Procédures sévères
Etude de la formation de la myéline et de son rôle dans la physiologie et le comportement chez un modèle murin génétiquement modifié.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un fragment de queue est prélevé sur chaque souriceau vers sept à dix jours, une partie des souris est ensuite opérée du crâne pendant trente à soixante minutes puis hébergée seule jusqu'à dix jours, certaines dès l'âge de quatorze jours avec le risque d'être rejetées par leur mère au retour dans la portée. 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 730 d'entre elles, modéré pour 60 et sévère pour 160. Sont tuées aussi les reproductrices renouvelées et les souris nées sans la mutation recherchée. Le projet porte sur le rôle d'une protéine dans la formation de la myéline, protéine que le résumé désigne d'un bout à l'autre comme la "protéine A" sans jamais la nommer.
Objectifs
Dans le cerveau, l’information électrique est transportée le long des axones des neurones. Pour assurer sa bonne propagation, l’établissement de gaines isolantes est essentiel : ce sont les gaines de myéline qui ont une double fonction : assurer la survie et la fonction des neurones. La formation de gaines de myéline, appelée myélinisation, est effectué par des cellules appelées, les oligodendrocytes. La perte de la myéline dans le cerveau et l'échec de sa régénération contribuent à de graves troubles neurologiques, moteurs et cognitifs, qui sont les principales caractéristiques de plusieurs maladies de la myéline, dont la sclérose en plaques (SEP). La synthèse continue de la myéline au cours du développement et chez l’adulte est essentielle au maintien de plusieurs comportements dont l’apprentissage et les interactions sociales. Ainsi la compréhension des mécanismes moléculaires de sa formation est très importante. Nous avons récemment identifié une protéine A comme une protéine essentielle à la formation de cette myéline in vitro. Cette protéine est connue pour être liée à une pathologie humaine dont les patients présentent des défauts de substance blanche à l’imagerie, ainsi qu’une plus grande susceptibilité au développement de SEP que la population générale. L’objectif de ce projet est d’étudier précisément chez le modèle animal le rôle de la protéine A dans la myélinisation in vivo. La myéline étant une structure adaptative, l’identification de cibles moléculaires permettant d’actionner cette dynamique au cours du développement représente un espoir thérapeutique très important dans plusieurs pathologies de la myéline.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra d’apporter de nouveaux éléments à la compréhension des mécanismes impliqués dans la myélinisation du système nerveux central (SNC). Les résultats de ce projet pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la formation de la myéline au cours du développement. Nous pensons que les bénéfices de cette étude pourraient permettre une meilleure compréhension des circuits neuronaux, notamment dans le cadre de pathologies impliquants la myéline. A plus long terme, une meilleure compréhension des mécanismes de la myélinisation du SNC pourrait permettre la mise en avant de nouvelles pistes thérapeutiques pour diverses maladies de la myéline.
Procédures
L’ensemble des animaux de cette étude seront prélevés d’un fragment de l’extrémité de la queue (prélèvement unique, moins d’une minute par animal) à l’âge de 7 à 10 jours afin de connaitre leur patrimoine génétique. Un groupe de souris sera étudié dans trois tests comportementaux non-invasifs pour évaluer les capacités sociales, motrices et mémorielles des soucis à raison de 1test tous les 10jours (étude sur 30jours, test sur 4-5jours maximum en prenant en compte le jour d’évaluation et les jours d’habituations et d’entrainement précédents, suivis par 6- 5jours de repos), effectués du moins au plus stressant. Les tests (test de sociabilisation, test coordination motrice, test de mémoire) seront effectués le matin, avec une habituation de l’animal à la salle d’expérimentation pendant à minima 30min. Les tests seront effectués par une personne qualifiée. La durée maximale par test n’excédera pas 1h30 (temps d’habituation à la salle et test compris) et les tests ne seront réalisés qu’une seule fois chacun. Enfin, une partie des souris seront opérées sous anesthésie locale et générale (durée opération 30 à 60min par souris), et analgésie avant et après l’opération. Les animaux devront être hébergés de façon individuelle après la chirurgie afin de ne pas abîmer le matériel implanté et permettre le bon enregistrement des données. L’hébergement individuel des souris sera réduit au temps minimal nécessaire (10 jours maximum) et leur cage sera enrichie en coton et en kraft afin de limiter le stress. L’ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une technique réglementaire. Les animaux vigiles seront connectés à un système d’enregistrement (connexion simple et indolore) pour enregistrer l’activité électrique du cerveau en continu pendant 72h, une seule fois.
Impact sur les animaux
Les animaux ressentiront un stress lors des manipulations et contentions nécessaires pour différentes étapes du projet. Ils pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement du bout de la queue pour connaitre leur patrimoine génétique, et un risque de saignement. La protéine que nous étudions est un gène suppresseur de tumeur, il est donc possible mais très peu probable que ces souris développent des tumeurs. En effet très peu probable car les patients ne développent pas de tumeur dans les oligodendrocytes (or notre modèle animal possède une perte partielle de la protéine dans les oligodendrocytes) et que des études précédentes utilisant le même type de modèle animal que nous ont montré le très faible développement de tumeur dans les cellules habituellement sujettes au développement tumoral chez les patients. Le risque zéro n’existe pas, mais il est extrêmement peu probable que notre étude produise des tumeurs chez les souris. L’anesthésie réalisée pour la chirurgie impliquera pour l’animal un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et un risque rare de dépression cardio-respiratoire. La chirurgie impliquera quant à elle une douleur et un inconfort post-opératoire ainsi que des risques de complications inattendues telles que saignement ou infection. Les souris étant des animaux grégaires, l’hébergement individuel nécessaire pour les enregistrements électrophysiologiques pourra être source de stress. Pour les souris qui seront opérées jeunes, un risque de rejet par sa mère lors de leur retour dans la portée en post-chirurgie est possible. Les tests comportementaux peuvent également représenter un stress pour les animaux lié au changement d’environnement et aux manipulations. Un risque d’hypothermie est également possible dans le test impliquant un placement des animaux dans l’eau.
Devenir
A l’issue de ce projet, l’ensemble des animaux sera euthanasié : - pour prélever leur cerveau en post-mortem, afin d’analyser de près la structure de la myéline et des neurones - à l’issue des tests comportementaux ou après la chirurgie puisque nous aurons d’ores et déjà obtenu le maximum de renseignements possibles sur ces animaux - les animaux reproducteurs renouvelés pour maintenir des capacités reproductives optimales - les animaux produits mais non porteurs de la mutation d’intérêt.
Remplacement
Le neurone, cellule nerveuse, comporte une partie très allongées appelée axone. Autour d’elle s’organise une structure particulière nommée myéline. Cette myéline est une structure en trois dimensions : une extension des membranes dites oligodendrocytaires qui s’enroule autour d’un axone électriquement actif. Suivant le principe de remplacement, nous étudierons en détail cette structure sur les cellules à l’origine de ces membranes, appelées oligodendrocytes, mis en culture (donc hors de l’animal) puisque même sans axone, ces cellules forment de la myéline. Or, il est essentiel dans le cadre de cette étude, de passer par une étude chez l’animal présentant une mutation jouant un rôle clé dans la formation de la myéline afin de pouvoir : (1) observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le cerveau et surtout l'activité électrique des neurones, (2) étudier l'impact de la mutation sur le comportement de la souris.
Réduction
Afin d’appliquer le principe de réduction, nous fondons une grande partie de notre étude sur des expériences de cellules en culture. De plus, nous optimiserons l’utilisation de nos animaux. Le nombre d’animaux utilisés (950) sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables (taille des effectifs nécessaire établi grâce à un calcul de puissance permettant une interprétation fiable des résultats, étude faite en collaboration avec les statisticiens). Une marge de production est incluse dans ce nombre d’animaux mais nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux strictement nécessaire pour nos lots expérimentaux, nous utiliserons donc potentiellement moins d’animaux que prévu ici. Toutes les expériences mentionnées seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d'évaluer la présence éventuelle d'un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle, c’est-à-dire sans connaitre au préalable le génotype de la souris analysée pour limiter le biais lié à l’observateur, donc la variabilité et ainsi le nombre de souris nécessaire.
Raffinement
L’animalerie est agréée, ainsi les conditions d’hébergement (température,hygrométrie,éclairage et espace selon les recommandations) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (bâtonnet à ronger, neslet), d’alimentation et les soins (quand nécessaires) seront contrôlés quotidiennement. L’hébergement individuel des animaux sera automatiquement suivi d’une supplémentation d’enrichissement (kraft). Une période d’acclimatation de 7 jours pour les animaux provenant de l’extérieur sera effectuée avant toute procédure. Les animaux seront observés quotidiennement par la zootechnie et surveillés régulièrement et de manière adaptée aux différentes procédures par notre équipe. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé au calme dans une pièce dédiée, avec du matériel désinfecté et suivi d’une surveillance pour vérifier la bonne prise en charge des petits par leur mère. Sa taille sera limitée au strict minimum et il sera fait sur de jeunes animaux pour lesquels l’extrémité de la queue est peu sensible et cicatrise vite. Pour les tests comportementaux, une période d’habituation propre à chaque test sera réalisée avant chacun des tests et une période de repos sera assurée entre chaque test. Pour chaque test comportemental, un suivi adapté de la souris sera assuré pour limiter son stress et favoriser son bien- être. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec un maintien et un suivi de la température des animaux. Un suivi renforcé sur 7 jours sera mis en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Un suivi spécifique sera mis en place pour les animaux opérés à 14 jours d’âge. Afin d’évaluer les impacts phénotypiques des mutations étudiées, nous tiendrons un registre de suivi du bien-être des animaux : observation 2 fois parsemaine par notre équipe de la naissance à la mort des animaux à l’aide d’une grille d’évaluation (en fonction des critères, l’observation et le suivi de l’animal pourra devenir quotidienne). Des points limites sont mis en place et respectés pour éviter toute souffrance, avec décision et prise en charge rapide des animaux.
Choix des espèces
La formation de myéline est propre au développement des animaux vertébrés. Ainsi son étude nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. De plus, puisque nous étudions une voie moléculaire en particulier, celle de la ‘protéine A’, l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique de cette protéine A avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes codant la protéine A présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. Nous étudierons les animaux à différents âges depuis la naissance. Nous réaliserons un prélèvement pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours. Une étude à différents âges au cours du développement post-natal permettra de suivre l’évolution de la myélinisation (à 14, 21, 30, 60, 120 et 180 jours). En parallèle, nous étudierons aux mêmes âges comment est affecté le fonctionnement du cerveau en enregistrant les ondes produites (étude dite électrophysiologique). Enfin, nous étudierons le comportement des souris chez le jeune adulte (entre 60 et 90 jours).
Remodelage des cartes corticales somesthésiques et motrices après déafférentation vestibulaire
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une solution chimique injectée à travers le tympan détruit leurs capteurs d'équilibre et provoque vertiges, pertes d'équilibre et troubles de la marche, puis neuf séances de tests comportementaux s'échelonnent sur trente jours, avant une cartographie du cortex de cinq à huit heures, crâne ouvert sur cinq millimètres de côté, dont les rats ne se réveillent pas. Le projet décrit la réorganisation de deux zones cérébrales après la lésion, avec l'idée d'améliorer un jour la rééducation des patients atteints de troubles vestibulaires. Le porteur conclut que le recours aux rats est "nécessaire et incontournable" et qu'il n'est "pas remplaçable" par d'autres modèles.
Objectifs
La déafférentation des capteurs vestibulaires de l’oreille interne est à l’origine de pathologies appelées « vestibulopathies périphériques » (VP). Ces pathologies provoquent des troubles de l’équilibre et de la marche, mais également visuels, perceptifs et cognitifs associés à des vertiges. Les VP ont une forte prévalence dans la population des pays industrialisés et représentent un coût sociétal important. Dans ce projet, nous allons réaliser un modèle de lésion de l’oreille interne à l’arsanilate qui est un modèle animal de vestibulopathie représentatif de la pathologie vestibulaire chez le patient. Dans le cadre de ce projet nous allons étudier les modifications cérébrales induites dans deux zones du cerveau : une qui reçoit les informations de la surface du corps en lien avec le sens du toucher (cortex somatosensorielle primaire), et une autre zone qui contrôle les mouvements volontaires (cortex moteur primaire). À ce jour, aucune étude ne s’est intéressée précisémment à ces deux zones cérébrales après une lésion de l’oreille interne et nous faisons l’hypothèse qu’il y aura des modifications cérébrales importantes après la lésion vestibulaire. En effet, après une lésion de l’oreille interne, avec le temps le cerveau va s’adapter et compenser la perte d'équilibre permettant ainsi de retrouver une stabilité posturale. C’est ce qu’on appelle la compensation vestibulaire. Ainsi, les modifications cérébrales dans les deux zones du cerveau seront étudiées à 3 délais post-lésionnels : 4 jours après la lésion vestibulaire, 15 jours ou 30 jours. Ces différents délais nous permettrons d’évaluer comment la perte des informations vestibulaire et la compensation vestibulaire modifient nos deux zones cérébrales d’intérêts. Comprendre ces mécanismes est crucial, non seulement pour la science fondamentale, mais aussi pour améliorer les méthodes de rééducation sensorielle et motrice en clinique.
Bénéfices attendus
En France, les déficits vestibulaires représentent 5% des urgences à l’hôpital et 300 000 consultations par semaine. La perte de l’équilibre constitue un vrai handicap sensoriel et moteur et les déficits vestibulaires impactent grandement la vie quotidienne des patients. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent la compensation vestibulaire restent en partie méconnus, notamment dans les zones cérébrales motrices et sensorielles qui nous intéressent dans ce projet. Comprendre ces mécanismes est crucial, non seulement pour la science fondamentale, mais aussi pour améliorer les méthodes de rééducation sensorielle et motrice en clinique.
Procédures
Injection d’une solution chimique à travers le tympan sous anesthésie générale pour induire le syndrome vestibulaire (vertige, déficits de la posture et de la marche) : de 40 à 90 min. Test comportementaux à J1, J2, J3, J4, J7, J10, J15, J21 et J30 après la lésion vestibulaire: 15 min par session. Cartographie (sous anesthésie générale – de 5 à 8h) : - Ouverture du crâne (5 mm x 5 mm) pour implantation d’électrodes permettant l’enregistrement des signaux cérébraux. - Stimulation de la patte et enregistrements cérébraux. - Stimulation cérébrale et enregistrements des mouvements de la patte. Perfusion intracardiaque sous anesthésie générale pour récupérer les tissus d'intérêts.
Impact sur les animaux
Les animaux soumis à une lésion vestibulaire peuvent avoir un déficit d’hydratation dans les 24-48 heures après l’atteinte vestibulaire. Une perte de poids attendue chez les animaux les premiers jours après la lésion vestibulaire (environ 5 à 10%). L’introduction d’un liquide dans l’oreille moyenne (pour la lésion vestibulaire) peut être source d’inconfort. Les déficits vestibulaires conduisent à d’autres effets indésirables tels que des problèmes de maintien de la posture, une perte d’équilibre et de la fatigue. Les tests comportementaux peuvent être source de stress pour les animaux car ils sont séparés temporairement de leurs congénères (5 à 10min). Pour la lésion vestibulaire et les enregistrements cérébraux les animaux sont sous anesthésie générale (40 à 90min pour la lésion vestibulaire, 5 à 8h pour les enregistrements). Il est nécessaire de réaliser sous anesthésie générale l’ouverture du crâne (5 mm x 5 mm) pour une implantation d’électrodes afin d’enregistrer les signaux cérébraux. Les animaux ne seront pas réveillés à la fin de cette chirurgie mais de nouveau anesthésiés profondément afin de récupérer le cerveau pour différentes analyses.
Devenir
La totalité des animaux du projet (n=480 ; 14 groupes) auront une perfusion intracardiaque afin de récupérer les tissus pour des marquages immunohistochimiques.
Remplacement
Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle informatique mimant de manière aussi complexe la physiologie et la physiopathologie du syndrome vestibulaire. De manière identique, les modèles in-vitro ne peuvent pas s’appliquer dans le cadre de ce projet puisque nous avons besoin de l’individu dans son ensemble, autant au niveau du système nerveux central (pour les modifications au niveau cortical) qu’au niveau périphérique (informations quant à l’équilibre postural et locomoteur, et la compensation des déficits vestibulaires). Les objectifs même de cette étude axée sur la compréhension des mécanismes de plasticité mis en jeu après une atteinte vestibulaire et leur corrélation avec la récupération fonctionnelle nécessitent le recours à des animaux. Par ailleurs, l’étude des mécanismes neurochimiques nécessite une approche post-mortem sur coupes histologiques. Nos approches invasives ne pouvant être utilisées chez l’humain, l’utilisation de rats est donc nécessaire et incontournable et n'est pas remplaçable par d’autres modèles alternatifs.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est limité à son strict minimum. Le nombre d’animaux par groupe a été fixé au regard de la littérature sur les modifications cérébrales à savoir n=10/groupe/sexe. Certains animaux pourraient probablement être écarteés de notre étude pour l’une des causes suivantes : une défaillance physiologique de l’animal, une mauvaise diffusion de la solution chimique à travers le tympan, des problèmes techniques (parasitage des enregistrements cérébraux…). Ce qui nous amène à fixer le nombre de rats par groupe à n=12/sexe mais nous pourrons réduire le nombre d’animaux à n=10/sexe si aucun animal n’est écarté.
Raffinement
Avant l’administration d’une solution chimique à travers le tympan pour induire les déficits vestibulaires, les animaux sont sous anesthésie générale. La température de l’animal est maintenue avec une couverture chauffante thermorégulée, et une solution est appliquée sur les yeux pour l’hydratation oculaire. Avant le réveil de l’animal, une solution sera injectée pour sa réhydratation et ainsi compenser les pertes liquidiennes lié à la chirurgie. Les biberons des cages des animaux seront équipés d’une pipette allongée et une solution nutritionnelle complète sera fournie dans la cage des animaux pour faciliter l’hydratation et l’alimentation durant la première semaine post-lésion. Le suivi de poids, ainsi que l’évaluation de l’apparence et du comportement des animaux (réalisée avec une grille de score adaptée pour reconnaitre les points limites et actions à entreprendre mais également les points d’arrêts de l’expérimentation), sont effectués quotidiennement durant la première semaine, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin des tests comportementaux. Les animaux sont habitués à l’expérimentateur et à la salle d’expérimentation pendant 1 à 2 semaines pour limiter le stress. Une récompense (riz soufflé chocolaté) est donnée aux animaux après les tests comportementaux avant leur retour dans l’animalerie. Avant de réaliser les enregistrements cérébraux, les animaux sont sous anesthésie générale. L’hydratation de l’animal est maintenue et renouvelé toute les heures grâce à une solution injectable. Pour faciliter la miction de l’animal pendant la chirurgie, un palpage de la vessie sera réalisé. Un analgésique sera également administré à l’animal avant incision au niveau du crâne pour pouvoir accéder au cerveau. Une solution est appliquée sur les yeux pour l’hydratation oculaire et la température de l’animal est maintenue avec une couverture chauffante thermorégulée. Tout au long de la procédure chirurgicale des points limites ont été définis visant à éviter, réduire ou supprimer la douleur ou la souffrance de l’animal. Une fois les enregistrements cérébraux terminés, les animaux sont de nouveau anesthésiés profondément avant de réaliser une perfusion intracardiaque et de récupérer leurs cerveaux.
Choix des espèces
Les études antérieures dans le domaine de la plasticité post-lésionnelle du cortex cérébral ont été menées chez l’humain, le primate non-humain et, majoritairement, chez le rat. Par ailleurs, les études développées dans le laboratoire au niveau du cortex somesthésique ont été réalisées chez le rat avec des approches électrophysiologiques, immunohistochimiques et comportementales. Les études du laboratoire dans ce domaine constituent des études de référence importantes pour l’avancée de notre projet. De même, les tests comportementaux visant à évaluer les déficits vestibulaires et leur récupération sont bien standardisés dans les études conduites chez le rat et sont maîtrisés dans notre laboratoire. Afin d’étudier la plasticité post-lésionnelle du système nerveux, les animaux utilisés seront âgés de 3 mois (± 15 jours), chez qui le système nerveux est considéré comme mature.
Étude de l’influence des neurones sensoriels Nav1.8+ sur l’effet antitumoral des chimiothérapies dans des modèles murins de tumeurs mammaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Certaines des souris utilisées développent spontanément des tumeurs sur leurs dix glandes mammaires vers quatorze à seize semaines, d'autres reçoivent à quatre semaines une toxine qui détruit une partie de leurs neurones de la douleur. 3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent des adénocarcinomes mammaires, subissent des chimiothérapies, des injections péritumorales et l'implantation chirurgicale d'une micropompe, sans qu'aucun analgésique puisse leur être donné puisque le projet porte justement sur les neurones de la douleur, et le porteur affirme pourtant qu'en respectant les limites de taille des tumeurs elles n'atteindront jamais le stade de la souffrance. La mise à mort, entre seize et vingt-huit semaines, sert à prélever les tumeurs, les poumons, la rate, les ganglions lymphatiques et les ganglions rachidiens.
Objectifs
Il apparait de plus en plus évident que les systèmes nerveux et immunitaire travaillent de concert pour détecter les menaces, assurer la défense de l’hôte et maintenir ou restaurer l’homéostasie. Leur interaction repose sur l’action de molécules libérées par les fibres nerveuses innervant les tissus, capables de moduler les fonctions des cellules immunitaires, et vice-versa. Les glandes mammaires saines et les tumeurs mammaires murines sont innervées par ces fibres nerveuses impliquées dans la perception de la douleur et pourraient influencer la progression tumorale en fonction du statut inflammatoire des tumeurs. L’objectif principal de ce projet est donc d’examiner en détail l’influence potentielle de certaines de ces fibres nerveuses (Nav1.8+) sur la croissance tumorale et la réponse immunitaire antitumorale, en particulier lors de traitements chimiothérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’influence des fibres nerveuses Nav1.8+ sur la régulation de la réponse immunitaire antitumorale et l’effet thérapeutique des chimiothérapies reste peu exploré. Outre son aspect fondamental, la compréhension des mécanismes sous-tendant cette régulation permettrait d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques combinées aux chimiothérapies. L’étude de l’influence des nocicepteurs sur la croissance tumorale et la réponse immunitaire anti-tumorale lors de traitement chimiothérapeutiques revêt donc une pertinence clinique évidente. Notamment, cette étude pourrait apporter des éclaircissements sur la prise en charge de la douleur provoquée par ces traitements, et déterminer si celle-ci influe sur la réponse antitumorale.
Procédures
Certaines souris seront soumises à une procédure chirurgicale afin de d'implanter une micro pompe osmotique. L'ensemble des injections (Intrapéritonéales, sous-cutanées, péri-tumorales) seront réalisée sous anesthésie gazeuse légère (isofluorane) et n’excèdent pas 10 secondes. Les souris subiront des prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie gazeuse sans nuisance pour l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront porteurs d’un ou plusieurs adénocarcinomes mammaires et seront soumis à des traitements chimiothérapeutiques, susceptibles de déclencher des douleurs chez les animaux. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d’explorer l’effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne pourra être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Certaines lignées de souris utilisées dans ce projet développent des tumeurs mammaires au niveau des 10 glandes mammaires aux alentours de 14-16 semaines. Cependant, par expérience, en respectant les limites de taille des tumeurs, les souris n’atteindront jamais le stade de souffrance ou de difficulté de mouvement aux temps auxquels elles seront mises à mort (entre 16 et 28 semaines). Dans ce projet, les souris seront soumises à diverses interventions (injection de cellules, agents chimiques, actes chirurgicaux) susceptibles de provoquer des douleurs allant de modérées à sévères, ainsi qu'un stress de durée variable, allant de courte durée (10 secondes) à plus longue durée (1 heure).
Devenir
Mise à mort des animaux à la fin des procédures expérimentales pour récupérer les organes d'intérêts (tumeurs, poumon, ganglion lympahatiques, rate, ganglions de la corne dorsale)
Remplacement
Notre hypothèse est que les fibres nerveuses Nav1.8+ pourraient influencer l’effet thérapeutique des chimiothérapies et la réponse immunitaire antitumorale. Compte tenu de la nature même du projet, qui nécessite d’effectuer des traitements de chimiothérapies sur des individus malades, seuls des modèles animaux sont utilisables pour répondre à ces questions. De plus, la tumeur est un micro-environnement complexe qui ne peut pas être modélisée in vitro et in silico, particulièrement en ce qui concerne son innervation sensorielle. Cependant, pour la recherche des mécanismes de l’interaction neurone-cellules immunitaires-cellules tumorales, nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques ex vivo déjà maitrisées au laboratoire, telles que la coculture de neurones, de cellules tumorales et de cellules immunitaires. De même, pour comprendre l’effet spécifique des chimiothérapies sur l’activation neuronale, nous tenterons d’effectuer ces traitements sur des cultures de neurones
Réduction
Le plan de nos expériences est construit de sorte à limiter le nombre de souris au maximum. Le modèle d’induction d’un adénocarcinome mammaire est très bien décrit et maitrisé au sein du laboratoire. Ainsi, la pousse tumorale aura lieu dans quasiment 100% des souris. Des expertises antérieures de certains membres de l’équipe, enrichies par des recherches bibliographiques, nous ont permis de déterminer le nombre de souris nécessaires par expérience. Ce nombre a été également déterminé afin de répondre aux exigences de tests statistiques permettant d’obtenir une différence clinique et significative. Pour chaque groupe d'animaux utilisé, tous les paramètres quantifiables seront vérifiés (poids, taille de la tumeur, marqueurs sanguins, comportement) et tous les organes nécessaires à notre étude seront prélevés (tumeur, rate, foie, poumons, ganglions lymphatiques drainant et ganglion rachidien de la racine dorsale (DRG)) afin d'éviter de répéter des expériences inutiles. Pour minimiser l'impact du microbiote intestinal sur le développement tumoral et donc la variabilité de nos expériences, nous avons choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec leurs contrôles de même portée respectifs et non avec des souris de type sauvage.
Raffinement
Pour réduire le stress des animaux, un temps d'acclimatation d'au minimum une semaine sera respecté après un transfert d'une animalerie à l'autre ainsi qu'avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 souris par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons en dôme. Les souris sont nourries et boivent ad libitum et sont libres de leur déplacement. Pour réduire la souffrance : une surveillance quotidienne est réalisée. Les points d’observation seront réalisés quotidiennement suivant le développement tumoral et consisteront en une vérification du poids, de la vivacité et de l'état du pelage et du comportement général des animaux, ainsi que de la taille et de l’aspect de la tumeur. Une souris qui aura perdu 20% de son poids initial sera systématiquement mise à mort. De la nourriture humide sera déposée systématiquement dans la cage des animaux à partir du moment où la taille des tumeurs atteindra 200mm3 pour faciliter au maximum l'alimentation.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle idéal pour notre étude. Le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme (dans notre cas, les schémas des systèmes immunitaires et neuronaux sont très similaires entre l’homme et la souris), l’état actuel des connaissances, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de génération court font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaire et nerveux. De plus, le modèle murin est un modèle de choix par l'existence de souris génétiquement modifiées. Des souris d'âge minimum de 7-8 semaines seront utilisées afin d'avoir un système immunitaire et sensoriel mature. Certaines souris seront traitées à la résinifératoxine et à la toxine diphtérique, respectivement, à l’âge de 4 semaines. En effet, l'injection doit être effectuée le plus précocement possible lors du développement du système nerveux afin d'obtenir une déplétion optimale et spécifique de cette sous-population neuronale.
Mieux comprendre la physiopathologie de la dénutrition sévère et son dimorphisme sexuel lors d’interventions probiotiques et vaccinales
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Sevrées à 21 jours puis nourries quatre à huit semaines avec un régime carencé en macronutriments et en micronutriments, des souris juvéniles reçoivent ensuite par gavage des probiotiques, une souche vaccinale, puis une souche bactérienne virulente qui provoque une infection intestinale. 1 140 souris vont être utilisées, 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 660 dans des procédures d'un niveau sévère, avec six prélèvements sanguins caudaux par animal. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le porteur écrit pourtant que son modèle "ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance", tout en reconnaissant que la combinaison de la dénutrition et de l'infection peut faire souffrir les souris non vaccinées.
Objectifs
Près d'une personne sur trois dans le monde souffre de malnutrition. L'apparition précoce de la malnutrition a des conséquences désastreuses plus tard dans la vie. Au moment du sevrage, un changement du microbiote intestinal (flore intestinale) se produit et induit une réaction immunitaire qui protège des pathologies futures liées au système immunitaire. La malnutrition entrave ce processus, entraînant une plus grande sensibilité aux maladies non transmissibles, aux infections et une diminution de l'efficacité vaccinale. Développer de manière durable des thérapies nutritionnelles pour contrer la dénutrition est une priorité sanitaire mondiale notamment chez les enfants souffrant de dénutrition sévère aigüe (Severe Acute Malnutrition, SAM). La guérison de la SAM nécessite la prise en compte simultanée des paramètres de croissance, immunitaires et du microbiote intestinal. De par sa complexité, le modèle animal reste incontournable. Récemment, nous avons développé un modèle de SAM chez la souris mâle juvénile qui récapitule fidèlement les principales caractéristiques de la SAM observés chez les enfants. La prépondérance des différences entre les hommes et les femmes dans la malnutrition plaide en faveur de l'inclusion des deux sexes dans la recherche, et lors de la conception de thérapies. Dans notre modèle murin de la SAM, nous avons démontré que le microbiote intestinal et l'immunité intestinale ne sont pas restaurés lors d’une intervention nutritionnelle et ce malgré un retour de croissance. Il faut donc étudier comment restaurer l’ensemble de ces paramètres simultanément. Les probiotiques sont des microorganismes vivants et non pathogènes qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités suffisantes, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte. Certaines souches ont démontré leur capacité à limiter les retards de croissance et les infections intestinales. Dans ce projet nous étudierons donc 1/ le dimorphisme sexuel de la SAM, 2/ l’impact de la SAM sur l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection à Salmonella enterica Typhimurium, 3/ la capacité de probiotiques à améliorer la SAM et 4/ la capacité de probiotiques à améliorer l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection intestinale.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : ce projet permettra l'identification des mécanismes à l'origine des différences entre les mâles et les femelles dans la dénutrition ainsi que la caractérisation de ses effets lors d’interventions vaccinales et probiotiques. Ce projet permettra non seulement de disséquer la pathogénie de la dénutrition mais aussi de fournir les connaissances manquantes pour améliorer les interventions thérapeutiques. Ce projet permettra notamment l’identification de nouvelles thérapies pour restaurer le microbiote intestinal et l'immunité, pour in fine renforcer l’écosystème intestinal général face aux infections et optimiser la formulation des régimes thérapeutiques et des vaccins. Ce projet fera avancer les connaissances dans les domaines de la nutrition, l'immunité, l'infection, la vaccinologie et le microbiote intestinal. Bénéfices à long terme : ce projet fournira des informations importantes pour concevoir des thérapies nutritionnelles adaptées aux garçons et aux filles souffrant de malnutrition. Des stratégies multifactorielles comprenant des probiotiques devraient fournir des approches thérapeutiques durables en favorisant aussi bien la reprise de poids et la croissance, que la maturation du système immunitaire et du microbiote intestinal.
Procédures
Consommation d’un régime alimentaire carencé en macro- et micronutriments durant 4 semaines ou 8 semaines. Prise de poids sur animaux vigiles quotidienne ou hebdomadaire, durée estimée à 2 minutes/souris. Contention des souris associée à l’administration par gavage de probiotiques, de molécules servant à étudier la perméabilité intestinale ou la capacité d’absorption des graisses, d’une solution de glucose (2g/Kg pour suivi glycémique), de souche vaccinale et souche virulente de bactéries causant des infections intestinales sur animaux vigiles : durée estimée à environ 30 secondes/souris (gestes de contention 10 secondes + de gavage 10 secondes). Mise à jeun 4h00 ou sur la nuit : 1 fois durant la procédure. Prélèvements sanguins sous-mandibulaire sur animaux endormis : 1 à 2 fois/souris sous mélange à 4% d'isoflurane et 96% d'oxygène. Prélèvements sanguins caudaux sur animaux vigiles : 6 fois/souris.
Impact sur les animaux
Le but de ce projet est de suivre l’impact d’une alimentation entrainant une dénutrition sévère sur la physiologie, l’immunité et le microbiote intestinal des individus. Grâce à notre expérience dans ce domaine, nous savons aujourd’hui que notre modèle murin de malnutrition ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance chez les mâles juvéniles. Nous nous attendons à ce que les femelles juvéniles soient moins sévèrement impactées du fait de leur capacité à mieux résister à certaines carences en vitamines. Dans ce projet, nous nous intéressons donc à caractériser les différences entre mâles et femelles lors d’une dénutrition apportée par un régime fortement carencé en macro- et micronutriments. Ces différences seront également étudiées lors d’essais vaccinaux réalisés avant l’infection. L’administration du vaccin ne devrait pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Par contre la combinaison d’une malnutrition et d’une infection intestinale peut engendrer une souffrance liée à une réponse immunitaire faible chez les groupes d’animaux qui n’auront pas été vaccinés. Afin de renforcer le système immunitaire et contrer les effets de la dénutrition, des probiotiques seront également testés chez les souris dénutries et vaccinées. L’administration des probiotiques ne devraient pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Des gavages seront également réalisés sur animaux vigiles. Les gestes de contention (10 secondes), de gavage (10 secondes) génère du stress chez l’animal que nous évaluons à environ 30 secondes/intervention de ce type. En fonction de la procédure cette intervention est occasionnelle, hebdomadaire ou quotidienne. De même, nous allons mettre à jeun les souris 4h00 ou sur la nuit ainsi que réaliser des prélèvements sanguins qui généreront également du stress.
Devenir
De par la nécessité de prélever des organes vitaux pour analyses, tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures.
Remplacement
De nos jours la complexité de l’écosystème intestinal et notamment l’interaction entre système immunitaire et microbiote intestinal ne peut être reproduite in vitro, les organoïdes ne peuvent pas remplacer l’animal dans ce projet. L’étude de la physiologie, de l’immunité et du microbiote intestinal des individus, implique de facto l’utilisation d’animaux.
Réduction
Grâce à un test effectué au préalable sur 6 souris femelles (3 souris sur régime contrôle (Ctrl) + 3 souris sous régime SAM), nous avons pu réaliser un test statistique basé sur la prise de poids hebdomadaire des souris, et calculer l’effectif nécessaire par expérience pour obtenir une puissance du test 80% minimum, avec un risque de se tromper de 5%. Ceci nous amène à un nombre sujets de 5/groupe pour une puissance du test de 81%. Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de souris utilisées. En parallèle des souris femelles, nous allons utiliser certaines souris mâles que nous allons décomptés d’une autre DAP et non de cette DAP. Nous allons également étudier certains paramètres avant la mise à mort des souris, qui seront par la suite mises à mort pour l’analyses d’autres paramètres. Nous aurons donc besoin de 5 souris/groupe. Nous réaliserons 3 expériences indépendantes pour chaque lot de souris enrôlé dans chaque procédure. Le nombre de souris utilisé est justifié au sein de chaque procédure expérimentale, soit 1140 souris. Nous aurons également 60 souris mâles qui seront décomptés dans une autre DAP.
Raffinement
Les souris seront hébergées à raison de 5 souris/cage maximum avec la nourriture et l’eau fournies à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes pour la surveillance des souris seront réalisées plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. La souffrance potentielle induite par ce régime et son impact sur l’efficacité vaccinale sera prise en compte dans le respect du bien-être animal, et les souris seront observées quotidiennement ou 2 fois par jour afin de prévenir l’apparition de points limites : prise alimentaire et poids corporel, signes cliniques (fièvre, respiration), comportement, apparence générale (poils et sécrétions). Des mesures adéquates seront prises pour soulager la douleur comme l’administration éventuelle d’un analgésique.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de caractériser l'impact d'une dénutrition sévère sur la physiologie, le système immunitaire et le microbiote intestinal afin de proposer un régime thérapeutique durable aux enfants souffrant de SAM. Il est maintenant bien reconnu que le système immunitaire et le microbiote intestinal de la souris sont suffisamment proches de celui de l’Homme pour pouvoir utiliser la souris comme modèle avant qu’une transposition ne soit faite chez l’Homme. De plus, l’épithélium intestinal murin est anatomiquement et physiologiquement proche de celui de l’Homme. Aucun autre organisme modèle de petite taille (danio zébré, drosophile) ne possède une telle structure aussi similaire. Par ailleurs, le modèle murin est celui pour lequel les effets de la dénutrition ont été validés chez les souris mâles. Enfin, le modèle infectieux que nous souhaitons utiliser est très bien décrit et étudié chez la souris. L’ensemble de ces critères fait de la souris l’espèce animale la plus appropriée pour effectuer notre étude. Nous utiliserons des souris mâles et femelles sevrées à 21 jours afin d’être au plus proche des conditions de développement de la SAM observée chez l’Homme entre trois et 24 mois lors du sevrage. En effet, l’épithélium intestinal des rongeurs est immature à la naissance. L’intestin grêle de la souris continue à se développer après la naissance et sa maturation est fortement associée à la période de sevrage. Le sevrage est donc une étape clef dans la structuration de l’épithélium intestinal, le développement immunitaire et la maturation du microbiote intestinal des rongeurs. Par ailleurs notre étude chez les mâles a montré que la dénutrition induite à 21 jours reproduit les principaux critères de dénutrition décrits chez l’Homme. A cet âge la maturité du système immunitaire, la physiologie et la maturation du microbiote intestinal sont en cours de développement chez la souris, tout comme ça l’est chez l’enfant à bas âge.
Évaluation du potentiel thérapeutique d’un composé d’intérêt dans un modèle murin d’épilepsie du lobe temporal
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des points limites sont censés interrompre l'expérience avant la mort, mais environ 20 % des souris peuvent mourir directement des crises provoquées. 42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Jusqu'à neuf injections en quatre jours déclenchent chez elles un état de mal épileptique, puis une partie subit l'implantation de sondes cérébrales et vit isolée jusqu'à cinq semaines, avec vingt-quatre à trente-deux injections supplémentaires et des enregistrements allant jusqu'à dix heures par jour pendant douze jours. Le bénéfice annoncé pour les patients pharmacorésistants, éviter une résection chirurgicale du foyer épileptique, reste au conditionnel, quand l'état de mal épileptique, lui, est infligé d'emblée.
Objectifs
L’épilepsie est l’une des affections neurologiques les plus fréquentes avec une prévalence de près de 1 pour cent au niveau mondial. En particulier, l’épilepsie du lobe temporal mésial (mTLE) avec sclérose hippocampique est la forme la plus fréquente d’épilepsie focale chez l’adulte. Près de 30 pour cent des patients souffrant de cette forme d’épilepsie ne répondent pas aux traitements antiépileptiques conventionnels et sont dits pharmacorésistants. Une résection chirurgicale du foyer épileptique est alors parfois la seule option thérapeutique disponible pour ces patients. L’objectif du projet sera de tester spécifiquement l’effet et le potentiel thérapeutique d’une administration répétée d’une molécule dans un modèle murin d’épilepsie expérimentale. Spécifiquement, nous testerons l’effet de ce composé sur la fréquence des crises et des activités de type épileptique dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de valider le potentiel thérapeutique d’une nouvelle classe de molécules dans les épilepsies du lobe temporal, offrant une nouvelle piste thérapeutique pour les patients pharmacorésistants et leur évitant ainsi le recours à une procédure chirurgicale.
Procédures
Les animaux recevront des injections intrapéritonéales et sous-cutanées, sur animal vigile (durée inférieure à 1 minutes par injection, 9 injections maximum réparties sur 4 jours) afin d’induire un état de mal épileptique jusqu’à la fin de la procédure (durée 9 semaines maximum). Une partie des animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptées pour l’implantation de sondes au niveau du cerveau (1 fois, durée 1h). Ils seront ensuite hébergés individuellement jusqu’à la fin de la procédure, soit 5 semaines maximum. Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, afin d’évaluer l’effet d’un composé sur notre modèle pathologique, les animaux opérés recevront des injections d’une molécule d’intérêt ou de son contrôle pendant 2 périodes de 6-8 jours, 2 fois par jour (matin et soir), soit 24-32 injections intrapéritonéales maximum (durée inférieure à 1 minute). Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, l’activité électrique du cerveau des animaux opérés sera mesurée, pour cela ils seront connectés à un système d’enregistrement, vigiles et libres de se déplacer durant les mesures (maximum 10 heures par jour, pendant 12 jours consécutifs). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L'injection de la molécule permettant de mettre en place notre modèle chez la souris peut entraîner une perte de poids, une fatigue et une réduction de la mobilité pendant quelques jours. Environ 20 pour cent des souris peuvent mourir à cause de crises épileptiques sévères. Les injections peuvent causer une légère douleur au point d'injection. Les manipulations nécessaires pendant les procédures peuvent être stressantes pour les souris. L'implantation d'électrodes dans le cerveau peut causer une douleur temporaire et une légère perte de poids. Les souris implantées seront isolées pendant trois à cinq semaines, ce qui peut également être une source de stress pour elles.
Devenir
Une partie des animaux sont susceptibles de décéder spontanément des suites de l’état de mal épileptique. Le reste des animaux seront euthanasiés en fin de période de maintien prévue ou plus tôt en cas d’atteinte d’un point limite. En effet, ces animaux ayant subi un état de mal épileptique, il n’est pas possible de les réutiliser pour un autre projet.
Remplacement
Les composés utilisés dans cette étude ont déjà été testés sur des modèles cellulaires et des modèles humains (tissus postopératoires) afin d’en prédire le potentiel thérapeutique. Toutefois, ces modèles ne permettent pas d’en tester directement l’effet sur des crises d’épilepsie. Pour cela, le recours à un modèle animal est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux (42 souris) mis en œuvre dans ce projet est basé sur les travaux précédents du laboratoire et de la littérature. Ainsi un nombre de 10 animaux par groupe a été défini, en prenant en compte : - la mortalité liée à l’induction d’un état de mal épileptique (environ 20 pour cent) - le taux d’échec d’induction d’un état de mal épileptique (environ 25 pour cent) - l’absence de développement d’une épilepsie chronique (environ 15-20 pour cent) afin d’atteindre un nombre d’animaux expérimentaux minimal de 10 par groupe avec 2 groupes expérimentaux (test et contrôle). Nous analyserons nos résultats avec les tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux agréés, en groupes sociaux de 5 individus maximum (sauf en post-chirurgie où ils seront en hébergement individuel, identifié et avec enrichissement complémentaire) et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification et d’un bâtonnet à ronger au minimum. Ils auront accès à l’eau et à une nourriture adaptée à leur stade physiologique ad libitum. Une observation quotidienne des animaux sera assurée par l’équipe de zootechnie. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront pris en charge avec les soins nécessaires ou exclus du protocole. Depuis plusieurs années, nous avons raffiné notre protocole d’induction d’état de mal épileptique chez la souris, nous avons testé et comparé plusieurs protocoles d’induction et retenu celui offrant le plus haut taux de succès (survie de l’animal et développement d’une épilepsie chronique). Un soutien nutritionnel et une surveillance de la récupération des animaux sont assurés lors de l’induction du modèle pathologique. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique adaptée. Nous nous assurerons du maintien de la température de l’animal durant toute la durée de l’anesthésie. Après la chirurgie la surveillance des animaux sera renforcée pendant au minimum une semaine. A partir de la chirurgie les animaux seront hébergés seuls afin d’éviter tout endommagement du matériel mis en place, ils bénéficieront alors d’un d’enrichissement complémentaire (lanière de kraft et maison en cellulose). Des points limites sont définis et seront respectés afin d’éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Le modèle rongeur est standard dans notre domaine de recherche. D’autre part, les paradigmes d’induction de crises que nous souhaitons tester ont été très bien caractérisés chez la souris. Enfin, nous avons conduit sur cette espèce des essais préalables dans ce modèle visant à l'optimiser, en réduisant notamment les doses de molécules injectées pour la mise en place du modèle, la mortalité et la fréquence des échecs d'induction, limitant ainsi le nombre d'animaux mis en œuvre. En outre, les procédures d’anesthésie et d’analgésie sont également très bien standardisées dans cette espèce. Les animaux seront étudiés à 8 semaines (stade jeune adulte) qui est le stade le plus proche des conditions de la pathologie humaine.
Rôle de différents types de cellules dendritiques dans l’infection cutanée par le HSV-1
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
724 souris vont être utilisées, toutes tuées deux jours après l'inoculation pour prélèvement d'organes, dont 100 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 624 un niveau modéré. Sous anesthésie, elles sont tondues, dépilées à la crème, puis la peau du flanc est abrasée avant l'inoculation du virus de l'herpès et la pose d'un pansement. Le porteur décrit une douleur modérée au réveil pendant un à deux jours, une irritation cutanée possible, des lésions vésiculaires au cinquième ou sixième jour, et le risque que les souris se coincent les dents dans le pansement pendant la nuit. Les anti-douleurs, écrit-il, "ne peuvent être utilisés sans compromettre les résultats expérimentaux".
Objectifs
La majorité de la population est chroniquement porteuse du virus de l’Herpès, suite à une infection dans la petite enfance lors d’un contact salivaire. Après son excrétion sur la peau, le virus de l’Herpès migre dans le ganglion nerveux du trijumeau, où il établit une infection latente. Il devient dormant et les hôtes infectés peuvent rester asymptomatiques toute leur vie. Des facteurs génétiques et environnementaux peuvent déclencher une réactivation rapide du virus. Une réactivation régulière peut entraîner l'apparition précoce de troubles auto-immuns (lupus). Des troubles cutanés sous-jacents (dermatite atopique) peuvent provoquer le développement d'un eczéma herpétique nécessitant souvent une hospitalisation. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la reconnaissance et du contrôle immunitaire du virus de l’Herpès est essentielle pour progresser vers la mise au point de nouvelles thérapies visant à éradiquer ce virus ou à mieux soigner ses effets pathologiques. In-vitro, les cellules dendritiques de type 1 (cDC1s) sont capable de réguler l’activation des lymphocytes contre le virus de l’Herpès. Les lymphocytes jouent un rôle important dans le contrôle de la réactivation du virus mais on ne sait pas si c’est le cas au cours de l’infection cutanée initiale. Les cellules dendritiques plasmacytoides (pDCs) produisent des interférons lors d'une infection virale. Les interférons sont essentiels pour lutter contre les infections virales mais ils peuvent parfois avoir des effets nocifs. Les pDCs sont essentielles au contrôle d'une infection généralisée par le virus de l’Herpès, mais leur rôle est controversé dans le cas d’infections locales. ; il n’a jamais été abordé dans le cas d’une infection cutanée. Dans ce projet nous voulons étudier 1/ la cinétique des différentes phases de la réponse immunitaire précoce à une infection cutanée par le virus de l’Herpès ; 2/ le rôle des pDCs et des cDC1s dans la réponse immunitaire à une infection cutanée par le virus de l’Herpès ; 3/ le rôle des pDCs et des cDC1s dans la génération de la réponse immunitaire mémoire contre le virus de l’Herpès.
Bénéfices attendus
Nos travaux contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la reconnaissance et du contrôle immunitaires du virus de l’Herpès. Ces recherches seront essentielles pour progresser vers la mise au point de nouvelles thérapies permettant de lutter contre les complications graves observées chez certains patients infectés. Notre Laboratoire dispose d’ores et déjà d’outils pour étudier le rôle de certains gènes, à la fois chez la souris et chez l’homme.
Procédures
1ère type d’intervention : sous anesthésie générale, les souris seront tondues et dépilées. Elles subiront ensuite une abrasion superficielle de la peau sur le flanc gauche suivie d’une inoculation du virus, puis elles seront pansées. 2 jours après, les souris seront anesthésiées afin de retirer les pansements puis elles seront mises à mort pour analyses. 2ème type d’intervention : les souris recevront un traitement par ingestion ou injection pour éliminer un groupe donné de cellules immunitaires. Sous anesthésie générale, les souris seront tondues et dépilées. Elles subiront ensuite une abrasion superficielle de la peau sur le flanc gauche et une inoculation locale du virus puis seront pansées. 2 jours après, les souris seront anesthésiées afin de retirer les pansements. 27 jours après une primo-infection, les souris recevront un second traitement par ingestion ou injection pour éliminer un groupe donné de cellules immunitaires. Sous anesthésie générale, les souris seront tondues et dépilées. Elles subiront ensuite une abrasion superficielle de la peau sur le flanc droit et une seconde inoculation locale du virus puis seront pansées. 2 jours après, les souris seront anesthésiées afin de retirer les pansements. Les souris seront mises à mort pour analyses.
Impact sur les animaux
La piqure d’aiguille pour l’injection d’anesthésie entraine une légère douleur de courte durée. L’application de crème dépilatoire au-delà du temps préconisé peut entrainer une irritation modérée de la peau de l’animal pendant moins d’une journée . L’abrasion du flanc sous anesthésie peut entrainer une douleur modérée au réveil de la souris, d’une durée d’un à deux jours , une fois les effets de l’analgésie dissipés. L'inoculation des flancs au virus de l’Herpès entraîne l'apparition de lésions vésiculaires dans l’épide au 5ème/6ème jour qui guérissent spontanément à partir du 7ème jour. Durant la nuit suivant la pose de bandage post-infection, les souris peuvent se coincer les dents dans le pansement s’il n’est pas bien réalisé ce qui entraine des difficultés à se mouvoir et s’alimenter. La technique d’administration de substance par voie intragastrique peut être modérément douloureuse, le temps de l’intervention , si le geste n’est pas maitrisé.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, la totalité des animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse par divers protocoles. Soit un total de 724 animaux.
Remplacement
Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres de la réponse immunitaire au cours d’une infection virale in vivo. L’importance et la complexité des nombreuses interactions cellulaires nécessaires au développement du système immunitaire ainsi qu’à la mise en place d’une réponse immunitaire suite à une infection virale justifient l’utilisation de modèles d’études vivants. Ainsi, l’intégration d’un système vivant et complet est indispensable.
Réduction
Nous réaliserons des expériences pilotes, afin de réduire la variabilité et le nombre de souris utilisées. Ces expériences nous permettront également de définir la temporalité optimale des analyses pour nos études. Selon les résultats, nous pourrions réduire le nombre total de souris utilisées à 622 : soit une réduction possible de 102 souris. Les effectifs d'animaux nécessaires seront réduits le plus possible. Nous travaillons avec des souris de fond génétique pur, ce qui nous permet de réduire la taille des groupes expérimentaux à 5 souris pour chaque condition, et afin de répondre aux exigences des tests statistiques nécessaires à effectuer. Pour les souris non infectées, la variabilité étant moindre, nous réduirons la taille des groupes à 3 individus par condition. Aussi, nous répéterons chaque expérience de façon indépendante seulement 2 fois.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, ils seront gardés tant que possible en groupe. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids. Pour la partie infectieuse, les animaux seront rapidement transférés en animalerie de confinement et immédiatement hébergés dans des cages ventilées étanches. Ce type d’hébergement offre une protection contre les pathogènes et prévient aussi toute contamination entre cages adjacentes. Les animaux seront observés quotidiennement, avec attribution d’un score clinique. En fonction de ce score, des mesures adéquates seront prises pour minimiser la souffrance des animaux. Pour un score faible, ( pas de souffrance ou seulement très légère), aucune mesure ne sera prise. Pour un score moyen, (souffrance modérée), l’accès à la nourriture et à l’eau sera facilité ainsi que l’ajout d’enrichissements supplémentaires pour nidation, et la surveillance sera accrue à deux fois par jour. Pour un score élevé (une souffrance ne pouvant être soulagée), les animaux seront immédiatement mis à mort. Les anti-douleurs ne peuvent être utilisés sans compromettre les résultats expérimentaux. Lors de la pose des pansements, une vérification sera réalisée le lendemain, afin de s’assurer que les animaux ne se sont pas coincés les dents dans les bandages. Dans le cas où les modèles de souris que l’on testera dans ce projet présenteraient une infection aggravée, nous solliciterons l’avis de la Structure du Bien-Etre Animal de notre établissement, afin d’adapter notre grille de score. L’ensemble des gestes techniques sur souris vigile sera effectué par du personnel expérimenté, afin de réduire le plus possible le stress des animaux.
Choix des espèces
La taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées, pour lesquelles des stratégies interventionnelles expérimentales sont nécessaires, y compris l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire humain. Des souris âgées de 6 à 12 semaines seront utilisées car elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires. Un écart type de maximum 2 semaines au sein d’un même groupe expérimental est défini afin de limiter les variabilités qui pourraient exister entre des souris d’un écart d’âge plus important.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
1 888 souris porteuses d'une modification génétique reproduisant la maladie d'Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 580 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection unique de virus modifié, soit dans la veine, soit directement dans le cerveau après ouverture du crâne sous anesthésie de quatre-vingt-dix à cent vingt minutes, avec barres d'oreille et risque de saignement. Deux tests de mémoire à court terme et d'apprentissage sont menés sur une journée ou après quatre à huit jours d'entraînement, avant un prélèvement de liquide céphalo-rachidien suivi de la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ni système synthétique ne reproduit la complexité architecturale des cellules du cerveau, et tient le recours aux modèles animaux pour "essentiel".
Objectifs
A l’heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper ou ralentir les maladies neurodégénératives. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de la thérapie génique, consistant à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau afin de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer (MA). Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié permettant de délivrer l’ADN au coeur même des cellules. Notre but étant de développer ces applications en clinique, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie chez les patients. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux virus modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle murin de la maladie MA. Notre objectif est donc de comparer l’efficacité thérapeutique de virus administrés soit par une injection intraveineuse, soit par une injection intracérébrale. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA.
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) codant pour la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives. La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative affectant les fonctions cognitives, notamment la mémoire, l’apprentissage ou encore le langage, et responsable d’une perte d’autonomie des patients. La maladie d’Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives et représente plus de 70 pourcents de l’ensemble des démences de la personne âgée. Environ 1 million de personnes sont touchées en France, avec 225 000 nouveaux cas chaque année. Plus de 35 millions de personnes sont touchées dans le monde.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec signes cliniques dommageables seront utilisés. Les animaux seront génotypés par un prélèvement de l'extrémité distale de la queue. Les animaux seront injectés une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (90-120 minutes sous anesthésie gazeuse après injection d’un anti-douleur et injection d'analgésique en post-opératoire). Deux tests comportementaux permettent de mesurer la mémoire à court terme, l’apprentissage et la mémoire des souris (selon le test, 1 session d’une journée ou des sessions d’entraînement de 4 à 8 jours avec un test effectué en une journée juste après la session d’entraînement ou jusqu’à 72h après) seront effectués afin d’évaluer les déficits cognitifs. Puis le jour d'euthanasie, les animaux seront anesthésiés et analgésiés, puis nous réaliserons un prélèvement du liquide céphalo-rachidien (20 minutes) et sanguin (1 minute) préalablement à l'euthanasie (pas de réveil entre les actes).
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1) Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observé suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) pourrait être observée (5 à 7 pourcents du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études),7) le stress engendré par les test comportementaux. 8) douleur de courte durée engendrée par le génotypage invasif par prélèvement de l’extrémité distale de la queue. 9) le phénotype dommageable de la lignée (modèle de maladie neurodégénérative (Maladie d’Alzheimer), déficits cognitifs).
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, impliquant donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux. Ceux-ci seront euthanasiés à la fin des actes prévus que ce soit à l’issu des procédures (avec prélèvement pour analyse) ou pour l’élevage (à la fin de la période reproductive, sans prélèvement).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (1888) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives.
Raffinement
Le geste de génotypage invasif est parfaitement maitrisé par les zootechniciens : prélèvement de la queue réalisé sur un animal très jeune où l’extrémité de la queue est peu sensible et cicatrise vite, au même moment que le tatouage pour limiter les manipulations, dans une pièce dédiée au calme, rapidement avec des ciseaux adaptés et désinfectés après chaque portée. Le souriceau est surveillé immédiatement après (absence de saignement et bonne reprise en charge par sa mère), puis 20-30 minutes après avant de replacer la cage sur le portoir d’hébergement. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’application locale d’anesthésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l’injection sur les yeux de l’animal. Une surveillance particulière de l’oeil sera faite en post-opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. L’applicateur est formé au geste d’injection intraveineuse. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. Le respect des points limites en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe contribuent au bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. A partir de 9 mois, les animaux seront pesés deux fois par semaine avec ajout de croquette/poudre sur le fond de la cage et observation attentive à chaque pesée. De plus, certains tests comportementaux étant réalisés sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux adultes (jusqu’à 14 mois d’âge) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 6 semaines puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections intracérébrales ou intraveineuses chez les souris adultes (entre 5 et 7 mois d'âge) et évaluerons les effets du traitement (entre 6 mois et 14 mois d'âge) à différents âges et stades de la neuropathologie afin de comparer les effets du traitement sur la neuropathologie et le comportement en fonction des deux voies d’administration.
Etude de la capacité d’un minétique synthétique de l’héparane sulfate à promouvoir la réparation et la régénération du tissu pulmonaire dans un monde murin de dommage alvéolaire diffus
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Anesthésiées, les souris reçoivent une instillation de toxine bactérienne directement dans la trachée, puis des injections répétées dans la veine de la queue, avant une heure d'exploration respiratoire sur animal éveillé. 2 028 souris vont être utilisées, dont 1 740 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur indique que le développement des lésions pulmonaires est indolore faute d'innervation sensitive du poumon, tout en prévoyant une insuffisance respiratoire sévère, une mortalité accrue, et une grille de score allant de l'immobilité aux vocalisations et à l'automutilation. Vingt-quatre, quarante-huit ou soixante-douze heures après l'induction, elles sont tuées pour prélever poumons, sang et liquide de lavage broncho-alvéolaire.
Objectifs
Ce projet vise à développer une thérapie régénérative pour le traitement des lésions pulmonaires tels que celles observées dans le syndrome de détresse respiratoire aigue, les exacerbations aigues de maladies pulmonaires fibrosante ou dans les pneumopathies sévères. Nous envisageons l'utilisation de mimétiques de polysaccharides pulmonaires afin d'améliorer la réparation du tissu pulmonaire et de permettre une récupération fonctionnelle après une agression pulmonaire aigue. Les effets bénéfiques seraient principalement liés à la régénération du tissu lésé en restructurant le réseau de molécule formant l’architecture pulmonaire et en limitant la fibrose. Le projet explorera la capacité de notre molécule à réduire l'inflammation, les altérations des mécanismes de formation de nouveaux vaisseaux et la fibrose. Cette thérapie a pour objectif d'éviter les séquelles de lésions pulmonaires aigues caractéristiques des dommages alvéolaires diffus.
Bénéfices attendus
La survenue de dommage alvéolaire diffus (DAD) est une véritable problématique dans l'évolution des maladies pulmonaires. La DAD est une réaction aiguë non spécifique du poumon commune au syndrome de détresse respiratoire aiguë chez au moins 50 pourcents des patients, mais aussi dans les exacerbations aiguës des maladies pulmonaires interstitielles fibrotiques, dans les pneumopathies sévères du COVID-19 ou dans d'autres conditions diverses, dues à une multitude d'agents nocifs (infections, médicaments, etc..). L'évolution clinique de la DAD peut être aiguë, définissant des formes sévères potentiellement mortelles de pneumonie interstitielle aiguë, ou subaiguë-chronique, qui, après un schéma histologique initial de DAD, évolue vers des pneumopathies interstitielles fibrosantes (PIF) ou une fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) avec une fibrose interstitielle étendue et une hypertension pulmonaire. Au cours de ces phases, des enzymes sont libérées et vont dégrader des protéines impliquées dans l’architecture du tissu. L'hypothèse de recherche de ce projet est que la molécule administrée par voie intra-veineuse chez la souris présenterait un potentiel thérapeutique pour lutter contre les lésions pulmonaires aigues en permettant une cicatrisation de l’épithélium pulmonaire. Ainsi cet agent (1) remplacera le réseau de molécule formant l’architecture pulmonaire remodelée suite à l'induction des lésions (2) améliorera la formation de nouveaux vaisseaux et la récupération alvéolaire, et (3) diminuera significativement le processus inflammatoire.
Procédures
La réalisation de ce projet nécessite l'induction de lésion pulmonaire aigue (72h). Dans un premier temps nous déterminons la dose optimale de toxine bactérienne nécessaire pour induire des lésions pulmonaires. Pour cela les animaux anesthésiés recevront 1 instillation intratrachéale (durée 3 minutes) de cet toxine ou de sérum physiologique. Suite à cela nous déterminerons les effets d'injections intraveineuses unique ou multiple d'agent thérapeutiques (Animaux vigiles, durée quelques secondes). Le groupe contrôle (animaux vigiles) recevra une injection intrapéritonéale d'anti-inflammatoire (durée quelques secondes). Après une exploration fonctionnelle respiratoire (animaux vigiles, durée 1h) les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d'organes (durée 10 minutes) afin de déterminer les mécanismes d'action de cet agent thérapeutique à 24h, 48h et 72h après induction des lésions pulmonaires. Enfin une étude du devenir de l’agent thérapeutique dans l’organisme (distribution dans les différents organes-10 minutes) sera réalisée à différents temps (5 min, 30min, 3h, 6h, 12h et 24h) après son administration par voie intra-veineuse.
Impact sur les animaux
L'administration de toxine bactérienne via la trachée est l'un des modèles de rongeurs les plus couramment utilisés pour induire des les lésions pulmonaires aigues. Dans ce modèle expérimental, le tissu pulmonaire est endommagé en 48 à 72h. Le modèle présente une réponse inflammatoire conduisant à des lésions au niveau des vaisseaux sanguins et alvéoles. Ces éléments sont des caractéristiques des patients atteints de lésions pulmonaires aigues. L'instillation par la trachée n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Le développement de lésions pulmonaires est également indolore du fait de l'absence d'innervation sensitive à la douleur dans le tissu pulmonaire. Elle peut néanmoins entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité plus importante. L’évaluation de la respiration de l’animal peut entrainer un stress. La contention lors des injections intrapériotnéales et intraveineuses peuvent induire un stress. Les injections IV répétées dans la queue des souris peuvent entrainer des blessures à la queue, des irritations, des saignements, une sensibilisation, des hématomes. Les injections intrapéritonéales peuvent entrainer des réactions au site d’injection et des lésions viscérales. Les anesthésies par voie intra-péritonéale sont suivies par l'euthanasie de l’animal (sans réveil). Lors de l’anesthésie gazeuse, les niveaux seront ajustés en temps réels afin d’éviter les risques anesthésiques.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasié pour prélèvement d'organes, du sang et du liquide de lavage broncho-alvéolaire. tous les prélèvements sont nécessaires pour répondre à la question scientifique.
Remplacement
La réalisation de ce projet nécessite l'induction de lésions pulmonaires in vivo. De fait, il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale in vivo à ce jour. D'autre part, l'étude des mécanismes d'action d'un mimétique de l'héparane sulfate dans le cadre d'une thérapie matricielle peut-être plus facilement entreprise chez la souris du fait de l'existence d'outils permettant une approche mécanistique plus poussée.
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqué est de 2028. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi sur la base de données, publiées ou non, et des calculs statistiques afin de définir le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif. Cela permet également de déterminer les points d'arrêt d'expérimentation les plus précoces et compatibles avec les objectifs du projet. Pour cela nous nous sommes basé sur la littérature existante ainsi que des tests de puissance et des statistiques issues de séries expérimentales précédentes prenant en compte les effets du lipopolysaccharide et la potentielle variabilité de nos paramètres physiologiques entre les différents individus.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi par groupes sociaux de 4 animaux par cage. La température de l’animalerie et l’humidité relative sont contrôlés en permanence. La nourriture sera fournie ad libitum et la photopériode sera de 12h/12h. L'enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification (bandes de papier naturel compacté) et d'abri en cellulose. Concernant l'insitllation intra-trachéale, celle-ci sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l'instillation n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu'a leur réveil complet. Afin d’améliorer le confort de l’animal suite à l’instillation intra-trachéale et afin de prévenir une perte de poids trop importante, un gel hydraté enrichi pourra être proposé au animaux afin de faciliter l’alimentation et la récupération des animaux dans les premières heures suivant la procédure. En fin de procédure, lors de l'anesthésie précédent l’euthanasie, la profondeur d'anesthésie sera vérifiées via l’observation des signes suivants: le relâchement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe de fermeture des paupiéres, une respiration calme. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour réduire le plus possible toute souffrance qu’auraient pu ressentir les animaux. Les points limites seront basés sur l'examen visuel des signes suivant: immobilité, difficultés respiratoires (râle, respiration rapide..), position anormale (dos vouté, couché sur le coté..), réduction de la mobilité (faiblesse musculaire, manque de coordination, tremblements, paralysie..), perte de poids rapide ou progressive, mauvais état du pelage (poil ébouriffé, mal entretenu..), vocalisation, pâleur des yeux ou des extrémités, automutilation. Pour cela, une échelle d'évaluation avec score est utilisée.
Choix des espèces
Ce projet nécessite d'induire des lésions pulmonaires aigues, de réaliser des explorations fonctionnelles respiratoires et de prélever des tissus. Il n'existe donc pas d'alternative à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques dans notre contexte. Le modèle murins de lésions pulmonaires induits par une toxine bactérienne permet d'explorer les mécanismes de plusieurs pathologies respiratoires aigues. C’est un modéle validé dans la littérature et courament utilisé. Il est parfaitement décrit et fournit des informations utiles pour la découverte de nouveaux biomarqueurs et de nouvelles cibles médicamenteuses. Pour réaliser notre étude nous avons besoin que le système ventilatoire soit mature et fonctionnel. De plus, Le vieillissement augmente l'incidence et la mortalité du syndrome de détresse respiratoire aigu chez l'homme et les modèles animaux vont dans le même sens, les souris âgées présentant une augmentation de l'infiltration neutrophile et de la perméabilité alvéolo-capillaire après une exposition aux toxines bactériennes. Compte tenu de ces éléments et de la littérature existante sur le sujet, nous avons décidé d’utiliser des souris âgées de 8 semaines.
Utilisation de modèles transgéniques murins pour l’étude de la lymphomagenèse
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris de ce projet ont été construites pour surexprimer la protéine humaine BCL2 et porter une seconde altération génétique, de façon à développer un lymphome folliculaire. Elles sont 1 284, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes, dont 40 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 40 un niveau modéré. Elles reçoivent trois gavages, des injections dans l'abdomen et des prises de sang à fréquence mensuelle, une partie subissant en plus une irradiation du corps entier de trente minutes suivie d'une greffe de cellules. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, une meilleure compréhension des stades de la lymphomagenèse.
Objectifs
Le lymphome folliculaire (LF) est un cancer des cellules immunitaires se développant au sein des ganglions. Cette pathologie, malgré des avancées thérapeutiques notables, reste à l’heure actuelle incurable et sa fréquence est en constante augmentation dans les pays industrialisés. Les cellules tumorales de LF se caractérisent par l'accumulation d'altérations génétiques. La première altération conduit à la surexpression de la protéine de survie BCL2, puis d'autres altérations additionnelles sont fréquemment observées. Ainsi les modèles murins que nous avons développés pour mimer le LF surexpriment la protéine BCL2 humaine et possèdent une altération fréquemment décrite chez les patients. Ces multiples anomalies présentes dans le LF favorisent la croissance tumorale et la résistance au traitement en agissant directement sur la survie ou la prolifération des cellules tumorales mais aussi en favorisant le dialogue des cellules tumorales avec les cellules qui l’entourent, les cellules du microenvironnement. Nos modèles murins permettent ainsi d'analyser le développement tumoral en étudiant la fonctionnalité des cellules tumorales et en caractérisant la composition du microenvironnement tumoral.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient permettre une meilleure compréhension des différents stades et acteurs de la lymphomagenèse.
Procédures
1)- La majorité des animaux aura une administration par voie orale d'une molécule chimique à 3 reprises pour l'induction des altérations d'intérêt, ce geste prend quelques secondes. En parallèle, ces souris recevront à une fréquence mensuelle une administration intrapéritonéale pour stimuler leur système immunitaire, cette administration prendra moins de 30 secondes. Dans le cadre du suivi de ces animaux, des prélèvements de sang, dont la fréquence sera au maximum mensuelle et la durée de moins de 30 secondes, seront réalisés. Dans certains cas, de l'imagerie non invasive pourra être réalisée impliquant une administration intrapéritonéale prenant moins de 30 secondes. 2)- Une petite partie du projet sur des souris non transgéniques implique cette fois-ci une irradiation de 30 minutes des souris sous oxygène (évite le stress), puis une injection intraveineuse de cellules, réalisée en moins d'une minute, pour reconstituer les souris.
Impact sur les animaux
L'administration par gavage peut générer un stress, un inconfort, voire une fausse route créant une détresse respiratoire, c'est pourquoi elle ne sera réalisée que par des personnes qualifiées pour ce geste et sur animal vigil, diminuant ainsi drastiquement les fausses routes. En cas de fausse route, l’animal sera surveillé le temps de l’évacuation du liquide, l’animal vigil aura le réflexe d’évacuer par lui-même le liquide. Dans nos expériences précédentes, nous n’avons pas observé de stress lié à la répétition de ce geste de gavage. Pour les animaux transgéniques portant la double altération et conservés plus de 6 mois, on peut observer un développement tumoral qui reste généralement indolent (non douloureux) comme chez l'Homme ; cependant ces souris seront observées régulièrement afin de détecter l'apparition de signes d'affaiblissement (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Concernant les souris ayant reçues une irradiation corps entier, une perte de poids en lien avec des diarrhées induites par l'irradiation peut être attendue.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêt qui seront rigoureusement exploités et analysés afin de recueillir un maximum d'informations.
Remplacement
La caractérisation des évènements géniques impliqués dans le développement du cancer que nous étudions (lymphome folliculaire) ne peut être réalisée que partiellement in vitro puisque les modèles de culture ne nous permettent pas encore de reproduire la complexité du microenvironnement tumoral (présence de tous les acteurs cellulaires impliqués et complexité 3D) alors que celui-ci est justement essentiel au développement de ce type de cancer. Même si nous travaillons en parallèle à développer des modèles 3D plus complexes et de plus en plus fidèles à la réalité afin d'avoir recours au minimum à l'expérimentation d'animaux, l'utilisation de modèles animaux est indispensable pour certaines étapes de nos recherches sur la lymphomagenèse.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations. Les croisements principaux des souris pour l'élevage ont été conçus de manière à obtenir uniquement des souris qui pourront être expérimentées sans produire des souris de mauvais génotype à euthanasier. Lorsque des expérimentations différentes sont nécessaires pour l'analyse des différents types cellulaires, les organes non utilisés sur chaque souris expérimentée seront congelés pour des analyses complémentaires afin d'éviter d'avoir d'autres souris à expérimenter pour générer ces échantillons. Notre expérience précédente nous a permis de dimensionner les groupes de souris pour l'étude des stades tardifs par la connaissance du taux de développement tumoral. Enfin, lorsque cela était pertinent, un calcul d'effectif a été réalisé afin de définir la taille des groupes d'animaux permettant d'observer l'éventuel effet des mutations étudiées.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, un environnement contrôlé (température, humidité, pression), avec alternance jour/nuit (12h/12h), accès à la nourriture et l’eau de boisson ad libitum, change des cages 1 fois/semaine, et hébergement en groupe avec respect de la densité recommandée. Ils bénéficient également d'un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et afin qu’elles puissent se construire un «nid». Afin de limiter le stress lié aux gavages et injections, une acclimatation à la manipulation sera réalisée (manipulation préalable sans administration dans la salle d’expérimentation) par les expérimentateurs. Pour l'irradiation des animaux, ils seront placés dans une boite de confinement afin de maintenir une asepsie maximum, et de l'oxygène sera administré dans cette boite en continu à l'aide de filtre pour éviter l'apparition de stress ou de l'inconfort aux souris. Egalement, dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, et le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire.
Choix des espèces
La souris possède un système immunitaire proche du système humain. Les mécanismes de diversification du répertoire et de réponse à une stimulation antigénique sont similaires. De plus le modèle murin a déjà démontré sa pertinence pour reproduire les mécanismes de développement de nombreuses pathologies lymphoprolifératives humaines. Les souris transgéniques seront utilisées à partir de 12 semaines et jusqu'à 18 mois dans le cadre de la procédure la plus longue, ce stade a été déterminé afin de reproduire au mieux la pathologie humaine survenant tardivement et avec un développement s'étalant sur plusieurs années. Les souris sauvages seront utilisées à 6 semaines puisque ce stage jeune favorise une reconstitution post-greffe efficace.
Squelette neuronal et dyskinésie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chaque souris subit une chirurgie cérébrale de trente minutes sous anesthésie générale, puis reçoit des injections quotidiennes dans l'abdomen pendant deux semaines. 472 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'examen de leur cerveau, dont 412 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objectif déclaré est de comprendre comment la L-Dopa s'intègre au squelette interne des neurones et provoque les mouvements involontaires des patients parkinsoniens traités au long cours. Le porteur ramène les atteintes à une perte de poids et à une perte d'autonomie pour boire et manger, compensées selon lui par les soins, et annonce des tests comportementaux moteurs tous les deux jours sans préciser lesquels.
Objectifs
La maladie de Parkinson est une affection cérébrale qui perturbe les mouvements et peut avoir un impact considérable sur la vie quotidienne. La L-Dopa, le médicament le plus couramment utilisé, aide à gérer les symptômes de la maladie de Parkinson, mais après un traitement prolongé, elle peut provoquer des effets secondaires très gênants tels que des mouvements involontaires anormaux nommés dyskinésies. Il est nécessaire de mieux comprendre le mécanisme en cause afin d’identifier un moyen de limiter ces effets indésirables. Nous avons découvert que la L-Dopa peut s'intégrer directement dans les structures qui composent le squelette interne des neurones, appelées microtubules. Ces microtubules sont importants pour la transmission d'informations d'un neurone à l'autre. Notre projet vise à comprendre le rôle des microtubules contenant de la L-Dopa dans le développement de la dyskinésie et à contribuer à mieux comprendre les défauts neurologiques chez les patients en traitement prolongé à la L-Dopa.
Bénéfices attendus
Étant donné que la L-Dopa est le traitement standard de la maladie de Parkinson et que son utilisation à long terme peut entraîner des effets secondaires tels que les mouvements involontaires (dyskinésie), il est très important de comprendre son impact sur le fonctionnement normal du squelette neuronal dans la communication entre les neurones. En étudiant les protéines impliquées dans la modification de ce squelette neuronal par la L-Dopa, nous pourrions trouver de nouvelles façons de minimiser les effets secondaires de ce traitement.
Procédures
Les souris subissent des procédures chirurgicales sous anesthésie générale pour une durée de 30 minutes. Nous administrons quotidiennement des substances par injections dans l'abdomen pendant deux semaines. Les souris participeront également à des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités motrices impactées par l'administration du traitement contre la maladie de Parkinson. Ces tests dureront de 1 à 30 minutes et se feront durant deux semaines, avec un test tous les deux jours. Les souris peuvent subir une injection intraveineuse sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le projet implique la mise en place d'un état pathologique chez le rongeur affectant l'autonomie des souris à s'hydrater et se nourrir et donc une perte de poids, n'impactant pas leur taux de survie grâce aux soins apportés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour l'étude de l'anatomie du cerveau.
Remplacement
Une première partie des expériences a été faite in vitro et sur des neurones en culture. Pour la suite du projet, il n'existe aucune alternative expérimentale nous permettant d'éviter l'utilisation d'animaux vivants pour évaluer les transmissions de signaux naturels dans le cerveau et les mouvements anormaux.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Des études préliminaires permettent la mise au point des expériences. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
Pour permettre l'acclimatation, un minimum d'une semaine sera alloué lorsque les animaux seront transférés d'autres installations. Afin de donner la priorité au bien-être des animaux et de minimiser la douleur, la détresse ou la souffrance potentielles pendant les expériences, nous surveillons l'état de santé et de stress des souris tout au long de l'étude. Pendant les semaines de convalescence suivant l'opération, les souris seront surveillées et recevront de la nourriture supplémentaire. En cas de douleur ou d'inconfort, un analgésique sera administré. Nous utilisons des points limites adaptés permettant d’intervenir rapidement pour limiter la souffrance de l’animal. Étant donné que la procédure chirurgicale pour l'induction de la lésion qui générerait la maladie de Parkinson peut entraîner des problèmes d'alimentation et de déshydratation, les souris recevront une injection sous-cutanée d'une solution de glucose et de sérum physiologique immédiatement après l'opération et une fois par jour pendant la première semaine postopératoire. Compte tenu de la possibilité de complications postopératoires, un dossier complet d'évaluation de la santé sera tenu pour chaque souris pendant les 14 premiers jours suivant l'opération. Des tests comportementaux seront effectués après une période d'entraînement pour limiter le stress de la nouveauté.
Choix des espèces
La souris est un mammifère génétiquement modifiable, dont l'anatomie et la physiologie sont comparables à celles de l'homme, de sorte que les connaissances acquises peuvent également être appliquées à l'homme. En outre, l'élevage des souris et les conditions de leur utilisation expérimentale sont bien établis. Des modèles génétiquement modifiés d'intérêt existent déjà dans notre laboratoire et les échelles de dyskinésie pour les souris sont maintenant bien validées et largement utilisées. Nous utilisons des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines.
Distribution 3D de la bléomycine après instillation intratrachéale et relation dose-effet dans un modèle de fibrose pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Une instillation de bléomycine directement dans la trachée sous anesthésie, répétée jusqu'à trois fois pour le groupe suivi trente jours, provoque chez 48 souris une fibrose pulmonaire. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour prélever les poumons et cartographier en trois dimensions la distribution du produit et des lésions. Le projet doit fournir un atlas de référence à un modèle mathématique, présenté comme une étape vers un "jumeau numérique" qui réduirait ensuite le nombre d'animaux utilisés. Le porteur affirme que l'instillation ne cause aucune douleur au réveil et que le développement de la fibrose est indolore faute d'innervation sensitive du poumon, tout en annonçant une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité de 20 à 30 % après sept à dix jours à forte dose.
Objectifs
La fibrose pulmonaire progressive correspond à un ensemble pathologie pulmonaire fibrosante qui met en jeu le pronostic vital et qui recouvre des causes très différentes, avec des réponses hétérogènes et insatisfaisantes aux traitements. L’étude de cette pathologie nécessite de développer des modèles réalistes pour comprendre les mécanismes impliqués dans le remodelage tissulaire à l’origine de la morbidité associée à la maladie et la proposition de nouveaux traitements ciblés. Le modèle de fibrose pulmonaire le plus largement utilisé est réalisé in vivo chez la souris par instillation dans la trachée d'un agent pro-fibrosant. Cependant, ce modèle présente des inconvénients tels que l'hétérogénéité spatiale anatomique des lésions. Ce modèle étant malgrés tout le plus utilisé et reproduisant un certains nombre d’éléments retrouvé chez le patient, nous envisageons : 1/ d’évaluer virtuellement la distribution de l'agent pro-fibrosant après instillation intra-trachéale en utilisant les mathématiques probabilistes, d'abord appliquées à un modèle simplifié ; 2/ de comparer les résultats obtenus dans les modèles virtuels avec la distribution pulmonaire 3D de cet agent pro-fibrosant immédiatement après instillation intra-trachéale, ainsi que les lésions fibrotiques induites 1 semaine plus tard.
Bénéfices attendus
La fibrose pulmonaire progressive est une pathologie qui met en jeu le pronostic vital et qui recouvre des causes très différentes, avec des réponses différentes aux traitements disponibles. Cette pathologie pulmonaire est considérée comme un problème majeur de santé publique. L’étude de cette pathologie nécessite de développer des modèles animaux en injectant dans le poumon un agent fibrosant. Ces modèles permettent de comprendre les mécanismes impliqués dans les modifications de l’organisation du tissu pulmonaire à l’origine des symptômes associés à la maladie. Ce projet vise à approfondir nos connaissances du modèle de souris qui reproduit la fibrose pulmonaire progressive. L’objectif est de construire un « atlas de référence » de l’apparition et de l’évolution de la maladie à partir d'un modèle mathématique. Ce modèle permettra de prédire l’apparition et la distribution des lésions afin de mieux comprendre et mieux traiter les modifications de l’organisation du tissu pulmonaire. Nous utiliserons une technique d’imagerie tridimensionnelle à haute résolution afin de : 1) déterminer la distribution 3D des instillations de l’agent fibrosant injecté dans le poumons des souris en fonction des programmes d'administration (injection unique ou répétée) ; 2) déterminer la distribution des lésions dans le poumon de la souris; 3) réaliser un "atlas" de référence pour la construction des modèles mathématiques. Une meilleure connaissance du modèle animal permettra de construire un jumeau numérique afin de réduire le nombre d'animaux utilisé et permettra également une meilleure connaissance de la pathologie humaine.
Procédures
La réalisation de ce projet nécessite deux types d’induction et deux temps de maintien. L’induction de lésion pulmonaire aigue (8 jours) via l’administration unique d’un agent pro-fibrosant sous anesthésie générale (durée 10 min). L’induction de lésion pulmonaire progressive (30 jours) via l’administration répétée d’un agent pro-fibrosant sous anesthésie générale (durée 10 min répétée 3 fois). Les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses soit immédiatement après administration de l’agent pro-fibrosant soit une semaine après.
Impact sur les animaux
L'instillation intra-trachéale d’un agent fibrosant n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Le développement d'une fibrose pulmonaire est également indolore du fait de l'absence d'innervation sensitive à la douleur dans le parenchyme pulmonaire. Elle peut néanmoins entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité de 20 à 30 pour cent après 7 à 10 jours suite à l’administration d’une forte dose d’agent fibrosant ou de 10 pour cent après 45 jours lors des instillations répétées de faibles doses de cet agent. Les anesthésies par voie intra-péritonéale sont suivies par l'euthanasie de l’animal (sans réveil). Lors de l’anesthésie gazeuse, les niveaux seront ajustés en temps réels en fonction des réactions de l’animal afin d’éviter les risques anesthésiques.
Devenir
A la fin de la période de maintien ou en cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront euthanasié pour prélèvement d'organes. Tous les prélèvements sont nécessaires pour répondre à la question scientifique
Remplacement
La réalisation de ce projet nécessite d’instiller des agents pro-fibrosant et des produits de contratse avant d’étudier leurs distributions post instillation ainsi que l'induction de lésions pulmonaires in vivo. De fait, il n'existe pas de méthodes alternatives à l'expérimentation animale in vivo à ce jour pour cette expérimentation.
Réduction
48 animaux sont prévus dans ce projet. Le nombre de souris par groupe à été estimé en fonction de la littérature existante. Il s’agit du nombre minimum d’animaux requis pour l’obtention des acquisitions par tomographie par contraste de phase à rayons X à haute résolution permettant une imagerie volumétrique nécessaire à l’étude de la distribution 3D des lésions.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi par groupes sociaux de 4 animaux par cage. La température de l’animalerie et l’humidité relative sont contrôlés en permanence. La nourriture sera fournie ad libitum et la photopériode sera de 12h/12h. L'enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification (bandes de papier naturel compacté) et d'abri en cellulose. Concernant l'instillation intra-trachéale, celle-ci sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l'instillation n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu'à leur réveil complet. Afin d’améliorer le confort de l’animal suite à l’instillation intra-trachéale et afin de prévenir une perte de poids trop importante, un gel hydraté enrichi pourra être proposé au animaux afin de faciliter l’alimentation et la récupération des animaux dans les premières heures suivant la procédure. En fin de procédure, lors de l'anesthésie précédant l’euthanasie, la profondeur d'anesthésie sera vérifiée via l’observation des signes suivants: le relâchement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe de fermeture des paupières, une respiration calme. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour réduire le plus possible toute souffrance qu’auraient pu ressentir les animaux. Les points limites seront basés sur l'examen visuel des signes suivants: immobilité, difficultés respiratoires (râle, respiration rapide..), position anormale (dos vouté, couché sur le coté..), réduction de la mobilité (faiblesse musculaire, manque de coordination, tremblements, paralysie..), perte de poids rapide ou progressive, mauvais état du pelage (poil ébouriffé, mal entretenu..), vocalisation, pâleur des yeux ou des extrémités, automutilation. Pour cela, une échelle d'évaluation avec score est utilisée.
Choix des espèces
Ce projet a pour objectif d’induire des lésions pulmonaire puis de prélever les poumons afin visualiser la distribution de ces des lésions pulmonaires. Notre choix c'est porté sur la souris car le modèle murin de fibrose pulmonaire induite par instillation intra-trachéale d'agents pro-fibrosant est un modèle validé dans la littérature et couramment utilisé pour l’étude des fibroses pulmonaires progressives. Il est parfaitement décrit et il a permis l’identification de multiples phénomènes moléculaires et cellulaires impliqués dans la fibrogénèse pulmonaire et a été́ utilisé pour tester de nombreuses stratégies thérapeutiques Pour réaliser notre étude, nous avons besoin que le système ventilatoire soit mature et fonctionnel. Les souris jeunes semblent moins sensibles aux agents pro-fibrosant comparées aux souris âgées. Cependant, il est bien décrit dans la littérature que les souris plus âgées, développent une fibrose pulmonaire plus sévère, ce qui risquerait d’induire une surmortalité. Le compromis qui a été choisi est un âge de 8 semaines.
Rôle de forces mécaniques dans le développement du système nerveux chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Pour comprendre le rôle des forces mécaniques dans la construction du système nerveux, 3 120 poissons zèbres vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart et sévère pour 180 d'entre eux. Une partie subit un prélèvement de nageoire caudale pour génotypage et un prélèvement de gamètes sous anesthésie, gestes dont le porteur reconnaît qu'ils peuvent être douloureux au réveil. D'autres sont exposés trente minutes à des molécules odorantes dont certaines sont connues pour leur effet répulsif, ou immobilisés une heure pour l'imagerie de l'activité neuronale, l'isolement lié au génotypage et à l'analyse de nage étant lui aussi compté comme une nuisance. Les poissons sont tués par excès d'anesthésiant ou par refroidissement rapide, faute de porter le génotype voulu, à la limite d'âge de 24 mois fixée par l'animalerie ou en fin d'expérience, à l'exception de 360 gardés en vie pour des projets ultérieurs.
Objectifs
Nous étudions le rôle des forces mécaniques dans la construction du système nerveux. Les mouvements cellulaires sont omniprésents dans le développement des circuits neuronaux : dans l’embryon, les neurones migrent vers leur destination finale et forment de longues protrusions qui s'allongent avant de se connecter au niveau des synapses. L'étude de ces processus s'est jusqu'ici focalisée sur les signaux chimiques qui guident la migration neuronale et la navigation des axones. Or les mouvements des neurones et de leurs protrusions sont aussi influencés par des forces mécaniques, dont la fonction reste largement inconnue in vivo. Disséquer le rôle des forces mécaniques dans l'assemblage des circuits neuronaux représente donc un défi majeur pour les neurosciences modernes.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances inédites sur la construction du système nerveux en mettant en lumière l'importance des signaux mécaniques, contribuant ainsi à une meilleure compréhension du développement neuronal. Au-delà de son impact fondamental en neurosciences, ce projet a des implications biomédicales dans l'étude de l'origine des maladies du système nerveux et la bioingénierie des tissus. Ici, nous nous concentrons sur la contribution des forces mécaniques dans la migration neuronale et la croissance des axones, deux événements clés de la construction des circuits neuronaux. Si l'un de ces deux processus ne se produit pas correctement, la fonction du système nerveux est affectée, comme en témoignent les troubles neurodéveloppementaux graves résultant de défauts de migration neuronale et de formation des axones, tels que les lissencéphalies, le retard mental, les épilepsies et le syndrome de Kallmann. La contribution des forces mécaniques dans l'origine de ces maladies est loin d'être comprise et nécessite plus d'attention. De plus, décrypter la réponse des neurones aux signaux mécaniques in vivo fournira des informations précieuses pour la conception de systèmes de culture neuronale et d'échafaudages 3D associés dédiés à la réparation du cerveau et de la moelle épinière. Nos travaux alimenteront ainsi potentiellement les développements futurs en ingénierie biomédicale pour aider à traiter à long terme les lésions du cerveau et de la moelle épinière.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à des prélèvements de fragments de nageoire pour identification génétique (sur animaux anesthésiés, 1 prélèvement par poisson, durée du prélèvement : 3 minutes), à des prélèvements de gamètes pour préservation des lignées (sur animaux anesthésiés, 1 prélèvement par poisson, durée du prélèvement : 10 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes et analyse du comportement de nage sur animaux vigiles (1 stimulation par poisson, durée de la stimulation : 30 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes et analyse de l'activité des neurones par microscopie sur animaux immobilisés (durée de l'immobilisation : 60 minutes, durée de l'imagerie pendant la stimulation avec des molécules odorantes : 30 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes sur animaux vigiles suivie d'une euthanasie par refroidissement rapide (1 stimulation par poisson, durée de la stimulation : 5 minutes), à une euthanasie par excès d'anesthésiant (1/poisson).
Impact sur les animaux
La substance appliquée aux poissons pour l'anesthésie et l’euthanasie provoque un comportement d'aversion et/ou de stress. De plus, même s’il se fait sous anesthésie, le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale (fin clip) peut générer une douleur après le réveil, ainsi que le prélèvement du sperme et des ovocytes. L’isolement des poissons au moment du génotypage par fin clip ou de l’analyse de la nage représente également une nuisance. Enfin, certains stimulis odorants que nous allons utiliser sont connus pour avoir un effet répulsif sur les poissons, ce qui peut stresser les animaux. L’immobilisation des animaux pour l’imagerie de l’activité neuronale peut également stresser ou générer un inconfort chez les larves analysées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures décrites dans ce projet, exceptés pour 360 d’entre eux qui seront gardés en vie et réutilisés pour des projets ultérieurs dédiés à de nouvelles études du développement de la fonction olfactive chez le poisson-zèbre. Les poissons seront euthanasiés parce qu'ils ne portent pas le génotype d'intérêt, parce qu'ils ont atteint la limite d'âge imposée dans l'animalerie (24 mois), ou en fin de procédure expérimentale (après stimulation olfactive et analyse du comportement de nage ou de l'activité des neurones - il est impossible de les ré-utiliser car ils seront sortis physiquement du système d'élevage, et après stimulation olfactive pour prélèvement/analyse du cerveau sur échantillons fixés).
Remplacement
L’expérimentation sur le poisson-zèbre est essentielle pour répondre à notre question scientifique, afin d’étudier sur un organisme vertébré les processus complexes qui sous-tendent le développement du système nerveux et la contribution des forces mécaniques. L'utilisation du poisson-zèbre comme modèle est notamment essentielle pour étudier les interactions mécaniques entre les neurones en développement et les tissus environnants, car de telles interactions sont encore très difficiles à reproduire in vitro.
Réduction
Le développement externe des embryons nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. En effet une même femelle peut être accouplée toutes les semaines pendant au moins un an pour produire des œufs fécondés pour les expériences, sans dommage pour elle. Lorsque c’est possible, nous utilisons les œufs produits (jusqu’à 200 par ponte) pour plusieurs expériences simultanément. Dès qu’un animal n’est plus utile pour les expériences il est euthanasié. Enfin, afin d’identifier le plus tôt possible les animaux qu’il faut garder et ceux qu’il faut supprimer, nous avons mis en place, lorsque c’est compatible avec le protocole expérimental, le génotypage des embryons à des stades précoces (avant 5 jours). Pour chaque expérience, le nombre d’animaux est limité au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, grâce à un calcul de puissance. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre total d'animaux employés dans le projet est de 3120.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et d’élevage des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont élevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure) à 26-28 degrés, en eau douce, à une densité maximale de 5 poissons par litre. Les poissons aimant être en groupe, les périodes d’isolement (nécessaires au moment du génotypage des poissons pour identification d’une mutation) sont réduites à 10 jours maximum (en général 2 ou 3 jours). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères, de la nourriture vivante, ce qui leur permet d’exprimer leur comportement de chasse/prédation. Les étagères pour les bacs de croisements sont recouvertes de posters figurant des galets, de manière à diminuer le stress généré par le changement d’environnement/d’étagères pendant les croisements. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect ou comportement anormal et de lui attribuer un score. Un animal est euthanasié dès qu’il atteint un score égal ou supérieur à 4. Nous allons mettre en place la congélation de sperme pour conserver les lignées qui sont transitoirement inutilisées. Outre le gain de place, ceci évite de renouveler les lignées et de procéder à des expériences de génotypage qui produiraient des animaux sauvages qu’il faudrait ensuite euthanasier. Les animaux sont anesthésiés pendant les procédures expérimentales pouvant générer une douleur.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude du développement embryonnaire. Son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités de modification du génome en font un modèle de choix pour la recherche. Les possibilités d’imagerie sur embryon vivant font du poisson zèbre un excellent modèle vertébré pour étudier la dynamique des processus de morphogenèse (comprendre comment les organes acquièrent leur forme et leur fonction) et de développement du système nerveux. Pour produire des animaux mutants, nous réalisons une micro-injection dans l’embryon au stade 1-4 cellules. Nous suivons les animaux aux stades larvaires, juvéniles et adultes sur plusieurs générations (sur 5 ans : 3 générations) pour détecter toute anomalie potentiellement nuisible dans les poissons injectés ou porteurs d’une mutation. Quand cela est nécessaire nous génotyperons (génotyper signifie analyser l'ADN) les poissons adultes de nos lignées par prélèvement d’un fragment de nageoire. En effet, il n’est pas toujours possible de réaliser le génotypage aux stades précoces c’est à dire avant 5 jours (incompatibilité avec le calendrier et/ou les expériences) et nous devons dans ce cas effectuer le génotypage à partir de 3 mois. Les prélèvements de sperme et d’ovocytes se font à l’âge adulte. Les tests comportementaux consistant à exposer les poissons à des odeurs puis analyser leur nage seront réalisés aux stades juvénile et adulte. En effet, c’est à partir du stade larvaire que le système olfactif commence à être fonctionnel et en état de répondre aux odeurs. L’analyse de l’activité des neurones par imagerie sera réalisée au stade larvaire. C’est à partir de ce stade que le système olfactif commence à être fonctionnel. Nous exposerons des poissons juvénile et adulte à des stimuli odorants puis nous les euthanasierons par choc thermique avant de réaliser des analyses sur leurs cerveaux fixés.