous les animaux seront utilisés après 4 semaines de développement (après sevrage) et jusqu'a 5 mois. En effet, les données de la littérature montrent qu'à partir de 5 mois d'age les animaux deviennent plus anxieux, ce qui peut interférer avce le test.

Chirurgie du cerveau sous anesthésie générale jusqu'à deux heures, deux interventions possibles par animal, implants portés jusqu'à deux mois, dix tests comportementaux à raison d'un par jour : 3 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur induit chez elles un phénotype qu'il qualifie de dit-dépressif et annonce une détresse "induite et attendue", tout en écrivant que les procédures du projet sont "relativement bien tolérées par les animaux". Les dix tests comportementaux ne sont pas nommés, alors qu'ils servent à mesurer l'approche et l'évitement de stimuli plaisants ou déplaisants. Toutes seront tuées, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées parce que des études histologiques sur leurs tissus sont prévues.

Objectifs

La dépression représente une cause majeure d’incapacité à l’échelle mondiale, affectant environ 300 millions de personnes dont 50% davantage de femmes. Or, la physiopathologie des troubles dépressifs est encore assez méconnue, tout comme les mécanismes par lesquels agissent les traitements antidépresseurs existants, dont l’efficacité est d’ailleurs limitée puisqu’environ un tiers des patients ne répondent pas aux thérapies classiques et plusieurs semaines sont nécessaires pour pouvoir observer ces effets. En outre, la dépression est accompagnée d’altérations sensorielles : les patients dépressifs percevraient les stimuli sensoriels comme étant moins plaisants, ou davantage déplaisants que des sujets sains. On parle ainsi d’un biais de valence négatif, qui est cependant peu considéré dans les critères diagnostiques. Or, ces biais émotionnels sont particulièrement intéressants à étudier d’un point de vue translationnel. D’une part, la réponse émotionnelle est assez facilement mesurable chez la souris, notamment à travers le comportement d’approche (stimuli plaisants) ou d’évitement (stimuli déplaisants), contrairement à d’autres symptômes plus classiques de la dépression comme l’humeur dépressive ou les idées suicidaires qui sont difficilement évaluables chez l’animal. D’autre part, ces biais perceptifs seraient rapidement restaurés après l’administration d’un traitement antidépresseur, c’est pourquoi la prise en compte de la réponse émotionnelle en clinique pourrait permettre de déterminer beaucoup plus rapidement si un patient répond efficacement ou non à la thérapie proposée et donc améliorer la prise en charge thérapeutique. Puisque l’amygdale basolatérale est une région du cerveau jouant un rôle majeur dans la régulation émotionnelle et l’attribution de la valence, et que l’activité de certaines voies neuronales de l’amygdale basolatérale serait modifiée dans des modèles de dépression, l’objectif de ce projet est ainsi (1) d’étudier la réponse émotionnelle dans des modèles de dépression de souris mâles et femelles en nous concentrant sur des stimuli olfactifs, (2) de comprendre quels circuits neuronaux sont impliqués dans ces biais émotionnels, et enfin (3) de chercher comment des traitements antidépresseurs à la fois classiques et innovants modulent l’état émotionnel ainsi que la réponse neuronale associée dans notre modèle murin de dépression.

Bénéfices attendus

En cherchant à comprendre quels sont les mécanismes sous-jacents au biais émotionnel négatif associé à un état dit-dépressif à l’échelle des circuits neuronaux, cette étude permettra d’améliorer notre connaissance et notre compréhension de la physiopathologie de la dépression. De plus, les diagnostics en psychiatrie reposent actuellement sur une approche catégorielle qui consiste à classer les patients selon la présence ou l’absence d’un certain nombre de symptômes discrets. Cependant, cette approche fait face à un nombre grandissant de limitations. En réponse à ces critiques, l’approche RDoC (Research Domain Criteria) propose de changer de paradigme diagnostique pour se fonder sur un continuum de symptômes et de biomarqueurs. De façon notable, les systèmes de valence positive et négative constituent deux des six domaines fonctionnels majeurs d’intérêt relevés par cette approche. Ainsi, en s’inscrivant dans cette approche alternative, notre étude des biais émotionnels négatifs dans une perspective translationnelle chez la souris pourrait non seulement permettre d’élucider de façon fondamentale certains mécanismes physiopathologiques de la maladie (bénéfices à court terme du projet), mais également d’ouvrir la voie au développement de nouveaux outils diagnostiques et de détection de réponse aux traitements antidépresseurs (bénéfices à long terme du projet). En particulier, la restauration de la réponse émotionnelle par un antidépresseur serait obtenue de façon très précoce après administration du traitement, bien avant des effets sur l’amélioration de l’humeur, c’est pourquoi ces biais sont particulièrement intéressants à étudier et pourquoi une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux sous-jacents serait cruciale d’un point de vue thérapeutique. Enfin, la dépression est une maladie qui touche 50% davantage de femmes que d’hommes. Toutefois, les mécanismes neuronaux à l’origine de cette différence sont encore largement méconnus. Ainsi, en comparant systématiquement des souris mâles et femelles tout au long de notre étude, nous pourrons également mettre en lumière l’existence ou non de mécanismes spécifiques au sexe à la fois dans l’installation du phénotype dit-dépressif et du biais de valence négatif, mais aussi dans l’efficacité de la réponse à un traitement antidépresseur.

Procédures

Dans ce projet, les souris pourront être soumises à différents types d’interventions : - Induction d’un phénotype dit-dépressif. Chaque souris ne pourra subir qu’une seule fois un des modèles de dépression. - Tests de comportement non-invasifs pour tester le phénotype dit-dépressif. Les souris devront réaliser au maximum 10 tests comportementaux différents (1 test/jour). - Administration chronique d’un antidépresseur (3 semaines), par voie orale ou par injection intrapéritonéale (1 injection tous les 3 jours) - Procédures chirurgicales sur le cerveau sous anesthésie générale. Ces interventions ne durent pas plus de deux heures par souris et chaque souris sera soumise à un maximum de deux interventions séparées par un minimum de 30 jours. - Ponction sanguine (environ 1 min par souris). Chaque animal subira un maximum de deux prélèvements sanguins, séparés au minimum de quatre semaines.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés aux procédures : 1) détresse induit et attendu pour les modèles de dépression. Cependant, notre stratégie expérimentale par rapport a des travaux précédents (durée réduite à 4 semaines de traitement, hébergement groupé) est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux et en réduisant la détresse et l’inconfort de l’animal. 2) les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort de courte durée (2-3 jours) liés à la chirurgie. Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies. Des implants seront introduits par chirurgie sous anesthésie générale chez les souris. 3) La présence de ces implants pourrait générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort (durée maximale de l’expérience : deux mois). Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo pour étudier les circuits neuronaux impliqués dans le phénotype dit-dépressif et les biais émotionnels. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal non-nécessaire à l’induction du modèle expérimental de dépression.

Réduction

L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Le nombre de souris minimum par groupe a été calculé pour pouvoir utiliser des tests paramétriques, plus puissants que les tests non paramétriques grâce à des expériences similaires déjà réalisées dans notre laboratoire. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour comparer les groupes. De plus, nous nous attacherons à décrire au mieux le phénotype des animaux utilisés à l’aide d’une grande batterie de mesures comportementales et physiologiques. Cela nous permettra de réduire la variabilité intra-individuelle de chacun des tests, et ainsi de nécessiter d’un moins grand nombre d’individus pour évaluer l’effet de nos modèles et des traitements. Enfin, lorsque cela s’y prête, nous aurons recours à une étude longitudinale de l’état phénotypique et de la réponse neuronale des individus, ce qui nous permettra également d’augmenter notre puissance statistique et d’avoir besoin de moins d’animaux par groupe.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, des points limites précoces et spécifiques seront bien définis et mis en place. Selon les signes cliniques présentés par les animaux, nous pourrons notamment avec recours à : - un complément alimentaire hautement calorique (gel hydrique) - chauffage des cages - réhydratation sous cutanée - renforcement d’enrichissement des cages De plus, la durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’une semaine minimum. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Tout ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour la validité des résultats des tests comportementaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle animal est justifié par le fait que les circuits impliqués dans l’attribution de valence aux stimuli sensoriels sont très bien conservés entre l’homme et les rongeurs. Par conséquent notre travail permet de délimiter de nouvelles approches pour le diagnostic et les thérapeutiques des troubles de l’humeur chez l’homme tout en travaillant sur une espèce mammifère mais phylogénétiquement éloignée de l’homme. De plus, en dehors de l’induction du phénotype dit-dépressif souhaité pour l’étude, le type de procédures effectuées dans ce projet sont relativement bien tolérées par les animaux et des traitements anesthésiques et antidouleurs très efficaces existent pour cette espèce et seront appliqués pour ce projet. Nous utiliserons tout au long du projet des jeunes souris adultes, âgées de 8 semaines, car nous étudions des modèles de dépression chez le sujet adulte.

152 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 104 d'entre elles passant sur la table d'opération pour qu'on leur implante des cellules cancéreuses, puis sous anesthésie deux fois par semaine pendant trois semaines pour mesurer la bioluminescence de leurs tumeurs. Une neuropathie douloureuse leur est provoquée par injection d'un anticancéreux, puis évaluée en appliquant des filaments sur la patte de l'animal vigile. Le porteur écrit que la neuropathie et les métastases osseuses constituent des atteintes irréversibles, mais "indispensable" à la conduite de l'étude, et toutes les souris sont mises à mort pour cette raison. Il annonce un antalgique et antitumoral à breveter, sur un marché qu'il désigne comme principalement celui des cancers du sein triple négatif.

Objectifs

Le cancer du sein triple négatif présente un taux de survie à 5 ans de 77% qui chute à 11% si métastases. Les douleurs associées à ce type de cancer sont de deux types : les douleurs neuropathiques périphériques induites par la chimiothérapie et les douleurs métastatiques. Nous avons montré que le récepteur GPER (pour G protein-coupled estrogen receptor), était impliqué dans le cancer et la douleur. Sur la base de ces résultats, nous émettons l’hypothèse que des molécules modulant le récepteur GPER pourraient améliorer le cancer triple négatif et les douleurs associées. Pour ceci, de telles molécules seront synthétisées. Après plusieurs étapes de screening in vitro, les meilleurs ligands (10 molécules maximum) seront alors évalués par nos soins (objet de cette procédure APAFIS) sur la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies grâce à l’utilisation d’un modèle murin. Le ligand présentant la meilleure efficacité sera alors évalué sur : (1) le développement de la tumeur, (2) la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies et (3) la douleur métastasique grâce à l’utilisation de modèles murins. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le produit attendu est un nouvel antalgique et antitumoral permettant de lutter contre la progression tumorale ainsi que les symptômes neuropathiques, tels que les douleurs induites par certaines chimiothérapies, mais aussi prévenant (lorsqu’il sera co-administré avec les chimiothérapies) l’apparition de neuropathies pour lesquelles il n’existe aucun traitement efficace. L’utilisation d’animaux est indispensable dans ce contexte d’interaction entre système nerveux, tumeur, dissémination sanguine et système immunitaire. Ces travaux compileront les bases nécessaires au dépôt de brevet de molécule dans le but de passer ensuite à des études chez l’Homme. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein triple négatif, permettant d’améliorer non seulement le pronostic vital de nombreuses patientes, mais aussi leur qualité de vie.

Procédures

*L’ensemble des animaux subiront des injections pour administrer l’anticancéreux responsable de la mise en place du modèle et des composés à tester. La piqure d'aiguille pour l’injection est réalisée en quelque secondes sur animal vigil. *L’application de filaments au niveau de la patte de l’animal vigile pendant quelques secondes sera réalisée afin d’évaluer la douleur. *104 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale pour l'implantation des cellules cancéreuses qui durera environ 5 minutes par animal. *La mesure de la bioluminescence (durée : 5 min par animal) sera réalisée 2 fois par semaines pendant 3 semaines sous anesthésie générale. *Toutes les interventions sont réalisées à l’établissement utilisateur EU1 à l’exception de la mesure de la bioluminescence qui sera effectuée à l’EU2.

Impact sur les animaux

L’induction de la neuropathie chimio-induite (CIPN) ainsi que de tumeur chez l’animal seront des nuisances à part entière et irréversibles, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN ainsi que les métastases osseuses seront associées à des désordres douloureux qui seront évalués dans le cadre du projet. Elle sera aussi responsable d’une diminution du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement. Une application de quelques secondes de filament au cours du test de von Frey est susceptible d’induire chez l’animal une douleur légère.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal est irréversible.

Remplacement

Plusieurs étapes de screening réalisées en amont des expériences demandés dans cette procédure seront effectués afin de réduire le nombre de molécules à évaluer et donc le nombre d’animaux. En effet, l’ensemble des molécules designées ou synthétisées subiront : - un screening in silico des dérivés (seules les molécules se fixant sur le GPER seront retenues) - un screening in vitro des dérivés (seules les molécules présentant une action agoniste inverse sur le GPER et une action antiproliférative sur cellules TNBC seront retenues). S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN et de métastases osseuses n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. S'agissant d'étude sur la croissance tumorale, un screening des composés et une étude de l’interaction de ces composés avec le paclitaxel in vitro sera réalisé préalablement au passage chez l’animal. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. En effet, les modèles animaux vivant sont, dans les derniers stades d’études, nécessaire pour explorer et évaluer l’effet antitumoral, que ce soit la dissémination de métastases dans la circulation sanguine, mais aussi l’impact du système immunitaire, par le biais d’imagerie. Ce type d'étude sur modèle animal de métastases osseuses est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.

Réduction

*Ces travaux seront précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. *Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. *De plus le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. *La PROCEDURE 1 est une étape de GoNoGo, c’est-à-dire que si les résultats de celle-ci sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées. *Toutes les procédures seront réalisées sur des groupes randomisés avec un groupe témoins négatif (recevant du véhicule ou une chirurgie factice), et menées en aveugle. *L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expérience.

Raffinement

Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation . De plus, le milieu est enrichi par du matériel de nidification (coton), un abri (dôme carton) et des matériaux à ronger (bois tendre). L’hébergement en groupe est maintenu pour le bien-être animal. Une surveillance des conflits sera réalisée. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Les expérimentateurs sont tous titulaires du niveau « concepteur et réalisateur de projet » ainsi que de la formation de chirurgie sur rongeurs. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. De plus, le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs utilisent dès que possible la technique du cupping pour limiter l’anxiété des souris lors du transfert des animaux. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum. Le transport des animaux entre l’animalerie (EU1) et le centre d’imagerie (EU2), s’effectuera en voiture. Les animaux seront hébergés dans des boites opaques avec couvercle filtrant. Un document de transport (avis/accord du vétérinaire) accompagnera les animaux. Le transport sera conditionné à l’état des animaux et les conditions climatiques.

Choix des espèces

La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les CIPN et la croissance tumorale. D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie et le développement tumoral. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.

Cinq échocardiographies de trente minutes sous anesthésie générale, des injections rétro-orbitaires et deux prélèvements sanguins sont pratiqués sur des souris chez qui l'invalidation d'un gène provoque une insuffisance cardiaque. 1 800 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour collecter leurs organes. Le porteur décrit des œdèmes pulmonaires, des difficultés respiratoires, une fatigabilité, des troubles du rythme et des morts subites possibles, l'objectif étant d'évaluer des cibles thérapeutiques pour la régénération cardiaque. Il présente l'anesthésie des échographies comme un moyen de limiter le stress des souris, tout en reconnaissant que le risque de mort qu'elle comporte augmente chez des animaux dont la fonction cardiaque est dégradée.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires constituent la première cause de mortalité dans les pays industrialisés. Les cardiomyopathies dilatées (CMD) sont la forme la plus courante de cardiomyopathies. Les CMD sont principalement d’origine génétique. Le gène LMNA est le deuxième gène le plus fréquemment muté chez l’Homme, représentant 10% des cas de CMD. Les mutations du gène LMNA sont à l’origine de CMD à progression rapide avec des défauts cardiaques sévères. Ainsi, notre projet a pour objectif d’évaluer la pertinence de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles sur la progression de la pathologie cardiaque liée à l’invalidation du gène Lmna.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait d’identifier et de valider des cibles thérapeutiques cliniques pertinentes pour induire la régénération et réparation cardiaque chez l’Homme dans le contexte de cardiomyopathies dilatées (CMD) d’origine génétique. Le gène LMNA est le deuxième gène le plus fréquemment muté dans les CMD d’origine génétique, représentant 10% des cas de CMD et démontrant ainsi le fort impact thérapeutique de ce projet. Ainsi, notre projet permettrait également d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les autres types de CMD augmentant ainsi le potentiel thérapeutique du projet. Ce projet s’inscrit dans un contexte translationnel vers le développement d’un traitement clinique grâce à l’étroite collaboration avec les cliniciens. Ce projet va permettre d’augmenter nos connaissances sur la régulation de la prolifération des cardiomyocytes et la régénération cardiaque afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour combattre les pathologies cardiovasculaires telles que les CMD qui constituent un problème majeur en santé publique.

Procédures

Les animaux seront soumis à: - une biopsie à l'oreille permettant d'identifier les animaux et de les génotyper - une injection intrapéritonéale (30s à 1 minute) - une injection intraveineuse ou une injection rétro orbitaire sous anesthésie (30s à 1 minute) - 5 échocardiographies sous anesthésie générale gazeuse (30 minutes) - 2 prélèvements sanguins

Impact sur les animaux

Les animaux non traités sont susceptibles de développer une insuffisance cardiaque. . Si les souris développent des symptômes proches de ceux identifiés chez l’homme, elles pourraient développer une insuffisance cardiaque (avec des oedèmes dont des oedèmes pulmonaires associés à des difficultés respiratoires, une fatigabilité et des difficultés à se déplacer) , des troubles du rythme et des morts subites. Au cours du projet, certains animaux recevront une injection unique de tamoxifène par voie intra péritonéale. La principale nuisance attendue est le stress de l'animal lié à la contention. Des injections intraveineuse ou rétro orbitaires seront également réalisées sous anesthésie générale gazeuse. Les échographies réalisées pour le suivi de la fonction cardiaque seront réalisées sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Cependant, les anesthésies pourront être réalisées sur des animaux dont la fonction cardiaque n'est pas optimale. Le risque de mort inhérent à toute anesthésie pourrait être augmenté chez ces animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure afin de collecter les organes et faire des analyses histologies et de biologie moléculaire

Remplacement

Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux. Malgré les stratégies de remplacement développées, ces dernières ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique. Ainsi, l’expérimentation animale utilisant des souris contrôles et génétiquement modifiées est indispensable à l’étude intégrée des phénomènes physio-pathologiques et à la réalisation de notre projet.

Réduction

Afin de limiter ou d’éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal, tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions reliées à l'étude, des stratégies ont été mises en place. L’élaboration précise des protocoles et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques couplée à notre expérience permettent d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Ainsi, le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence des anomalies de la fonction cardiaque. De plus, cette étude de type longitudinale permet de suivre les animaux au cours du temps ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des stratégies d’optimisation sont mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse chez l’animal : - Modifications apportées à l'élevage afin d'améliorer le bien-être des animaux : enrichissement des cages. - La planification des procédures expérimentales (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) diminue le stress des animaux et favorise la validité de l'expérience. - Établir des points limites les plus précoces possibles en fonction de l'objectif de l'expérimentation. - L’ensemble des actes nécessitant une contention seront réalisé par des expérimentateurs aguerris avec plusieurs années de pratique pour ces gestes, limitant ainsi le stress ressenti par les souris. - Les injections intraveineuses seront réalisées sous anesthésie afin de limiter le stress de l’animal. - Afin de prévenir toute souffrance, les animaux seront examinés quotidiennement. Une grille d'évaluation des scores sera mise en place (Annexe 2) et permettra selon des critères précis, le déploiement d’actions spécifiques permettant de soulager la souffrance..

Choix des espèces

Chez la souris, le développement et le fonctionnement physiologique du cœur sont similaires à ceux décrits chez l’Homme. Par ailleurs, l’utilisation de souris génétiquement modifiées représente le modèle le plus pertinent en ce qui concerne la compréhension des maladies humaines. Pour cette étude les animaux adultes âgés de plus de 8 semaines seront utilisés. Cet âge permettra d'étudier les cibles thérapeutiques potentielles identifiées pour la régénération cardiaque dans les cardiomyopathies dilatées d’origine génétique.

Sévèrement immunodéprimées pour accepter des cellules tumorales humaines, 40 souris reçoivent une injection de cellules de cancer de l'ovaire dans l'abdomen. Les procédures impliquent un niveau de souffrance sévère et aucune souris ne survit au projet. Chacune est rasée sous anesthésie, passe deux séances d'imagerie par semaine, reçoit jusqu'à treize injections de réactif révélateur et dix-neuf injections sous-cutanées, avec un risque de métastases pulmonaires, de gêne respiratoire et d'accumulation de liquide dans le ventre. Trois souris sont tuées chaque semaine pour ouvrir leur abdomen et comparer la taille réelle des tumeurs à celle mesurée par imagerie, l'objectif étant de se passer ensuite de cette vérification.

Objectifs

L’immunothérapie dans le domaine du cancer est une approche thérapeutique qui vise à stimuler le système immunitaire du patient pour qu’il puisse éliminer les cellules cancéreuses. Parmi les approches disponibles, il est possible de récupérer certaines cellules immunitaires du patient, de les modifier afin qu’elles reconnaissent spécifiquement les cellules cancéreuses avant de les réinjecter au patient. Cette approche, appelée thérapie cellulaire, a démontré son efficacité dans de nombreux essais cliniques pour le traitement de différents cancers. Nous avons réussi à générer des cellules immunitaires modifiées capables de reconnaître différents types de cancers, tels que le cancer de l’ovaire et un sous-type de cancer du sein très agressif. De plus, nous avons démontré que ces cellules immunitaires modifiées sont capables d’éliminer des cellules cancéreuses in vitro. Cependant, il est nécessaire de vérifier leur potentiel thérapeutique in vivo. Dans ce projet, l’objectif est de mettre en place un modèle de souris immunodéprimées développant une tumeur d’ovaire dans l’abdomen. Ce modèle permettra dans un second temps d’évaluer la capacité de cellules immunitaires modifiées reconnaissant notre cible à éliminer les cellules cancéreuses dans ce modèle de souris.

Bénéfices attendus

Si la mise au point du modèle est validée, cette étude permettra d’évaluer une approche thérapeutique innovante pour les patients atteints de cancers, notamment de cancers de l’ovaire qui ne répondent pas aux traitements standards. Ceci accélèrera la validation préclinique de cet outil thérapeutique afin d’entamer le transfert vers la clinique. Cette évaluation fera l’objet d’une nouvelle demande.

Procédures

Pour réaliser l'injection dans l’abdomen de cellules cancéreuses humaines, la souris est maintenue 15 secondes. Une seule injection est effectuée par animal. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur dans l'abdomen. La croissance de la tumeur est suivie par imagerie 2 fois par semaine durant toute la procédure. Pour cela, les animaux doivent la veille de la mesure être rasés et dépilés. Cet acte se fait sous anesthésie générale et dure 5 min. Le jour de la mesure, les animaux seront maintenus 15 secondes pour recevoir un réactif permettant de révéler la tumeur dans l'abdomen, puis les souris sont anesthésiées durant toute l’imagerie (entre 6 à 8 min). Au maximum, chaque souris recevra 13 injections de réactif. Les injections sous-cutanées de molécules de soutien aux cellules lymphocytaires dans le but d’anticiper les conditions d’une future expérience, seront réalisées 3 fois par semaine durant toute la procédure, soit 19 injections sous cutanée au total. La souris est maintenue 15 secondes pour ce geste. Les souris seront également pesées et le diamètre du ventre sera mesuré deux fois par semaine durant toute la procédure. Pour cela, la souris est maintenue 15 secondes.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales dans l’abdomen de la souris devrait entrainer une douleur temporaire et modérée. A la suite de cette injection les animaux développeront des tumeurs qui devraient être localisées dans la cavité péritonéale. Cependant, on ne peut pas exclure une dissémination des cellules (métastases) dans l’organisme, notamment au niveau des poumons qui pourraient engendrer une gêne respiratoire. De plus ce développement tumoral pourrait s’accompagner d’une production eau dans le ventre qui pourrait engendrer des douleurs abdominales. L’injection sous-cutanée de protéines solubles pourrait entrainer un désagrément voire une douleur temporaire légère. Les multiples injections dans l’abdomen de la souris qui sont réalisées pour le suivi de la croissance tumorale pourraient entrainer une inflammation au niveau des sites d’injections. Les injections dans l’abdomen de la souris qui sont réalisées pour le suivi de la croissance tumorale pourraient néanmoins entrainer une gêne modérée et temporaire.

Devenir

Chaque semaine, 3 animaux seront mis à mort afin d’évaluer la répartition et la taille des tumeurs dans l’abdomen des animaux. Cette taille sera corrélée à une mesure par imagerie des tumeurs sur les animaux vivants. L’objectif est d’utiliser pour les prochaines expériences une mesure exclusive de la taille des tumeurs par imagerie sur animaux vivants.

Remplacement

Ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité d’une thérapie utilisant des cellules immunitaires modifiées dans un second projet. Les animaux sévèrement immunodéprimés correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité de ce type de traitement, puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires murines. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible.

Réduction

Dans ce projet, nous voulons mettre en place un modèle de souris développant une tumeur d’ovaire dans l’abdomen. Dans la littérature scientifique, 3 concentrations de cellules cancéreuses utilisées sont majoritairement décrites. Dans un objectif de réduire le nombre de souris utilisé, nous allons évaluer dans un premier temps une première concentration de cellules cancéreuses (concentration médiane). Si les résultats nous permettent d’avoir un modèle satisfaisant, nous nous arrêterons à cette étape. Si la croissance des tumeurs est trop rapide ou trop lente, nous évaluerons une seconde concentration de cellules cancéreuses, inférieure ou supérieure respectivement.

Raffinement

L’effet des composés (cellules cancéreuses et réactifs injectés) sur l’état physiologique des souris est suivi par pesée des animaux, mesure du diamètre du ventre des animaux et mesure des tumeurs par imagerie. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour le projet, incluant des critères d’arrêt de l’expérience en cas de souffrance des animaux. Aucun effet indésirable lié à des molécules de soutien dans le modèle de souris utilisé n’est attendu. Les souris seront anesthésiées pour le suivi longitudinal réalisé par imagerie. Leur réveil est facilité en plaçant la cage sur un tapis chauffant.

Choix des espèces

Ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité d’une thérapie utilisant des cellules immunitaires modifiées dans un second projet. Les animaux sévèrement immunodéprimés correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité de ce type de traitement, puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires murines. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible. Les animaux utilisés seront à l’âge de 6-8 semaines afin de pouvoir réaliser les greffes dans l’abdomen. A ce stade de développement, les souris ont atteint une maturité permettant de représenter l'âge d’un jeune adulte chez l’homme.