Procédures sévères
Rôles de protéines associées à la neuroinflammation dans les traumatismes de la moelle épinière [EU 2/2]
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux souches de souris génétiquement modifiées pour ne pas exprimer une protéine du système nerveux central fournissent les 192 animaux de ce projet, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. La moitié subit une hémisection de la moelle épinière sous anesthésie, opération de trente minutes qui paralyse une patte arrière, altère le contrôle du sphincter urinaire et peut provoquer des escarres. Les tests sont détaillés : activité motrice spontanée pendant huit minutes, marche et coordination pendant dix minutes, force d'agrippement, qualité du nid sur vingt-quatre heures, temps de toilettage et latence à rejoindre la nourriture, répétés jusqu'à six semaines après la lésion. Toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus destinés aux analyses histologiques, les animaux utilisés étant les surnuméraires issus des croisements menés pour un autre projet.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière touchent 2.5 millions de patients dans le monde (dont 40 000 en France) et induisent des symptômes allant de troubles neurologiques minimes à la tétraplégie complète souvent associés à des douleurs chroniques. Bien que les lésions de la moelle épinière touchent des personnes relativement jeunes (moyenne d’âge à 40 ans), le nombre de patients plus âgés est en nette croissance dans les pays industrialisés. L’étude de cette pathologie représente un enjeu majeur. Il n'existe aucun traitement curatif efficace pour aucun des symptômes induits par une lésion de la moelle épinière. Il est donc de grand intérêt de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à augmenter la récupération motrice et sensitive suivant une lésion de la moelle épinière. Après une lésion de la moelle épinière une cicatrice se forme et constitue un obstacle à la transmission des informations depuis le cerveau au reste du corps ainsi que du corps vers le cerveau. Les cellules immunitaires du système nerveux central jouent un rôle prépondérant dans les réponses neuroinflammatoires suite à une lésion de la moelle épinière. Nous voulons étudier si l’absence d’expression de protéines spécifiques qui sont modulées après lésion de la moelle épinière et associées à la neuroinflammation favorise une meilleure récupération. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière induisent des symptômes allant de la paraplégie partielle à la tétraplégie complète. Il n’y aucun traitement permettant de soigner les patients. Développer des travaux visant à favoriser la récupération après lésion de la moelle épinière représente donc un enjeu majeur tant sur le plan de la santé individuelle que sur le plan économique et social. Nous cherchons à caractériser les conséquences de l’absence d’expression de deux protéines spécifiquement dans un type de cellule du système nerveux au niveau de la moelle épinière dans un contexte pathologique tant sur le plan cellulaire et tissulaire que comportemental. Nous obtiendrons des informations importantes sur le rôle de ces protéines qui restent méconnues à ce jour dans les lésions de la moelle épinière lors de la mise en place et le maintien de l’inflammation. Cette étude permettra de déterminer précisément leur importance après lésion moelle épinière chez les deux sexes et d’envisager des stratégies appropriés pour une approche visant à développer des thérapies adaptées.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux recevront des injections quotidiennes (moins d’1 minute) en intra-péritonéal durant 5 jours à l’âge de 5-8 semaines sur le site 1 . Les animaux seront transférés du site 1 vers le site 2 selon la réglementation et avis du vétérinaire. Sur le site 2, les animaux subiront des lésions de la moelle épinière sous anesthésie générale et analgésie (30 min ; n=96). Les animaux seront évalués au niveau comportemental pour déterminer les fonctions motrices et évaluer l’anxiété avant et après lésion de la moelle épinière. L’évaluation comportementale analysera l’activité motrice spontanée durant 8 minutes, la marche et la coordination des animaux durant 10 minutes et la force d’agrippement des animaux (2 minutes par animal par session). Les manipulations peuvent engendrer un stress léger. Les tests seront faits 7 jours et 24 heures avant la lésion, puis à J3, J5, J7, J10 et J14 postopératoire puis 1 fois par semaine jusque 6 semaines post-opératoires. Les comportements de type anxieux seront évalués par des tests qui évaluent la qualité du nid fait par un animal durant 24 heures, le temps de toilettage durant 5 minutes, et le temps que met l’animal à aller au contact de la nourriture durant 5 minutes. Ces tests seront effectués deux fois, au début et à la fin de la procédure. Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d’organes post-mortem.
Impact sur les animaux
Une anesthésie peut induire une hypothermie transitoire et un dessèchement de la cornée. Les injections quotidiennes en intra-péritonéal peuvent induire un stress pour l’animal. Le transport et le changement de site peut induire un stress pour l’animal. Nuisances motrices : paralysie de la patte arrière du côté de la lésion de la moelle épinière (hémisection). Une récupération spontanée du support de poids est observée dès le 5ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Nuisance urinaire : le contrôle du sphincter urinaire est altéré après une hémisection, une récupération spontanée est observée dès le 7ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Suite à la chirurgie les animaux sont observés quant au développement de signes légers relatifs à la détérioration de l’état de santé de l’animal. 24-48hrs suivant la lésion, les animaux peuvent présenter des signes de douleurs. Suite à la chirurgie, une perte de poids est observée pendant 1 à 2 jours après la lésion. A cause de la paralysie des escarres peuvent se former. Suite à la lésion, des comportements de dominance peuvent être observés. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Devenir
A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés afin collecter les tissus d’intérêt pour faire des analyses post mortem histologiques et cellulaires.
Remplacement
Pour éviter l'expérimentation animale, on encourage l'utilisation de cultures de cellules nerveuses. Cependant, ces cultures ne peuvent pas reproduire entièrement la complexité des organismes vivants. Les modèles animaux de traumatisme de la moelle épinière sont actuellement considérés comme la méthode la plus adaptée pour étudier cette pathologie, car ils reproduisent de manière fidèle les différents aspects pertinents chez l'humain. Ces modèles permettront d'explorer les changements provoqués par l'absence d’expression de 2 protéines du système nerveux de manière spécifique dans un type de cellule et faciliteront l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. L'utilisation d'animaux est nécessaire à cette étape préclinique et demeure cruciale pour envisager des applications cliniques.
Réduction
Les animaux sont utilisés pour plusieurs analyses, les deux sexes sont utilisés. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire. Nous avons également calculé le nombre d'animaux avec un logiciel de biostatistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant des effectifs pertinents pour répondre à notre hypothèse biologique. Ces animaux sont générés et aussi utilisés dans le cadre d’une autre demande de projet et nous utiliserons les animaux surnuméraires issus des croisements effectués sur le site 1. De plus, cela évitera de développer cette lignée en doublon dans l'animalerie du site 2.
Raffinement
Les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 2,7km). Puis période d’acclimatation pour les animaux d’une période de 7 jours sur le site d’accueil. Afin de réduire le stress, les expérimentateurs seront toujours les mêmes au cours de l’étude et les animaux seront habitués aux tests. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement de l’environnement (hutte, coton). Pour la gestion de la douleur, utilisation d’anesthésiants et d'analgésiques adaptés mais compatible avec les lésions de la moelle épinière et le type de données analysées. Afin de réduire la souffrance : soins quotidiens spécifiques. L'absence de signes anormaux sera vérifié 2 fois par jour après la lésion. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux le plus utilisées dans le cadre de la recherche sur les lésions de la moelle épinière, en particulier avec le développement de plusieurs modèles chirurgicaux différents (section, compression, contusion). Ces 2 souches de souris génétiquement modifiées n’expriment pas une protéine du système nerveux central dans un type de cellules associé à la neuroinflammation. Cela en fait donc des modèles de choix pour déterminer les conséquences de l’absence de ces protéine après une lésion médullaire sur l’inflammation. Les animaux sont opérés à 3 mois et observés pendant 6 semaines. Nous utilisons des animaux adultes car les souris plus jeunes présentent des phénomènes de récupération spontanée non seulement plus importants mais surtout non homogènes. Ceci n’est ni compatible avec des analyses statistiques fiables ni avec notre optique de transposition à la clinique.
Mise en place d’une décompensation spontanée de la cirrhose et d’un modèle d’ACLF suite à une induction de la cirrhose par un agent hépatotoxique et d’un désordre métabolique.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Jusqu'à 44 administrations d'un produit toxique pour le foie, deux fois par semaine pendant 22 semaines, par gavage ou par injection dans l'abdomen : c'est ce que subissent des rats arrivés au laboratoire à quatre semaines, pour reproduire une cirrhose puis sa décompensation aiguë. 8 140 rats sont concernés, dont 4 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous sont tués à l'issue. Le porteur annonce des animaux en état de choc et en détresse cardio-respiratoire dans les heures qui suivent l'induction, écarte l'analgésie au motif qu'elle introduirait un biais, et écrit viser une gravité "jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique". Dans les études de survie, le délai jusqu'à la mort compte comme donnée, et c'est l'atteinte du point d'arrêt anticipé qui vaut déclaration de la mort de l'animal.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche destiné à identifier de nouvelles molécules permettant de traiter la cirrhose à stade très avancé ou une ACLF (acronyme d’Acute on Chronique liver Failure ou décompensation aiguë de la cirrhose) La cirrhose se définit par l'accumulation excessive de fibrose conduisant à la dégénérescence du foie.
Bénéfices attendus
Le pronostic des patients cirrhotiques est variable en fonction de la cause et de son contrôle et de la présence de décompensations. L’ascite réfractaire survient chez 5-10 % des patients cirrhotiques, avec un taux de mortalité de plus de 50 % à 2 ans. Souvent, elle s’associe à d’autres complications comme l’infection spontanée du liquide d’ascite. Lors de la phase terminale de cette décompensation et suivant la qualité de vie du patient, l’espérance de survie en dehors d’une transplantation hépatique n’est que de quelques mois. Dans le cadre de l’ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour des défaillances multiples et de préserver le capitale hépatocitaire des patients. La perte de fonctionnalité du foie durant cette période conduit à un décès du patient de façon précoce. Les traitements actuels sont purement symptomatiques et ne visent qu’à limiter les risques liés à l’hypertension portale, les surinfections, les risques d’hémorragie ou au contraire de thrombose et sont proposés au cas par cas, ce de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons développer visent à agir sur les différents mécanismes conduisant à une réfractarité de l’ascite, la perméabilité de la paroi intestinale et les productions d’ammoniaque à l’origine de l’encéphalopathie pour la décompensation traditionnelle. Elles visent à agir sur les différentes voies à l’origine de la défaillance multiple (inflammation, immunitaire, métabolique et vasculaire) dans le cadre de l’ACLF.
Procédures
Période d’induction : Décompensation spontanée selon les procédures : Jusqu’à 44 administrations par gavage ou par administration intrapéritonéale de composé chimique hépatotoxique, à raison de 2 fois par semaines pendant 22 semaines (15 secondes) ou jusqu’à 44 administrations par administration intrapéritonéale de composé chimique hépatotoxique à raison de 2 fois par semaines pendant 22 semaines (15 secondes). Sur les procédures de caractérisation de chacun des agents inducteurs (procédure 1 et 2), les animaux pourront subir jusqu’à 6 prélèvements de sang à la veine sublinguale intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3minutes). En dehors de ces deux procédures, les animaux subiront un prélèvement de sang intermédiaire à la veine sublinguale intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3minutes). Pour les études de type ACLF, les animaux subiront une administration intrapéritonéale, par voie intraveineuse ou par gavage des agents inducteurs (15 secondes). Pour les études avec test de composés, en dehors de la phase d’induction de la cirrhose et de l’ACLF, les animaux pourront subir jusqu’à 10 administrations par gavage, voie intrapéritonéale ou intraveineuse (15 secondes). Dans certains cas, les 4 administrations avec un volume plus important en intrapéritonéale se fera sous anesthésie (durée 1 minute), avec 4 drainages du dialysat à raison d’une fois par jour (15 minutes) sous anesthésie générale. L’administration intraveineuse pourra être faite par infusion lente à l'aide d'un perfuseur (durée 120 minutes).
Impact sur les animaux
L’induction de la fibrose n’induit pas de douleur mais un inconfort et un stress passager lié à la contention nécessaire pour le gavage ou l’administration intrapéritonéale des agents, l’habituation au geste estompe rapidement ce stress. La gêne est présente mais pas accompagnée d’une analgésie chez l’humain. Les animaux présentant de l’ascite semblent présenter des signes de gêne de posture lorsque celle-ci est abondante sans pour autant présenter des signes de douleurs (grimace scale). L’administration massive d’alcool produisent les effets d’une ivresse importante (perte d’équilibre, ataxie). L’ACLF est un épisode grave chez le patient dont le pronostic vital est engagé. Le modèle animal présente, par voie de conséquence, lors de l’induction de l’ACLF des signes d’inconfort manifestes. L’administration unique ou répétée des agents inflammatoires ont des effets notoires sur les animaux dans les heures qui suivent les inductions. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux présenteront ces symptômes à des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Dans les situations d’études de survie où le délai jusqu’à la mort est une donnée clé de la procédure, le recours au point d’arrêt anticipé sera appliqué et c’est à ce moment précis que sera déclarée la mort de l’animal. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
L'intégralité des animaux sera mis à mort à l'issue des procédure afin de pouvoir étudier les biomarqueurs circulant, histologique ou transcriptionnelle permettant de caractériser la pathologie et l'efficacité d'une molécule.
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Les pathologies étudiées étant multi-organes, le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et « global », capable de métaboliser les principes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans un système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevant. Ces études pilotes nous permettront de caractériser et d’écarter les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". La connaissance de la variance de ces biomarqueurs permet de définir un effectif théorique à l'aide d’un test statistique qui associe variance et probabilité d'atteinte d'un seuil de significativité. Cette approche statistique permet d'affiner les effectifs et de réduire donc les nombres d'animaux qui seraient surévalués et non nécessaires à l'obtention d'un résultat biologique relevant. Une priorité sur le développement sera accès par rapport à la prépondérance observée chez l’homme : infection (LPS), consommation excessive d’alcool et/ou intoxication médicamenteuse (APAP), le développement des autres agents précipitants sera envisagé qu'au cas où ceux-ci ne donneraient pas les résultats escomptés. Dans le cas d’administrations de composés par voie veineuse en aigue ou en répétés, peuvent se présenter des difficultés techniques et nous oblige parfois à augmenter les effectifs de façon à combler les pertes.
Raffinement
Les rats sont hébergés par paire, l’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teintés en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Pour les études menées sur les rats avec une présensibilisation au phénobarbital et induction au composé hépatotoxique, nous utiliserons des animaux de 4 semaines à l'arrivée (75-100 gr) âge préconisé dans la littérature, c’est en effet lorsque les rats ont atteint un poids de 100gr environ que l'effet du phénobarbital est le plus efficace. L'ensemble des autres études (sans présensibilisation au phénobarbital) sera réalisé sur de jeunes adultes, à savoir 6 à 7 semaines (250 à 300 g) à l'arrivée. Les traitements induits aux animaux affectent essentiellement la fonction hépatique et produisent des modifications métaboliques. Il est nécessaire de les appliquer sur un organisme développé, qui puisse mettre en place des mécanismes de réparation et de défense. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent (microbiote bien établi) et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer notre modèle expérimental.
Utilisation du poisson zèbre pour l’étude des métastases EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des poissons zèbres utilisés ici portent un vieillissement accéléré qui les amaigrit et les fait mourir prématurément, d'autres développent des mélanomes. 1 040 individus sont concernés, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous sont tués à l'issue. Les embryons reçoivent une injection de cellules tumorales 48 heures après la fécondation, puis passent jusqu'à deux heures par jour sous anesthésie pour être imagés pendant quinze jours, les adultes du troisième groupe étant intubés quatre heures toutes les deux semaines sur une période pouvant atteindre 52 semaines. Le porteur décrit chez les malades des œdèmes, des abcès, une nage dégradée et un éloignement des congénères, et justifie la mise à mort par la nécessité d'éviter que les tumeurs continuent de croître.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier les interactions entre les cellules tumorales circulantes et l'endothélium dans le réseau vasculaire, la sortie des vaisseaux de ces cellules et leur croissance métastatique. Il s'attache notamment à définir la contribution des facteurs sécrétés par les tumeurs et le rôle des cellules non cancéreuses (endothéliales, fibroblastiques et immunitaires) dans ces processus . L'embryon de poisson zèbre permet de visualiser les étapes précoces de la formation des métastases: sortie des vaisseaux sanguins (extravasation), invasion, prolifération dans l'animal vivant. Nous allons comparer le comportement de lignées de cellules tumorales de différentes origines et ayant différentes propriétés biomécaniques et déterminer leurs interactions avec différents composants de la circulation et de la niche métastatique (vaisseaux sanguins, plaquettes, globules rouges, macrophages, neutrophiles etc..). De plus, nous comptons évaluer le rôle de facteurs secrétés par les cellules tumorales, en particulier les vésicules extracellulaires, dans ces processus. Finalement nous allons déterminer si ces processus se déroulent de la même manière chez des poissons jeunes et chez des poissons ayant un vieillissement accéléré. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d'accroitre les connaissances fondamentales sur les étapes précoces de la formation des métastases.
Procédures
Groupe 1: Une injection au stade embryonnaire (48 heures après fécondation). Durée 10 secondes (EU1). Imagerie non invasive au maximum une fois par jour (EU1). Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 2: Deux injections au stade embryonnaire (48 heures après fécondation) (EU1). Durée 10 secondes chacune. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour (EU1). Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 3 Une injection au stade embryonnaire (au stade une cellule) (EU1). Durée 10 secondes. Photographie une fois par semaine au maximum (EU1), sous anésthésie. Imagerie par microscopie sous intubation avec anésthésie et analgésie, jusqu'à une fois toutes les deux semaines (EU2). Durée 4 heures. De 8 à 52 semaines maximum. Groupes 4 et 5: prélèvements d'un petit morceau de nageoire sur animaux anésthésiés pour génotypage (EU1).
Impact sur les animaux
Chez l'embryon ou la larves, on peut observer un retard de développement suite à l'injection, mais cela reste très rare. Les larves de moins de 15 jours peuvent souffrir de l'isolement. Chez l'adulte, la formation de mélanomes peut entrainer des changements de comportement généralement associés au stress ou à une maladie. Ceux-ci comprennent : une diminution de la qualité de la nage (moins droite et régulière, moins rapide), la formation d'abcès ou d'oedèmes, des difficultés de respiration (visibles par un rythme anormal de dilatation des branchies) ou de prise de nourriture. Les animaux malades peuvent également s'éloigner de leurs congénères. Le vieillissement accéléré conduit à un amincissement des individus et une mort prématurée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer des prélèvements et pour éviter que les tumeurs ne continuent à croître et entrainent plus de nuisances.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable à la réalisation de ce projet car il n'existe pas de modèle permettant de reproduire in vitro toute la complexité du microenvironnement entre le moment où la cellule tumorale quitte la circulation envahit un nouveau tissu et le colonise. Néanmoins, certaines étapes ou certaines interactions sont étudiées in vitro. Nous avons par exemple développé un système de microfluidique permettant de reproduire les interactions entre cellules tumorales soumises à un flux et cellules endothéliales. Nous utilisons également un modèle d'invasion en matrice de collagène in vitro, ainsi que des systèmes de co-culture cellules tumorales-cellules immunitaires. Nous utilisons des lignées de cellules tumorales dérivées de mélanome ou de carcinome mammaire.
Réduction
Nous utilisons des systèmes d'imagerie qui permettent un suivi longitudinal d’un même animal et donc une réduction du nombre total d’animaux nécessaires. Une étude exhaustive des données récentes de la littérature n'a pas permis d'identifier une équipe réalisant des expériences similaires ailleurs dans le monde. Nous avons établi le nombre d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Un traitement analgésique et anesthésique est prévu avant imagerie des adultes. Les larves en procédure seront hébergés individuellement pour permettre leur suivi longitudinal. Les adultes en procédure seront hébergées en groupe de 10 à 20 pour conserver les interactions sociales essentielles à leur bien être. Les aquariums, en particulier lorsque les larves sont isolées, sont enrichis avec des fonds imprimés représentant des cailloux de rivières. Certains adultes sont isolés pendant 12h pour vérifier qu'ils récupèrent bien des séances d'imagerie. Dans ce cas, ils sont hébergés par 2, mais séparés par une vitre pour leur permettre de maintenir un contact visuel et réduire leur stress. Lors de leur transport, les animaux sont conservés dans leur eau d'origine et une fois arrivés sur place un temps de récupération est prévu.De plus larves et adultes seront nourris quotidiennement avec de la nourriture vivante, ce qui induit des comportements de chasse et augmente le bien être. Cet enrichissement est particulièrement important pour limiter le stress dans les rares cas où les animaux doivent être isolés (plaie ou blessure apparente). Tous les animaux utilisés sont obtenus par croisements sur place et sont donc habitués à notre animalerie.
Choix des espèces
Depuis quelques années, il apparait que la progression tumorale chez le poisson zèbre présente d'importantes similarités avec l'homme, d'un point de vue génétique et histologique. Par ailleurs, le poisson zèbre présente l'avantage, notamment par rapport à la souris, de permettre l'observation des tumeurs par imagerie non-invasive dans l'animal vivant. Nous avons récemment montré que des cellules de mélanomes de poisson zèbre sécrètent des vésicules extracellulaires très semblables à celles sécrétées par des lignées de mélanomes humaines (en morphologie et en contenu protéique). Nous avons également montré que nous pouvions suivre ces vésicules extracellulaires marquées par fluorescence dans l'embryon vivant. Nos expériences portent majoritairement sur les stades embryonnaires et larvaires, mais aussi sur les adultes pour certaines investigations.
Excitabilité des neurones épineux striataux chez des animaux compulsifs pour l’alcool
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Isolés en cage individuelle, 272 rats sont conditionnés à boire de l'alcool au cours de quelque 80 sessions de trente minutes étalées sur une vingtaine de semaines. Six de ces sessions s'accompagnent de stimuli aversifs, destinés à séparer ceux qui continuent de boire malgré le signal négatif de ceux qui s'arrêtent, et le porteur classe l'isolement combiné au modèle de consommation comme un impact sévère, qui concerne 200 animaux sur 272. Vient ensuite une chirurgie d'une quarantaine de minutes, avec des injections dans deux à quatre sites du cerveau, avant trois semaines d'attente puis la mise à mort et le prélèvement des cerveaux. Les 40 rats qui ne boivent pas assez pour rester dans l'étude sont proposés pour des formations à l'expérimentation animale.
Objectifs
Démontrer qu’en modulant spécifiquement l’activité de certaines populations de neurones sensibles à la dopamine (une substance active du cerveau) dans le cerveau - par des approches génétiques chez le rat - on peut moduler une prise compulsive d’alcool (une consommation irrépressible d’alcool en dépit des conséquences négatives que ces prises d’alcool peuvent avoir sur l’individu).
Bénéfices attendus
Comprendre une partie des mécanismes liés à la prise compulsive d’alcool en lien avec le rôle de la dopamine dans le cerveau. La prise compulsive d’alcool est à la base de nombreux troubles psychiatriques et comprendre son fonctionnement est un préalable indispensable au développement de stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces.
Procédures
La production des animaux transgéniques nécessitera une biopsie de tissus. La recherche envisagée s’étale sur une durée d’environ 20 semaines. Des rats adultes seront conditionnés à consommer de l’alcool de façon compulsive au cours d’un total cumulé de près de 80 sessions de 30 minutes chacune. Après habituation à consommer de l’alcool (environ 60 sessions), 6 sessions seront associées à stimuli aversifs pour associer la recherche d’alcool à un signal négatif et ainsi distinguer les rats compulsifs ne pouvant pas stopper leur consommation d’alcool malgré ce signal, de ceux non compulsifs. Les animaux utilisés dans ce projet auront ensuite des injections dans le cerveau (chirurgie sous analgésie et anesthésie générale d’injections en deux à quatre sites, pour une durée d’opération n’excédant pas 40 minutes) qui permettront au bout de trois semaines d’étudier les mécanismes de régulation de la prise compulsive d’alcool.
Impact sur les animaux
La production des animaux transgéniques nécessitant un génotypage par biopsie d’oreille peut induire une douleur légère de courte durée. L’effet du modèle de consommation d’alcool que nous allons utiliser et l’isolement des animaux pour cette expérimentation sont à considérer comme ayant un impact d’ordre sévère sur l’animal, augmentant son niveau d’anxiété mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Des nuisances modérées sont attendues liées à la procédure de chirurgie d’injection et à la procédure des stimuli aversifs. Des nuisances légères sont attendues pour ce qui est des injections dans l’abdomen et/ou sous-cutanées des traitements antalgiques et anesthésiques.
Devenir
Les animaux ayant suivi l'ensemble des expériences auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses histologiques. Cependant, dans notre projet, nous estimons à vingt pour cent au maximum les animaux ne satisfaisant pas au critère comportemental (appétence pour l'alcool) nécessaire à la poursuite des expériences. Ceux-ci seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. La décision sera prise en concertation avec le vétérinaire réfèrent et/ou un membre de la Structure chargée du Bien Être des Animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation d’un comportement compulsif de prise d'alcool (comportement pour lequel on observe une continuation de la prise en dépit des conséquences négatives, un des critères diagnostic des addictions).
Réduction
Chez les animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool différents scores d’activité́ comportementale seront relevés et les analyses des cerveaux de ces mêmes animaux prélevés en fin d’expérimentation permettront de déterminer également les pourcentages de neurones préférentiellement activés en fonction de nos conditions expérimentales. Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe estimé sur la base de procédures similaires. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool sera traité au cours de sessions distinctes et successives pour n’avoir à suivre simultanément qu’un nombre restreint d’animaux à la fois.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans les conditions répondant aux critères légaux relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Nous serons cependant obligés de les isoler par rapport à la procédure expérimentale, mais en cages ouvertes, ce qui limitera toutes nuisance associée à un isolement plus strict. Ils seront hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations (pendant une semaine) afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux contentions et aux manipulations. Les chirurgies du cerveau seront réalisées sous anesthésie générale, après analgésie préalable des sites d’incision. Les yeux seront protégés de la dessication par application d’un gel ophtalmique. La température de l’animal sera maintenue constante par une couverture chauffante. En post-opératoire les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Des injections d’eau glucosée seront réalisées pour faciliter le processus de récupération post-chirurgical. Les douleurs post-opératoires seront prévenues par un antalgique. L’intégrité du processus cicatriciel en post-opératoire sera renforcé par application d’une solution iodée après suture de la peau. A leur réveil les animaux seront retournés dans leur cage. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Le suivi quotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et des points limites adaptés.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré́ de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux de neurones sur lesquels portent notre étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les registres comportementaux explorés sont facilement appréhendables dans cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (de 8 à 10 semaines, de 200 à 240 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui pourront, pour certaines, prendre plusieurs mois.
Etude du rôle des plaquettes dans l’insuffisance cardiaque (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une souris sur cinq est censée mourir sur la table d'opération, la chirurgie qui rétrécit l'artère en sortie du cœur ayant une mortalité attendue de 20 %, à laquelle s'ajoutent 5 % de pertes pendant le développement de la maladie. 1 260 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'opération dure une demi-heure, la douleur postopératoire est annoncée pour les 24 heures qui suivent, et l'évolution de l'insuffisance cardiaque est ensuite suivie chaque semaine par échographie sous anesthésie. Il n'existe aucun traitement curatif de cette maladie, et le porteur écrit que ses résultats "pourraient par conséquent s'avérer être bénéfiques à la santé humaine".
Objectifs
Cette demande d'autorisation concerne deux laboratoires (EU1 et EU2). L'insuffisance cardiaque est une pathologie évolutive au cours de laquelle le cœur perd progressivement sa capacité à pomper correctement le sang, avec un essoufflement qui apparaît chez les sujets atteints d'abord à l'effort puis au repos. Cette maladie s’installe progressivement le plus souvent suite à la survenue d'un infarctus du myocarde, ou bien en raison de l'hypertension artérielle ou d'un rétrécissement aortique. Elle est due à un changement de morphologie du cœur qui doit s'adapter à de nouvelles contraintes, et qui finit par s'épuiser. Notre étude porte sur l'étude du rôle des plaquettes sanguines dans l'évoluton de cette maladie. Pour ce faire, nous allons utiliser un modèle d'insuffisance cardiaque qui est bien décrit chez la souris, et qui permet d'induire la maladie en quelques semaines. Nous appliquerons dans une 1ère partie ce modèle à des souris modifiées génétiquement chez lesquelles différents déterminants de surface des plaquettes ont été modifiés. En comparant ces souris à des souris non modifiées génétiquement, nous pourrons déterminer si un ou plusieurs de ces déterminants est important dans l'évolution de la maladie du cœur. Dans une 2ème partie, en fonction des données obtenues dans la 1ère, nous testerons différents traitements pharmacologiques susceptibles de freiner le développement de la maladie chez les souris. L'objectif de ce projet est de trouver de nouvelles approches thérapeutiques qui permettrait de traiter l'insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
Il n'existe actuellement pas de traitement curatif contre l'insuffisance cardiaque. Nous souhaitons par ce projet mieux comprendre l'évolution de cette maladie afin de trouver une nouvelle cible thérapeutique qui permettrait de la combattre. Si un ou plusieurs des déterminants de surface plaquettaire s'avère(nt) être une (des) cible(s) potentielle(s) (Partie 1), nous testerons alors des traitements pharmacologiques dont nous disposons et qui sont capables de les bloquer (Partie 2). Nos résultats pourraient par conséquent s'avérer être bénéfiques à la santé humaine.
Procédures
Tous les gestes techniques sont réalisés sur des animaux analgésiés et anesthésiés à l'aide d'une anesthésie gazeuse. La veille de l'intervention chirurgicale, un prélèvement sanguin (1 min) est prévu ainsi qu'une session d'épilation de la zone opérée. Un prélèvement sanguin final est prévu également au moment de l'euthanasie des animaux. La chirurgie dure environ 30 minutes. Elle consiste en l'exposition de l'artère en sortie du cœur et en son rétrécissement (20 min). L'animal est ensuite recousu (10 min). L'évolution de la pathologie cardiaque est suivie chaque semaine par imagerie en échographie sur les animaux anesthésiés (5 min). Les interventions ont lieu au sein du premier laboratoire (EU1), à l'exception du suivi échographique qui est quant à lui effectué dans les locaux du deuxième (EU2).
Impact sur les animaux
Une certaine mortalité est attendue lors de la chirurgie induisant l'insuffisance cardiaque, estimée de l'ordre de 20%, puis au cours du développement de la maladie (5%). Les autres effets indésirables prévus sur les animaux sont : - une douleur post- opératoire à J0 et pendant 24h - une perte de poids post-opératoire (modérée) - un stress occasionné par les séances d'imagerie
Devenir
Les animaux arrivant à la fin de la procédure sont euthaniasiés afin de pouvoir analyser leur cœur. Nous étudions également leur sang pour analyser des marqueurs de la maladie cardiaque qui peuvent s'y trouver en circulation.
Remplacement
La maladie que nous étudions est complexe et fait intervenir un grand nombre de paramètres différents (inflammation, modification de la paroi cardiaque, dialogue avec d'autres organes comme les poumons et les reins). Il n'est aujourd'hui pas possible de mimer ces phénomènes autrement qu'en utilisant des animaux vivants dont la physiologie est proche de celle de l'être humain.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grâce aux données disponibles dans la littérature du domaine et à notre expérience des modèles animaux. Des tests statistiques permettant de connaître le nombre de souris minimal nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir en cas de souffrance des animaux. Les animaux qui dépassent les points limites que nous avons définis sont euthanasiés. La douleur post-opératoire ou potentiellement occasionnée par les prélèvements sanguins est évaluée et traitée préventivement par l'administration d'un anti- douleur. De la nourriture humide est placée au sol dans leur cage afin de faciliter la prise de nourriture et l'hydratation après la chirurgie. Chaque jour, les animaux sont pesés et leur apparence générale est contrôlée. Du coton est placé dans leur cage pour leur permettre de faire des nids. Le transport des souris entre les deux établissements dure 5 minutes à pied et se fait dans leur cage qui est placée dans un sac de transport.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont le système cardiovasculaire a un fonctionnement et une organisation très proches de ceux de l'être humain. Ce système est mature lorsque la souris est adulte (à environ 8-10 semaines), raison pour laquelle nous utiliserons des animaux de cet âge, la maladie touchant des êtres humains d'âge adulte. Le patrimoine génétique de la souris est par ailleurs connu depuis de nombreuses années et nous avons à notre disposition des souris modifiées génétiquement qui ne produisent pas un certain nombre de molécules d'intérêt, ce qui permet d'étudier leur rôle (partie 1 du projet), comparativement aux souris qui la produisent normalement. D'autre part, des souris qui ne sont pas modifiées génétiquement seront utilisées dans le cadre du test de nouvelles approches thérapeutiques (partie 2 du projet).
Rôle du récepteur minéralocorticoïde dans la fibrose intestinale chez la Souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Tester si un médicament de l'hypertension déjà sur le marché freine la fibrose intestinale suppose ici d'infliger des colites chroniques à 924 souris, dont 374 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Une semaine d'antibiotiques vide leur microbiote, puis sept jours de gavage quotidien le remplacent par un autre, avant l'administration d'un agent chimique dans l'eau de boisson une semaine sur trois, ou par injection dans le rectum. Les protocoles durent 42 à 59 jours et provoquent, selon le porteur, une hypersensibilité viscérale sévère et une perte de poids, sans qu'aucun analgésique soit administré : il affirme que les quatre molécules disponibles interféreraient toutes avec l'inflammation étudiée. Les souris dont le score dépasse 3 sont mises à mort par surdosage d'anesthésiques.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) regroupent principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Ces maladies se caractérisent par la répétition de poussées inflammatoires, entrecoupées de phases de rémission. Une complication fréquente des MICI est la fibrose intestinale. Celle-ci se caractérise par une paroi intestinale plus épaisse en raison d’une réparation excessive. Cela peut conduire à un rétrécissement de la lumière intestinale. Aujourd’hui, aucun traitement spécifique ne permet de prévenir ou d’inhiber le développement de la fibrose intestinale, ce qui conduit les patients à des interventions chirurgicales, d’où l’importance de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir ou inhiber la fibrose intestinale. Nous avons décidé de cibler le récepteur minéralocorticoïde (RM). Ce récepteur est impliqué dans la régulation de la pression artérielle. Or, la suractivation de ce récepteur est impliquée dans le développement de fibroses extra-intestinales. Par exemple, cibler le RM permet de diminuer la fibrose cardiaque induite dans un modèle murin d’hypertension artérielle. Ainsi, nous évaluerons l’effet de l’antagonisme du RM sur le développement de la fibrose intestinale dans des modèles murins de colite. De plus, le RM exprimé au niveau des macrophages joue un rôle dans le mécanisme du développement de fibrose dans différents contextes extra-intestinaux, d’où l’importance d’évaluer spécifiquement l’implication du RM exprimé au niveau myéloïde dans le développement de la fibrose intestinale.
Bénéfices attendus
Même si des progrès thérapeutiques notables ont été réalisés dans le traitement des MICI, il n’existe pas de traitement préventif ou thérapeutique contre le développement de la fibrose intestinale. Comme les antagonistes du RM ne sont pas contre-indiqués chez les patients atteints de MICI, nous pourrions repositionner les antagonistes du RM déjà disponibles sur le marché dans un nouveau champ thérapeutique. De plus, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents sur l’implication du RM dans le développement de la fibrose intestinale et en particulier le rôle du microbiote intestinal.
Procédures
Transfert de microbiote intestinal et induction de la fibrose intestinale. Les souris seront déplétées de leur microbiote par traitement antibiotique dans l’eau de boisson d’une durée d’une semaine. Puis, le transfert de microbiote intestinal se fera par gavage quotidien pendant 7 jours consécutifs et chaque gavage dure environ 1 min par souris. Les protocoles de colite chronique induite chimiquement se feront respectivement soit par administration de l’agent chimique dans l’eau de boisson, soit par une injection intra-rectale sous anesthésie/analgésie. L’administration de l’agent chimique dans l’eau de boisson dure 1 semaine et est répétée 3 fois au cours du protocole expérimental. L’injection rectale dure environ 1min. Les protocoles d’induction de fibrose sont de 59 jours et 42 jours respectivement. La composition corporelle est mesurée par EchoMRI les premiers et derniers jours de protocole de façon non invasive et la procédure dure environ 1 minute par souris. Dans le cadre de certaines procédures, des inhibiteurs pharmacologiques seront administrés dans l’alimentation des souris pendant toute la durée du protocole expérimental.
Impact sur les animaux
Les modèles de colites peuvent entrainer une hypersensibilité viscérale (modérée pour la colite aigue aux doses testées et sévère pour les modèles de colite chronique induite chimiquement) et une perte de poids corporelle chez la Souris
Devenir
A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’informations à partir de ces séries expérimentales.
Remplacement
Avant d’être testés in vivo, nos hypothèses de travail sont validées dans des modèles cellulaires comme des lignées de fibroblastes intestinaux humains ou des lignées de macrophages en conditions de fibrose. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de rendre compte de la complexité physiologique de la réponse fibrotique ou inflammatoire in vivo. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.
Réduction
Ce projet s’efforce de réduire le nombre de souris au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante et en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience : (i) données nutritionnelles (composition corporelle, poids des animaux), (ii) inflammation, (iii) fibrose intestinale, (iv) fonction de barrière intestinale et (v) microbiote intestinal. Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études, d’études pilotes pour valider les doses d’agents chimique et des données de la littérature. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs approches combinées ont été prévues : des modèles de colites intestinales induites chimiquement par deux agents différents à des concentrations faibles mais efficaces d’après la littérature. Nous avons fait le choix d’utiliser une dose faible d’inducteur chimique pour limiter au maximum la mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux utilisés. - L’utilisation d’espèces d’animaux utilisés à des fins scientifique, caractérisés par une faible variation génétique permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. - L’effectif de chaque groupe a été déterminé par une approche statistique en prenant comme critère principal le score histologique. - Nous avons fait le choix de tester l’antagonisme pharmacologique ou génétique du RM uniquement sur les animaux colitiques et par conséquent de limiter les groupes contrôles au strict minimum. Les données obtenues chez des animaux contrôles seront réutilisées autant que possible. Par exemple, des échantillons de colon sont préservés dans le laboratoire et indiqués dans la base de données communes à notre Unité et peuvent ainsi être réutilisés au cours d’un autre protocole par nous ou une personne de l’Unité.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages standards (4-5 souris/cage), avec enrichissement. Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. - Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée des procédures, afin de déceler tout éventuel signe de souffrance. Une grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal sera utilisée . Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA. Pour limiter la douleur des animaux avec colite induite chimiquement, l’usage est de ne pas utiliser d’analgésique en raison de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire. Il existe 4 analgésiques potentiels utilisés dans l’inflammation intestinale, qui présentent tous un risque d’interférence avec notre modèle selon la littérature scientifique. Nous ne pourrons donc pas utiliser ces analgésiques dans nos procédures expérimentales. En cas d’atteinte des points limites (score >3), les souris seront mises à mort par surdosage d’anesthésiants.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est le mammifère non primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme. La souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser la colite expérimentale et les modèles génétiques d’invalidation du récepteur minéralocorticoïde ne sont disponibles que chez la Souris. Cette souche n’est pas résistante à l’induction de colite chronique par le DSS et le TNBS comme d’autres souches de souris et permet ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. La lignée de souris a été utilisée par notre laboratoire pour la mise en place des techniques de greffe de microbiote intestinal et de déplétion du microbiote endogène des animaux greffés par antibiothérapie.
Epreuve Maladie de Carré (CDV) par voie intraveineuse chez le chien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
150 chiens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Ils reçoivent un vaccin candidat une à cinq fois, puis le virus de la maladie de Carré injecté dans une veine sous anesthésie, avant des écouvillonnages oculaires et buccaux et des prélèvements sanguins répétés. Les chiens du groupe témoin ne sont pas vaccinés et développent la maladie, avec myoclonies, convulsions, vomissements, diarrhées et écoulements nasaux purulents. Cinq à six candidats vaccins pourront être testés de cette manière, le nombre de chiens étant fixé par les textes réglementaires que le porteur invoque comme cadre de l'étude.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité d’un vaccin destiné au chien contre la maladie de Carré. Pour qu’un vaccin soit autorisé, il faut notamment démontrer que celui-ci apporte un effet bénéfique sur l’animal pour la pathologie considérée. Les études sont réalisées sur l’espèce cible (chien) pour s’approcher au mieux des conditions réelles d’utilisation (Pharmacopée Européenne et réglementations des pays destinataires). Pour démontrer l’efficacité d’un vaccin contre cette pathologie canine, une phase d’épreuve suit la phase d’administration du vaccin. L’épreuve correspond à l’administration d’un agent pathogène pour reproduire expérimentalement la pathologie.
Bénéfices attendus
La finalité de ces études est de permettre le développement de vaccins efficaces contre la maladie de Carré et donc de réduire l’impact des maladies infectieuses chez les chiens.
Procédures
Les nuisances prévues sur les animaux sont les suivants : - Administration du vaccin : 1 à 5 fois avec 2 à 5 semaines d’intervalle, sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 1 minute. - Administration de l’agent pathogène en intra-veineuse, 1 fois sur tous les animaux anesthésiés, acte inférieur à 10 minutes - Ecouvillons oculaires et buccaux sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 3 minutes - Prélèvements sanguins plusieurs fois pendant l’étude sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 1 minute. - Observation clinique quotidienne sur tous les animaux en vigile, 5 minutes/animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : - La contention et la répétition d’actes techniques (administrations et prélèvements) peuvent occasionner un stress et éventuellement de la douleur. - Les écouvillons oculaires et buccaux peuvent provoquer une gêne pour l’animal. - Le développement de la pathologie peut donner lieu à des signes cliniques sévères (myoclonies, convulsions, diarrhées, vomissements, douleur abdominale, écoulement nasaux purulent, signes cutanés…) notamment chez les animaux non-vaccinés = animaux témoins dans les études d’efficacité.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin d'étude, pour des raisons de biosécurité liées à la catégorie de risque de l’agent biologique (ARG2), aucun chien administré (même protégé) ne peut ressortir du batiment (confinement BSL2).
Remplacement
Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre de candidats à tester in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
Pour les études réglementaires, le nombre d’animaux est fixé par les textes. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste de façon à minimiser le nombre de chiens tout en permettant d’interpréter les résultats des études. 5 à 6 candidats vaccins pourront être testés.
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique est prévue dans le but de limiter le stress des animaux et de stabiliser leur état physiologique (sauf cas exceptionnels subordonnés au protocole expérimental). Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans le cas d’études sur jeunes animaux (moins de 7 semaines d’âge), les animaux seront hébergés avec leur mère ou une nourrice. Les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La contention et les actes techniques sont réalisés par un personnel hautement qualifié. Ils peuvent avoir recours à une anesthésie et/ou une analgésie si l’acte ou l’animal le nécessite. Pour l’administration de l’agent pathogène en intra-veineuse, une anesthésie légère d’une durée d’environ 10 minutes est réalisée pour permettre la pose d’un cathéter et l’administration lente de la souche d’épreuve. Une surveillance accrue des animaux juste après cette administration (~2 à 3h) pour s’assurer du bon réveil des animaux et du bon déorulé de l’administration. Des points limites spécifiques de la pathologie sont définis. Ces critères sont en constante évolution de manière qu’ils reflètent au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires. Le personnel est formé et compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans son état physiologique optimal. Une observation quotidienne ou bi-quotidienne des animaux est réalisée. Elle porte sur les points suivants : apparence physique externe, comportement spontané, comportement provoqué/réponse aux stimuli externes. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.
Choix des espèces
L’évaluation sur espèce cible (chien) est une exigence règlementaire et le modèle optimal pour réaliser les études à ce stade de connaissance. En générale la vaccination s’effectue à 7 semaines d’âge, mais des animaux de 4 semaines pourront être inclus (animaux nés sur site ou chez un fournisseur). Dans ce cas les chiots seront hébergés avec leur mère ou une nourrice. Dans les études de durée d’immunité, les chiots sont vaccinés jeunes puis observés jusqu’à l’âge adulte pour tester la durée de protection conférée par le médicament. Pour la mise au point de modèle d’épreuve, des animaux adultes (> 12 mois) peuvent également être utilisés.
Effet d’un traitement périnatal à base de substances bioactives sur l’homéostasie intestinale dans un modèle d’IBS non inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Séparés de leur mère trois heures par jour entre le deuxième et le quatorzième jour de vie, gavés chaque jour pendant cette séparation, 720 souriceaux entrent dans un protocole impliquant un niveau de souffrance sévère. Leurs fèces sont collectées à trois, quatre, six, huit et dix semaines. Devenus adultes, ils reçoivent un gavage de molécule fluorescente, une ponction sanguine à la veine saphène, puis une distension colorectale poussée jusqu'à 80 mmHg pour mesurer leur sensibilité viscérale, avant d'être tués pour prélèvement de l'intestin et du cerveau. Le porteur affirme que la séparation maternelle pratiquée dans ses conditions "n'entraîne aucune autre nuisance" que l'hypersensibilité colique recherchée, tout en rappelant que d'autres protocoles de séparation néonatale font apparaître anxiété et dépression.
Objectifs
Les facteurs psychologiques occupent une place importante dans l’étiologie du syndrome de l’intestin irritable (SII). Il a été montré une forte association entre SII et anxiété, dépression ou encore somatisation. Les douleurs viscérales sont la forme la plus fréquente de douleur signalée en clinique. Il est maintenant reconnu que les douleurs viscérales peuvent être associées à des atteintes cognitivo-comportementales. La comorbidité entre les troubles psychologiques et viscéraux mène à une condition plus incapacitante que l’un ou l’autre seul, ce qui a un impact important sur la qualité de vie et la contribution à une charge économique importante. Bien qu’ils partagent des facteurs psychologiques et biologiques communs, y compris des voies neurales et des neurotransmetteurs similaires, le lien entre la douleur viscérale et les troubles psychologiques n’est pas bien compris. Les évènements stressants peuvent induire d’une part une exacerbation de la douleur et d’autre part induire de l’analgésie. Les troubles psychologiques liés au stress, y compris la dépression et l’anxiété, comptent parmi les affections médicales les plus invalidantes et les plus répandues. Ces troubles sont souvent concomitants avec diverses autres maladies systémiques et somatiques, allant des maladies cardio-vasculaires aux altérations de la fonction du tractus gastro-intestinal. Malgré l’association bien établie entre le stress et les troubles psychiatriques, des études pour une meilleure compréhension des processus complexes par lesquels le stress induit des changements pathologiques, augmentant la vulnérabilité à la maladie, sont en cours. Il a également été démontré que les facteurs de stress physiques et psychologiques augmentent la perception de la douleur viscérale. Ainsi, les interventions psychologiques et pharmacologiques qui favorisent la perception du stress améliorent les symptômes de douleur viscérale. Enfin, le stress, particulièrement pendant les phases de développements juvéniles, joue un rôle prépondérant dans le SII associé à de l’HSVC. Dans les modèles animaux, des études ont montré que les événements indésirables au début de la vie, comme la séparation de la mère (neonatal maternal separation - NMS), sont des facteurs de risque pour le développement d’une HSVC chronique à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes associés au SII, notamment ceux mises en jeu pendant la petite enfance et la maturation du tractus digestif, afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules bioactives agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettrait d’envisager une étude clinique. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs et des comorbidités psychologiques chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.
Procédures
Entre l’âge de 2 et 14 jours, les souriceaux subiront une séparation de leur mère de 3h par jour entre 9h00 et 12h00. Durant cette période de séparation, les souriceaux recevront aussi par gavage des substances bioactives contenues dans des vésicules extracellulaires et préparées à partir de lait maternel humain dans un volume de 20µL. Il sera effectué une collection des feces à l'âge de 3, 4, 6, 8 et 10 semaines. A l'âge adulte de 8-10 semaines, un prélèvement sanguin faisant suite à un gavage d’une molécule fluorescente sera réalisé par ponction dans la veine saphène. Enfin, les souris subiront une distension colorectale afin d'évaluer leur sensibilité colique puis seront mis à mort afin de réaliser différents prélèvements intestinaux et cérébraux
Impact sur les animaux
Le gavage entraîne un stress physique léger de courte durée. De plus, en cas d’échec, le gavage en période péri-natale (quotidien entre l’âge de 2 jours et de 14 jours) peut être accompagné de signes pouvant inclure une incapacité à respirer, une respiration haletante significative ou une langue tirée pendant une longue durée. Concernant le gavage à l’âge adulte, celui-ci peut entrainer une certaine agitation, pouvant ainsi créer des fausses routes. Pour cette raison, une fois l’acte de gavage terminée, l’animal est observé pendant 1 min afin de s’assurer de tout risque de fausse route. Les prélèvements de sang au niveau de la veine saphène entraînent un stress physique léger de courte durée suivie occasionnellement d’une très légère perte de poids qui retourne à la normal en moins de 24h. La séparation des nouveaux nés réalisée dans nos conditions expérimentales entraîne une augmentation de la sensibilité colique (but du modèle) mais n’entraîne aucune autre nuisance chez l'animal, comme par exemple une perte de poids ou le développement d'un comportement anxio-dépressif. Cependant, il a été décrit dans d’autres protocoles de séparation des nouveaux nés, l’apparition de certains stress psychologiques comme de l’anxiété ou de la dépression. La distension colorectale entraîne de l’inconfort intestinale le temps des 20 secondes correspondant au test de mesure de la sensibilité colique, en particulier pour les fortes distensions de pression correspondant à 60 et 80 mmHg, mais une fois celle-ci terminée, l’animal présente un comportement de retour à la normal. Au final, un seul des gestes techniques est sévère en lui-même et de courte durée comme mentionné ci-dessus mais il est répété toutes les 5min pendant 20min, l'animal restant en semi-contention durant tout ce temps. C'est l'accumulation de tout ça, le jeune âge et la durée de la procédure qui nous incite à considérer cela comme sévère.
Devenir
A l'issu de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes nécessaire pour les analyses fonctionnelles (biologie moléculaire et histologie).
Remplacement
Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact d’un stress néonatal sur les variations de l’homéostasie intestinal. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique et les principales analyses, notamment de suivi du poids, seront effectuées.
Raffinement
Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (week-end et jours fériés compris) voir deux ou trois fois par jour si l’état le nécessite par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. La douleur sera abrégée sans délai via l’administration d’antalgique dérivé de la morphine, ou si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids significative sur 3 jours, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Les personnes qui manipuleront et observeront les souris sont expérimentées. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à l’espèce et qui respectent leur bien-être : densité animale, température, hygrométrie contrôlées, présence d’enrichissement, eau et nourriture à volonté. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs et aux manipulations.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par sa pertinence pour l’étude des pathologies intestinales in vivo (Gkouskou et al., 2014) ainsi que par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. Les souris subiront un stress néonatal de PND2 à PND14 puis seront utilisées au stade adulte (8-10 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.
Evaluation du rôle de l’interleukine 2 dans des modèles de maladies inflammatoires auto-immunes chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une souris paralysée ou amaigrie jusqu'à un quart de son poids est mise à mort dès qu'un point limite est atteint. 2 500 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Les expérimentateurs déclenchent chez elles soit une maladie qui mime la sclérose en plaques, avec une paralysie remontant des pattes arrière vers l'avant, soit un lupus qui part d'une inflammation de l'oreille et se généralise sur huit semaines. S'y ajoutent des prélèvements sanguins jusqu'à quotidiens et jusqu'à trois ponctions de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie. Les traitements plus efficaces annoncés sont renvoyés au moyen terme et au conditionnel, tandis que le porteur qualifie d'"indispensable" l'accès aux organes qui interdit de garder ces souris en vie.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre de nos recherches sur les maladies inflammatoires auto-immunes, qui constituent un enjeu majeur de santé publique. Il a pour objectif de faire progresser les connaissances en explorant les mécanismes inflammatoires communs à plusieurs de ces maladies. Dans la sclérose en plaques (SEP), l'organe inflammé est le système nerveux central, tandis que dans le lupus systémique, différents organes sont affectés. Ces deux maladies sont très invalidantes : la SEP est la deuxième cause de handicap acquis chez les jeunes adultes, après les traumatismes, et elles touchent majoritairement les jeunes femmes. Si les traitements ont connu des avancées, aucune thérapeutique ne permet encore de soigner ces maladies, les traitements actuels sont peu efficaces sur l'aggravation des symptômes avec le temps. Dans ce contexte, il est indispensable de poursuivre les efforts de recherche pour développer de nouveaux traitements. Pour cela, une meilleure compréhension du développement de la maladie, obtenue par l'étude de modèles pertinents chez la souris, constitue un prérequis essentiel. Nous proposons, dans ce projet, d'étudier le rôle d'une molécule, l'interleukine-2 (IL-2), dans la régulation des mécanismes inflammatoires impliqués dans la SEP et le lupus. La thérapie par l’IL-2 a montré un potentiel considérable lors d’essais cliniques chez l'homme en tant que traitement de ces deux maladies. Cependant, les cibles cellulaires de ce traitement ne sont pas encore toutes bien identifiées ce qui limite la compréhension des mécanismes biologiques sous-jacents freinant l'optimisation et l'élargissement de son usage thérapeutique. À l'aide de modèles souris mimant ces maladies, nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes thérapeutiques de l'IL-2 au niveau cellulaire.
Bénéfices attendus
Nos travaux permettront de faire progresser les connaissances sur la physiopathologie de la SEP et du lupus, notamment en explorant les mécanismes inflammatoires impliqués. Le projet vise également à mieux comprendre les mécanismes thérapeutiques de l'IL-2. À moyen terme, ces travaux pourraient mener au développement de thérapies plus efficaces et mieux ciblées pour traiter les maladies inflammatoires auto-immunes, en optimisant l'utilisation de l'IL-2.
Procédures
Après immobilisation, les animaux au sevrage seront prélevés au niveau de queue ou de l’oreille (geste réalisé en moins d'une minute). Pour l’induction de la SEP, les animaux endormis recevront une ou deux injections sous la peau (geste réalisé en moins d'une minute) et deux injections abdominales après l’induction (jour 0 et jour 2, geste réalisé en moins d'une minute). Le traitement sera injecté quotidiennement (immobilisation rapide de l'animal, moins de 30 secondes) pendant maximum 4 semaines. Pour l’injection de cellules immunitaires, les souris seront endormies avant l’injection (pas plus d’une minute par souris). Pour le déclenchement d’un lupus, une immobilisation sera réalisée le temps d'appliquer la crème sur l'oreille (environ 30 secondes 3 fois par semaine) ou de faire une injection abdominale (geste réalisé en moins d'une minute, 3 fois par semaine). Les prélèvements sanguins répétés seront réalisés sur animaux immobilisés (environ une minute), à raison d’un prélèvement hebdomadaire ou quotidien en fonction du volume prélevé. Le prélèvement de liquide céphalo-rachidien (liquide dans lequel baigne le cerveau) après endormissement de l'animal (20 minutes) maximum 3 fois au cours de l'expérimentation avec 7 jours d'intervalle minimum.
Impact sur les animaux
Toutes les lignées de souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Le prélèvement au niveau de la queue ou de l’oreille peut entrainer de la douleur et du stress chez l’animal. L’induction de la maladie qui mime la SEP consiste à déclencher une réaction immunitaire au niveau du système nerveux central avec apparition d’une paralysie progressive mais transitoire (rémission partielle) allant des membres postérieurs vers les membres antérieurs. Cette procédure engendre un affaiblissement de l’animal avec une perte de poids transitoire dès le début de l’apparition des symptômes (J9-J10) pouvant atteindre jusqu’à 25%. L‘induction d’un lupus consiste à déclencher une inflammation, d’abord locale au niveau de la peau, puis généralisée entraînant l'affaiblissement de l'animal (perte de poids progressive à partir de 3 semaines de traitement qui peut atteindre 20% après 8 semaines de traitement). Pour les deux modèles (SEP et lupus), si l’un des points limites que nous avons définis est atteint, la souris sera mise à mort selon une méthode réglementaire.
Devenir
L'accès aux organes ainsi qu'aux fluides biologiques d’intérêts est indispensable. Il nous est donc impossible de garder en vie les animaux concernés par l’étude.
Remplacement
L’évaluation de l'efficacité du traitement sur les réponses immunitaires au cours de maladies auto-immunes inflammatoires nécessite l’utilisation d’animaux et l’accès aux différents organes touchés par la maladie : organes du système immunitaire (rate, ganglions, moelle osseuse), organes du système nerveux central (SNC : moelle épinière et cerveau) et rein, peau, poumon, glandes salivaires... Cette évaluation n’est pas possible en dehors de l'animal car ces pathologies complexes touchent de multiples organes simultanément (SNC, reins, système immunitaire, système vasculaire…). Les atteintes des tissus ne peuvent pas être modélisées en dehors de l'animal.
Réduction
Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Des projets précédant nous ont permis de déterminer précisément le nombre d’animaux nécessaires pour avoir des résultats significatifs. De plus, le laboratoire possède déjà une expertise dans l’induction de la SEP chez la souris ce qui nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisé lors de la mise en place de cette nouvelle étude. Pour le lupus, nous choisirons la méthode permettant d’induire efficacement une maladie chez tous les animaux. Les analyses sur les fluides biologiques (sang) à l'aide de micro-prélèvements (petits volumes) et des techniques de dosages combinées et ultrasensibles, permettront de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs tout en améliorant la qualité des données obtenues.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adéquates : locaux spécialisés, cages de dimension réglementaire, eau et nourriture à volonté. Les animaux sont maintenus maximum à 5 par cage. Un suivi quotidien des animaux comprenant une évaluation de leur bien-être, une mesure de leur poids et une évaluation de leur comportement, permettra de pouvoir contrôler correctement leur état de santé. Les procédures expérimentales du projet utilisent des méthodes éprouvées, précises, rapides et réalisées par du personnel formé, ce qui limite les effets de stress et douleurs chez les animaux. Les analyses biologiques réalisées dès les premiers stades de la maladie, serviront d'outils diagnostics ce qui permettra de réduire le temps d'expérimentation et donc la souffrance animale.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris. Ce modèle animal nous permet de déclencher des pathologies auto-immunes inflammatoires (sclérose en plaques ou lupus) pour étudier les mécanismes biologiques de ces maladies et évaluer l'efficacité de traitements avant l'évaluation chez l'homme. Chez l'homme, les maladies auto-immunes peuvent se déclencher chez l'adulte jeune ou âgé. Nous induirons donc ces maladies sur des animaux de 8 à 12 semaines (âge correspondant à des souris adultes jeunes) ou de 14 mois (âge correspondant à de vieilles souris).
Etude du rôle du récepteur aux œstrogènes dans la tumorigenèse hépatique dans un modèle murin de maladie métabolique (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris de ce projet portent une mutation qui reproduit la glycogénose humaine, avec des hypoglycémies pouvant être fatales, le porteur relevant 1 à 2 % de décès survenant généralement la nuit. 72 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Nourries neuf mois avec un régime riche en graisses et en sucre, elles développent obésité et diabète, puis des tumeurs du foie susceptibles d'entraîner une ascite, un ictère et une prostration, sous scanner mensuel puis tous les quinze jours le dernier mois. À onze mois, toutes sont mises à mort pour prélever le foie, l'hypophyse, l'hypothalamus, les ovaires et les testicules.
Objectifs
Les cancers du foie se développent souvent sur un foie gras (stéatose) qui est souvent associé à l’obésité et/ou au diabète de type 2. La pathologie peut évoluer vers une cirrhose, et/ou vers un cancer du foie. Il a été noté que ces maladies métaboliques apparaissaient plutôt chez les hommes, alors que les femmes sont protégées jusqu’à la ménopause. Ces différences pourraient s’expliquer en partie par le rôle protecteur des œstrogènes, hormones féminines, contre l’accumulation de graisses dans le foie. Cet effet passerait par la liaison des œstrogènes sur leurs récepteurs spécifiques localisés sur les cellules du foie. Dans une autre maladie métabolique rare, appelée glycogénose, le développement de tumeurs du foie est observé avec la même incidence entre les femmes et les hommes. Cette maladie se caractérise par la perte de la capacité à produire du sucre par le foie, les reins et les intestins, engendrant des hypoglycémies pouvant causer la mort du patient. De plus, les patients développent aussi un foie gras mais qui ne va pas évoluer vers la cirrhose. L’accumulation de graisses dans le foie va toutefois entrainer le développement de tumeurs du foie qui sont généralement bénignes. Ces tumeurs ont cependant un fort taux de transformation en cancer. Ce schéma de développement tumoral est encore mal caractérisé, et a aussi été décrit chez certains patients diabétiques et/ou obèses. Grâce au développement d’un modèle de souris viables reproduisant toute la pathologie du foie de la glycogénose, il a été montré une augmentation de la quantité de récepteurs aux œstrogènes dans le foie des souris mâles et femelles atteintes de cette maladie. Nous proposons d’étudier l’effet de la perte de ces récepteurs dans le foie de souris atteintes de glycogénose sur le développement de tumeurs du foie. Les souris seront produites puis élevées pendant 5 mois après l’induction de la maladie dans un premier établissement utilisateur (EU1), et le suivi du développement des tumeurs sera ensuite réalisé dans un 2ème établissement (EU2).
Bénéfices attendus
A terme ce projet devrait permettre de mieux caractériser le rôle des œstrogènes et de leur récepteur dans la pathologie du foie de la glycogénose, notamment son rôle dans le développement tumoral au stade tardif de la pathologie. Ainsi, cette étude pourrait mettre en évidence une nouvelle cible thérapeutique, les récepteurs aux œstrogènes, dans la prévention et le traitement des cancers hépatiques du foie dans la glycogénose. Ces récepteurs sont déjà ciblés dans le cadre de cancers œstrogéno-dépendants (cancer du sein notamment). Ces traitements pourraient par la suite être testés sur le modèle animal reproduisant la glycogénose pour valider leur efficacité sur la prévention de tumeurs. Ces avancées pourraient éviter la transplantation hépatique car, en absence de traitement curatif, seule la transplantation hépatique permet de contrôler la glycémie et prévenir les dommages du foie.
Procédures
Dans l’établissement 1 (EU1) : Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un petit morceau (
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques sont obtenues après une série d’injections pouvant engendrer une légère douleur. L’immobilisation de la souris ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Ces souris peuvent développer des hypoglycémies sévères si elles ne s’alimentent pas régulièrement. Actuellement, la gestion de l’élevage permet de limiter les décès liés aux hypoglycémies sévères, mais 1 à 2% de décès peuvent être rencontrés généralement durant la nuit. Il est à noter que sous régime riche en graisses et en sucre, aucune souris ne développe d’hypoglycémie si elles ont accès à la nourriture. Ce régime est connu pour induire le développement d’une obésité et d’un diabète, environ 4 à 5 mois après l’introduction du régime, chez les souris non transgéniques. L’obésité peut entrainer une réduction de la mobilité des souris. Les souris diabétiques boivent en général plus et urinent plus. Les souris atteintes de glycogénose développent des tumeurs hépatiques millimétriques après 6 mois de régime riche en graisses et en sucre. Un produit de contraste sera injecté une seule fois en veine caudale pour réaliser les analyses d’imagerie du foie chez des animaux immobilisé dans un tube ; cette injection peut engendrer une légère douleur, un léger saignement au niveau de la piqure et un stress dû à la contention en tube. L’apparition de tumeurs hépatiques peut entrainer une altération du comportement et de la prise alimentaire, avec une perte de poids, une diminution de la mobilité, ou une prostration des animaux. Elle peut s’accompagner du développement d’une ascite (accumulation de liquide dans l'abdomen) et éventuellement d’un ictère (jaunissement). La pathologie hépatique devrait être impactée par la suppression des récepteurs aux œstrogènes avec le développement probable de dommages cellulaires. Pour évaluer ces dommages (dosages des transaminases), toutes les souris subiront des prélèvements sanguins (5 prélèvements = 1 par mois à partir du 5ème mois), ce qui peut engendrer une légère douleur lors de la piqure et un stress lié à la contention de l’animal.
Devenir
`Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement du foie, de l’hypophyse, du cerveau (hypothalamus) et des organes reproducteurs (ovaires, testicules) afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires.
Remplacement
Même s’il est maintenant possible de produire des petits organes en culture qui intègrent les différents types de cellules du foie, la pathologie hépatique de la glycogénose de type 1a met en jeu un dialogue complexe entre ces cellules du foie et les cellules du système immunitaires de la circulation sanguin ainsi que des régulations hormonales. La sécrétion des hormones sexuelles comme les œstrogènes dépend de signaux passant par le cerveau. Ces régulations ne peuvent pas être reproduites en culture cellulaire. Ce projet nécessite de travailler avec un modèle animal permettant de maintenir les interactions inter organes. Dans le cadre de cette étude, l’hypothalamus, l’hypophyse, les ovaires/testicules et le foie seront prélevés pour étudier en détail l’ensemble des régulations à l’échelle de l’organisme.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux, du métabolisme et grâce aux connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 12 souris maximum par sexe et par génotype, permettront de réaliser à la fois l’étude du développement tumoral hépatique et des études moléculaires et histologiques. Des tests statistiques permettront de comparer les différents groupes de souris entre eux. Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera l’obtention de 48 souris transgéniques et 24 souris contrôles (mâles et femelles).
Raffinement
-La pathologie est induite uniquement dans le foie des souris à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies sévères qui peuvent être fatales et de passer la période néonatale. -Contrôle des risques d’hypoglycémie en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes dans la cage et tétines de biberon longue). En cas d’hypoglycémie, une solution de sucre sera administrée à la souris et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle. - Lors des prises de sang, l’arrêt du saignement sera rapidement maitrisé par un point compressif. -Afin de limiter la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones qui peuvent être douloureuses. -Lorsque les animaux deviennent diabétiques (après 5 mois de régime gras), la litière sera changée plus régulièrement pour assurer leur bien-être car les souris peuvent uriner plus. -Le suivi du développement tumoral par des imageries sera réalisé sous anesthésie. -La mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés a permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet. -Le transfert des animaux entre le 2 établissements situés à moins de 1 km sera effectué en voiture. Et une période d’adaptation de 15 jours sera respectée avant le début de l’expérimentation.
Choix des espèces
En ce qui concerne la régulation de la glycémie, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux, comme la souris, dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle de souris transgéniques reproduit toute la pathologie humaine de la glycogénose, y compris le développement de tumeurs. Par ailleurs, le modèle souris est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et de nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kits biochimiques…). Le protocole sera réalisé chez des souris adultes âgées d’au minimum 6 à 8 semaines, après l’induction de la glycogénose hépatique ce qui permet d’éviter l’apparition de retard de croissance dû à la maladie et de passer la période périnatale sans dommages. Les animaux seront mis à mort à l’âge de 11 mois.
Epreuve CAV1 (Adénovirus Canin de type 1) par voie intra-veineuse chez le chien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Vaccinés une à cinq fois, puis infectés par l'adénovirus canin injecté dans une veine sous anesthésie, 50 chiens subissent ensuite des prélèvements sanguins répétés et une observation clinique quotidienne, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Des chiots de quatre à sept semaines peuvent être inclus, hébergés avec leur mère ou une nourrice. Les chiens non vaccinés forment le groupe témoin et développent la maladie sans protection, avec diarrhées, apathie, hypothermie et douleur abdominale. Aucun ne ressort du bâtiment de confinement, tous sont tués en fin d'étude pour des raisons de biosécurité.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité d’un vaccin destiné au chien contre l’Hépatite de Rubarth. Pour qu’un vaccin soit autorisé, il faut notamment démontrer que celui-ci apporte un effet bénéfique sur l’animal pour la pathologie considérée. Les études sont réalisées sur l’espèce cible (chien) pour s’approcher au mieux des conditions réelles d’utilisation (Pharmacopée Européenne et réglementations des pays destinataires). Pour démontrer l’efficacité d’un vaccin contre cette pathologie canine, une phase d’épreuve suit la phase d’administration du vaccin. L’épreuve correspond à l’administration d’un agent pathogène pour reproduire expérimentalement la pathologie.
Bénéfices attendus
La finalité de ces études est de permettre le développement de vaccins efficaces contre l’Hépatite de Rubarth et donc de réduire l’impact des maladies infectieuses chez les chiens.
Procédures
Les nuisances prévues sur les animaux sont les suivants : - Administration du vaccin : 1 à 5 fois avec 2 à 5 semaines d’intervalle, sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 1 minute. - Administration de l’agent pathogène en intra-veineuse, 1 sur tous les animaux anesthésiés, acte inférieur à 10 minutes - Prélèvements sanguins plusieurs fois pendant l’étude sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 1 minute. - Observation clinique quotidienne sur tous les animaux en vigile, 5 minutes/animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : - La contention et la répétition d’actes techniques (administrations et prélèvements) peuvent occasionner un stress et éventuellement de la douleur. - Le développement de la pathologie peut donner lieu à des signes cliniques sévères (diarrhées, apathie, hypothermie, douleur abdominale) notamment chez les animaux non-vaccinés = animaux témoins dans les études d’efficacité.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin d'étude, pour des raisons de biosécurité liées à la catégorie de risque de l’agent biologique (ARG2), aucun chien administré (même protégé) ne peut ressortir du batiment (confinement BSL2).
Remplacement
Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre de candidats à tester in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
Pour les études réglementaires, le nombre d’animaux est fixé par les textes. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste de façon à minimiser le nombre de chiens tout en permettant d’interpréter les résultats des études. 3 à 4 candidats vaccin pourront être traités
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique est prévue dans le but de limiter le stress des animaux et de stabiliser leur état physiologique (sauf cas exceptionnels subordonnés au protocole expérimental). Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans le cas d’études sur jeunes animaux (moins de 7 semaines d’âge), les animaux seront hébergés avec leur mère ou une nourrice. Les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La contention et les actes techniques sont réalisés par un personnel hautement qualifié. Ils peuvent avoir recours à une anesthésie et/ou une analgésie si l’acte ou l’animal le nécessite. Pour l’administration de l’agent pathogène en intra-veineuse, une anesthésie légère d’une durée d’environ 10 minutes est réalisée pour permettre la pose d’un cathéter et l’administration lente de la souche d’épreuve. Pour les chiots (inférieurs à 6 mois), le volume administré est de 1.0mL. Pour les animaux adultes, le volume administré ne dépassera pas 10mL. Une surveillance accrue des animaux juste après cette administration (~2 à 3h) pour s’assurer du bon réveil des animaux et du bon déorulé de l’administration. Des points limites spécifiques de la pathologie sont définis. Ces critères sont en constante évolution de manière qu’ils reflètent au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires. Le personnel est formé et compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans son état physiologique optimal. Une observation, a minima, quotidienne des animaux est réalisée. Elle porte sur les points suivants : apparence physique externe, comportement spontané, comportement provoqué/réponse aux stimuli externes et détection des signes cliniques de la maladie. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.
Choix des espèces
L’évaluation sur espèce cible (chien) est une exigence règlementaire et le modèle optimal pour réaliser les études à ce stade de connaissance. En générale la vaccination s’effectue à 7 semaines d’âge, mais des animaux de 4 semaines pourront être inclus (animaux nés sur site ou chez un fournisseur). Dans ce cas les chiots seront hébergés avec leur mère ou une nourrice. Dans les études de durée d’immunité, les chiots sont vaccinés jeunes puis observés jusqu’à l’âge adulte pour tester la durée de protection conférée par le médicament. Pour la mise au point de modèle d’épreuve, des animaux adultes (> 12 mois) peuvent également être utilisés.
Évaluation de l’effet in vivo de combinaisons de traitements agissants sur la multiplication des cellules du cancer du sang.
- Recherche appliquée
- Cancers
676 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour tester deux associations de médicaments contre la leucémie aiguë myéloïde. Pour mesurer la toxicité, cinq premiers lots reçoivent les molécules seules ou associées pendant 14 jours, par injection dans l'abdomen ou par voie orale. D'autres souris sont irradiées, éveillées, puis reçoivent dans la veine de la queue des cellules leucémiques de souris ou humaines, suivies d'une prise de sang par semaine à la joue et de jusqu'à trois ponctions de moelle osseuse au fémur sous anesthésie, avant d'être traitées. La leucémie peut provoquer une importante perte de poids, une déshydratation et une hypothermie, et toutes les souris sont tuées pour prélever leur moelle et leur rate, celles dont le traitement améliore la survie au plus tard trois mois après sa fin. Le porteur affirme qu'il est "indispensable d'avoir des preuves d'efficacité dans des modèles pré-cliniques murins", alors que l'effet de ces deux associations a déjà été confirmé in vitro sur des échantillons de patients.
Objectifs
Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des cancers du sang de mauvais pronostic. De nouvelles options thérapeutiques sont donc nécessaires. Afin d’identifier de nouvelles combinaisons de médicaments limitant la multiplication de cellules leucémiques, nous avons procédé à une première étape in vitro (sans utilisation d’animaux) sur 3 types de cellules leucémiques différentes, ce qui nous a permis d’identifier plusieurs combinaisons de traitements intéressantes. La deuxième étape in vitro à partir d’échantillons de patients, nous a permis de confirmer l’effet combiné pour deux combinaisons innovantes. Notre projet a pour but de tester ces combinaisons sur des modèles de souris afin de les valider et de pouvoir envisager leur utilisation dans des essais cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
Nos travaux pré-cliniques, qui évaluent la pertinence d’un traitement sur les cellules et dans des modèles de souris avant de le donner à l’homme, devraient permettre de mettre en évidence une nouvelle stratégie thérapeutique dans les LAM, grâce au développement d'une thérapie basée sur l’administration de deux médicaments en simultané. Ce nouveau traitement a pour ambition d'être à la fois efficace et bien toléré pour améliorer le pronostic des patients atteints de LAM.
Procédures
Dans un premier temps, pour déterminer la toxicité des traitements, il sera administré sur un premier lot d’animaux une molécule thérapeutique par injection au niveau de l’abdomen 1 fois tous les 2 jours pendant 14 jours (sur souris éveillée, durée de l'injection: 30s). Un deuxième lot recevra une deuxième molécule par voie orale 2 fois cinq jours avec une pause de 3 jours, un troisième lot une troisième molécule au niveau de l’abdomen 1 fois par jour pendant 14 jours, un quatrième lot une combinaison de la première molécule combinée avec la deuxième et un cinquième lot une combinaison de la première molécule combinée avec la troisième molécule. Dans un second temps, un groupe d’animaux vigiles sera irradié (2 min) au préalable pour favoriser une prise de greffe. 3 à 6h après, les cellules cancéreuses de souris seront injectées (souris vigile) au niveau de la veine de la queue (30s). Des prélèvements de sang d’une durée de quelques secondes seront réalisés une fois par semaine au niveau de la joue pour suivre le développement de la maladie et à deux semaines un prélèvement de moelle osseuse au niveau du femur sur animal anesthésié (5min) renouvelé 2 semaines plus tard (3 fois maximum). Une fois la maladie établie, les traitements vus précédemment seront administrés. Et enfin, un autre groupe de souris sera soumis aux mêmes interventions que le groupe précédent en remplaçant les cellules cancéreuses de souris par des cellules cancéreuses humaines.
Impact sur les animaux
Le développement de la maladie peut entrainer une importante perte de poids, un changement de comportement, de mobilité, une déshydratation et/ou une hypothermie. L’administration orale d’un traitement peut entrainer une possible irritation du tube digestif. Les différents prélèvements et injections peuvent générer un stress et une éventuelle gêne temporaire surtout après le prélèvement de moëlle osseuse.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse et la rate afin de caractériser l’effet du traitement sur l’expansion des cellules cancéreuses. Dans le cas où le traitement testé améliore la survie des animaux, alors ceux-ci seront gardés en vie post-traitements et ils ne seront euthanasiés que lorsqu’ils présenteront plusieurs points limites cumulés ou au plus tard 3 mois après la fin du traitement.
Remplacement
Bien que certains modèles cellulaires manipulés in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de caractérisation de réponse aux traitements, ils ne sont pas suffisants car ils ne permettent pas de récapituler toutes les conditions pathologiques de croissance de la leucémie observée chez l’homme. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles pré-cliniques murins.
Réduction
Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établi grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subis par l'animal. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Une surveillance, une pesée et un suivi clinique quotidien des animaux à l’aide d’une grille d’observation permettront de déterminer des points limites précoces qui conduiront à un renforcement du suivi et/ou à l’euthanasie de l’animal
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à identifier le traitement qui sera le plus efficace et le plus adapté pour être transféré et testé en clinique chez l’homme. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’au moins 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.