Procédures sévères
Etude du rôle de la GPVI, du fibrinogène et de la fibrine en thrombose artérielle et dans la thrombo-inflammation post-accident vasculaire cérébrale ischémique.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
La formation d'un gros caillot dans une artère interdit tout réveil, et les souris concernées sont tuées dès la fin de l'expérience. 576 souris vont être utilisées, 432 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 144 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent l'induction d'une thrombose de la carotide, de l'aorte abdominale ou des artérioles mésentériques pendant 30 à 45 minutes, la pose d'une sonde de mesure du flux sanguin, un accident vasculaire cérébral provoqué sous anesthésie de 30 minutes à 2 h 30, et pour certaines la pose sous la peau du dos d'un dispositif de diffusion continue. Les souris destinées à la thrombose des artérioles mésentériques ont 3 semaines, un âge choisi pour éviter les lipides entourant les vaisseaux et garantir la lésion des couches profondes de la paroi.
Objectifs
Les plaquettes jouent un rôle central dans l’arrêt du saignement qu’on appelle hémostase. Elles s’accumulent au niveau d’une lésion vasculaire, pour former un caillot qui stoppe les saignements. Un processus similaire peut survenir dans un vaisseau malade, nommé thrombose artérielle. Elle peut mener à l’occlusion du vaisseau, ce qui diminue l’apport en oxygène d’un tissu, aussi appelée ischémie. Elle est responsable de maladies graves comme l’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Dans le cadre du traitement de l’AVCi, le caillot obstruant la circulation est soit dissous par l’administration d’un médicament, soit retiré mécaniquement, ce qui permet de rétablir le flux sanguin des artères cérébrales. Cependant, ces traitements ont une efficacité modérée, due notamment à la formation de micro-caillots et à l’inflammation ayant lieu à la suite au rétablissement du flux sanguin cérébral. Ce projet, se focalise principalement sur la thrombose artérielle, l’événement pouvant déclencher les AVCi, ainsi que dans la formation de micro-caillots et l’inflammation à la suite d’un AVCi. De récents résultats montrent l’importance de la glycoprotéine VI (GPVI) dans la formation de ces micro-caillots et dans la réduction de l’efficacité des traitements de l’AVCi. Les ligands de la GPVI potentiellement présents dans ces événements sont le fibrinogène et la fibrine. Ainsi, ce projet vise à évaluer chez la souris l’importance des interactions de la GPVI avec le fibrinogène et/ou la fibrine dans la thrombose artérielle, et dans l’apparition de micro-caillots et d’une inflammation à la suite du traitement de l’AVCi.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet portent sur la thrombose artérielle et l’AVC ischémique. On pourrait mettre en évidence de nouveaux mécanisme impliquant la GPVI dans la thrombose artérielle, et améliorer les traitements ciblant la GPVI pour soigner la thrombose artérielle. On pourrait mettre en évidence que l’interaction entre la GPVI avec le fibrinogène et/ou la fibrine est à l’origine de l’aggravation de l’état de certains patients après le traitement de l’AVC. Ceci ouvrira des perspectives d’amélioration des traitements ciblant la GPVI avec de potentielles nouvelles indications.
Procédures
Les animaux subiront pour l’étude de la thrombose : • Les animaux seront soumis à des injections dans la cavité abdominale (animal vigile) et intraveineuses (animal anesthésié). Dans chaque procédure l’animal vigile recevra une injection pour l’anesthésie, puis il y aura une ou deux injections de quelques secondes sur animal anesthésié avant ou après le début de la thrombose artérielle en fonction des traitements à administrer. • L’induction d’une thrombose, soit au niveau de la carotide, soit de l’aorte abdominale, soit des artérioles mésentériques à proximité des intestins. Procédure : entre 30 et 45 minutes Les animaux subiront pour l’étude de l’AVC : • Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale permettant la pose de la sonde permettant de visualiser le flux sanguin de l’artère cérébrale qui sera obstruée. Procédure : 10 minutes • Une induction d’un accident vasculaire cérébral (AVC) sous anesthésie générale ainsi qu’une injection par voie intraveineuse d’un traitement. Procédure : entre 30 minutes et 2h30 selon la méthode d’induction de l’AVC • Une pose d’un dispositif sous la peau du dos pour diffusion continue du traitement. Procédure : 15 minutes
Impact sur les animaux
Lors de l’expérimentation, nous pouvons nous attendre à une baisse de la fréquence respiratoire et une baisse de la température corporelle provoquée par l’anesthésie. Nous pouvons nous attendre à un risque de saignement lors de la pose de la sonde de mesure du flux sanguin ainsi qu’un inconfort au niveau de l’incision. Nous pouvons nous attendre à un risque de saignement lors de la pose de la pompe permettant la diffusion continue du traitement, ainsi qu’un impact sur la mobilité et un inconfort au niveau de l’incision. Nous ne nous attendons pas à un impact du traitement sur les risques de saignements. Nous pouvons nous attendre à un risque de saignement lors de la chirurgie permettant d’induire l’AVC. A une réduction de la mobilité causée par l’AVC, pouvant rendre difficile l’alimentation. Egalement, à un inconfort postopératoire au niveau de l’incision.
Devenir
La formation du thrombus de grande taille dans une artère ne permet pas le réveil de l’animal. Ainsi, immédiatement après la fin de l’expérience de thrombose, l’animal sera mis à mort. 24h après la réalisation de la procédure d’AVC, les animaux seront mis à mort afin de procéder à des analyses post mortem sur les cerveaux.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’effet des interactions entre la GPVI plaquettaire et le fibrinogène et/ou la fibrine dans un processus complexe et intégré qu’est la thrombose artérielle et sa conséquence, l’AVC ischémique. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo. De plus, les plaquettes sont des cellules sans noyau qui ne peuvent être cultivées dans des boites, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire qui aurait pu être envisagé pour étudier une partie du processus.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé entre 8 et 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison des résultats obtenus entre les différents groupes d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux minimum 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Par un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. • Par une habituation au gel nutritif 3 jours avant l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’injection d’un analgésique pendant et après chaque procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont maitrisés, notamment les modèles de thrombose artérielle et d’AVC. Les techniques de mutation génétiques ont permis de générer des souris sur un même fond génétique (C57BL/6J) exprimant la GPVI humaine, déficiente pour le fibrinogène ou la fibrine. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent des outils originaux et uniques. Les souris sont utilisées lorsqu’elles sont adultes (exception faite de la thrombose laser sur artérioles mésentériques) car la thrombose artérielle et les AVC touchent plus souvent les adultes que les enfants. La thrombose sur artérioles mésentériques est réalisée sur des souris de 3 semaines afin d’éviter la présence de lipides autour des vaisseaux, permettant ainsi de s’assurer de la lésion des couches intermédiaire et profonde de la paroi vasculaire.
Développement d’épreuves infectieuses expérimentales chez le médaka, un outil modèle alternatif dans le domaine de la santé des poissons d’élevages
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
2 266 médakas vont être utilisés, dont 1 990 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Répartis par bassins de 23 pour huit pathogènes différents, ils sont infectés par des virus et des bactéries, certains par micro-injection sous anesthésie, et deux d'entre eux sont mis à mort à 3, 7, 10 et 15 jours après chaque infection pour prélèvement. Le porteur indique que plusieurs de ces pathogènes provoquent des mortalités significatives et qu'il est impossible de prédire les effets des virus émergents testés. Ce dispositif est présenté comme un modèle alternatif destiné à réduire à terme l'utilisation de poissons d'élevage, la réduction annoncée portant donc sur d'autres espèces que celles tuées ici.
Objectifs
Ce projet a pour finalité de mettre en place des infections expérimentales (virus et bactéries) chez un poisson modèle, le médaka, afin de pouvoir évaluer l’efficacité de stratégies anti-infectieuses et déterminer le potentiel de ce modèle alternatif dans l’aide au diagnostic et la caractérisation de pathogènes émergents. Les espèces de médakas Oryzias latipes et melastigma sont des poissons de petite taille dont le génome a été entièrement séquencé, qui s’élèvent et se reproduisent facilement toute l’année. Extrêmement tolérants, ils peuvent vivre en eau douce ou en eau de mer dans des plages de température relativement larges. Plusieurs études ont démontré qu’ils étaient permissifs à une grande diversité de pathogènes viraux ou bactériens. Dans un contexte de remplacement et de raffinement de l’expérimentation animale en santé des poissons d’élevage et de la mise à disposition de nouveaux outils en infectiologie, nos objectifs détaillés consistent à i) mettre en place un élevage pérenne de ces 2 espèces de médaka (melastigma, qui présente une affinité particulière pour les milieux marins ou saumâtres et latipes, plus retrouvé en eau douce) ; ii) développer des modèles infectieux (virus/bactéries connus) adaptés aux milieux marin ou d'eau douce et des outils d’analyses de l'ensemble des microorganismes vivant dans un hôte donné ; iii) explorer l’utilisation du médaka comme outil de diagnostic complémentaire aux méthodes d'analyses sur cellules pour la caractérisation de plusieurs pathogènes émergents décrits récemment et disponibles au sein de notre structure.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à terme une réduction du nombre d’animaux d’élevages utilisés en expérimentations en donnant la possibilité de mener des évaluations rapides de solutions thérapeutiques et de sélectionner celles présentant les meilleures potentialités pour des tests sur espèces cibles. L’apport au diagnostic sera un autre bénéfice important, en proposant une facilitation de l’identification et de la caractérisation d’agents infectieux émergents.
Procédures
Les infections par micro-injections, si elles sont réalisées, seront faites sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 5 minutes entre l'endormissement, l'injection, et la phase de réveil ; moins de 30 secondes pour l'opération d'injection). Au cours des infections, 2 animaux seront mis à mort dans les bacs dédiés aux prélèvements pour chaque pathogène testé à 3, 7, 10 et 15 jours post-infection. Les poissons survivants des bacs de prélèvements seront analysés au terme des essais après mise à mort.
Impact sur les animaux
Les médakas sont des animaux très adaptables et faciles à maintenir en aquariums à une température optimale de 26 à 28°C. Un léger stress pourrait être induit du fait des différentes conditions d’essais testées (différentes températures). Certains pathogènes ont été rapportés comme induisant des mortalités significatives. Il est par contre impossible de prédire les effets potentiellement induits par les virus émergents qui seront utilisés.
Devenir
Les animaux survivants au terme des procédures seront mis à mort, pesés/mesurés et conservés à -80°C pour analyses.
Remplacement
Cette étude vise à développer un modèle alternatif qui permettra à moyen terme de limiter l’utilisation de poissons d’élevages cibles pour la caractérisation d’agents infectieux émergents, le développement et la validation d’outils de diagnostic, et l’évaluation de stratégies de lutte. Les modèles in vitro disponibles sont limités par la diversité des pathogènes présents chez les différentes espèces de poissons d’élevage et il n’est pas possible d’évaluer la virulence ou l’efficacité d’un traitement sans passer par un système permettant d’appréhender la complexité d’un modèle hôte/pathogène.
Réduction
Des prétests seront nécessaires pour les pathogènes bactériens afin de définir les bonnes concentrations à utiliser pour les épreuves infectieuses. Elles nécessiteront l'utilisation de 25 poissons / pathogène (5 poissons, 4 concentrations + 1 groupe témoin), soit 75 poissons au total / espèce de médaka. Le suivi de mortalité sera réalisé sur 3 bassins de 23 poissons par pathogène afin d’intégrer la variabilité fréquemment observée en infectiologie sur modèles poissons. Un bassin supplémentaire de 23 poissons / pathogène est prévu afin de pouvoir réaliser des prélèvements en cinétique sans perturber les animaux des bassins destinés au suivi de mortalité. Au regard du nombre de pathogènes connus (n=6) ou émergents (n=2) à tester, des pré-tests pour les pathogènes bactériens et en intégrant le fait qu'un essai pourrait être réitéré avec une infection par micro-injection, le nombre total maximum de poissons utilisés sera de 1133 médaka / espèce, soit 2266 poissons au total.
Raffinement
Les mesures de raffinement viseront : - à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux afin de s’assurer de leur bien-être : une biomasse (nombre d’animaux par bassin) contrôlée permettant l'expression des comportements alimentaires et natatoires attendus, un volume d'eau adapté et renouvelé régulièrement, une saturation en oxygène suffisante, un rythme jour/nuit naturel, et une alimentation adaptée à leur stade de développement et la biomasse. - à réaliser des observations quotidiennes de l’état de santé général des poissons et de leur comportement natatoire et alimentaire. - à mettre à mort de façon compassionnelle les animaux qui présenteraient des signes de mal-être, en accord avec une grille de points limites définie.
Choix des espèces
Le médaka (Oryzia latipes et melastigma) est une espèce idéale facile à entretenir en raison de sa petite taille, de ses exigences simples en matière d’alimentation et d’habitat (eau douce/saumâtre/de mer) et de sa grande adaptabilité aux variations de température, ainsi qu’un temps de génération court (3 mois pour un cycle complet). Son génome, de taille réduite, est disponible et il possède une immunité innée et adaptive déjà bien documentées, ainsi qu’une sensibilité avérée à des agents viraux d’importance pour la filière piscicole, comme les virus de la nécrose nerveuse (VNN), de la septicémie hémorragique virale (VSHV) et de la nécrose pancréatique infectieuse (VNPI) ou à des agents bactériens comme Aeromonas hydrophila ou Vibrio harveyi. Les données de la littérature sur la sensibilité du médaka aux virus précédemment citées concernent en majorité le stade adulte ; les animaux utilisés dans le cadre de ces procédures seront donc au stade adulte.
Impact de la pression expiratoire positive en ventilation uni- pulmonaire sur la dysfonction endothéliale et le glycocalyx dans un modèle animal
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une mortalité de 5 à 30 % pendant l'opération, et jusqu'à 50 % au troisième jour : l'ablation d'un lobe pulmonaire pratiquée sur un rat dont un poumon est mis hors circuit tue une partie des animaux avant le terme du protocole. 102 rats Wistar mâles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour le prélèvement des organes. Chaque animal subit deux heures de chirurgie sous anesthésie totale et trois prélèvements sanguins de dix minutes, la ventilation sur un seul poumon pouvant provoquer un manque d'oxygène. Les rats qui perdent plus de 15 % de leur poids sont tués avant la fin, seuil que le porteur retient comme point limite.
Objectifs
Lors d’une lobectomie pour cancer du poumon, le poumon opéré doit être exclu, c’est à dire non ventilé pour permettre au chirurgien de réaliser une exérèse pulmonaire. La ventilation repose donc sur le poumon controlatéral, on parle alors de ventilation uni-pulmonaire (VUP). Les complications pulmonaires postopératoires sont fréquentes après une chirurgie de résection pulmonaire et ont un impact majeur sur la morbidité et de la mortalité postopératoires. L’emploi de la VUP en chirurgie thoracique se doit d’assurer une oxygénation efficace au patient sans entrainer de lésions pulmonaires induites par la ventilation, ces dernières étant associées à 20% de complications pulmonaires post-opératoire. Au cours de la dernière décennie, la généralisation de la ventilation protectrice au bloc opératoire et en réanimation a aussi été adaptée en ventilation uni pulminaire et a permis de diminuer significativement l’incidence des complications postopératoires après une chirurgie thoracique pour ablation pulmonaires. Ainsi, l’objectif principal de cette étude est d'évaluer l'impact de la PEP(pression expiratoire positive est la pression maintenue dans les voies aériennes à la fin de l’expiration lors de la ventilation mécanique) en ventilation uni - pulmonaire sur la dysfonction endothéliale et le glycocalyx pulmonaire dans un modèle de ventilation uni-pulmonaire chez le rat.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une thématique forte de recherche sur l’impact de la PEP en ventilation uni-pulmonaire chez l’homme au cours d’une chirurgie d’exérèse pulmonaire ainsi qu’à l’imputabilité immédiate de la dysfonction endothéliale et du glycocalyx dans la survenue de complications post-opératoires. Les résultats de cette étude sur l’impact de la PEP sur la dysfonction endothéliale pulmonaire pourrait constituer un argument supplémentaire dans le choix des paramètres ventilatoires au cours d’une chirurgie thoracique et conforter l’importance du rôle de la préservation de la fonction endothéliale et du glycocalyx dans la prévention de complication pulmonaire induite par la ventilation mécanique.
Procédures
Les animaux subiront des prélèvements sanguins au nombre de 3 d'une durée 10 min et une chirurgicale qui est l’exclusion pulmonaire chirurgicale et lobectomie pulmonaire d'une durée de 2 heures. Pour les prélèvements et la chirurgie les animaux serons sous anesthésie totale.
Impact sur les animaux
La procédure est classée sévère. En effet, la ventilation unipulmonaire peut entraîner une hypoxémie chez l’animale et la lobectomie supérieure droite sur le poumon exclu a un taux de mortalité allant de 5 à 30% en peropératoire et pouvant aller jusqu’à 50% à J3. De plus, l'anesthésie va entrainer la perte de la chaleur corporelle de l'animal,un dessèchement oculaire . La piqûre de l'anesthésie peut entraîner une gêne lors de l'injection.
Devenir
Tous les rats inclus dans ce protocole seront mis à mort à la fin de l’étude dans l’objectif de récupérer les organes pour des analyses fonctionnelles, moléculaires et structurelles, ainsi que pour limiter l'éventuelle présence de souffrance aussi minime soit-elle.
Remplacement
Actuellement, il n'existe pas encore chez l'homme de biomarqueurs spécifiques pour diagnostiquer ou étudier la dysfonction endothéliale associée à l'impact de la pression expiratoire positive sur la dysfonction endothéliale et le glycocalyx lors d'une ventilation uni-pulmonaire. Afin de mieux appréhender les mécanismes physiopathologiques liés à cette problématique, des modèles chez le rat ont été développés pour montrer l'impact de la ventilation uni-pulmonaire mais aucun ne s'est encore intéressé à l'impact de la pression expiratoire positive au niveau microvasculaire. Ce modèle permet de simuler de manière représentative les conditions observées chez l'homme lors de l'application de la ventilation uni-pulmonaire. Grâce à ce modèle chez le rat, nous disposons d'une représentation fidèle de l'impact de la ventilation uni-pulmonaire sur la dysfonction endothéliale et le glycocalyx. Cette similitude avec les conditions réelles chez l'homme nous offre une opportunité unique d'étudier les effets potentiels de la pression expiratoire positive. L'utilisation des animaux est rendue nécessaire par l'absence actuelle de modèle in vitro capable de reproduire avec précision les réponses physiologiques globales induites par la ventilation uni-pulmonaire. La validation de l'impact physiologique de la pression expiratoire positive en ventilation uni-pulmonaire nécessite inévitablement l'utilisation d'un modèle animal. Cela est crucial pour obtenir une compréhension holistique des réponses biologiques, incluant des paramètres complexes qui ne peuvent être pleinement appréhendés en dehors d'un organisme vivant.
Réduction
Nous avons choisi d'utiliser des espèces animales élevées spécifiquement à des fins scientifiques, sélectionnées pour leur faible variation génétique entre individus. Cette caractéristique permet de réduire considérablement la variabilité des réponses biologiques, contribuant ainsi à une diminution du nombre d'animaux nécessaires pour notre étude sur l'impact de la ventilation uni-pulmonaire sur la dysfonction endothéliale et le glycocalyx. Le nombre d'animaux requis a été soigneusement estimé en se basant sur des études antérieures portant sur la dysfonction endothéliale menées au sein de notre unité. Nous avons mis en place une stratégie précise d'optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de l'euthanasie des animaux. Cette approche nous permettra de maximiser les informations obtenues à partir d'un nombre restreint d'animaux. Pour atteindre notre objectif principal d'évaluer l'impact de la pression expiratoire positive sur la dysfonction endothéliale et le glycocalyx dans le contexte de la ventilation uni-pulmonaire, nous avons estimé que 2 groupe de 51 rats a Ces choix méthodologiques sont orientés vers une utilisation efficace et éthique des animaux dans notre recherche, en maximisant les informations obtenues tout en minimisant le nombre d'individus nécessaires pour parvenir à des conclusions significatives.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 par cage avec de l’enrichissement (Tunel,Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement controlé et stabilisé. Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien être animal est utilisé quand un animal présente un état de mal être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA. Les rats perdant plus de 15% de leur poids seront euthanasiés. Pendant la chirugie, nous injectons une solution saline en sous- cûtanée pour maintenir l'hydratation de nos animaux. En post- opératoire une injection de glucose à 5% en IP est réalisée en ainsi qu'un ajout dans la cage de nourriture gélifiée qui aide l'animal à mieux se nourrir. Un traitement analgésique en préopératoire et en pré et post-opératoire, soit immédiatement après la chirurgie est réalisé suivi d'une injection toutes les 8h pendant 24h qui suivent l’opération. Nous allons dans ce projet utiliser essentiellement des rats mâles, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles.
Choix des espèces
Les premiers modèles de la ventilation uni-pulmonaire ont été developpés chez le rat. Le rat Wistar est une espèce largement utilisé dans les expériences animales. Les études antérieures dans le laboratoire analysant la dysfonction endothéliale sur le rat ont dévelopé des marqueurs de dysfonction. Les animaux utilisés pour l’étude seront des rats Wistar âgés de 9 semaines et qui pèseront entre 400 et 500g. Ceci correspond à la plupart des études publiées sur la ventilation uni-pulmonaire chez le rat.
Evaluation préclinique de produits de santé pour la chirurgie cardiovasculaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Chiens : 100
Cochons : 600
Chèvres : 80
Moutons : 170
600 porcs, 500 lapins, 170 moutons, 100 chiens et 80 chèvres vont être utilisés pour tester des stents, des prothèses vasculaires et des valves cardiaques avant leur mise sur le marché. Chaque animal subit une implantation chirurgicale d'une à quatre heures selon la difficulté de l'accès au cœur, avec un risque d'hémorragie ou d'ischémie, parfois suivie d'une biopsie d'une heure et de séances d'imagerie dans un autre établissement. 950 sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 160 dans des procédures sévères, 240 sont opérés sans jamais être réveillés, et les 1 450 sont tués pour l'examen des tissus au contact du dispositif. Le donneur d'ordre commande ces essais et s'engage à ne pas les faire refaire à l'identique, le porteur indiquant par ailleurs que la réglementation impose le recours aux animaux avant tout test clinique.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en chirurgie cardiovasculaire (exemple : stent, prothèse vasculaire, valve cardiaque...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Certains projets nécessiteront des séances d'imagerie (scanner, IRM), qui seront externalisés dans des établissements utilisateurs partenaires disposant de l'ensemble des équipements nécessaires pour la conduite des examens.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et de tolérance des produits de santé en chirurgie cardiovasculaire. Ainsi, il est possible d'étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l'offre et améliorant ainsi les chances de guérison et/ou le confort des patients.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 1h et 3h voire 4h pour les chirurgies les plus compliquée (accès au cœur par exemple). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), et analgésie. L’antibiothérapie est ajoutée au cas par cas en fonction de l’invasivité de la chirurgie et des risques infectieux associés. Des prélèvements sanguins peuvent etre réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). Un prélèvement intermédiaire ou biopsie peut être réalisé en cours d'étude (durée de l'intervention estimée à 1h) afin de suivre l'évolution de la réaction des tissus au contact du dispositif. Cette intervention se fera systématiquement sous anesthésie générale (chimique et gazeuse) et analgésie. D'autres type d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude, 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude). Le scanner ou l'IRM seront externalisés dans des établissements utilisateurs partenaires, la durée de l'intervention est d'environ 1h pour le scanner, et 1h30 pour l'IRM.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables ne pouvant être résolus par des mesures de raffinement sont, selon les procédures, la survenue d'un hématome ou oedème au niveau du site opératoire, une hémorragie (perte de sang) ou ischémie (manque de perfusion sanguine d'organes) en raison des sites d'implantation (vaisseaux, coeur...). Les douleurs post-opératoires peuvent apparaitre et seront prises en charge par des mesures de raffinement. Les nuisances attendues en lien avec les séances d'imagerie sont le transport entre les établissements utilisateurs, pouvant être une source de stress. Les animaux recevront une anesthésie fixe afin de réaliser l'imagerie, pouvant induire un stress. Du produit de contraste pourra être injecté grâce à un cathéter en intraveineux. Une légère perte de poids (non systématique) pourrait être observée dans les quelques jours suivant l'anesthésie.
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des prothèses vasculaires pour évaluer l’élasticité du greffon). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé cardiovasculaire, en raison des interactions complexes s'établissant entre le tissus ciblé (exemple : vaisseaux, coeur) et le dispositif lui-même. De plus, l’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation que doivent suivre les tests précliniques sur les dispositifs médicaux, avant de pouvoir lancer les tests cliniques.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "controle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations (contention, palpation, isolement, mise en place de gilets pour porter les constituants de certains dispositifs). Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, plateforme de repos, augmentation de la quantité de litière…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires par exemple pour certaines espèces). La chirurgie est réalisée sous anesthésie chimique et gazeuse et analgésie (à base de morphiniques). En cas de signes de douleur et signes cliniques, le traitement adapté sera mis en place. Les animaux sont suivis de façon quotidienne sur la base des critères suivants : apparence et état général, consommation alimentaire et hydrique et transit, attitude, comportements, signes cliniques. Les signes cliniques servant de points limites sont listés dans le document joint en annexe, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances. Si le traitement mis en place n'a pas d'effet, l'animal est euthanasié. En phase postopératoire, le suivi est renforcé et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance ou réfection des pansements, désinfection des sites chirurgicaux…). En cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, l’équipe vétérinaire assure l’examen clinique et le suivi de l’animal, afin de mettre en place une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée. Le risque infectieux est controlé par l'administration d'antibiotiques. Les transports des animaux vers les établissements utilisateurs partenaires (séance d'imagerie) seront organisés dans le respect du bien-être animal et de la réglementation en vigueur. Un contrôle clinique de chaque animal est réalisé par du personnel qualifié au départ et à l'arrivée. Lors des séances d'imagerie externalisées, une période de repos de minimum 1h sera respectée entre la réception des animaux et l'anesthésie et entre le réveil et le transport retour. Le risque d'hypothermie sera contrôlée grâce à la température de la salle, l'isolation du sol, les couvertures, lampes chauffantes.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans les textes de référence (normes). Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le chien, les ovins/caprins ou les porcins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie), ainsi que sur les similarités avec l’Homme. Par exemple, le chien est une espèce communement utilisée dans certains types de test car la thrombose induite par un dispositif médical a tendance à se déclencher plus rapidement que chez l'Homme. Les ovins et les porcins sont généralement de bons modèles en raison des similarités cardiovasculaires et hématologiques avec l'Homme. Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requiert, le stade de développement est pertinemment sélectionné en fonction de l'utilisation clinique du produit ou de sa taille. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs domestiques Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance est la plus appropriée dans ce projet.
Évaluation du risque à long terme de l’utilisation d’opioïdes chez les adolescents pour traiter la douleur induite par la chimiothérapie, dans un modèle rongeur.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Des groupes de souris adolescentes, âgées de 5 semaines au départ, reçoivent sans anesthésie 20 injections quotidiennes d'un anticancéreux associé à de la morphine, puis passent des tests de 5 à 30 minutes sur la douleur, l'anxiété, la dépression et la récompense. 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou sévère, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour des analyses post-mortem. L'objectif est de mesurer les effets à l'âge adulte d'opioïdes donnés après une chimiothérapie à l'adolescence, pour éclairer la prise en charge de la douleur des enfants atteints de cancer, alors qu'aucune tumeur n'est décrite chez ces souris. Le porteur indique que l'association de l'anticancéreux et de l'étude de la douleur chronique peut entraîner une "nuisance sévère". Les tests comportementaux ne sont désignés que par ce qu'ils mesurent, et une chirurgie d'une heure au plus, prévue dans certaines procédures, est annoncée sans que son but soit précisé.
Objectifs
Environ 70 % des jeunes patients souffrant de cancers pédiatriques rapportent également des douleurs sévères. Ces dernières peuvent être le résultat des traitements destinés à éliminer les cellules cancéreuses. En effet, la plupart des agents chimiothérapeutiques détruisent les microtubules dans les nerfs périphériques, favorisent les processus inflammatoires et le dysfonctionnement axonal, provoquant ainsi des douleurs neuropathiques et des douleurs musculaires ou osseuses qui sont fréquemment décrites 4 à 5 jours après les cycles de traitement. Pour soulager ces douleurs, pour l’heure, les opioïdes tels que le tramadol ou la morphine restent le traitement de référence. Cependant, nous ne savons que peu de choses sur les effets à long terme de l'utilisation répétée d'opioïdes à un stade précoce de la vie. Il est donc urgent de mieux comprendre les effets à long terme de l'utilisation d'opioïdes chez les enfants atteints de cancer et ce sous différents angles. Il semble notamment crucial de comprendre les effets sur la sensibilité à la douleur, l'humeur et l'utilisation abusive d'opioïdes une fois que ces jeunes enfants atteignent l’âge adulte. Ainsi, ce projet pilote, réalisé sur un modèle murin, sera développé autour de deux objectifs principaux : (i) évaluer l'impact de l'utilisation répétée d'opioïdes au début de la vie (adolescence), suite à des traitements chimiothérapeutiques, sur la nociception, l'humeur et les comportements d’addiction à l'âge adulte ; (ii) identifier les régions du cerveau affectées par l'utilisation d'opioïdes au début de la vie (adolescence) en se concentrant particulièrement sur les structures impliquées dans la matrice de la douleur et le traitement de la récompense.
Bénéfices attendus
Ce projet, validé par un comité d’évaluation scientifique, a le potentiel d'apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur les effets comportementaux à long terme d’une traitement anti-cancéreux combiné à la prise de morphine à un stade précoce de la vie. De plus, ce projet apportera les premières informations permettant de comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans ces effets et permettra de mettre en évidence de potentielles différences sexuelles, souvent sous-estimées dans les études axées sur les adolescents. A long-terme, ce projet permettra d’améliorer le soin des cancers pédiatriques et surtout la gestion de la douleur associée aux traitements utilisés.
Procédures
Le but de ce projet est d’étudier l’effet à long terme d’un traitement anti-cancéreux combiné à des morphiniques effectué lors de l’adolescence. Nous évaluerons les effets nociceptifs, émotionnels et en lien avec les comportements d’addiction. Ainsi des groupes de souris seront traitées avec ce traitement [20 injections au total (1/jour), sur animal vigile; durée d'une injection ~10sec]. Les différentes procédures expérimentales mettront en jeu des tests comportementaux (de 5 min à 30 min de test) évaluant les seuils nociceptifs, les comportements anxiodépressifs et les en lien avec la récompense. Un seul test sera réalisé par jour et un délai minimal de 24h sera respecté entre chaque test. De plus, des chirurgies sur animal anesthésié seront nécessaires (1 chirurgie d'une heure maximum / animail). La combinaison du traitement anti-cancéreux et l'étude de la chornification de la douleur peut entrainer une nuisance sévère pour les animaux.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures nécessitent un traitement anti-cancéreux qui peut provoquer une douleur modérée aux animaux. L’administration aigue ou répétée de morphine peut induire un état de dépendance physique. De plus, la répétition des injections peut provoquer une douleur aigue transitoire, une inflammation locale au niveau du site d’injection, voire une induration. Certaines des procédures de ce projet nécessitent des chirurgies sur animal anesthésié (1 chirurgie d'une heure maximum / animail) pouvant induire une douleur modérée, une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. La combinaison du traitement anti-cancéreux et l'étude de la chornification de la douleur peut entrainer une nuisance sévère pour les animaux.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l’évaluation de réponses nociceptives, de comportement émotionnels et de type addictifs nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vigile.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance (power analysis) qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 20 animaux/groupe pour le comportement et 10 pour les analyses immunohistologiques. Bien que de nombreux groupes contrôles soient nécessaires pour ce projet et que les deux sexes soient utilisés, les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation d’enregistrement longitudinaux permettra de réduire grandement le nombre d’animaux nécessaire pour notre projet et les approches sur cerveau entier permettront d’identifier un grand nombre de cibles potentielles sans avoir à répéter les expériences.
Raffinement
Tout au long des expériences, les souris sont hébergées en cage collective, dans un milieu enrichi (matériel de nidification et bâton), et observées quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Pour le suivi du bien-être animal lors du traitement à la vincristine, une grille de score sera utilisée permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale. Cette grille de score visera également à évaluer la zone d’injection et d’ainsi vérifier l’absence d’inflammation locale, d’induration ou de dommages cutanés. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire. De plus, en complément de la grille de score du suivi, après chaque chirurgie, l’état de santé des animaux sera évalué à l‘aide d’une grille de score spécifique à la procédure chirurgicale permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale.
Choix des espèces
Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, entier et complexe afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’humain, le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences. Enfin, les outils viraux nécessaires à ce projet ont été développés et validés chez la souris, qui apparait encore donc comme le modèle le plus adapté à ce projet. Par ailleurs, d’autres expérimentations portant sur les conséquences d’une douleur neuropathiques ont déjà été réalisées par notre équipe sur des souris mâles et femelles. De ce fait, par soucis de cohérence et reproductibilité, nous souhaitons conserver la même souche de souris pour ce projet. Des animaux adolescents seront utilisés (début des procédures à 5 semaines pour le traitement anti-cancéreux/morphine) car l’objectif de l’étude est d’évaluer l’effet à long terme des traitements subis à un stade précoce de la vie.
Etude de l’implication des interneurones parvalbumine et des réseaux périneuronaux dans la douleur chronique et ses comorbidités anxiodépressives.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie de la patte droite provoque chez toutes les souris une douleur neuropathique chronique que le porteur indique ne pas pouvoir soulager, puisqu'elle est l'objet de l'étude. 696 souris vont être utilisées, 600 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 96 dans des procédures sévères, toutes tuées ensuite pour analyses cellulaires. Une partie subit trois opérations successives, deux de 45 minutes espacées de trois semaines puis une de 10 minutes, avant des privations de nourriture de 24 heures. Le développement de troubles anxieux et dépressifs est attendu et assumé comme le but même du projet, mesuré par quatre tests comportementaux que le résumé ne nomme pas.
Objectifs
La douleur neuropathique est une douleur chronique consécutive à une lésion ou une pathologie du système somatosensoriel, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population. De plus, cette maladie s’accompagne dans environ 50% des cas de troubles de l’humeur tel que l’anxiété et la dépression, constituant alors un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de ce lien entre ces 2 pathologies (douleur et troubles de l’humeur) restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Chez la souris mâle, des données de la littérature suggèrent que plusieurs structures cérébrales clés seraient impliquées dans les conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique. Les données cliniques chez l’homme mais également préclinique chez l’animal montrent que non seulement la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des structures cérébrales bien précises. Il y aurait des modifications cellulaires et moléculaires dans ces structures à la suite de la douleur, qui pourrait expliquer l’apparition des troubles anxiodépressifs. L’objectif du projet est alors d’étudier ces changements dans un modèle de douleur neuropathique développant des symptômes anxiodépressifs.
Bénéfices attendus
A l’issu de ce projet, nous comprendrons plus en détail les modifications cellulaires et moléculaires du cerveau suite à une douleur neuropathique, et l’impact de ces modifications sur les troubles anxieux et dépressifs. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour les troubles de l’humeur induits par la douleur chronique.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Un premier lot d'animaux subiront une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 10 min environ, puis 4 tests comportementaux d’une durée comprise entre 5 et 30min, avec une restriction alimentaire de 24h. De plus, un autre lot d'animaux subiront une chirurgie de 45 min, puis 3 semaines après, une deuxième chirurgie de 45 min, puis 3 semaines après, une dernière chirurgie de 10 min, puis 4 tests comportementaux d’une durée comprise entre 5 et 30min, chacun espacé de 24h, avec une restriction alimentaire de 24h. Enfin, deux autres lots d'animaux subiront une chirurgie de 45min, puis une semaine après, une chirurgie de 10min et deux autres lots subiront d’abord une chirurgie de 10min puis une semaine après, une chirurgie de 45min, puis 4 tests comportementaux d’une durée comprise entre 5 et 30min, chacun espacé de 24h, avec une restriction alimentaire de 24h.
Impact sur les animaux
Il y a présence d’une douleur mais qui ne peut être soulagée car c’est l’objet d’étude. Suite à une chirurgie neuropathique, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparait dans les 48-72h après la chirurgie. Le développement de troubles anxiodépressifs est attendu et ne peut être évité car c’est l’objet d’étude. Les autres chirurgies peuvent induire une douleur aigue mais transitoire qui sera soulagée. La restriction alimentaire de 24h peut provoquer une perte de poids des animaux. Celle-ci sera limitée le plus possible en ne dépassant pas 24h de restriction et en réalimentant les animaux juste après le test. De plus, le poids des animaux sera surveillé tous les jours jusqu’à leur mise à mort pour vérifier que celui-ci ne diminue pas de 80% du poids initial.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort, pour prélevements et analyses cellulaires.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, notre analyse nécessite le développement des troubles anxiodépressifs dans un modèle de douleur neuropathique, nécessitant une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats fiables et robustes à l’issue de l’étude tout en tenant compte des variabilités entre individus, le nombre d’animaux utilisé a été déterminé statistiquement. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental et émotionnel, puis fera l’objet d’investigations anatomiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des enrichissements sont placés dans la cage pour favoriser le bien-être animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été établis pour l’ensemble des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le modèle de douleur neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).
Mise en place et utilisation de modèles in vivo d’épendymomes pour des tests précliniques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des souris immunodéficientes, incapables de rejeter des cellules humaines, reçoivent une greffe de cellules d'épendymome directement dans le cerveau. 217 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. 210 d'entre elles subissent une craniotomie d'une trentaine de minutes, et 127 reçoivent jusqu'à quinze administrations orales de disulfiram et de gluconate de cuivre. La croissance de la tumeur cérébrale provoque une perte d'appétit puis un amaigrissement, et les mises à mort interviennent dans le cadre d'études de survie, donc au terme de la progression tumorale, pour prélever les cerveaux.
Objectifs
L'objectif de ce projet est double: 1) Il consiste en la mise en place de deux modèles animaux d'épendymomes (tumeurs cérébrales) au sein de notre laboratoire. Ces modèles nous permettront de tester l'efficacité de nouveaux médicaments contre ces tumeurs pour lesquelles la médecine ne dispose actuellement que d'un arsenal thérapeutique limité. 2) Nous utiliserons ces modèles pour tester in vivo l'efficacité de deux composés administrés en combinaison, le disulfiram et le gluconate de cuivre, sur la progression tumorale. La validation in vivo de l'efficacité de ces composés sur le developpement de la tumeur pourrait permettre la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les épendymomes.
Bénéfices attendus
Les épendymomes sont la troisième tumeur du système nerveux central de l'enfant la plus courante. Le pronostic dépend de l'âge de l'enfant mais malgré un traitement agressif, le taux de survie à 10 ans de l'épendymome est de 50 à 70 %. Il est donc important de proposer aux patients de nouvelles thérapies pour améliorer le résultat clinique. La validation in vivo de l'efficacité d'un traitement combiné de disulfiram /gluconate de cuivre permettrait la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les épendymomes.
Procédures
Des animaux recevront une administration orale de composés (127 animaux, intervention de 30 secondes environ, 15 interventions maximum/animal). Des animaux recevront une greffe intracérébrale de cellules tumorales d'épendymome (210 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ). Les greffes intracérébrales sont des procédures chirurgicales.
Impact sur les animaux
La manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques ou d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La craniotomie peut générer des douleurs post-opératoires minorées par l'administration d'antalgiques. La progression tumorale induite par la maladie (ependymome) provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études de survie, pour les analyses histologiques ou de progression tumorale (prélèvement de cerveaux) et à la fin de l'étude de dose maximum tolérée (une semaine après la dernière administration).
Remplacement
Le ciblage du cerveau et de la tumeur par les médicaments vectorisés et l'efficacité therapeutique de ces derniers nécessitent une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment robuste pour mimer toute la complexité biologique et physiologique des épendymomes. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit dans la continuité d'expériences et de résultats que nous avons obtenu in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.
Raffinement
La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d'une grille de score. En fonction des scores obtenus, il sera envisagé une analgésie ou l'euthanasie de l'animal. Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement. Les cages pourvues de couvercles filtrants seront disposées dans une armoire ventilée.
Choix des espèces
L'utilisation de lignées murines immunodéficientes permet la transplantation de cellules d'une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d'une espèce différente (souris). Les tumeurs d'épendymome générées dans l'un des deux modèles mis en place sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 5 semaines et utilisées à l’âge de 6 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ces modèles physiopathologiques.
Evaluation de la pathogénicité d’agents infectieux et de la protection induite par des antigènes associés ou non à des adjuvants en vue de l’identification de nouveaux candidats vaccins et d’anticorps pour la prévention de pathogènes infectieux.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
Rats : 200
Cochons d'Inde : 200
Hamsters dorés : 200
Lapins : 200
Furets : 200
Cochons : 100
Inoculés avec un agent infectieux bactérien ou viral après avoir reçu un candidat vaccin, 5 000 souris, 200 furets, 200 lapins, 200 rats, 200 cochons d'Inde, 200 hamsters dorés et 100 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 3 245 d'entre eux, modéré pour 1 505 et sévère pour 1 350, avec poils hérissés, hyperthermie, signes neurologiques et troubles respiratoires attendus selon les protocoles. Le porteur écarte l'analgésie au motif que les antalgiques modifieraient la réponse immunitaire étudiée, et indique que les animaux atteignant un score clinique critique sont mis à mort avant la fin de l'étude. Ni les pathogènes testés ni les candidats vaccins ne sont nommés, l'établissement se bornant à mentionner des agents de classe 2 ou 3 et un maximum de six doses infectieuses évaluées.
Objectifs
Le projet consiste à évaluer, sur l’animal, l’effet protecteur ou thérapeutique d’un candidat vaccin ou d’un traitement anti-infectieux contre une infection. Pour se faire, dans un premier temps des études de développement seront réalisées pour établir les modèles animaux dit infectieux afin de représenter la maladie d’intérêt. Ces études permettront de définir entre autres les doses infectieuses du pathogène cible, bactérien ou viral, qui sera inoculé chez l’animal. À la suite de cela, des études d’efficacité (ou d’épreuve) seront réalisées dans ces modèles infectieux. Les animaux recevront le candidat (vaccin ou traitement) dont l’efficacité sera mesurée par le degré de protection induit contre l’inoculation du pathogène.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont la mise sur le marché ou éventuellement l’utilisation en essai clinique, de différentes préparations vaccinales ou de traitements anti-infectieux, d’évaluer les nouvelles voies d’administration ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d’améliorer la performance du vaccin ou du traitement anti-infectieux. Enfin, ce projet peut permettre de comprendre les mécanismes d’action, la caractérisation de la réponse immunitaire et d’identifier des corrélats de protection. La découverte de nouveaux candidats permettra de lutter contre des maladies et de sauver des vies humaines dans le monde.
Procédures
Les études de protection et d’efficacité thérapeutique consistent à administrer des antigènes, anticorps, sérums dont la dose peut être unique ou multiple sous différentes voies d’immunisation en vue de protéger contre une épreuve par un agent infectieux. L'infection est unique, plus rarement répétée. Plusieurs voies d'épreuve peuvent être utilisées. Ces différents types d’injection durent moins d’une minute.
Impact sur les animaux
L’administration des candidats vaccins, ou thérapeutiques génère des signes cliniques légers (réactogénicité locale avec principalement de l’érythème voire parfois un gonflement et une induration des tissus, rarement des poils hérissés et une perte de poids transitoire de moins de 10%). Dans le cas de l’infection par le pathogène, en fonction du protocole appliqué les effets indésirables sont légers à sévères (poils hérissés, baisse d’activité, hyperthermie, signes neurologiques et troubles respiratoires et une perte de poids transitoire de moins de 15%).
Devenir
Aucun des animaux infectés ne peut être réutilisé pour des raisons sanitaires. Les animaux sont euthanasiés après épreuve par l’agent infectieux. L’euthanasie pourra être pratiquée plus précocement en fonction du type de test, de l’évolution des signes cliniques et de l’expérience du technicien animalier ou de recherche pour abréger la souffrance.
Remplacement
Dans le cadre du développement de candidats vaccins ou d’anticorps la réponse immunitaire ainsi que la protection induite par de nouveaux antigènes et des candidats vaccins doivent être évaluées sur un organisme entier. Ainsi à ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro pour évaluer les capacités d’un vaccin ou d’un anticorps à induire une protection contre une infection à un pathogène ou pour évaluer les réponses immunitaires post-infection, ou encore reproduire la complexité des réponses cellulaires et humorales impliquées dans la mise en place d’une immunité contre un agent infectieux. Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc nécessaire.
Réduction
Chaque étude est évaluée au plus juste et est revue par les biostatisticiens afin de définir le nombre minimum et suffisant d'animaux requis permettant une analyse statistique des résultats. 1. Interventions/Procédure 1= Etudes de développement pour établir les modèles animaux infectieux. Ces études permettront de définir entre autres les doses infectieuses du pathogène cible, qui sera inoculé chez l’animal. Quelques soient les espèces, les scientifiques après revue bibliographique sur la maladie d’intérêt définissent plusieurs doses infectieuses dont un maximum de 6 (le maximum 6 doses est le plus souvent utilisé pour la souris) qui seront évaluées selon un plan de l’étude établie par les biostatisticiens. Les biostatisticiens recommandent de reproduire ces études trois fois, dans les mêmes conditions expérimentales pour définir des doses robustes. Cependant les pas de dilution entre les doses seront resserrés afin d'affiner les doses d'infection et réduire le nombre d’étude et ainsi le nombre d’animaux. 2. Interventions/Procédures 2 et 3 : Etudes d’efficacité d’un candidat vaccin ou d’un traitement anti-infectieux contre une infection. Quelques soient les espèces, les scientifiques après revue bibliographique sur la maladie d’intérêt et en fonction du nombre de lots à tester élabore le plan de l’étude. Afin de réduire le nombre de lots, ceux-ci sont d’abord présélectionnés en amont sur des modèles vitro existants. Le plan d’étude est revu par l’équipe de recherche qui comprend d’autres scientifiques ainsi que des biostatisticiens afin de revoir les groupes et le nombre d’animaux afin de le réduire à un nombre suffisant pour que l’étude soit robuste.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Pour chaque étude, une période d’acclimatation est prévue et permet de diminuer le stress des animaux avant les épreuves. L’ensemble des contentions et des gestes techniques sont réalisés par du personnel qualifié. En fonction des pathogènes, une grille d'évaluation des signes cliniques post-infection sera mise en place entre le responsable d'étude, les biostatisticiens et les vétérinaires cliniciens. Cette grille permet d’évaluer le niveau de souffrance des animaux selon des critères cliniques spécifiques du pathogène, par un personnel spécifiquement formé. Dès que le score atteint un seuil jugé critique, les animaux sont euthanasiés avant la fin de l'étude pour abréger leur souffrance. Les autres options de traitement des points limites sont malheureusement exclues car les analgésiques modifient la réponse immune étudiée et les animaux infectés sortis d’étude ne peuvent être ni placés ni réutilisés. Les animaux qui rentrent dans ce projet sont utilisés pour évaluer l’efficacité de vaccins ou traitement thérapeutique contre des épreuves bactériennes ou virales de classes 2 ou 3. Pour des raisons sanitaires et de biosécurité, tous les animaux sont euthanasiés à la fin des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le modèle animal utilisé est sélectionné en fonction des pathogènes infectieux, des antigènes évalués, de la réponse immune analysée et des données de la littérature ou des connaissances scientifiques. Plusieurs critères entrent en ligne de compte pour le choix de l’espèce, voire de la souche : - développant une maladie et/ou une réponse immunitaire similaire à l’homme - sensible à l’infection - type d’antigènes : protéines, polysaccharides, pathogènes (vivants, atténués, non réplicatifs ou inactivés), acides nucléiques, anticorps en présence d’adjuvant ou non. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : âge et taille des animaux (voie ou volume administrés, volume de prélèvement…), disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…). Les souris transgéniques constituent une opportunité unique pour étudier les mécanismes d’actions et les voies associées à la réponse immunitaire et à la protection. Elles seront à phénotype non dommageable et ne nécessiteront pas de génotypage. Dans la plupart des protocoles, les rongeurs et les lapins sont tous utilisés après sevrage au stade adulte pour que leur système immunitaire soit mature. Pour des projets R&D particuliers, des animaux âgés seront utilisés pour étudier les phénomènes d’immunosénescence et l’évaluation de candidats vaccins pour les personnes âgées. De même, pour l’évaluation de candidats vaccins pédiatriques des modèles d’animaux juvéniles avec des systèmes immunitaires non matures, (souriceaux, raton ; etc…) seront utilisés.
Exploration du rôle du système nerveux périphérique sensitif dans des modèles murins de pathologies inflammatoires
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Injectées jusqu'à vingt et une fois dans l'abdomen sur trois semaines, et pour certaines trois fois dans la cavité située derrière l'œil, 1 808 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Une arthrite ou une paralysie des membres postérieurs leur est induite, pour étudier le rôle des neurones de la douleur dans la polyarthrite rhumatoïde et la sclérose en plaques. Les pattes, la moelle épinière et les ganglions rachidiens sont prélevés après la mise à mort. Le porteur écrit que les expériences sont susceptibles de déclencher des douleurs et qu'aucun analgésique ne peut être administré sans compromettre les résultats, puisque le projet porte précisément sur les neurones de la perception de la douleur.
Objectifs
De nombreuses études suggèrent que les neurones impliqués dans la perception de la douleur jouent un rôle important dans le développement des maladies inflammatoires. Notre projet a pour objectif de déterminer le rôle de ces neurones sur l’évolution de deux maladies inflammatoires : la polyarthrite rhumatoïde, causant une inflammation des articulations et la sclérose en plaque, causant une inflammation de la moelle épinière. Un objectif secondaire de ce projet sera également d’étudier le potentiel thérapeutique d’une molécule aux propriétés anti-inflammatoires.
Bénéfices attendus
A ce jour, peu d’études décrivent comment les neurones impliqués dans la perception de la douleur influencent l’apparition et l’évolution des maladies inflammatoires. Notre projet permettra donc à la fois de mieux comprendre comment ces neurones influencent ces maladies inflammatoires et permettra également d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques dans ces maladies chroniques, très invalidantes et nécessitantes de nouvelles thérapies.
Procédures
Les injections intra-veineuses retro-orbitales et sous-cutanées seront réalisées sous anesthésie légère au vétisoflurane gazeux et n'excèderont pas 10 secondes. Les injections intra-péritonéales seront réalisées sur animaux vigiles par du personnel expérimenté et n'excèderont pas 5 secondes. Les souris de la procédure 1 subiront 2 injections intra-péritonéales. Les souris de la procédure 2 subiront 2 injections intra-péritonéales et 3 injections intra-veineuses retro-orbitales. Les souris de la procédure 3 subiront 2 injections intra-péritonéales et 3 injections sous-cutanées. Les souris de la procédure 4 subiront 2 injections intra-péritonéales, 3 injections sous-cutanées et 3 injections intra-veineuses retro-orbitales. Les souris de la procédure 5 subiront de 2 à 21 injections intra-péritonéales (sur une période de 4 à 21 jours). Les souris de la procédure 6 subiront 21 injections intra-péritonéales (sur une période de 21 jours) et 3 injections intra-veineuses retro-orbitales. Les souris de la procédure 7 subiront 1 injection sous-cutanée et 2 injections intra-péritonéales. Les souris de la procédure 8 subiront 1 injection sous-cutanée et de 14 à 21 injections intra-péritonéales (sur une période de 14 à 21 jours).
Impact sur les animaux
Nos expériences sont susceptibles de déclencher des douleurs chez les animaux. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d’explorer l’effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne peut être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Notre modèle de sclérose en plaque induit une paralysie des membres inférieurs entrainant une difficulté à accéder aux croquettes. Une nourriture gélifiée sera ajoutée systématiquement lors pour prévenir la dénutrition des souris.
Devenir
Mise à mort des animaux à la fin des procédures pour prélèver différents organes (pattes, moelle épinière, ganglions rachidiens) afin d'analyser leur composition immunitaire, le score histologique afin de comprendre les mécanismes impliqués de ces pathologies.
Remplacement
Nous proposons que les neurones responsables du ressenti de la douleur joue un rôle dans le développement des maladies inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïde et sclérose en plaque. Seuls les modèles animaux mimant la complexité du système nerveux périphérique ainsi que de la réponse inflammatoire permettront de vérifier cette hypothèse. Ces interactions ne peuvent à ce jour pas être modélisées ni in vitro ni in silico. Cependant, pour la recherche du mécanisme de l’interaction neurone/cellule immunitaire nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques de remplacement.
Réduction
Le plan de nos expériences sera construit de sorte à limiter le nombre de souris. Le modèle d’arthrite a été choisi et optimisé afin d’obtenir une incidence proche de 100% et une variabilité minimale, permettant ainsi de réduire au minimum le nombre de souris nécessaire. Le modèle de sclérose en plaque est quant à lui le seul modèle murin mimant la pathologie humaine. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisé nous avons modélisé les tests statistiques en amont de nos expériences pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant pour répondre à chacune de nos hypothèses de travail.
Raffinement
Stratégie de réduction du stress : Pour réduire l’angoisse des animaux, un temps d’acclimatation d’au moins une semaine sera respecté avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons de souris en dôme de cellulose et fournies pour l'enrichissement environnemental. Les souris sont nourries et boivent ad libitum, et sont libres de leur déplacement. Stratégie de réduction du la souffrance : Une surveillance quotidienne est réalisée par des spécialistes animaliers permettant de subvenir aux besoins nécessaires au bien-être des animaux. Un soin particulier sera apporté pour éviter la souffrance des animaux par la surveillance de signes extérieurs de souffrance. L’atteinte d’un point limite entrainera la décision d’euthanasie de l’animal concerné. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage des animaux souffrant de sclérose en plaque pour assurer une alimentation suffisante. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d’explorer l’effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne pourra être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Tous les monitorings (mesure de du diamètre des articulation à l’aide d’un calliper et mesure en Bio-imaging) seront réalisés sous anesthésie légère au vetisoflurane gazeux (4% pour l’induction et 2,5% pour la maintenance et 1,25 L/min air-vetisoflurane). Les injections intra-veineuses retro-orbitales et sous-cutanées seront réalisées sous anesthésie légère au vetisoflurane gazeux (4% pour l’induction et 2,5% pour la maintenance et 1,25 L/min air-vetisoflurane). Les injections intra-péritonéales seront réalisées sur animaux vigiles par du personnel expérimenté.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle idéal pour notre étude dû au haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, l’état des connaissances actuelles, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de reproduction court. En particulier, la génération de souris génétiquement modifiées bien maitrisée dans notre laboratoire dans lesquelles les neurones sujets de notre étude peuvent être déplétés font de la souris un modèle non remplaçable. Des souris d’âge minimum de 6 semaines seront utilisées afin d’avoir un système immunitaire et sensitif mature. Pour les expériences utilisant une déplétion pharmacoloqique de ces neurones, nous utiliserons des souris âgées de 3-4 semaines. En effet, l’injection doit être effectuée le plus précocement possible lors du développement du système nerveux afin d’obtenir une déplétion optimale. La sclérose en plaque et l’arthrite seront ensuite induites à partir de 6 et 8 semaines, respectivement.
Evaluation du risque de saignement de Fabs antiplaquettaires dans des modèles de saignements intracérébraux et de leur potentiel anti-thrombotique dans un modèle de purpura thrombotique thrombocytopénique (EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris utilisées portent la forme humaine du récepteur plaquettaire visé par les deux agents testés, obtenue par mutation. 490 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 340 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie de 45 minutes, cinq à dix injections, quatre prélèvements de sang sur un mois et une IRM de vingt minutes, avec des saignements attendus au site d'incision et, au réveil, des signes de douleur et une atteinte du comportement, de la motricité et de l'alimentation. Les cerveaux sont prélevés après mise à mort pour mesurer le saignement cérébral, et le porteur indique que le modèle de purpura impose aussi de tuer les souris pour prélever une grande quantité de sang.
Objectifs
Les plaquettes sanguines ont un rôle primordial dans l’arrêt des saignements. Elles sont aussi impliquées dans la thrombose, c’est-à-dire la formation d’un caillot, qui se développent dans une artère malade. La paroi de l’artère malade induit le recrutement de plaquettes et la formation du caillot, appelé thrombus. Ce phénomène peut aboutir à un accident vasculaire cérébral (AVC). Nous avons généré deux agents antiplaquettaires. Ils ont montré qu’ils empêchaient la formation de caillot dans un modèle in vitro. De plus, des modèles de saignement ont montré qu’ils augmentaient moins le saignement que les antiplaquettaires actuellement utilisés en clinique. Ces agents pourraient être utilisés dans le traitement des AVC. Les traitements antiplaquettaires actuels sont peu utilisés car ils présentent un risque de saignement trop important qui pourrait être fatal pour le patient. Les options thérapeutiques sont donc limitées. Les agents pourraient présenter moins de risque de saignement et donc être utilisés dans cette pathologie. Les agents pourraient également être utilisés dans le traitement du Purpura Thrombotique Thrombocytopénique (PTT). Les patients présentant cette pathologie ont des tout petits caillots dans les vaisseaux sanguins ainsi qu’une diminution des plaquettes due à leur consommation des plaquettes lors de la formation de ces caillots, conduisant à des saignements. Nos agents pourraient réduire les petits caillots sans augmenter les saignements chez les patients PTT. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer le risque de saignement des agents dans deux modèles de saignements cérébraux et leur potentiel anti-thrombotique dans un modèle de PTT. Les agents seront comparés à des traitements déjà utilisés en clinique. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet portent sur 2 aspects : - AVC : les agents pourraient présenter un risque de saignement plus faible que les traitements antiplaquettaires classiques et donc représenter un nouveau traitement pour les patients présentant un AVC. - PTT : les agents pourraient réduire la formation de petits caillots chez les patients PTT sans augmenter le saignement, ce qui représenterait un nouveau traitement pour les patients PTT. Ce projet pourrait permettre à long terme de mieux traiter les patients présentant un AVC ou un PTT.
Procédures
Dans les modèles de saignements cérébraux, les animaux seront soumis à une chirurgie (45 min, EU1), à des injections (5 à 10, EU1), à des prélèvements de sang (4 sur 1 mois, EU1) et à un IRM (20 min, EU2). Dans le modèle PTT, les souris seront soumises à des injections (4, EU1) et à des prélèvements de sang (2, EU2).
Impact sur les animaux
Une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur la respiration. Concernant les injections, on peut s’attendre à une douleur localisée. Le transport et les anesthésies pourront causer du stress. Le prélèvement de sang peut entrainer un saignement localisé de courte durée. On pourra observer des saignements au site d’incision lors de la chirurgie et, au réveil, on s'attend à un impact sur le comportement, l'apparence physique, la nutrition et la motricité ainsi qu’à des signes de douleur notamment au site chirurgical. Dans le modèle antigène – anticorps, on s’attend à des saignements en cas de blessure, à un impact sur le comportement et sur l’apparence physique.
Devenir
A l’issue de la procédure de saignement cérébraux et d’AVC, les animaux anesthésiés sont mis à mort afin de prélever les cerveaux pour quantifier le saignement cérébral. Dans la procédure de PTT, une grande quantité de sang est prélevée pour évaluer l’impact de nos agents sur le PTT, ce qui nécessite la mise à mort de l’animal.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d’agents dans des modèles de saignements cérébraux et de PTT. Dans les deux cas, le processus étudié est complexe et relève du fonctionnement de l’organisme complet (vaisseaux, pression artérielle, circulation du sang…). Il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par de l’in vitro du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus. Cependant, l’effet anti-thrombotique de nos agents a déjà été confirmé in vitro dans un modèle de perfusion de sang utilisant du sang humain de donneur sain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 20 à 45 souris/groupe pour la mise au point des modèles et à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats lors des expérimentations.
Raffinement
Les animaux disposent de 14 jours d’acclimatation entre leur arrivée à l’animalerie et leur utilisation en procédure. Une habituation à la contention d’une durée de 5 jours est prévue. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Le changement d’hébergement en fonction des groupes n’est réalisé que si nécessaire. Aucun regroupement n’est réalisé afin d’éviter le risque de conflits, nous séparerons seulement les souris qui ne subiront pas l’expérimentation des souris qui la subiront. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie et analgésie de l’animal avant et pendant chaque opération. • Par utilisation de gel ophtalmique pour protéger les yeux de l’animal endormi • Par l’application d’une goutte d’anesthésique local sur l’œil après les injections au niveau de l’oeil • Par injection de sérum physiologique avant les procédures chirurgicales afin d’assurer l’hydratation de l’animal. • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont maitrisés et caractérisés. Les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant la forme humaine du récepteur plaquettaire ciblé, permettant d’étudier l’effet des agents sur les saignements cérébraux et dans le traitement du PTT. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris adultes et ne présentant pas encore de vieillissement.
Rôle des peptides antimicrobiens dans un modèle souris de neuroinflammation
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une paralysie progressive des membres postérieurs qui culmine quinze jours après l'induction de la maladie, diminue en partie puis devient chronique : 1 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 260 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par injection, pour étudier le rôle des peptides antimicrobiens dans la sclérose en plaques. Les procédures infligées tiennent en trois lignes, une biopsie de la pointe de la queue et trois injections, et le porteur fixe à quarante le nombre minimal d'animaux par groupe comparé. Il justifie le choix de la souris par ses similarités génétiques et physiologiques avec l'être humain et par la facilité avec laquelle son génome se manipule.
Objectifs
L'organisation mondiale de la santé considère aujourd’hui les maladies autoimmunes comme une priorité sanitaire. Parmi elles la sclérose en plaques, dont l'incidence a fortement augmenté durant ces dernières années. Malgré les différentes interventions thérapeutiques existantes, il n'existe pas de traitement définitif de la maladie. Il est donc nécessaire d'améliorer notre connaissance des mécanismes physiopathologiques à l'origine de la maladie. Dans la littérature dans le domaine de l'autoimmunité, le rôle des peptides antimicrobiens a récemment été décrit. Notre projet a pour but de mieux comprendre le rôle des peptides antimicrobiens dans le développement de la sclérose en plaques.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de comprendre le rôle des peptides antimicrobiens en condition neuroinflammatoire (sclérose en plaque). Ce projet pourrait ainsi mettre à jour une nouvelle cible thérapeutique pour les maladies neuroinflammatoires.
Procédures
- Biopsie extrême pointe de la queue : douleur de quelques secondes, 1 fois par animal; -Injections intrapéritonéales: douleur de quelques secondes, 2 fois par animal; -injection sous-cutané: douleur de quelques secondes, 1 fois par animal.
Impact sur les animaux
-induction d'encéphalomyélite autoimmune expérimentale est caractérisée par une paralysie progressive des membres inférieurs qui culmine 15 jours après induction de la maladie et diminue partiellement pour ensuite devenir chronique.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour collecte des tissus post-mortem.
Remplacement
Pour évaluer le développement de la neuroinflammation avec une physiopathologie complexe, nous devons utiliser des modèles in vivo. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques.
Réduction
L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Pour la robustesse de l’analyse statistique des expériences, chaque groupe comparé deux à deux doit comporter un minimum de 40 animaux par expérence pour effectuer un test statistique valide. Les souris mâles et femelles seront utilisées.
Raffinement
Selon le plan d’action défini, par les expérimentateurs : Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique. Concernant spécifiquement les souris atteintes d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale: nourriture humide (gel nutritif) en fond de cage. Utilisation d'aiguilles adaptées pour les injections. Pesées tous les deux deux jours.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Les souris seront utilisées à un age minimum de 8 semaines.
Développement et Validation de Biomarqueurs pour évaluer le remodelage vasculaire pulmonaire par Imagerie TEP.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Injectés d'une molécule qui provoque une hypertension artérielle pulmonaire ou une maladie veino-occlusive, 372 rats développent tous la maladie, avec gêne respiratoire, toux, œdème pulmonaire, perte d'appétit et baisse de mobilité. 288 d'entre eux sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les 84 autres dans des procédures de souffrance modérée, et tous sont tués pour que leurs organes soient analysés. Chacun passe jusqu'à trois séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie gazeuse, avec pose d'un cathéter fémoral et trente prélèvements artériels, pour mettre au point un traceur capable de distinguer les deux maladies à l'imagerie. Le porteur annonce des points limites destinés à arrêter la souffrance, sans indiquer lesquels.
Objectifs
Le projet vise à améliorer le diagnostic et le traitement de deux maladies pulmonaires rares et graves : l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) et la maladie veino-occlusive pulmonaire (MVOP). L'HTAP est une condition où la pression dans les artères des poumons augmente, jusqu’à causer éventuellement une insuffisance cardiaque. La MVOP est souvent confondue avec l'HTAP mais implique des changements dans les veines pulmonaires et une augmentation du nombre de petits vaisseaux sanguins, ce qui réduit l'oxygène dans le sang. Ces maladies sont difficiles à diagnostiquer correctement et à traiter efficacement. Notamment, l’établissement du bon diagnostic est d’autant plus crucial que l’état de santé d’une personne atteinte de MVOP peut s’aggraver si elle reçoit un traitement contre l’HTAP. Cela représente un défi médical majeur. Le projet se concentre sur deux objectifs principaux. Premièrement, il vise à développer un traceur pour l'imagerie médicale qui permettra de visualiser spécifiquement les changements dans les artères pulmonaires, et de différencier entre les deux maladies. Deuxièmement, le projet vise à comprendre comment ces maladies se développent. Pour atteindre ces objectifs, nous avons besoin de recourir à des modèles animaux. Deux modèles spécifiques seront utilisés chez les rats : l’injection de monocrotaline (MCT), une molécule qui induit une HTAP, et l’injection de mitomycine-C (MMC), un composé qui provoque une HTAP similaire à la MVOP. Ce projet pourrait améliorer la façon dont ces maladies rares sont détectées et traitées, offrant de nouvelles perspectives pour les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des bénéfices significatifs à court et à long termes, améliorant à la fois les connaissances scientifiques et la prise en charge des patients atteints d'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) et de maladie veino-occlusive pulmonaire (MVOP). Bénéfices à court terme : Le projet identifiera des signatures moléculaires spécifiques des différents types de modifications vasculaires observés dans l’HTAP et la MVOP. Cela aidera à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de ces maladies. Bénéfices à long terme : Les résultats du projet permettront d'identifier les patients susceptibles de bénéficier des thérapies visant à limiter les modifications vasculaires dès les stades précoces de la maladie. Cela est crucial pour offrir des traitements personnalisés et améliorer les résultats thérapeutiques. De plus, le radiotraceur développé pourrait aider à distinguer la MVOP de l’HTAP classique, une distinction essentielle puisque les patients atteints de MVOP, qui ont un pronostic plus sévère, ne peuvent pas bénéficier des thérapies vasodilatatrices standard en raison du risque élevé d’œdème pulmonaire. Un diagnostic précis pourrait donc améliorer significativement la gestion de ces patients, souvent en attente urgente de transplantation pulmonaire. Ces nouvelles connaissances pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques et à des innovations dans le traitement de l’HTAP et de la MVOP.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Administration d’un composé (10 secondes ; 1 fois par semaine pendant maximum 2 semaines) induisant une hypertension artérielle pulmonaire ou la maladie veino-occlusive pulmonaire selon le groupe . • Réalisation de 3 sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum et espacé de 7 jours) • Injection d’un radiotraceur (1 minute) • Pose d’un cathéter veineux (30 secondes) et fémoral (5 minutes) • Réalisation de prélèvements artériels sous anesthésie (30 prélèvements qui durent 2-3 secondes espacés sur 120 minutes au maximum)
Impact sur les animaux
L'exposition des animaux à la monocrotaline (MCT) ou à la mitomycine-C (MMC) entraînera le développement d'une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) chez tous les sujets, qui entrainera plusieurs effets indésirables, notamment : • Gêne respiratoire (dyspnée), toux, œdème pulmonaire • Diminution de l’activité globale et fatigue • Perte de poids due à une perte d’appétit • Modifications comportementales, telles que l’inactivité excessive ou une réduction de la mobilité • Risques de dysfonctionnement rénal (particulièrement avec la MMC) Les rats anesthésiés pour les sessions d'imagerie peuvent se sentir désorientés et anxieux à leur réveil. Pour minimiser ce stress, ils seront réveillés dans leur cage habituelle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
Pour comprendre pleinement les mécanismes de l'HTAP et les réponses aux traitements potentiels, il est essentiel de pouvoir observer les effets des interventions dans un organisme entier, incluant la distribution, le métabolisme, et l'élimination des composés, ainsi que les interactions avec divers systèmes biologiques. Cela est particulièrement crucial pour les études sur la fonction cardiovasculaire et le remodelage vasculaire, où les interactions entre les différents organes et systèmes doivent être évaluées dans leur totalité. Bien que des progrès significatifs aient été réalisés dans le développement de modèles non animaux, à l’heure actuelle, seul le recours à des modèles animaux permet d’y parvenir en obtenant des données complètes et fiables. Ces modèles sont pour l’instant les seuls à reproduire les conditions pathologiques et les réponses physiologiques de manière holistique, ce qui est indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. Il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico susceptible de constituer une alternative pour modéliser la complexité des tissus et des interactions biologiques dans un contexte physiologique et pathologique complet.
Réduction
Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre d'animaux à utiliser par une approche intégrée visant à utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables et reproductibles. Voici les techniques que nous mettons en œuvre pour réduire le nombre d'animaux nécessaires : - Imagerie non invasive répétée : Nous utiliserons une technique appelée tomographie par émission de positons (TEP) pour étudier les changements dans le système cardiovasculaire. Cette méthode, qui ne nécessite pas d'intervention chirurgicale, permet de suivre les mêmes animaux à plusieurs étapes de l’étude. Cela signifie que nous avons besoin de moins d’animaux, car nous pouvons observer les évolutions chez chaque individu au fil du temps. - Analyse statistique : Nous utilisons des méthodes statistiques qui nous permettent d’optimiser les comparaisons entre les groupes d’animaux. En réduisant les variations internes à chaque groupe, nous pouvons détecter des différences importantes avec un plus petit nombre d’animaux. - Nous avons également utilisé des logiciels spécialisés pour optimiser la taille des échantillons.
Raffinement
Deux semaines d’acclimatation sont prévues avant l’entrée des animaux en protocole. Une surveillance quotidienne des rongeurs sera pratiquée par les zootechniciens et les expérimentateurs. De l'enrichissement sera ajouté dans les cages des animaux. Tous les examens d’imagerie sont réalisés sous anesthésie générale par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal. Un suivi de l’état des animaux est pratiqué de façon hebdomadaire : poids, qualité de la fourrure des animaux et posture de l’animal dans sa cage. Des points limites sont établis afin de minimiser et d’arrêter, la souffrance chez les animaux.
Choix des espèces
L'utilisation du rat comme modèle animal pour ce projet de recherche sur l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est justifiée pour plusieurs raisons : - Les modèles induits chez le rat sont couramment utilisés pour modéliser l'HTAP, car ils reproduisent fidèlement les caractéristiques pathophysiologiques de la maladie humaine, notamment le remodelage vasculaire et les réponses inflammatoires, ce qui n’est pas le cas pour les souris. - De plus, cette espèce, de par sa taille, présente l’avantage d’être particulièrement adaptée aux études d’imagerie par TEP (tomographie par émission de positons). Les rats utilisés seront aux stades adultes afin d’avoir des systèmes cardiovasculaires et immunitaires pleinement développés, ce qui permet une étude plus précise et stable des mécanismes de l'HTAP, une maladie qui survient principalement chez l’adulte.