Procédures sévères
Impact du rythme circadien et des régimes alimentaires sur la susceptibilité à l’infection bactérienne
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une perte de poids de plus de 20 % ou un score de souffrance cumulé de 5 déclenche la mise à mort immédiate. 2 880 souris vont être utilisées, 1 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 440 un niveau sévère, toutes tuées pour prélèvements. Elles reçoivent des régimes riches en gras ou en sucre pendant huit semaines, subissent des gavages, des prélèvements fécaux hebdomadaires, des prises de sang répétées jusqu'à huit fois en deux heures, puis une infection par Salmonella Typhimurium. Le porteur précise qu'aucun analgésique ni antalgique ne pourra leur être administré, les anti-inflammatoires et les opiacés modifiant la réponse infectieuse qu'il cherche à mesurer.
Objectifs
Le rythme circadien, influencé par la photosensibilité et le comportement alimentaire, joue un rôle régulateur dans divers processus physiologiques, notamment au niveau intestinal. La barrière intestinale peut être fortement perturbée les régimes riches en graisses ou en sucres qui sont connus pour perturber l'horloge biologique. Il s'en suit une réaction en chaine qui conditionne la susceptibilité post-prandiale aux maladies infectieuses comme cela est observée chez les patients atteints d'obésité. En particulier, des études viennent de mettre en évidence que ces alimentations (dé)favorisent la colonisation par certaines bactéries commensales ayant la capacité de moduler la surveillance immunitaire et la résistance à la colonisation par des pathogènes. Dans ce contexte, un intérêt tout particulier de notre étude réside résolument dans notre capacité à documenter dans le détail la réponse anti-infectieuse post-prandiale en réponse à ces alimentations riches en graisses ou en sucres qui favorisent l'obésité. Nos résultats pourraient ainsi ouvrir aujourd'hui des pistes d'intérêt pour la recherche sur les graves complications du surpoids et de l'obésité.
Bénéfices attendus
L’utilisation d'agent infectieux permettra d’élucider les mécanismes favorisant ou limitant le pronostique de l’infection à Salmonella Typhimurium, en réponse à un régime hypercalorique. Cela permettra à plus long terme de proposer de meilleures approches thérapeutiques aux patients atteints de plusieurs comorbidité comme l’obésité.
Procédures
Prélèvements fécaux : sur animaux vigiles, ramassage dans la cage d’une durée 1 à 2 min par souris, de manière hebdomadaire. Prélèvements sanguins pour test glycémies et insulinémies : sur animal vigile, prise de sang d’une durée de 10 à 30 secondes, 8 mesures par test étalé sur 2h, 2 fois au cours de la vie de l’animal (1 de chaque). Prélèvements sanguins pour suivi métabolique : sur animal anesthésié, prise de sang unique d’une durée de 30 secondes, de manière hebdomadaire, pendant 8 semaines. Procédure de gavage pour colonisation microbienne et test de perméabilité intestinale : sur animaux vigiles maintenu par contention afin de ne pas les blesser et ajuster le geste de gavage à leur déglutition/respiration et à tout signe potentiel de douleur. Le gavage dure 4-5 secondes environ. 1 fois durant la vie de l'animal, 2 fois si greffe fécale en plus.
Impact sur les animaux
A) Les régimes riches en gras et/ou sucres sont susceptibles d’entraîner une prise de poids, affectant la mobilité. Mesures envisagées : Un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (moustaches, museau, yeux, pelage), une pesée des animaux hebdomadaires et avec un suivi de la consommation de nourriture et d'eau et de signe clinique mesurable (respiration, amorphe, diarrhée) seront effectués. En cas d’accès réduit à l’eau et à la nourriture, des biberons d’eau et des croquettes seront mis à dispositions à hauteur de souris. Il est à noter qu’aucune obésité morbide n’est attendu dans ce protocole. B) Les injections et prélèvements sanguins peuvent être douloureux. Mesures envisagées : Des seringues d’injection avec des gauges les plus élevés seront utilisées pour limiter la douleur. Les prélèvements seront espacés d’une semaine pour cicatrisation. Les cicatrices seront désinfectées. C) Les manipulations répétées peuvent induire du stress. Mesures envisagées : Les animaux seront manipulés par les mêmes expérimentateurs (formés et 2 max) quelques jours avant l’expérimentation pour adaptation et à heure régulière tout au long de l’expérience. Un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (moustaches, museau, yeux, pelage) et de signe clinique mesurable (respiration, amorphe, diarrhée) seront également effectués. D) Les effets de l’infection à Salmonella Typhimurium, comme la perte de poids et les modifications des selles et un risque de mortalité, peuvent être observés. Mesures envisagées : Les animaux seront observés quotidiennement par les expérimentateurs. Afin de limiter la souffrance des animaux, une grille de notation avec un score a été établie. Un score cumulé de 5 ou plus ou une perte de poids de plus de 20% entraînera l’euthanasie immédiate des animaux.
Devenir
Euthanasie des animaux nécessaires aux prélèvements et aux analyses
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour étudier le rythme circadien et son impact sur l’homéostasie des tissus et la flore intestinale. En effet, les relations entre l’apport alimentaire, le microbiote, la réponse immunitaire anti-infectieuse sont autant de facteurs s’adaptant aux différents moments de la journée, ne peuvent pas être reproduites dans d’autres systèmes tels que la culture in vitro ou ex vivo de cellules ou même d’organoïdes.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux avec une puissance statistique suffisante, des lots de 8 souris seront utilisés avec une charge infectieuse préalablement établie. Ce nombre est justifié sur la base d’expériences préliminaires montrant la variabilité inter-individuelle qui influence notamment la puissance des tests statistiques de comparaisons inter-groupes. Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront surveillés quotidiennement par des personnes formées avec un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe), de la nourriture et d'eau et de signe clinique mesurable (respiration...) sera réalisé. En parallèle, l’apparence physique externe de l’animal sera observée afin de déceler des signes de diarrhée, ainsi qu'un éventuel changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe.
Raffinement
Les souris seront manipulées par des personnes formées (au maximum deux), notamment quelques jours précédant l’expérimentation, afin qu’elles s’habituent à l’expérimentateur et ainsi de réduire le stress. Les manipulations se feront à la même heure chaque jour, ceci afin d’établir une habitude pour les animaux. La manipulation des animaux se fera dans une salle de manipulation séparée de la salle d’hébergement. Les animaux seront hébergés au sein de la plateforme d’expérimentation et de haute technologie animale ou par défaut dans un des isolateurs de l’Institut Pasteur de Lille (eau et aliment standard ad libitum (ou restreint le jour ou la nuit selon les protocoles), cycle jour/nuit 12h/12h, 23 °C). Les animaux sont individualisés avec une boucle d’oreille par le fournisseur, et maintenus dans des cages de 4 à 5 individus, en portoirs ventilés (Etiquetage informatisé des cages individuelles). Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront observés quotidiennement à la recherche de signes classiques de souffrance par des personnes formées, avec un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (moustaches, museau, yeux, pelage seront surveillés), d’un changement de comportement (perte de réponse comportementale au stimulus externe), une pesée des animaux et avec un suivi (en début et fin de journée) de la consommation de nourriture et d'eau et de signe clinique mesurable (respiration, amorphe, diarrhée, automutilation). Si une détérioration de l’état d’un animal est observée, une grille de notation sera réalisée. Si une perte de poids supérieure à 20 % survenait, les souris en souffrance seraient immédiatement mises à mort. Il est à noter qu’il ne pourra pas être utilisé d’analgésique ou d'antalgique, car ces traitements interfèrent avec la réponse inflammatoire intestinale et anti-infectieuse. En effet, les molécules anti-inflammatoires non stéroïdiens et les opiacés modifient la susceptibilité aux infections.
Choix des espèces
L'infection par les pathogènes murins que nous utilisons est permise en ayant recours au modèle animal ‘souris’ sous fond C57BL6/J. Nous utilisons cette espèce ainsi que ce fond génétique car les modèles KO que nous possédons sont sous fond C57BL6J. Les procédures commenceront entre 6 et 12 semaines d'âge des souris pour permettre à la composition du microbiote intestinal de se stabiliser et au système immunitaire d’être à maturité.. Les protocoles d'infection peuvent durer jusqu'à 3 semaines. L’induction de l’obésité par le régime durent jusqu’à 8 semaines.
Nouvelle approche thérapeutique par des nanoparticules siRNA-squaléne pour le traitement des neuropathies diabétiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Sept tests locomoteurs avant traitement, sept après, cinq injections intraveineuses sous anesthésie brève : 1 080 souris rendues diabétiques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées ensuite pour des analyses biochimiques et histologiques. Le traitement testé, des nanoparticules d'ARN interférents, cible les neuropathies diabétiques, complication invalidante qui n'a aujourd'hui aucun traitement efficace. Les souris du groupe diabète de type 2 sont génétiquement modifiées pour développer la maladie et le porteur les décrit comme sévèrement atteintes à 22 semaines, avec des troubles locomoteurs. Celles du groupe type 1 reçoivent une injection qui déclenche la maladie en sept à dix jours. Chaque test locomoteur est pourtant présenté comme n'engendrant aucun désagrément, alors que le projet entier relève d'un niveau de souffrance sévère.
Objectifs
Les neuropathies périphériques diabétiques sont une complication grave et invalidante du diabète, causant des dommages aux nerfs, ralentissant la transmission des signaux nerveux et provoquant une douleur excessive. Les patients risquent davantage d'avoir des ulcères du pied et des amputations. Il n'existe actuellement aucun traitement efficace. Cette étude cherche à développer une nouvelle thérapie qui réduit les niveaux d’expression de certaines protéines et molécules nuisibles en utilisant des petites molécules d'ARN appelées ARN interférents (siRNA). Les effets de cette réduction sur le comportement, les tissus et les cellules seront analysés chez des modèles murins diabétiques, avec l'espoir de trouver un nouveau traitement pour améliorer la vie des patients atteints de neuropathies diabétiques.
Bénéfices attendus
Par ce projet, nous espérons faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des neuropathies diabétiques dans le cadre d’un diabète de type 1 ou 2.
Procédures
Les injections seront administrées par voie intravéneuse en cinq fois : 2 fois par semaine pendant 2 semaines, et une dernière fois la dernière semaine. Chaque injection dure quelques secondes et sera réalisée sous anesthésie brève. Pour tester l'efficacité du traitement, les animaux seront soumis avant tout traitement et à la fin du traitement à sept tests locomoteurs. Chaque test dure moins d'une minute et n’engendre aucun désagrément pour l’animal. Les souris subiront 1 test locomoteur par jour. La vitesse de conduction neuronale sera réalisée avant et après traitement sous anesthésie gazeuse. L'enregistrement dure moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les souris diabétiques auront tendance à uriner beaucoup plus que leurs congénères. La cage sera beaucoup plus vite souillée et nécessitera un changement plus fréquent. Les souris atteintes de diabète de type 2 sont génétiquement modifiées pour être atteintes par la pathologie. Leurs premiers symptômes se déclarent à partir de 8 semaines, et sont sévèrement atteintes à 22 semaines ; engendrant des troubles locomoteurs. Les souris atteintes de diabète de type 1 reçoivent des injections intraveineuses d’une substance qui induit la pathologie. Leurs premiers symptômes se déclarent à partir de 7 à 10 jours après l’injection de la substance induisant le diabète. Ces souris développeront également une neuropathie progressive menant à des troubles locomoteurs. En ce qui concerne notre traitement, et en se basant sur nos expériences précédentes aucun effet indésirable n'a été souligné sur les animaux.
Devenir
Toutes les souris (1080) seront mises à mort pour les études biochimiques, histologiques, et histochimiques.
Remplacement
Les neuropathies diabétiques induisent un processus de démyélinisation complexe qui nécessite l’intervention de multiples acteurs cellulaires. Il en est de même pour le processus de myélinisation qui se mettra en place si notre traitement fonctionne comme attendu. Les procédures que nous souhaitons mener ne peuvent donc être modélisées in vitro.
Réduction
Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre la puissance statistique suffisante pour l'analyse des altérations comportementales induites par la perturbation puis la réparation du système sensori-moteur. Nous soumettrons les données à un test statistique et comparerons les groupes d'animaux entre-eux.
Raffinement
Un suivi particulier du bien-être des animaux présentant un phénotype dommageable sera mis en place et une grille spécifique de prise en charge de la douleur sera utilisée pour définir des points limites adaptés au phénotype observé. Une prise en charge spécifique de la douleur due à la mesure de la vitesse de conduction nerveuse sera mise en place, basée sur l'injection en sous-cutanée puis l'inhalation de produits anesthésiques.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères au système métabolique et physiologique suffisamment proche de celui de l’Homme pour servir à la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques visant la gaine de myéline périphérique. Les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’efficacité du traitement sont très bien adaptées chez la souris. L’analyse comportementale ainsi que les techniques biochimiques et histologiques envisagées pour étudier le statut myélinique nous permettront d’apporter des réponses claires quant à l’effet du traitement aux siRNA contre les DPN (diabetic peripheral neuropathy en anglais ou neuropathie diabétique périphérique). De plus, l’étude du traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth par l’injection de NPs siRNA-squalène avait été menée sur des souris. Nous pourrons comparer nos résultats à ceux de cette étude pour mesurer l’efficacité de notre traitement. Pour le traitement du début de la neuropathie induite par le diabète de type 2 (DT2), les animaux de la seront utilisés à partir de 10 semaines soit 2 semaines après l’apparition du DT2. Ils devraient présenter un début de neuropathie. Pour le traitement du début de la neuropathie avancée induite par le DT2, les animaux seront utilisés à partir de 22 semaines car il est connu que la neuropathie sera à un stade avancé. Enfin, pour le traitement préventif de la neuropathie induite par le DT2, les animaux seront utilisés dès l’âge de 8 semaines, un âge où toutes les souris présenteront un DT2 mais pour lequel il n’y aura pas encore d’atteinte des nerfs périphériques. Pour le traitement des différents stades de la neuropathie (début, avancé, et préventif) induite par le diabète de type 1 (DT1), les animaux seront utilisés à l’âge de 8 semaines car il est connu que le processus de myélinisation des nerfs est parfaitement achevé à cet âge.
Epreuve Parvovirus canin de type 2 par voie oro-nasale chez le chien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Des chiots de 4 à 7 semaines reçoivent le parvovirus canin par voie oro-nasale sous anesthésie légère, puis un écouvillon rectal chaque jour pendant quatorze jours. 370 chiens vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va du léger au sévère, la forme sévère touchant surtout les témoins non vaccinés, laissés sans protection pour que la maladie s'exprime. Le porteur présente ces épreuves comme un moyen de réduire l'impact des maladies infectieuses chez les chiens, alors qu'elles consistent à provoquer chez eux diarrhées et vomissements pour valider dix à quinze vaccins. Tous sont tués en fin d'étude, la raison invoquée tenant au statut sanitaire de l'établissement et à la résistance du parvovirus dans le milieu extérieur.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité d’un vaccin destiné au chien contre la parvovirose. Pour qu’un vaccin soit autorisé, il faut notamment démontrer que celui-ci apporte un effet bénéfique sur l’animal pour la pathologie considérée. Les études sont réalisées sur l’espèce cible (chien) pour s’approcher au mieux des conditions réelles d’utilisation (Pharmacopée Européenne et réglementations des pays destinataires). Pour démontrer l’efficacité d’un vaccin contre cette pathologie canine, une phase d’épreuve suit la phase d’administration du vaccin. L’épreuve correspond à l’administration d’un agent pathogène pour reproduire expérimentalement la pathologie.
Bénéfices attendus
La finalité de ces études est de permettre le développement de vaccins efficaces contre la parvovirose canine et donc de réduire l’impact des maladies infectieuses chez les chiens.
Procédures
Les nuisances prévues sur les animaux sont les suivants : - Administration du vaccin : 1 à 5 fois avec 2 à 5 semaines d’intervalle, sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 1 minute. - Administration de l’agent pathogène en oro-nasale, 1 sur tous les animaux anesthésiés, acte inférieur à 5 minutes - Prélèvements sanguins : plusieurs fois pendant l’étude sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 1 minute. - Ecouvillons rectaux : 1 par jour pendant 14 jours sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 1 minute. - Observation clinique quotidienne sur tous les animaux en vigile, 5 minutes/animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : - La contention et la répétition d’actes techniques (administrations et prélèvements) peuvent occasionner un stress et éventuellement de la douleur. - L’administration oro-nasale peut provoquer des éternuments et/ou une gêne respiratoire momentanée. - Les écouvillons rectaux peuvent provoquer une gêne pour l’animal. - Le développement de la pathologie peut donner lieu à des signes cliniques sévères (diarrhées, vomissements) notamment chez les animaux non-vaccinés = animaux témoins dans les études d’efficacité.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin d'étude du fait du statut ARG2 et du fait de la grande résistance dans le milieu extérieur du parvovirus canin.
Remplacement
Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre de candidats à tester in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible. Lorsque les modèles existent, un premier test sur des espèces alternatives (notamment des rongeurs) est réalisé afin de réduire le nombre de chiens utilisés. Le recours à l’espèce cible est à l’heure actuelle indispensable d’un point de vue réglementaire (Ph. Eur. monographie 0964 et 0795) et scientifique, les résultats obtenus in vitro et sur espèces alternatives n’étant pas complètement extrapolables.
Réduction
Pour les études réglementaires, le nombre d’animaux est fixé par les textes. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste de façon à minimiser le nombre de chiens tout en permettant d’interpréter les résultats des études. Entre 10 et 15 vaccins seront évalués pendant la durée du projet permettant de tester des antigènes, des adjuvants et des voies d'administration différentes.
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique est prévue dans le but de limiter le stress des animaux et de stabiliser leur état physiologique (sauf cas exceptionnels subordonnés au protocole expérimental). Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans le cas d’études sur jeunes animaux (moins de 7 semaines d’âge), les animaux seront hébergés avec leur mère ou une nourrice. Les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La contention et les actes techniques sont réalisés par un personnel hautement qualifié. Ils peuvent avoir recours à une anesthésie et/ou une analgésie si l’acte ou l’animal le nécessite. Pour l’administration de l’agent pathogène en oro-nasale, une anesthésie légère permettra à l’animal de garder le réflexe de déglutition. Des points limites spécifiques de la pathologie sont définis. Ces critères sont en constante évolution de manière qu’ils reflètent au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires. Le personnel est formé et compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans son état physiologique optimal. Une observation quotidienne des animaux est réalisée. Elle porte sur les points suivants : apparence physique externe, comportement spontané, comportement provoqué/réponse aux stimuli externes. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.
Choix des espèces
L’évaluation sur espèce cible (chien) est une exigence règlementaire et le modèle optimal pour réaliser les études à ce stade de connaissance. En générale la vaccination s’effectue à 7 semaines d’âge, mais des animaux de 4 semaines pourront être inclus (animaux nés sur site ou chez un fournisseur). Dans ce cas les chiots seront hébergés avec leur mère ou une nourrice. Dans les études de durée d’immunité, les chiots sont vaccinés jeunes puis observés jusqu’à l’âge adulte pour tester la durée de protection conférée par le médicament. Pour la mise au point de modèle d’épreuve, des animaux adultes (> 12 mois) peuvent également être utilisés.
Projet d’éradication des poissons du genre Ancistrus en tant qu’Espèces Exotiques Envahissantes (EEE) : test en conditions expérimentales de leur sensibilité au sel en comparaison aux espèces indigènes
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
La mise au point d'une méthode de mise à mort par choc salin conduit à exposer 183 poissons à une eau salée pendant vingt-cinq minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les ancistrus, poissons laveurs de vitres échappés de l'aquariophilie, sont capturés par pêche électrique qui les paralyse, transportés une heure trente, gardés jusqu'à trente heures sans leur alimentation naturelle, puis tués par choc osmotique et hypoxie. 45 individus d'espèces indigènes, cabots bouche-ronde et anguilles, sont soumis au même test à titre de comparaison et seront relâchés dans leur rivière d'origine si leur état clinique le permet. Le porteur compte parmi les bénéfices attendus la proposition d'une nouvelle méthode de mise à mort applicable aux poissons d'eau douce, y compris dans les programmes de pêche commerciale.
Objectifs
Les EEE sont identifiées comme une principale cause de perte de biodiversité à l’échelle Mondiale. Les milieux aquatiques d’eau douces insulaires, malgré leur relatif isolement, ne sont pas épargnés par ces introductions. De plus, dans ces territoires, les milieux aquatiques présentent des conditions hydrologiques et thermiques souvent variées du fait d’une amplitude saisonnière de pluies et d’un gradient altitudinal important. Ainsi, dans ces milieux, on observe l’acclimatation d’espèces aux préférendums très variés, depuis la truite arc-en-ciel (O. mykiss) jusqu’aux tilapias (Oreochromis sp.). Parmi les dernières en date, on note le poisson laveur de vitre (Ancistrus sp.) et la crevette red cherry (Neocaridina heteropoda). Ces espèces non natives sont issues de l’aquariophilie. Leur introduction peut être accidentelle ou malveillante. Ces espèces représentent un risque de compétition avec les espèces indigènes.
Bénéfices attendus
La réalisation d’un choc salin est une méthode de lutte contre les EEE encore non appliquée et innovante. Elle a déjà été évoquée dans le cadre de la gestion d'EEE dans des milieux d'interface, mais n’a jamais été documentée ni étudiée d’un point de vue scientifique. Les bénéfices attendus sont : - Lutte contre Ancistrus sp en tant qu’EEE (réduction voire éradication), à courte échéance ; - Connaissance de la sensibilité des espèces indigènes (amphihalines) pour réplication possible de l'action en lutte précoce sur d'autres EEE (territoires insulaires tropicaux), à courte échéance ; - Développement d’une méthode de lutte reproductible et efficace pour des EEE aquatiques sensibles, à moyenne échéance. - Proposition d’une nouvelle méthode de mise à mort applicable aux poissons d’eau douce, dans le cadre de l’Utilisation d’Animaux à des Fins Scientifiques, ou dans des programmes de pêche commerciale (moyenne à longue échéance).
Procédures
- Capture des individus : paralysie par décharge électrique lors de la pêche électrique (30 secondes) - Transport des individus en contenants fermés jusqu’au laboratoire (1h30) - Captivité dans des bacs d’eau (30h maximum) - Individus privés de l’accès à leur alimentation naturelle (30h maximum) - Exposition à une substance chimique mortelle, le NaCl (25 minutes maximum)
Impact sur les animaux
- Induction d’un choc osmotique et d’une hypoxie potentielle conduisant à la mort des animaux (25 minutes maximum)
Devenir
Tous les individus Ancistrus qui ne seraient pas morts seront euthanasiés. Les individus des espèces poissons cabot bouche ronde et poissons anguille seront maintenus en vie si leur état clinique le permet. Ils seront alors relâchés dans leur milieu naturel où ils avaient été prélevés initialement.
Remplacement
Les expérimentations portent sur l’étude d'un choc salin sur des poissons de rivière, pour évaluer le potentiel létal de ce choc. Leur remplacement remettrait en cause la possibilité de mener l'expérience, et notamment les 2 phases suivantes du projet global qui sont : la documentation de la méthode de mise à mort par choc salin pour les demandes d’autorisations en milieu naturel et la réalisation des opérations en milieu naturel.
Réduction
Les procédures ont été réfléchies dans le but de diminuer au maximum le nombre d’animaux tout en ayant des résultats exploitables. Pour la procédure 1, l’objectif est de décrire les observations cliniques et comportementales, les effets indésirables et les points limites. Nous avons choisi d’utiliser des groupes de 3 individus par lots en s’inspirant des études pilotes menées en toxicologie, puisque nous n’allons pas effectuer d’études statistiques sur ces groupes. Nous avons déterminé plusieurs lots pour chaque espèce, en fonction de leur stade de développement, pour s’assurer que chaque lot de 3 individus soit le plus homogène possible.
Raffinement
Pour la capture des individus, les équipements de pêche électrique seront calibrés pour un voltage n’engendrant pas de blessures aux animaux, et uniquement une paralysie courte de 30 secondes environ. Pour la captivité, les animaux seront hébergés dans des aquariums enrichis avec des galets provenant de leur milieu naturel, afin qu’ils puissent exprimer un comportement naturel (support et cache). La température de l’eau sera contrôlée pour être dans les gammes de confort de chaque espèce (20 à 24 °C). Chaque lot sera hébergé dans un aquarium séparé afin de limiter le nombre de poisson par aquarium et permettre l’observation individuelle. L’hébergement temporaire n’excédera pas 30 heures (avec période d’accoutumance de 24h) et sera fait dans une salle dédiée et calme, avec une alternance jour/nuit calée sur l’alternance naturelle. Pour pallier à l’accès à l’alimentation naturelle, les poissons seront nourris avec une alimentation adaptée aux espèces : salade, épinard, courgette pour les poissons ancistrus et poissons cabot bouche ronde ; des vers de terre pour les anguilles. Afin de limiter au maximum les effets indésirables liés à l’exposition toxique au sel, nous proposons une étude pilote afin de déterminer les points limites précoces. Pour cela, nous observerons sur chaque individu les paramètres comportementaux et cliniques suivants : aspect général, posture, nage, couleur, décubitus... Une fiche de suivi individuel servira de support pour l’observateur pour noter tous les signes cliniques et comportementaux. Nous pourrons alors établir une cinétique d’apparition des différents symptômes.
Choix des espèces
L’objectif de l’étude est d’étudier le choc salin comme méthode de mise à mort de poissons ancistrus dans le cadre de la lutte contre une EEE. Nous souhaitons réaliser une éradication de cette espèce, tout en préservant les espèces de poissons indigènes présentes dans les cours d’eau traités. C’est pour cela que nous réalisons des expérimentations sur des poissons cabot bouche ronde et des anguilles, qui sont les poissons présents naturellement dans ces zones. Les animaux seront utilisés à des stades de développement différents. Nous avons déterminé 3 stades différents chez les poissons ancistrus (un stade juvénile, un stade intermédiaire, un stade adulte), 2 stades chez les poissons cabot bouche ronde (un stade juvénile et un stade adulte), et un seul stade juvénile chez l’anguille. Ce choix se justifie par le fait que la résistance à la salinité risque de varier en fonction du stade de développement. Pour l’anguille, nous savons que les adultes effectuent des séjours en milieux marins (avec une salinité à 35 g/l), c’est pour cela que nous n’envisageons pas de tester un choc salin car nous savons qu’à ce stade de développement, les individus sont résistants à la salinité marine.
Etude des mécanismes responsables du syndrome cardiorénal chez des modèles rongeurs
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 500
Un rein retiré par chirurgie, un second passage sur la table dix jours plus tard, une échocardiographie sous anesthésie, vingt-quatre heures seul en cage à métabolisme, cinq mesures de pression artérielle sur cinq jours consécutifs, un électrocardiogramme, une prise de sang après un mois d'insuffisance rénale : 500 rats et 540 souris vont subir cet enchaînement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La maladie rénale ainsi provoquée entraîne perte de poids, perte d'appétit et augmentation de la diurèse, auxquelles s'ajoute un régime alimentaire spécial qui peut modifier la mobilité et le comportement. Le projet cherche des cibles thérapeutiques contre le syndrome cardiorénal, en partant de l'hypothèse que l'inflammation y joue un rôle central. Tous sont tués en fin de procédure, le porteur jugeant "obligatoires" les analyses de sang et d'organes prélevés.
Objectifs
Les comorbidités cardiovasculaires de l’insuffisance rénale chronique , ce qu’on appelle le syndrome cardiorénal, sont dramatiques et impactent la survie des patients. La prévalence de l’insuffisance rénale chronique en Europe est pres de dix pour cent. Il est important de comprendre les mécanismes sous-jacents des interactions entre rein et coeur par exemple ou rein et microbiote, mais également d’identifier des thérapeutiques permettant de limiter ces comorbidités Les données recueillies chez l’Homme et l’animal montrent que l’inflammation (infiltration de monocytes et macrophages, augmentation de l’expression de molécules pro-inflammatoires) joue un rôle critique dans le remodelage rénal et cardiaque induit par l’aldostérone. La modulation de l’inflammation dans les organes affectés (rein, cœur) peut également jouer un rôle critique dans l'instauration et/ou le maintien du remodelage rénal et cardiaque. Les anomalies du microbiote intestinal associées à l’insuffisance rénale chronique peuvent contribuer à ces altérations. Les objectifs du projet sont de comprendre les mécanismes et éventuelles nouvelles cibles thérapeutiques du syndrome cardiorenal. Notre hypothèse est que l’inflammation joue un rôle central dans le syndrome cardiorénal, soit directement au niveau de l’organe cible, soit indirectement en affectant le microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de comprendre les conditions et mécanismes par lesquels un récepteur hormonal et sa cible aval sont impliqués dans le syndrome cardiorénal présent lors d’une insuffisance rénale chronique dont la prévalence en Europe est d’environ dix pour cent. Pour cela, l’efficacité des antagonistes de ce récepteur hormonal et de sa cible aval seront étudiés ainsi que le rôle de la dysbiose induite par l’insuffisance rénale chronique dans ce processus. Le rôle des cellules intestinales (épithéliales, cellules musculaires lisses) ou inflammatoires/macrophages dans ces processus seront identifiés. Ces résultats permettront de proposer des alternatives diagnostiques et thérapeutiques aux patients souffrant de syndrome cardiorénal
Procédures
Les animaux sous soumis à diverses interventions. Pour induire une insuffisance rénale chronique, l’ablation d’un rein est réalisée par chirurgie sous anesthésie et avec une prise en charge analgésique avant/pendant et après l’opération (20 min, 2 fois à 10 jours d’intervalle). L exploration de la maladie cardiaque comporte une échocardiographie sous anesthésie gazeuse (15 min, 1 fois). Pour recueil des urines (une fois pendant 24h) un hébergement individuel temporaire est nécessaire (animal vigile). La mesure de la pression artérielle est réalisée cinq fois sur 5 jours consécutif pendant 15 min (animal vigile). Un électrocardiograme (une fois, durée 15 min) est réalisé (animal vigile). Des prélèvements sanguins sont effectués une fois après 1 mois d'insuffisance rénale chronique (1 minute) chez l’animal vigile. L’euthanasie est réalisée en fin de période expérimentale après analgésie et anesthésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables notoires seront 1) la baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie (chirurgie rénale, échocardiographie) 2) la douleur et les risques d’infection suite à l’intervention chirurgicale, 3) les conséquences de la maladie rénale chronique (perte de poids, perte d’appétit, diurèse augmentée) 4) le régime alimentaire spécial peut entrainer une perte de poids et modifier la mobilité et le comportement des animaux 5) l’hébergement individuel temporaire dans les cages à métabolisme pourra engendrer un stress 6) le stress lié à la manipulation et la contention durant la prise de pression artérielle ou l’installation des gilets pour l’électrocardiograme 7) le stress et la douleur légère de courte durée au site de prélèvement de sang avec un risque minime d'hémorragie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car des analyses biochimiques sanguines (composition, cytokine, molécules pro-inflammatoire) ainsi que des analyses sur organes prélevés sont obligatoires pour mener à bien ce projet.
Remplacement
Cette recherche est de type fondamentale. Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris et le rat afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude intégrée et multi-organes de l’activation du récepteur minéralocorticoïde et de la signalisation sous-jacente dans le syndrome cardiorénal. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.
Réduction
1040 animaux (500 rats et 540 souris) seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft et batonnet en bois. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés. Lors des anesthésies, la température interne est suivie et une attention particulière est portée pour la période de réveil pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. La douleur post-opératoire sera prise en charge par une analgésie et des croquettes hydratées seront déposées au fond de la cage pour faciliter l’alimentation. La prise alimentaire sera contrôlée pendant les traitements et les analyses métaboliques. Enfin, les analyses cardiovasculaires seront réalisées sous anesthésie afin de réduire le stress des animaux. Des points limites suffisamment précoces ont été définis.
Choix des espèces
Les espèces rat et souris ont été choisies car ce sont des modèles établis pour le développement de maladies cardiovasculaires et rénales. De plus nous disposons de deux modèles de rats génétiquement modifiés permettant de surexprimer le récepteur minéralocorticoïde (RM) dans ses territoires naturels d‘expression (rat) et d’inactiver l’expression d'un gène d'intérêt, ainsi que de modèles souris génétiquement modifiées permettant de moduler l’expression du RM de façon conditionnelle uniquement dans les types cellulaires d’intérêt. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Évaluation de l’effet anti-inflammatoire de métabolites produits par le microbiote intestinal dans un modèle pré-clinique de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Aucun antalgique ne sera donné aux souris rendues colitiques, le porteur indiquant que ces molécules interféreraient avec l'inflammation qu'il étudie. 932 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va du léger au sévère. 464 d'entre elles reçoivent pendant une ou deux périodes de sept jours une eau de boisson additionnée de dextran sulfate de sodium, qui déclenche la colite avec ses douleurs et sa perte de poids, 388 sont gavées quotidiennement avec des bactéries, et toutes sont pesées chaque jour, une contention manuelle venant au besoin stimuler l'émission de fèces. L'enjeu affiché reste la "preuve de concept" de métabolites bactériens anti-inflammatoires, qui justifierait plus tard des essais cliniques chez l'humain.
Objectifs
Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin se caractérisent par des inflammations fortes et répétées au niveau intestinal. La répétition de ces épisodes d'inflammation conduit à des complications telles que des des diarrhées, des saignements, des douleurs abdominales, une perte de poids et d’autres symptômes sévères. Ces symptômes diminuent de façon très significative la qualité de vie des patients. Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin constituent un enjeu majeur de santé publique dans de nombreux pays. Il n’existe pas, actuellement, de traitement permettant de soigner définitivement ces maladies. Différents traitements médicaux sont utilisés pour traiter les patients mais, malheureusement, un certain nombre de patients ne répondent pas à ces traitements. Il existe donc une forte demande pour trouver de nouveaux médicaments contre les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. Certaines molécules, produites par des bactéries vivant dans le tube digestif, possèdent des propriétés anti-inflammatoires. Les objectifs de ce projet de recherche sont d’évaluer l’effet de ces molécules sur l’inflammation intestinale chez la souris. Pour cela, l’effet de l’ajout de ces molécules dans l’eau de boisson des animaux, ou l’effet de l'administration de bactéries productrices de ces molécules sur l’inflammation sera évalué. Les résultats obtenus par ce projet constitueront des données essentielles pour valider et poursuivre le développement de nouveaux médicaments basés sur ces molécules.
Bénéfices attendus
L’ensemble des procédures expérimentales présentées dans ce projet permettront de déterminer si les métabolites peuvent constituer des outils thérapeutiques innovants dans le traitement des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. Le potentiel anti-inflammatoire de diverses espèces bactériennes sera déterminé. Elles pourront constituer des probiotiques d’intérêt dans le traitement des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. L’ensemble des données précliniques obtenues dans ce projet seront essentielles pour valider la « preuve de concept » de l’utilisation de ces métabolites et pour justifier d’initier des essais cliniques chez l’Homme basés sur ces molécules.
Procédures
Tous les animaux de ce projet (932 souris) seront hébergés dans des cages et bénéficieront d’une semaine d’acclimatation à l’animalerie. Une période d’habituation de 3 jours à la manipulation/contention par les expérimentateurs (une fois par jour), sera réalisée avant le début des expérimentations. Tous les animaux de ce projet (932 souris) seront pesés (animaux vigiles) une fois par jour sur une période de 10 à 15 jours. Pour cela, les animaux seront extraits de leurs cages et pesés sur une balance adaptée. Une partie des animaux (388 souris) seront gavés oralement avec des bactéries, une fois par jour pendant 5 à 15 jours consécutifs. 832 souris recevront un gavage oral de dextran couplé à de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC-dextran) le dernier jour du protocole. Pour cela, les animaux (vigiles) seront extraits de leurs cages et maintenus en contention pendant quelques secondes. Il y aura un délai de 4 heures entre l’administration de l’isothiocyanate de fluorescéine et la mise à mort. Tous les animaux de ce projet (932 souris) seront extraits de leurs cages le jour de la mise à mort et maintenus en contention pendant quelques secondes pour la réalisation d’une injection intrapéritonéale d’anesthésiques. Une partie des animaux (464 animaux) auront accès uniquement à de l’eau de boisson supplémentée en Dextran Sulfate Sodium, qui génère les symptômes attendus de la colite, sur une ou deux périodes de 7 jours. Pour chaque souris (932 souris), une collecte de fèces sera réalisée une fois par jour sur une période de 10 à 15 jours, lors de la pesée. Si aucune fèces n’est récupérée, une contention manuelle de quelques secondes sera réalisée afin de stimuler l’émission de fèces.
Impact sur les animaux
- Des administrations par gavage seront réalisées au cours de ce projet. La réalisation de ces gavages oral (et la prise des animaux en contention) peut engendrer un stress de quelques secondes (nuisance légère). - L’induction de la colite peut être associée à une perte de poids et à des douleurs chez les animaux. Ces effets indésirables surviennent après environ 3 jours de traitement au Dextran Sulfate Sodium et peuvent durer jusqu’à la fin du traitement au Dextran Sulfate Sodium soit une durée totale d’environ 7 jours (nuisance sévère).
Devenir
A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’information à partir de ces séries expérimentales.
Remplacement
Ce projet de recherche vise à étudier les interactions entre le microbiote intestinal, l’épithélium intestinal et le système immunitaire dans un modèle de colite sévère. Ce projet se focalise donc sur une réponse intégrée de l’organisme faisant appel à plusieurs grands systèmes, et ne pouvant être modélisée par des procédures moléculaires et cellulaires simples. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour réaliser cette étude et atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs facteurs ont été combinés. L’utilisation d’une lignée de souris congénique, présentant une faible variation génétique, permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. L’effectif de chaque groupe a été limité au maximum de façon à garder une puissance statistique suffisante dans le traitement des résultats. Un maximum de tissus sera collecté après la mise à mort des animaux et stocké de façon à maximiser les données obtenues et permettre de réaliser des analyses complémentaires ultérieurement, sans avoir à renouveler les expérimentations chez l’animal.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. Une période d’habituation à la manipulation de 3 jours sera réalisée à la suite de la période d’acclimatation. Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Une grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal sera utilisée. Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule Structure chargée du Bien Etre des Animaux. Un suivi quotidien de la consommation hydrique sera réalisé pour prévenir une éventuelle déshydratation des animaux. Une augmentation de la quantité de matériaux de nidification sera réalisée. L'usage est de ne pas utiliser d’antalgiques pour limiter la douleur des animaux avec colite en raison de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire qui est l'élément central étudié dans ce projet.
Choix des espèces
Les souris sont très régulièrement utilisées dans la littérature pour l'étude des mécanismes pathologiques associés aux colites aigües ou chroniques. Il est donc pertinent d'utiliser cette espèce dans ce projet de recherche centré sur l'inflammation intestinale. Des souris âgées de 6 à 12 semaines seront utilisées (stade jeune adulte).En effet, ce stade correspond à la période d'apparition des Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin chez l'homme.
Etude de l’effet de nouvelles stratégies thérapeutiques (vaccins, immunostimulants) lors d’une infection bactérienne ou virale chez la truitelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Toutes tuées à l'issue, parce qu'un protocole d'infectiologie interdit leur réutilisation, 4 500 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va du léger au sévère. Elles sont mises à jeun 24 ou 48 heures, anesthésiées, puis infectées par bain ou par injection avec des bactéries et des virus contre lesquels on teste des vaccins et des additifs immunostimulants. Le porteur classe la douleur en sévère chez les poissons infectés, chez qui l'infection peut conduire à la perte d'appétit, à une nécrose au point d'injection, à une nage erratique et à la mort, tout en indiquant qu'aucun élément concret d'appréciation de cette souffrance n'existe dans la littérature. Il affirme qu'aucun test in vitro ne permet de mesurer le bénéfice apporté à l'"organisme entier" et présente ces travaux comme un service rendu au bien-être des poissons d'élevage.
Objectifs
De nombreux agents pathogènes (bactéries, virus) affectent les salmonidés en Europe et dans le monde pouvant conduire à des taux de mortalité et à des pertes économiques considérables. En l’absence de vaccins efficaces, les antibiotiques sont le seul moyen de lutte contre les maladies bactériennes. Pour limiter leur utilisation et les risques de développement d’antibiorésistances, la mise au point de stratégies alternatives de lutte (immunostimulants, vaccins) est essentielle pour l’avenir de ce secteur d'activités. La vaccination devra être complétée par de bonnes pratiques d’élevage et par l’utilisation de substances stimulant le système immunitaire car l’optimisation des formules alimentaires modernes avec des ingrédients d’origine végétale est un facteur fragilisant le système immunitaire des poissons d’élevage carnivores. Parmi les nombreux additifs présents sur le marché et revendiquant des propriétés immunostimulantes, les prébiotiques (constituants alimentaires), les probiotiques (bactéries), les concentrés de protéines (hydrolysats) et les ingrédients d’origine marine représentent une solution d’avenir pour améliorer les performances de l’aquaculture. Leur richesse en peptides bioactifs (antimicrobiens, antioxydants, immuno-modulateurs…), et leur très haute valeur nutritionnelle pourraient permettre d’améliorer significativement le statut physiologique des animaux et, par conséquent, leur résistance aux pathogènes. L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets protecteurs de ces nouvelles stratégies chez la truite arc-en-ciel soumise à une infection expérimentale maîtrisée avec des pathogènes d’intérêt agronomique
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont l’évaluation d’aliments expérimentaux contenant des immunostimulants ou de vaccins pour les industriels de la filière aquacole avec une potentielle mise sur le marché de ces nouvelles stratégies. Ces résultats seront utilisés pour prévenir les maladies ou réduire leur impact, et donc améliorer le bien-être des poissons en élevage. La prévention des pathologies est un élément essentiel du développement d’une aquaculture plus « durable ».
Procédures
Les animaux seront soumis à des vaccinations et des infections par balnéation ou injection (1 seule et sous anesthésie durant moins d’une minute) Les infections expérimentales réalisées par injection sont réalisées sous anesthésie et une seule injection par poisson en moins de 15 secondes sur 4500 poissons au maximum. Les animaux sont mis à jeun 24 ou 48 heures avant l’infection.
Impact sur les animaux
Les manipulations (tri, pesée, transfert, injection) ainsi que la mise à jeun 24 ou 48 heures avant l’infection engendrent un stress chez les animaux. Aucun élément d’appréciation très concret de la souffrance éprouvée lors de l’évolution de la maladie n’est disponible dans la littérature. Cependant, le niveau de douleur sera considéré comme nul chez les contrôles non infectés en bonne santé, et sévère chez les animaux infectés chez qui l’infection peut conduire à la mort. L’infection peut également conduire certains individus à une perte d’appétit, un excès d’excrétion de fèces, une nécrose au point d’injection et une nage erratique.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc euthanasiés en fin d'expérience.
Remplacement
Les procédures décrites ne peuvent être remplacées par des expériences sur des lignées cellulaires (in vitro) car elles visent à comprendre la réaction de l'organisme dans son intégralité au pathogène. Il n'est pas actuellement possible d'évaluer l'effet immunostimulant/protecteur sur le système immunitaire d’un animal in vitro. Les tests in vitro permettent d'évaluer des effets sur certains types cellulaires, mais pas de mesurer le bénéfice apporter à l'organisme entier, via la stimulation intégrée du système immunitaire.
Réduction
La mise en évidence de différences significatives entre les conditions nécessite un effectif total de 90 poissons par condition (60 infectés et 30 témoins). Des effets-bac étant classiquement observés lors des épreuves infectieuses, il est indispensable de dupliquer les groupes infectés (2 x 30 poissons). Les effectifs proposés sont ceux utilisés récemment pour les analyses statistiques lors d’autres projets.
Raffinement
Le stress lié à la manipulation et à l’injection est compensé par anesthésie jusqu’à sédation pour une durée < 2 min. Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères et les biomasses maximales sont rigoureusement respectées. La qualité de l’eau est optimale et surveillée en permanence. Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Les individus atteignant le point limite défini dans le projet sont sortis du protocole et euthanasiés. Une anesthésie par bain jusqu’à sédation est réalisée avant de procéder à l’injection intramusculaire. Les aquariums sont équipés de bulleur qui est un élément d'enrichissement ayant un impact positif d'après la littérature (Colson et al. 2022 et 2023).
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est la principale espèce d’élevage en France et c’est l’hôte naturel des bactéries et virus pathogènes étudiés dans ce projet. Pour l’évaluation de la sensibilité/résistance à l’infection par la bactérie et virus d’intérêt, les animaux sont utilisés soit au stade alevin, soit à des stades relativement précoces où la sensibilité à des infections par la bactérie ou le virus est maximale.
Etude du métabolisme d’un acide aminé, le tryptophane, par microdialyse cérébrale dans un modèle de syndrome de l’intestin irritable post-infectieux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Infectées par gavage avec un milliard de bactéries, puis trépanées pour recevoir un guide de microdialyse cimenté dans le crâne, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Chacune est manipulée 46 fois sur quatre mois, en plus des pesées quotidiennes, et subit deux fois par semaine pendant trois mois une perfusion cérébrale de deux heures, éveillée. L'objectif déclaré consiste à relier un dérèglement du métabolisme du tryptophane à l'hypersensibilité colique et aux troubles anxieux du syndrome de l'intestin irritable, pour identifier de futures cibles pharmacologiques. Le guide qui dépasse de cinq millimètres du crâne est décrit comme une "légère gêne" pouvant occasionner des grattages, alors que le même texte annonce une hypersensibilité colique et un comportement anxieux installés jusqu'à la fin des expériences.
Objectifs
L’hypersensibilité colique et les douleurs abdominales sont les principaux symptômes du syndrôme de l'intestin irritable (SII) mais s’accompagnent très fréquemment de comorbidités psychologiques. La prise en charge de ces symptômes en clinique est actuellement limitée. En effet, le manque d’efficacité des traitements disponibles rend le développement de nouveaux outils pharmacologiques nécessaire. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes de ces symptômes afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, puis de tester de nouveaux médicaments agissant sur ces nouvelles cibles. La complexité de cette pathologie faisant intervenir plusieurs organes rend impossible l’utilisation in vitro d’un modèle cellulaire. Ainsi, afin de tester de nouvelles molécules dans des conditions mimant ces pathologies, il est indispensable de développer un modèle animal présentant des origines communes à ce qui est observé chez le patient et permettant donc de reproduire ces pathologies douloureuses. Le protocole s’orientera sur les mécanismes centraux impliqués dans l’initiation, le développement et le maintien d’une hypersensibilité viscérale d’origine colique (HSVC) ainsi que des comorbidités psychologiques (anxiété, dépression, troubles de la cognition) sur des modèles animaux de syndrome de l’intestin irritable post-infectieux (SII-PI). En effet, parmi les différents facteurs étiologiques suspectés dans la physiopathologie de ces atteintes intestinales, il a été observé, chez des patients présentant de sévères douleurs abdominales, des facteurs communs tels qu’un dérèglement du métabolisme du tryptophane pouvant être l’origine d’une HSVC ainsi que de comorbidités psychologiques. L’objectif de ce projet sera donc de clarifier le lien entre un désordre du métabolisme du tryptophane et le développement d’une HSVC et des comorbidités psychologiques afin de proposer de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement des symptômes.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes associés au SII afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettrait d’envisager une étude clinique. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs et des comorbidités psychologiques chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.
Procédures
Les groupes "infectés" seront infectés une fois par un gavage de 0,2ml de suspension de bactérie dans du PBS à une concentration de 10E9 bactéries/souris. Les groupes "non-infectés" seront traités une fois par un gavage de 0,2mL de PBS pour ne pas induire un biais. Un prélèvement de fèces sera effectué à J3, 7, 10 et 16 post infection sur chaque souris pour évaluer l’état de colonisation du tractus digestif nécessitant une contention de 5 minutes maximum. Les souris recevront un traitement par gavage oral deux fois par jour à base de métabolites dérivés du métabolisme du tryptophane entre J16 et J23. Chaque gavage prendra au maximum 30 secondes. A la suite de la période post-infectieuse (J16) les animaux subiront une procédure chirurgicale prenant une heure environ permettant l’implantation du guide de microdialyse au niveau cérébral. Après 48h de récupération suite à la chirurgie, les animaux subiront des perfusions de liquide céphalorachidien artificiel d’environ 2h à travers une sonde de microdialyse permettant de récupérer 200µL de liquide céphalorachidien sur animaux vigiles de façon bihebdomadaire sur une période pouvant s’étendre jusqu’à 3 mois. De plus, les animaux seront pesés quotidiennement pour vérifier leur bien-être. Au total, les animaux seront manipulés 46 fois en plus des pesées quotidiennes sur une période de 4 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux seront pris en en contention lors de l’infection à J0 et lors de la récupération de fèces à J3, J7, J10 et J16 induisant un stress léger. L’infection par C. rodentium induira des symptômes associés au syndrome de l’intestin irritable post-infectieux tels qu’une hypersensibilité colique et un comportement anxieux en phase post-infectieuse et jusqu’à la fin des expérimentations. L’administration d’un traitement curatif par gavage intragastrique deux fois par jour sur 8 jours lors de la phase post-infectieuse nécessitera une contention quotidienne rapide des animaux. Pour la chirurgie stéréotaxique, les animaux seront pris en contention pour être anesthésiés par injection sous-cutanée de kétamine/xylazine, plus un mélange de lidocaine et buvipacaine en analgésique. Le crâne des animaux sera percé permettant l’implantation du guide en conditions stériles, la zone sera refermée par un ciment dentaire laissant dépasser le guide. Celui-ci dépasse d’environ 5mm du crâne des animaux et pourrait donc occasionner une légère gêne et des grattages. A la suite, les animaux seront stabulés individuellement permettant leur récupération optimale et minimisant le risque de déplacer le guide. Une douleur au niveau du site chirurgical pourra être observée chez les animaux mais ce phénomène sera étroitement surveillé et la douleur sera traitée par des injections de lidocaïne et buvipacaine pendant 2 jours minimum après la chirurgie. Si un animal montre des signes d’infection post opératoire, il sera traité ou retiré de l’expérimentation. Pour la microdialyse, les animaux seront habitués 30min dans des cages de microdialyse, permettant leur libre déplacement, équipé d’eau et de nourriture à volonté, ensuite, les animaux seront rapidement anesthésiés par anesthésie gazeuse pour l’introduction de la sonde de microdialyse au travers du guide implanté, habitués à nouveau 30min puis perfusés (2h environ). A la fin, une nouvelle anesthésie gazeuse aura lieu pour retirer la sonde de microdialyse du guide et les animaux seront remis dans leur cage d’origine. Cette perfusion de microdialyse sera répétée de façon bihebdomadaire sur une période de 3 mois pouvant entrainer un stress lié à la manipulation. Durant la phase infectieuse et suivant la chirurgie, une perte de poids (maximum 5% du poids initial) pourra être observée chez certains animaux. Un suivi quotidien du poids et de l'état général des animaux sera effectué.
Devenir
A l'issu de la procédures, les animaux seront mises à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes.
Remplacement
Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de C. rodentium sur les variations du métabolisme du tryptophane au niveau cérébral. De plus, une étude comparant des données de métabolomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec C. rodentium. Ce type d’étude n’est concevable que chez l’animal. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Ce nombre d'animaux a été determiné par une approche statistique.
Raffinement
Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (week-end et jours fériés compris) voir deux ou trois fois par jour si l’état le nécessite par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. La douleur sera abrégée sans délai via l’administration d’antalgique dérivé de la morphine, ou si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20% sur 3 jours, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Les personnes qui manipuleront et observeront les souris sont expérimentées. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à l’espèce et qui respectent leur bien-être : densité animale, température, hygrométrie contrôlées, présence d’enrichissement, eau et nourriture à volonté. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs et aux manipulations.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par sa pertinence pour l’étude des pathologies intestinales in vivo ainsi que par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. De plus, la spécificité d’espèce de la souche bactérienne pathogène utilisée rend ce modèle encore plus approprié. Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (4-5 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.
Modèles de migraine pour évaluation de traitements
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2415
Pour évaluer des candidats anti-migraineux, 1 623 souris et 2 415 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des crises de migraine leur sont provoquées par injection d'un réactif ou par stimulation optogénétique, une fois par jour ou tous les deux jours pendant deux à quatre semaines, après une chirurgie de trente minutes à deux heures pour implanter des électrodes crâniennes chez une partie d'entre eux. Le porteur décrit des tests de réaction à des stimuli tactiles ou thermiques provoquant une douleur aiguë, arrêtée dès le retrait de la patte, et un hébergement en cage individuelle jusqu'à quatorze jours pour les rats blessés par leurs congénères. Les animaux porteurs d'implants crâniens et ceux soumis à des inductions répétées sont tués, le porteur estimant qu'un maintien en vie les exposerait à des céphalées récurrentes, tandis que 50 souris et 50 rats sont réutilisés.
Objectifs
La migraine est un trouble neurologique courant et potentiellement invalidant, caractérisé par des crises récurrentes de maux de tête modérés à sévères, souvent accompagnés d'autres symptômes tels que la sensibilité à la lumière, au son et/ou aux odeurs, ainsi que des nausées et des vomissements. Les migraines peuvent être classées en deux principaux sous-types : les migraines avec aura et les migraines sans aura. Les migraines avec aura représentent environ un quart de tous les cas de migraines. L'aura se réfère à une série de symptômes neurologiques qui précèdent habituellement le mal de tête, pouvant inclure des phénomènes visuels tels que des éclairs de lumière, des taches aveugles ou des zigzags lumineux, ou des sensations sensorielles telles que des engourdissements ou des picotements dans les membres. L'aura dure généralement moins d'une heure et précède souvent le mal de tête, bien que parfois elle puisse se produire simultanément avec le mal de tête ou même après. Les migraines sans aura sont beaucoup plus courantes, représentant environ 75 à 85 % de tous les cas de migraines. Contrairement aux migraines avec aura, celles-ci surviennent sans les symptômes neurologiques précurseurs. Les migraines constituent un fardeau significatif pour les individus qui en souffrent, ainsi que pour la société dans son ensemble, en raison de leur prévalence élevée, de leur impact sur la qualité de vie et de leurs coûts économiques associés. Malgré les progrès dans la compréhension de la physiopathologie de la migraine, le développement de thérapies efficaces reste un défi majeur. Dans ce contexte, l'évaluation préclinique d'agents pharmacologiques potentiels est essentielle pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques. Le présent projet vise ainsi à évaluer l'efficacité voire potentiellement la sécurité d'anti-migraineux chez le rongeur, en utilisant des modèles animaux présentant des symptômes typiques de la migraine.
Bénéfices attendus
L'objectif principal est de déterminer si les candidats médicaments sont capables de réduire l'intensité, la fréquence et/ou la durée des crises migraineuses chez le rongeur afin de potentiellement développer de nouveaux traitements plus efficaces contre les différents types de migraine. De plus, cette évaluation permettra de recenser de potentiels effets secondaires de ces traitements, tels que la toxicité et les altérations comportementales. Cette approche préclinique revêt une importance cruciale puisqu'elle permet une évaluation initiale de l'efficacité des anti-migraineux potentiels avant de les tester chez l'homme, réduisant ainsi les risques et dans une moindre mesure les coûts associés au développement clinique. De plus, elle offre la possibilité d'identifier de nouveaux mécanismes thérapeutiques et de comprendre les bases biologiques de la migraine, ce qui pourrait conduire au développement de thérapies plus ciblées et plus efficaces à l'avenir. En résumé, ce projet s'inscrit dans une démarche visant à améliorer la prise en charge de la migraine en identifiant de nouveaux traitements potentiels et en comprenant mieux les mécanismes sous-jacents à cette pathologie. Les résultats obtenus contribueront au développement de nouvelles options thérapeutiques pour les patients.
Procédures
Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée (principalement 1 fois (2 fois max) par jour; pendant 1 à 4 semaines en fonction de la spécificité du traitement), sous anesthésie (quelques minutes) si nécessaire. L'induction de crises migraineuses sera réalisée par administration d'un réactif (environ 1 minute, sous contention ou quelques minutes sous anesthésie) ou par stimulation optogénétique (quelques minutes, sous anesthésie), de manière unique ou répétée (en général, 1 fois/jour ou tous les 2 jours pendant 2 semaines, max 4). Cette induction et éventuellement le placement d'électrodes pour enregistrement d'ondes cérébrales pourra nécessiter une phase chirurgicale (de 30 minutes à 2h si électrodes) sous anesthésie. Dans certains cas, les signaux électriques au niveau cérébral seront mesurés après l'induction de la migraine (en général pendant 1h). Le comportement général des animaux sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de quelques minutes à 30 minutes pour les tests d'exploration/activité locomotrice) et des tests comportementaux (réaction à des stimuli tactiles ou thermiques, de l'ordre de quelques secondes à 5 minutes). Des prélèvements sanguins (en général 2 maximum par animal) pourront être réalisés (durée de l'ordre de la minute, sous anesthésie légère ou non).
Impact sur les animaux
Les manipulations réalisées au cours des procédures peuvent entraîner un stress le temps de l'administration de réactif, de substance, ou lors du test (e.g. stimulation tactile au niveau d'une patte, ou placement dans un dispositif nouveau comportant une zone ouverte ou fortement éclairée) ou du prélèvement sanguin, notamment du fait de la contention. Dans les modèles impliquant une chirurgie, il est possible que celle-ci entraîne une douleur post-opératoire au niveau de la peau du crâne (un analgésique est toutefois administré en péri-opératoire). Pour les cas avec implantations d'électrodes chez le rat, ceux-ci seront potentiellement hébergés en cage individuelle en cas de blessure causée par le congénère, ce qui peut entraîner un stress le temps de l'étude (1 à 14 jour en général). Les tests comportementaux basés sur la stimulation tactile ou thermique d'une zone cutanée peuvent entraîner une douleur aigue au moment du test (la stimulation est arrêtée dès la réaction de retrait de l'animal). L'induction de crises migraineuses est supposé entraîner une douleur de type céphalées pour les animaux le jour de test (il n'est pas attendu de crises spontanées).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude dans les modèles sévères, impliquant à la fois une chirurgie avec placement d'implants crâniens qui ne permettent pas un maintien en vie dans de bonnes conditions. Ils seront également euthanasiés en cas d'induction répétée de crises de migraine et de tests de douleurs, afin déviter tout risque de développement de céphalées récurrentes ou de pathologies associées à un stress chronique. Les animaux ayant reçu un traitement aux effets potentiellement néfastes ou soumis à un prélèvement de sang ou d'organes terminal seront euthanasiés car cela ne permet pas leur maintien en vie dans de bonnes conditions. Les animaux ayant reçu une seule induction de crise migraineuse, ou les animaux Sham (pas d'induction de la migraine), pourront être maintenus en vie, s'ils n'ont pas reçus un traitement induisant des effets néfastes.
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction au sein du corps entier. Les migraines sont des affections complexes impliquant des interactions entre différents systèmes biologiques incluant notamment le système nerveux central et le système vasculaire. Les modèles animaux permettent d'étudier ces interactions multisystémiques dans un contexte physiologique plus réaliste. Les modèles animaux permettent d'évaluer à la fois l'efficacité et, si pertinent, la sécurité des anti-migraineux potentiels à différents niveaux, notamment l'absorption et la distribution du médicament, ainsi que ses effets sur les organes et les systèmes biologiques. Cependant, dans certains cas les traitements médicamenteux étudiés dans le cadre de ce projet ont été sélectionnés au cours d'études in vitro et/ou in silico avant leur évaluation chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques (test t de Student, ANOVA one-way) ou non paramétriques (tests de Mann-whitney, Kruskal-Wallis) pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Ce projet est en développement dans notre établissement utilisateur, et une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal sera demandée afin de permettre de réévaluer et d’adapter a posteriori la catégorie éthique et les méthodes de raffinement, si pertinent. Le cas échéant, pendant la phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
Les rats et les souris partagent de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec les humains, ce qui en fait des modèles animaux pertinents pour évaluer l'efficacité des traitements anti-migraineux potentiels. Des modèles de migraine chez le rat et la souris ont été développés pour reproduire certains aspects de la pathophysiologie de la migraine, tels que l'hypersensibilité à la lumière et au son. Ces modèles permettent d'étudier les mécanismes de la migraine et d'évaluer l'efficacité des traitements anti-migraineux potentiels. Majoritairement à l'âge adulte (au moins 6 semaines après la naissance), mais la migraine pouvant survenir chez des patients jeunes, potentiellement dans certains cas spécifiques des rongeurs plus jeunes (stade post-natal - adolescence) pourraient être utilisés.
Etude de la cicatrisation cutanée au cours du diabète et de l’effet de l’application d’un substitut cutané chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Une partie des souris utilisées est immunodéprimée, donc plus exposée aux infections, alors que le protocole leur inflige des plaies ouvertes. 1 592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles suivent un régime gras et sucré pour devenir prédiabétiques, subissent une plaie d'excision ou deux plaies de pression de trois heures chacune sous anesthésie, un débridement, la greffe d'un substitut cutané humain et des tests répétés de tolérance au glucose avec incision de la queue, chacune finissant isolée en cage individuelle pour que ses plaies ne soient pas aggravées. Le porteur attend de cette durée d'expérimentation des signes excessifs d'agressivité, des griffures, de l'apathie ou de la prostration, et la mise à mort intervient pour prélever la peau totale du dos.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la compréhension de l’intégration de cellules humaines dans la problématique des plaies chroniques non cicatrisantes afin de déterminer la contribution des cellules du donneur versus hôte dans la régénération tissulaire. Les plaies chroniques sont des plaies de pression qui apparaissent chez les patients diabétiques, qui persistent dans le temps, ne cicatrisent pas et mettent la survie ou la qualité de vie du patient à risque pouvant entraîner de graves complications voire un décès. La thérapie locale des ulcères du pied repose principalement sur le débridement de la plaie et la protection des plaies à l’aide de pansements mais la cicatrisation reste longue et peut échouer. Il y a une urgente nécessité à trouver de nouveaux traitements et augmenter la compréhension du défaut de cicatrisation. Les études d’efficacités des pansements et peaux artificielles incluant des cellules sont principalement effectuées sur des animaux sains avec quelques études sur des animaux pathologiques et exclusivement réalisées sur des plaies aigues de type coupure. Toutefois, la peau d’un patient diabétique ou d’un sujet sain sont différentes, de même qu’une plaie liée à la gravité par application de la pression du corps est très différente d’une coupure. L’objectif de ce projet est de caractériser le rôle d’une peau artificielle humaine dans l’amélioration significative de la durée et de la qualité de la cicatrisation de la peau après coupure et application de pression chez des souris non et pré- diabétiques, mâles et femelles.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes de contribution des cellules du donneur versus hôte dans la formation du nouveau tissu permettra, à terme, de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts de cicatrisation qui peuvent affecter les patients diabétiques et améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Les souris seront soumises à un régime hypercalorique riche en graisse et sucre, associé ou non à des injections (x5, 3sec/injection – 20 sec/ contention) afin d’induire un pré-diabète. Sous anesthésie générale, les souris seront soumises à une plaie d’excision (1 en 1 min) ou deux plaies de pression (2x 3h), associé ou non à la greffe d’un substitut cutané. Il existe une répétition d’anesthésie gazeuse pour l’induction des plaies de pression, le débridement des plaies (10min) et le suivi des plaies par photo (5min). La détermination du temps de régime hypercalorique nécessaire pour induire un prédiabète nécessite la répétition de tests de tolérance au glucose et de tests de sensibilité à l’insuline. Les tests de tolérance au glucose ou de sensibilité à l’insuline nécessitent une seule incision (2 sec) de la queue pour chaque test. Pour les souris poilues, une crème dépilatoire VEET sera utilisée (appliquez 30 sec et bien rincé à l’eau claire avec compresse stérile)
Impact sur les animaux
Les souris immunodéprimées sont sujettes à plus d’infection. La génération de la plaie et le débridement peuvent engendrer une douleur. La durée des expérimentations peut engendrer des signes excessifs d’agressivité et l’apparition d’irritations ou de griffures cutanées ou l’apparition d’apathie, de prostration ou d’immobilité. La mise en cage isolée des souris pour préserver les plaies induites et ne pas avoir de sur-blessure peut engendrer une perte d’interaction, palliée par un enrichissement du milieu des cages. Une douleur transitoire peut être associé aux injections répétées.
Devenir
Mise à mort en fin d’expérimentations et prélèvement des tissus. MODIFICATION du 16/04/2024 : mises à mort par la méthode réglementaire pour prélèvements de peau totale du dos. Pour les souris avec plaie, mise à mort par injection d’euthasol ou induction en cage à CO².
Remplacement
La cicatrisation est un processus naturel qui permet à la peau de se refermer. Souhaitant étudier les défauts de cicatrisation liés au diabète (régime enrichi en sucre/gras), et l’effet de la pose d’un substitut cutané sur les blessures, notre projet requiert une approche intégrée qui n’est rendue possible que par l’utilisation du modèle souris. Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux. Ce projet de recherche fait suite à des résultats cellulaires obtenus et des travaux in vitro se poursuivent en parallèle.
Réduction
Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 1592 incluant les 2 sexes, la réalisation d’expérimentation se fera par salves. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles. Les animaux ayant été utilisés pour la première partie du projet et répondant à nos attentes pourront être réutilisés pour la suite du projet, dans un objectif de réduction du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées tous les jours et pesées 1 fois par semaine. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Des croquettes mouillées au sol et/ ou gel nutritifs pourront être ajouté à la cage si les souris présentent une difficulté à se déplacer et/ ou se mettre debout ou si il n’y a pas de prise de poids. Toutes les anesthésies seront gazeuses Des analgésiques seront administrés 30 min avant l’acte chirurgical, puis 6-8h après et enfin 24h après l’acte chirurgical. L’hébergement et les instruments utilisés sont stériles, et les cages sont chauffées après les chirurgies via des pads chauffants disposés sous les cages, pour aider le réveil des animaux. Une fois les animaux isolés seul par cage, il y a l’ajout d’une maison carton comme nouvel enrichissement.
Choix des espèces
Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie et une organisation cutanée proche de celle de l'Homme et permet d'étudier l’induction des plaies et les processus de cicatrisation, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaires et moléculaires. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 3 semaines pour débuter les régimes hypercaloriques et pour que les souris soient sexuellement matures au moment de l’induction des plaies. Excepté pour les souris NSG qui auront 6 semaines d’âge au moment de la greffe de peau humaine.
Evaluation de candidats médicaments dans le modèle d’asthme chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Sensibilisés par injection une fois par semaine pendant trois semaines, puis enfermés dans des chambres de plexiglas pour respirer le même réactif en aérosol trente minutes, trois fois par semaine pendant trois semaines, 1 200 rats développent un asthme expérimental. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère et tous les rats sont tués à l'issue, soumis à un prélèvement terminal de sang, d'organes ou de liquide bronchoalvéolaire. Le porteur décrit des crises de gêne respiratoire, une respiration sifflante et une hyperréactivité bronchique pouvant aller jusqu'à la détresse respiratoire, et prévoit jusqu'à douze heures d'affilée en chambre de pléthysmographie. Les bénéfices annoncés, des médicaments qui amélioreraient la qualité de vie des patients asthmatiques, restent au stade de l'évaluation préclinique, quand l'atteinte respiratoire infligée aux rats, elle, est immédiate.
Objectifs
Affectant des millions de personnes à travers le monde, l'asthme est une affection pulmonaire chronique qui touche les personnes de tous les âges. Elle se manifeste par des crises, caractérisées par des épisodes de gêne respiratoire (essoufflement), de respiration sifflante, de toux sèche ou de sensation d’oppression dans la poitrine. Les crises d'asthme peuvent durer de plusieurs minutes à quelques heures. Entre deux crises, la respiration redevient normale. L’asthme est caractérisé par trois composantes : l’inflammation des bronches, leur hyperréactivité et leur remodelage. Ces trois phénomènes sont intimement liés et s’influencent entre eux. L’inflammation bronchique est liée à l’activité anormale de différentes cellules de l’immunité au niveau du tissu bronchique. Lorsqu’elles sont agressées par une substance chimique ou microbiologique, les cellules de la paroi des bronches (cellules épithéliales bronchiques) déclenchent une réaction de défense qui fait intervenir plusieurs molécules pro-inflammatoires de la famille des cytokines qui vont déclencher différentes cascades réactionnelles locales. L’hyperréactivité bronchique se traduit par la contraction exagérée du muscle lisse des bronches et au rétrécissement des voies respiratoires au contact d’une substance déclenchante. Le remodelage bronchique correspond à l’accumulation d’anomalies au niveau des cellules qui structurent les voies aériennes (hypertrophie, hyperplasie, fibrose). Ce phénomène aboutit à l’épaississement de la paroi des bronches. L’asthme altère considérablement la qualité de vie des patients. Il entraîne des insomnies, une baisse d’activité et un absentéisme à l’école ou au travail. Un asthme mal contrôlé peut conduire à une altération de la fonction respiratoire. En effet, certains patients répondent mal ou pas du tout aux thérapies ciblées et il est donc nécessaire de développer de nouveaux traitements ou des associations médicamenteuses. Dans ce contexte, le présent projet consiste à évaluer l’efficacité de candidats médicaments dans un modèle d’asthme chez le rat.
Bénéfices attendus
Les bénéfices recherchés sont le développement de médicaments destinés à améliorer la qualité de vie des patients asthmatiques. Les modèles précliniques appropriés à l'évaluation de l’asthme sont nécessaires pour comprendre les mécanismes sous-jacents entraînant le développement de la réaction asthmatique chez l’homme. Ces modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter les problématiques de la réaction asthmatique (diminution des symptômes, de la réaction inflammatoire,…) quels qu'en soient l'origine et/ou le mécanisme d'action.
Procédures
Les rats sont sensibilisés une fois par semaine pendant 3 semaines minimum par injection d'un réactif (durée d'environ quelques secondes). Quelques jours après la phase de sensibilisation, les animaux sont placés dans des chambres en plexiglas et reçoivent par aérosol le même réactif (durée : 30 minutes, 3 fois/semaine, pendant 3 semaines). Le traitement avec les candidats médicaments est initié en parallèle des aérosols (administration pendant quelques secondes) de manière chronique (durée maximum de 3 semaines selon le composé, soit 21 administrations). Quelques jours après les challenges, la fonction respiratoire des animaux est évaluée dans des chambres de plethysmographie (maximum 12 heures, incluant la période de stabilisation). A la fin de la procédure, ces animaux seront soumis à des prélèvements de sang, ou de liquide bronchoalvéolaire sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, l’induction de la pathologie entraine une atteinte de la fonction respiratoire, une réaction inflammatoire et un remodelage pulmonaire. Parmi les symptômes les plus couramment observés dans ce modèle d’asthme, nous retrouvons des crises caractérisées par des épisodes de gêne respiratoire (essoufflement), de respiration sifflante, d’hyperactivité bronchique pouvant aller jusqu’à la détresse respiratoire (dans des cas extrêmes). De plus, un stress lié aux prélèvements et aux administrations répétés peut être ressenti par les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car ils sont soumis à un prélèvement terminal (sang, organes ou liquide bronchoalvéolaire).
Remplacement
De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant à la fois de sélectionner uniquement les molécules présentant une certaine efficacité, innocuité et d’explorer les détails relatifs au mécanisme d’action de ces dernières. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester in vivo (et donc du nombre d’animaux), il ne représente pas la complexité du système immunitaire. Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la réaction inflammatoire (respiration sifflante, hyperactivité bronchique, sécrétion de mucus, mesure des taux de cytokines, immunoglobulines...).
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Dans le contexte d’études cherchant à réverser/diminuer la réaction inflammatoire, nous pouvons observer une variabilité inter-individuelle de réponse pouvant être liée à l’agent allergisant utilisé et à la substance d’essai évaluée. Compte-tenu de la variabilité de réponse connue d'un individu à un autre, 8 rats minimum sont généralement nécessaires pour atteindre une sensibilité correcte du test. De nombreux critères d’évaluation (scores ou valeurs quantitatives telles que suivi du poids corporel, mesure des paramètres respiratoires, dosages des immunoglobulines, cytokines,…) sont intégrés dans ces études. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire et adapté à la condition des animaux (troubles respiratoires), afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce est basé sur la bibliographie scientifique. Les rats répondent bien à une variété d'allergènes couramment utilisés pour induire des modèles d'asthme, tel que l'ovalbumine..., permettant l'étude de différents aspects de la maladie. Il existe une vaste base de publications chez le rat dans la recherche sur l'asthme. Cela permet de comparer les résultats de nouvelles études avec des données antérieures, offrant ainsi une continuité et une cohérence dans la recherche. Principalement rongeurs sevrés, après 4 semaines de développement, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.
Etude de la toxicité et efficacité de la radiothérapie et de la radiorésistance dans les tumeurs cérébrales pédiatriques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Jusqu'à quinze séances de tests comportementaux par semaine et cinq irradiations du crâne par expérience : 9 143 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des cellules ou des fragments de tumeurs cérébrales pédiatriques leur sont greffés sous la peau ou injectés directement dans le cerveau sous anesthésie, avec un suivi par imagerie chaque semaine et des mesures de tumeur au pied à coulisse. Le porteur décrit des tests portant sur la capacité d'apprentissage et la mémoire spatiale, sans préciser lesquels sont employés. Il justifie l'emploi de souriceaux de dix jours par le fait que leur cerveau est alors en plein développement, comme celui des jeunes enfants atteints des cancers étudiés.
Objectifs
Les cancers sont la seconde cause de mortalité chez les enfants âgés de 1 à 15 ans dans les pays industrialisés. Parmi eux, les cancers cérébraux sont la deuxième cause de cancers pédiatriques et la cause majeure de mortalité liée au cancer. La radiothérapie est nécessaire et souvent curative pour traiter les tumeurs cérébrales pédiatriques. Cependant, elle est associée à une forte toxicité sur le cerveau en développement entraînant des effets secondaires dramatiques chez les enfants (défauts neurocognitifs sévères, etc). Chez certains patients, la radiothérapie échoue et des récidives tumorales apparaissent suggérant une forme de radiorésistance de ces tumeurs. Chez les très jeunes enfants, le médulloblastome (MB) et les tumeurs rhabdoïdes et tératoïdes atypiques (AT/RT) sont parmi les cancers cérébraux les plus agressifs. En outre, ils sont souvent associés à une rechute et ce malgré d’intensifs traitements classiques associant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. Ce projet a pour but d’améliorer les connaissances scientifiques en permettant de mieux comprendre les mécanismes de radiorésistance et de toxicité sur le tissu normal. L’objectif est d’identifier de nouvelles cibles ou modalités thérapeutiques afin d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie et de diminuer ses effets secondaires indésirables. De plus, l’étude de l’infiltrat des cellules immunitaire c’est-à-dire l’accumulation de cellules du système immunitaire dans les tumeurs permettra d’identifier les meilleurs traitements d’immunothérapie à combiner à la radiothérapie pour améliorer le contrôle de la tumeur.
Bénéfices attendus
L’étude de l’impact de l’irradiation sur la réponse tumorale dans 2 types de cancer pédiatrique permettra de mieux comprendre les mécanismes associés à la rechute et de diminuer les effets secondaires indésirables. Ce projet a pour but d’identifier de nouvelles modalités thérapeutiques telles que la combinaison de traitements d’irradiation avec de l’immunothérapie ou un traitement par thérapie ciblée. La finalité est donc d’améliorer le traitement de ces cancers tout en diminuant les effets délétères. Les bénéfices directs attendus sont de deux ordres, l'un cognitif pour une meilleure compréhension des mécanismes de résistance et de toxicité et le second, d’ordre sociétal en santé humaine avec le potentiel développement de nouvelles thérapies plus efficaces pour soigner des patients atteints de cancers pédiatriques. Les effets indirects attendus en réduisant les effets secondaires indésirables pourront également avoir un effet sociétal en diminuant les handicaps associés et permettant une meilleure intégration des patients dans la société, mais aussi avoir un impact économique en réduisant la nécessité de soins liés aux effets secondaires. La bonne connaissance de nos modèles nous garantira une qualité au niveau de nos expériences ce qui contribuera à l’enrichissement des connaissances à travers la publication de nos résultats dans des journaux scientifiques.
Procédures
Des fragments de tumeurs seront placés soit en sous-cutanée soit en interscapulaire sous anesthésie gazeuse (1 fois par expérience/ 10 minutes/ souris), Des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience/ 2 minutes/souris) ou des fragments de tumeurs seront greffés aux animaux sous anesthésie (1 fois par expérience/ 10 minutes/souris), Les tumeurs de ces animaux seront ensuite irradiées (soit 3 fois/expérience soit 5 fois/expérience, compter entre 2 et 10 minutes/irradiation/animal). Les animaux seront ensuite suivis, et les tumeurs mesurées à l’aide d’un pied à coulisse (1 à 2 fois par semaine/ 1 minutes/souris). Les animaux vigiles recevront un ou plusieurs traitements soit par injection intrapéritonéale, soit par voie orale. (Environ 1 minutes/souris). Des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau sous anesthésie gazeuse (1 fois au cours de l’expérience/ 10 minutes/souris) puis suivi à l’imagerie sous anesthésie (1 fois par semaine/ environ 20 minutes/souris). Le cerveau de ces animaux sera ensuite irradié en préservant les bulbes olfoactifs et la gorge (soit 3 fois/expérience soit 5 fois/expérience, compter entre 2 et 10 minutes/irradiation/animal) – acte réalisé sous anesthésie). Afin d'évaluer la capacité d'apprentissage et la mémoire spatiale de ces animaux, des tests de comportement seront réalisés avec au maximum 15 séances/semaines (chaque séance ayant une durée de moins de 10 minutes par animal). Enfin, des animaux anesthésiés seront irradiés au niveau du cerveau en veillant à préserver les bulbes olfactifs (1 irradiation - durée de l'anesthésie environ 10 minutes). Puis pour évaluer la capacité d'apprentissage et la mémoire spatiale de ces animaux, des tests de comportement seront réalisés avec au maximum 15 séances/semaines (chaque séance ayant une durée de 10 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Des cellules ou des fragments de tumeurs seront implantées chez des souris. Ces souris développeront des tumeurs et pourront recevoir des traitements tel qu’un protocole d’irradiation, un traitement ciblé et/ou une immunothérapie. Suite à la greffe des cellules ou de fragments de tumeurs, une perte de poids peut être observée jusqu’à environ 4 jours post-greffe. Suite à l’irradiation d’une partie du corps de l’animal, une perte de poids pourrait être observée durant 15 jours post-irradiation. Les nuisances attendues lors des administrations d’agents pharmacologiques sont liées à l’administration en elle-même (douleur légère de courte durée suite aux injections, stress de courte durée lié à la contention de l’animal lors des administrations orales) ainsi qu’à la composition du solvant utilisé . Les nuisances attendues lors des tests comportementaux sont liés au stress provoqué par les modifications apportées à l’environnement des animaux : conditions du test, type d’hébergement, expérimentateur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Concernant l’étude sur le médulloblastome, nous disposons au laboratoire de nombreux modèles : des progéniteurs neuronaux (= progéniteurs des cellules granulaires (GCP)) dissociés et purifiées à partir de cervelet de souriceaux âgées de 3 à 8 jours, des lignées cellulaires sur lesquelles de nombreux résultats prometteurs in vitro ont déjà pu être obtenus. Des expériences préliminaires in vitro sur cellules tumorales sont toujours réalisées en amont de l’approche in vivo chez la souris afin de ne poursuivre qu’avec les axes de recherche les plus solides. De la même façon, tous les composés de thérapies ciblés seront testés in vitro, seul ou en combinaison à l’irradiation et ne seront testés in vivo que ceux pour lesquels les résultats seront prometteurs. Des travaux sont également en cours en ce moment dans notre laboratoire sur l’obtention d’organoïdes de cervelet à partir de cellules humaines souches induites pluripotentes (iPS) ce qui nous permettra dans l’avenir d’augmenter nos approches in vitro et de remplacer une partie des animaux utilisés à des fins expérimentales . Concernant les traitements d’immunothérapie, ils ne peuvent être testés qu’in vivo du fait de la nécessité d’avoir un système immunitaire complet au sein d’un organisme. Enfin, l’étude de la toxicité des nouveaux traitements ou modalités ne peut s’envisager que sur animal. Nous chercherons en particulier à évaluer l’effet de ces traitements sur le tissu sain par des tests de comportement à plus ou moins long terme qui permettent d’étudier les déficits moteurs ou cognitifs semblables à ceux observés chez les patients après radiothérapie. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (cultures in vitro) l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
1-Pour minimiser le nombre d’animaux tout en cherchant à répondre aux objectifs scientifiques, nous aurons recours à des études longitudinales avec l’utilisation de l’imagerie du petit animal (suivi du même animal au cours du temps). Des études pilotes pourront être réalisés pour l’administration d’agent pharmacologique en fonction des données déjà publiées ou non. L’utilisation des patient derived xenograft qui sont des fragments de tumeurs obtenus chez des patients fraichement opérés (PDX) et qui sont maintenues sur animaux vivants est mutualisée avec les autres projets au sein de l’équipe ce qui contribue également à la réduction du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux estimé dans ce présent projet est un nombre maximum, mais il sera sans doute réduit. 2- Le nombre d’animaux à utiliser a été défini à l’aide d’outils statistiques
Raffinement
Dès que cela n’implique pas de stress ou de l’angoisse supplémentaire, une méthode d’anesthésie sera utilisée pour réaliser le geste technique nécessaire à l’expérimentation. De plus, des méthodes analgésiques seront appliquées avec l’utilisation d’analgésiants locaux ou généraux pendant l’opération et si besoin post-opératoire. Le réveil de l’animal se fera sous lampe chauffante et sera surveillé par l’expérimentateur. Des méthodes sont mises en place durant la chirurgie pour le bien-être de l’animal avec par exemple l’utilisation d’un coussin chauffant, l’utilisation de vaseline pour éviter le dessèchement des yeux, et en post-opératoire en favorisant l’accès à la nourriture molle en déposant au fond de la cage des cupules d’aliment gélifié. Nous habituerons les animaux quelques jours avant la chirurgie à se nourrir à base de ces cupules d’aliments gélifiés pour diminuer encore le stress et l’angoisse. Lorsque cela est possible scientifiquement, nous choisissons la méthode la moins invasive comme par exemple le choix du site d’implantation en sous cutané pour le maintien des PDX contrairement à un maintien qui aurait également pu être fait en orthotopique. L’injection de cellules dans le cerveau exprimant un marqueur permettra de suivre la croissance tumorale par une méthode non invasive d’imagerie. L’imagerie sera réalisée de 1 à 3 fois par semaine et sous anesthésie. Une procédure d’entrainement du personnel permettra de transmettre les gestes techniques de manière sûre aux nouveaux personnels en diminuant ainsi le stress et l’angoisse chez la souris. Les animaux greffés seront observés régulièrement par l’expérimentateur pour le suivi de la croissance tumorale soit par mesure à l’aide d’un pied à coulisse soit par imagerie en fonction du site d’implantation et pour vérifier leur état général de santé. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Dès atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de prédilection pour les expériences menées en recherche en thérapeutique du cancer, en particulier pour sa parenté physiologique avec l’Homme. Ce modèle est utilisé dans de nombreuses études en cancérologie, notamment pour des expériences de greffes ainsi que l’utilisation de lignées murines génétiquement modifiées. De plus, le modèle murin est un modèle de choix puisque les tumeurs spontanées sont rares et la croissance tumorale induite par greffe est relativement rapide. La majorité des animaux seront utilisés au stade adulte soit à 7 semaines Greffées à l’âge adulte, ce modèle de génération de tumeur est communément utilisé et bien maîtrisé (reproductible). La bonne connaissance de nos modèles sur les souris adultes nous ont conduit à réaliser ces expériences sur adultes pour garantir une bonne reproductibilité et donc une réduction du nombre d’animaux à utiliser. Concernant les greffes en sous-cutanés, les tumeurs seraient rapidement trop volumineuses par rapport à la taille de l’animal si nous la réalisions chez le souriceau. Nous utiliserons également des jeunes souriceaux non sevrés à 2 jours et 9 jours pour comparer l’infiltrat immun en fonction du stade de développement. Pour les tests comportementaux, des jeunes souris de 10 jours seront utilisés car à cette période, le cerveau est en plein développement (prolifération des progéniteurs neuronaux) tout comme l’est celui des jeunes enfants atteints des cancers pédiatriques étudiés.